Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Bien que le mélanome malin cutané (MMC) ne représente que 10% des cancers cutanés, il en est la forme la plus agressive et est responsable de 90% des décès dus aux cancers de la peau. Son incidence ne cesse d'augmenter ces dernières années et atteint 10.8 cas pour 100 000 habitants chez les hommes et 11 chez les femmes. La survie médiane des patients atteint de mélanome à un stade avancé est de 6.2 mois et seulement 1 patient sur 4 est encore en vie à 1an. Le diagnostic du mélanome est uniquement histopathologique et seul l'examen de la biopsie permet de le poser définitivement. De la même façon, il n'existe pas de marqueurs pronostiques associés au mélanome malin cutané. Seuls des facteurs histologiques tels que l'épaisseur de la tumeur, le degré d'invasion ou encore l'envahissement ganglionnaire ont été validés par l'American Joint Committee on Cancer et servent de facteurs pronostiques. Cependant, bien qu'ils permettent d'évaluer le risque métastatique, leur valeur pronostique est encore très insuffisante. L'objectif de ma thèse est d'identifier et de caractériser les protéines associées à la progression tumorale du MMC. Grâce à une approche protéomique quantitative de type iTRAQ par nanoLC MS/MS, j'ai pu identifier et caractériser 2242 protéines dans un modèle cellulaire de progression tumorale du mélanome. La surexpression de huit de ces protéines dans les lignées tumorales par rapport à la lignée normale a été validée par western blot. Deux d'entre elles, TRAP1 et PDIA4 ont ensuite été validées en immunohistochimie comme marqueurs associés à la progression tumorale dans le MMC. Dans un second temps, l'implication de ces deux protéines dans les mécanismes de carcinogénèse du mélanome a été étudiée. L'inhibition de TRAP1 et de PDIA4 induit une diminution de la migration et de la viabilité de la lignée cellulaire métastatique de mélanome 1676. Enfin, la sous-expression dePDIA4 induit une inhibition du complexe Cycline D/CDK4 provoquant un blocage des cellules en phase G0/G1. Ce blocage passerait par la voie PERK liées au stress du réticulum endoplasmique. / Although cutaneous malignant melanoma (CMM) represents only 10% of skin cancers, it is the most aggressive form with 90% of deaths from skin cancer. The Incidence rate is increasing in recent years to 10.8 cases and 11 cases per 100000, in men and women respectively. The prognosis of metastatic melanoma is poor, with a median survival of only 6.2 months. Histopathologic examination remains the gold standard for melanoma diagnosis. There are no prognostic markers associated with CMM. Only histological factors such as tumor thickness, level of invasion, or lymph node involvement have been validated by the American Joint Committee on Cancer and are currently used as prognostic factors. However, although these histological factors are used to assess the risk of metastasis development, their prognostic value is still very low. The aim of my PhD work is to identify and characterize biomarkers associated with tumor progression of CMM. Using a quantitative proteomics approach (iTRAQ and nanoLCMS/MS), I was able to identify and characterize 2242 proteins in a cellular model of melanoma tumor progression. The overexpression of eight proteins in tumor cell lines compared to the normal cell line was validated by immunoblotting. Among these proteins, TRAP1 and PDIA4 were then validated by immunohistochemistry as markers associated with tumor progression in the CMM. Secondly, the involvement of these two proteins in the mechanisms of melanoma carcinogenesis has been studied. The inhibition of TRAP1 and PDIA4 induces a decrease in migration and viability of the metastatic melanoma cell line. Finally, PDIA4 under expression induce an inhibition of cyclin D/Cdk4 complex leading to G0/G1 cell-cycle arrest dependant of endoplasmic reticulum stress by the PERK pathway.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d’élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l’inhibition de la voie mTOR par l’évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l’évérolimus n’a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l’inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d’expression de ces sema3 montre que l’expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs / GEP-NETs are heterogeneous tumors for which therapeutic options are limited and must therefore be enlarged. Targeted therapies, and mainly everolimus-directed mTOR inhibition, constitute standard treatments for GEP-NETs of pancreatic origin. Nevertheless, the therapeutic benefits of everolimus have not been evaluated in the poorly-differentiated GEP neuroendocrine carcinomas (pdGEP-NECs) subgroup. By using a preclinical in vivo model, we demonstrated that mTOR inhibition could be considered as a therapeutic option for pdGEP-NECs. Then, a proteomic study highlighted novel proteins involved in GEP-NETs progression with all identified factors displaying function in cytoskeleton regulation. Among them, CRMP2 is a key member of class 3 semaphorin (sema3) signaling. An expression profile of sema3 revealed that sema3F expression was decreased in GEP-NETs. The re-expression of this protein in TNE-GEPs cellular models showed that sema3F is responsible of the reduction of cell viability and proliferation. In vivo, sema3F hampered tumor development. Further studies are thus needed to better understand the role of the sema3F signaling pathway in the progression of GEP-NETs

Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d’origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l’oncologie pédiatrique. L’extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d’une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d’autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l’aide d’une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L’expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d’expression différentielle. Ainsi, l’expression de miR‐487b et miR‐410 s’est révélée être un facteur pronostique supérieur à l’algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l’amplification de l’oncogène N‐MYC). Le contexte d’empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d’autres microARN d’intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d’expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d’expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu’aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d’anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l’épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l’expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature – rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l’adulte, des anomalies d’expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) – suggèrent très fortement l’implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine. / Neuroblastoma, an embryonal tumour of neuro‐ectodermal origin, stands up with brain tumours as the most worrying cancer of paediatric oncology. The huge heterogeneity of neuroblastic tumours has led i) to find oncogenic mechanisms, and ii) to refine risk stratification of the disease. In using a tumour cohort of patients as well as human NB lines, we sought for microRNA involved in neuroblastoma tumour progression. Comparison of tumours of low‐risk to those of high‐risk resulted to identifying several microRNA composing the C14MC cluster (located within the 14q32.31 locus), whose expression was associated with prognosis; high risk tumours having a differential lower transcript level.Expression of miR‐487b and miR‐410 was a better prognostic factor than the standard algorithm based on age, stage, and N‐MYC genomic content status. As the C14MC cluster belongs to a imprinted locus, the second cluster of microRNAs so far described in the human genome as imprinted, i.e., the C19MC, was analysed: in high‐risk neuroblastoma, miR‐516a‐5p transcript level was differentially up‐regulated (contrasting to microRNAs from C14MC) and was also associated with prognosis. Combination of transcript levels of miR‐487b and miR‐516a‐5p provides a powerful prognostic factor better than only miR expression from C14MC. Therefore, new risk stratification has been proposed.In neuroblastoma, tumour expression deregulation found to be restricted to C14MC and C19MC as well as the DLK1 et MEG3 harboured by the 14q32.31 locus, should result from methylation anomalies. Epigenetic modulators (5‐AZA and PBA) resulted in a significant increase of miR from C14MC as well as DLK1 and MEG3 genes. With regards to target genes, our results point out N‐MYC, TWIST1 and TWIST2 as direct or indirect targets of miR‐487b & miR‐516a‐5p. Our data and literature – indicating relative underexpression of C14MC microRNAs and hyper‐expression of C19MC microRNAs in aggressive forms of various adult cancers – thus stress the potential involvement of the two clusters in human carcinogenesis.

Le contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes représente un vaste ensemble de processus biologiques autour de la machinerie des ARNm, jouant un rôle majeur dans la création de la diversité du répertoire protéique. La dérégulation de ces processus, générant un phénotype altéré, pourrait contribuer à la progression tumorale dans les cancers du sein. Nos travaux se sont axés sur l'étude de l'épissage alternatif des pré-ARNm et la dérégulation de la machinerie de l'épissage dans la progression métastatique des cancers du sein. Dans un modèle murin de carcinome mammaire, nous avons identifié des variants d'épissage spécifiquement associés au potentiel métastatique. Dans une large cohorte de patientes, nous avons montré que l'expression de certains de ces variants dans des tumeurs est associée à un pronostic défavorable. Enfin, nous avons caractérisé le profil d'expression des protéines régulatrices de l'épissage dans plusieurs séries de cancer du sein. Cette étude offre de nouvelles connaissances et perspectives pour le développement de biomarqueurs de la progression tumorale. / Alternative RNA processing is a mechanism that plays a critical role for creation of protein diversity through selective inclusion or exclusion of RNA sequences during post-transcriptional control of gene expression. We hypothesized that alteration in this process might contribute greatly to tumour development and progression in breast cancer. The aim of our study was to identify and characterize defects in alternative splicing during breast tumour progression. In a murine model, we could identify specific mRNA splicing variants associated with metastatic development. In a large cohort of breast cancer patients, expression of a subset of these variants was correlated to poor prognosis. Finally, we characterised the expression profile of a large panel of proteins of the splicing machinery in breast cancer. Our study provides new insights in the understanding of mechanisms leading to tumour progression and perspectives for the development of new biomarkers and therapies.

