Une des questions fondamentales en neurobiologie du développement est de comprendre quels sont les mécanismes responsables de la formation des circuits neuronaux. Alors que les circuits de neurones projecteurs ont fait l'objet d'études intensives, aujourd'hui encore peu de chose est connu sur les molécules et les voies de signalisation impliquées dans la croissance et la différentiation axonale des interneurones GABA. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la molécule de guidage axonal Semaphorine 3a (Sema3A) dans le développement des axones des interneurones GABA du cervelet. Pour mener à bien cette étude, j'ai développé de nouvelles approches expérimentales in vitro et in vivo. En utilisant ces nouveaux outils, j'ai montré que la SEMA3A était capable d'attirer l'axone des interneurones GABA. In vitro, la SEMA3A induit une augmentation locale de la formation de branches axonales et l'apparition précoce d'un marqueur présynaptique (GAD65). Nous avons également montré que la combinaison d'expression de SEMA3A avec une molécule d'adhésion de la famille L1CAM dans les cellules hétérologues était capable d'induire l'innervation de cette cellule de manière spécifique par les interneurones GABA du cervelet. Cette étude nous a permis de montrer que la combinaison entre une molécule de guidage axonal et une molécule d'adhésion cellulaire spécifique était suffisante pour induire des mécanismes de reconnaissance cellulaire par les interneurones GABA du cervelet. / GABAergic interneurons are fundamental component in neural processing and their specific innervation patterns are though to be the building block for physiological brain function and computing. However the molecular and cellular mechanisms that assemble inhibitory local circuits remain largely unknown. In cerebellar cortex, molecular layer GABAergic interneurons are key regulators of cerebellar signal coding and memory formation by sending specifically their axons to innervate the Purkinje cells. Here, we show that a combination of both secreted axon guidance and recognition molecules of L1CAM family is sufficient to trigger target cell recognition by molecular layer GABAergic interneuron˙s in vivo. Using BAC transgenic reporter mice for cell-type specific gene-expression profiling of secreted SEMAPHORIN molecules, we identified that SEMAPHORIN3A (SEMA3A) expression picked precisely at relevant time-point of GABAergic local circuit formati on. In vitro, in a co-culture model, we found that semaphorin3A (SEMA3A) secreted by CHO cells attracts GABAergic interneurons axons and triggers their local specific branching. In vivo, the injection of these heterologous cells expressing SEMA3A ectopically in the granule cell layer is able to disrupt the « crystal »like organization of molecular GABAergic interneurons and attracts their axons in this ectopic territory. Moreover we found that both in vitro and in vivo, the co-expression of SEMA3A and the L1CAM family recognition molécules, Neurofascin, but not their respective expression alone, are able to induced heterologous cells innervation by molecular GABAergic interneurons. These results suggest that specific combination between axon guidance molecules and L1CAM family is sufficient to specify cell type recognition in a space and timely dependent manner.

L'expansion d'une tumeur résulte d'une multiplication non contrôlée des cellules tumorales, de l'acquisition de leur capacité à migrer, ainsi que de la genèse du réseau vasculaire nécessaire à leur survie. Ces propriétés reposent en partie sur