Des données antérieures obtenues dans notre laboratoire ont montré le rôle essentiel de PAI-1 dans la croissance de cellules cancéreuses dorigine murine et linduction dune angiogenèse concomitante (Bajou et al, 1998;Bajou et al, 2001). Bien que ces résultats aient été confirmés par dautres groupes dans différents modèles expérimentaux (Gutierrez et al, 2000;McMahon et al, 2001), très peu dinformations concernant limplication de PAI-1 dans la progression des carcinomes humains étaient disponibles dans la littérature. Cest pourquoi, dans le premier chapitre de ce travail, nous nous sommes intéressés au comportement de différentes lignées de carcinomes humains lorsquelles sont placées dans un environnement dépourvu en PAI-1. Lensemble des résultats obtenus est décrit dans la première publication intitulée : « Host plasminogen activator inhibitor-1 promotes human skin carcinoma progression in a stage-dependent manner » (Maillard et al, 2005, Neoplasia, 7: 57-66) La synthèse des différentes études utilisant différents modèles expérimentaux in vivo (voir introduction, Tableau 6) a montré quelques divergences quant à linfluence de PAI-1 dans la progression tumorale et la formation de métastases. Ces résultats contradictoires pourraient sexpliquer en partie par la grande diversité des modèles expérimentaux utilisés. Les lignées de cellules tumorales utilisées, le nombre de cellules implantées, ainsi que le site dimplantation chez les animaux sont quelques uns des facteurs pouvant influencer les résultats. Dans ce contexte, lutilisation danimaux transgéniques développant spontanément des lésions tumorales est une alternative attrayante pour étudier limpact dun facteur sur lévolution de ces lésions. A lheure actuelle, un seul groupe sest intéressé à limpact dun déficit en PAI-1 dans un modèle de souris développant de manière spontanée des adénocarcinomes mammaires qui métastasent dans les poumons, et na pas observé de différences entre les animaux déficients en PAI-1 et leurs contrôles de type sauvage (Almholt et al, 2003). Ce deuxième chapitre est consacré à létude de limplication de PAI-1 dans un autre modèle murin de cancérogenèse spontanée, à savoir, les souris TRP-1/SV40 Tag caractérisées par un développement de tumeurs oculaires qui forment des métastases dans le cerveau. Ce travail a été réalisé en collaboration avec le Laboratoire de Vectorologie et de Transfert de Gènes (Docteur M. Perricaudet, UMR8121, Villejuif, France), au cours dun séjour de plus de 6 mois. Lensemble des résultats obtenus est décrit dans la seconde publication intitulée : « Reduction of brain metastases in transgenic ocular tumor in plasminogen activator inhibitor-1 deficient mice » (Maillard et al, soumis pour publication) Les résultats présentés dans le troisième chapitre mettent en avant lintérêt des chambres de transplantation in vivo de kératinocytes tumoraux comme modèle détude des interactions hôte-tumeur. Dans un premier temps, ce modèle nous a permis de déterminer limportance de lorigine cellulaire de PAI-1 (cellules tumorales ou cellules hôtes) sur son effet pro-angiogène. Dautre part, des effets opposés de PAI-1 en fonction de sa concentration ont été mis en évidence et apportent des éléments de réponse quant aux effets pro- ou anti-angiogènes de cet inhibiteur des activateurs du plasminogène. Les résultats sont repris dans la troisième publication intitulée : « Host-derived plasminogen activator inhibitor-1 (PAI-1) concentration is critical for in vivo tumoral angiogenesis and growth » (Bajou et al, 2004, Oncogene, 23:6986-6990) Dans un second temps, en collaboration avec léquipe du Professeur J. Boniver (Laboratoire dAnatomie et de Cytologie Pathologiques, ULg, Liège), les chambres de transplantation ont été utilisées pour évaluer in vivo lefficacité thérapeutique du GM-CSF comme cytokine favorisant la migration intratumorale de cellules dendritiques matures. Ces travaux sont présentés dans la quatrième publication intitulée : « Delivery of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor in bioadhesive hydrogel stimulates migration of dendritic cells in models of human papillomavirus-associated (pre)neoplastic epithelial lesions » (Hubert et al, 2004, Antimicrobial agents and chemotherapy, 48: 4342-4348)

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Nous avons étudié, le statut de la voie p53/p14arf dans l'adénocarcinome bronchique muté pour EGFR ou KRAS ainsi que l'impact du complexe NTS/NTSR1 sur la progression tumorale et la survie du cancer bronchique non à petites cellules. Dans une série de 96 patients, les mutations de TP53, KRAS et EGFR ont été détectées dans respectivement 45.2%, 15.8% et 34.4% des cas. La diminution de l'expression de p14arf a été observée dans 57.1% des cas. Le déficit de la voie p53/p14arf a été observé dans 83,3% et 76.9% des tumeurs mutées pour EGFR et KRAS respectivement, ce qui suggère que les altérations de la voie p53/p14arf sont des événements communs dans ces tumeurs mais pas systématiques. L'expression du NTSR1 a été mise en évidence par immunohistochimie dans 60.4% des adénocarcinomes de stades I (n= 139); 47% de stade II (n = 74) et 50% de stade III (n = 133). A l'analyse univariée et multivariée, l'expression du NTSR1, était associée significativement à un mauvais pronostic en termes de survie globale (p = 0,0081 pour les stade I, p = 0.0087 pour les stade II-III). Par contre, l'expression de NTSR1 n'était pas associée avec une différence significative en terme de survie globale pour le carcinome épidermoïde ou le carcinome à grandes cellules. Les études, in vivo et in vitro, ont montré que le complexe NTS/NTSR1 favorise la progression tumorale en augmentant l'expression HER2 et HER3 et la transactivation d' EGFR, HER2 et HER3 par l'activation de MMP1 et la libération de HB-EGF et de NRG1. Ces résultats suggèrent que le complexe NTS/NTSR1 contribue activement à l'agressivité et à la progression tumorale bronchique

Dans les cancers du poumon, une des altérations les plus souvent observées est la perte ou l’atténuation de l’expression du gène FHIT (Fragile Histidine Triad). Nous avons précédemment montré que FHIT est un suppresseur d’invasion tumorale. En effet, FHIT contrôle l’invasion des cellules tumorales bronchiques en régulant négativement l'expression de gènes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse (TEM), en particulier la vimentine et la MMP-9 via l’inhibition d’une voie orchestrée par l’EGFR. Un intérêt particulier a donc été porté aux relations entre FHIT et un autre membre de la famille de l’EGFR : HER2. Nous avons non seulement mis en évidence, in vivo et in vitro, une corrélation inverse entre les taux de FHIT et l’activité du récepteur HER2 dans les CBNPC mais également montré que FHIT est capable de réguler l’activité du récepteur HER2 dans les cellules tumorales pulmonaires et ce grâce à sa dimérisation avec HER3. De plus, l’utilisation de deux inhibiteurs spécifiques d’HER2, le Trastuzumab et l’Irbinitinib, nous a permis de mettre en évidence, que l’activation du récepteur HER2 lors de l’inhibition de FHIT, participe à l’acquisition par les cellules tumorales bronchiques de caractéristiques invasives via la régulation de certaines cibles de la TEM, telles la vimentine, la MMP-14 ou encore le facteur de transcription TWIST-1. Ces résultats montrent que FHIT régule l’activité d’HER2 dans les cellules tumorales pulmonaires et que les inhibiteurs d’HER2 sont capables de limiter l’invasion induite par l’inhibition de FHIT. Cette étude laisse envisager de nouvelles perspectives thérapeutiques pour le cancer du poumon. / The lack or decrease of FHIT (fragile histidine triad) expression is a common event in lung cancer. We recently showed that FHIT acts as a suppressor of tumor invasion. Indeed, FHIT controls the invasive phenotype of lung tumor cells by regulating the expression of genes associated with epithelial-mesenchymal transition (EMT) such as vimentin or MMP-9 through an EGFR signaling pathway. Accordingly, we focused on the relationships between FHIT and another member of this tyrosine kinase receptor family: HER2. First, we observed in vivo and in vitro a negative correlation between FHIT expression and the activated form of HER2 in lung tumor cells. Moreover, FHIT controls HER2 activation through its dimerization with HER3. The use of HER2 specific inhibitors, Trastuzumab and Irbinitinib, allowed to demonstrate that the in vitro invasion induced by FHIT inhibition is HER2-dependent. Furthermore, FHIT controls the HER2-dependent invasion by regulating genes associated with EMT such as vimentin, MMP-14 or TWIST-1. In conclusion, we showed that FHIT regulates HER2 activity in lung tumor cells and that HER2 inhibitors reduce invasion induced by FHIT inhibition. This study would allow for the identification of new therapeutic leads for lung cancer.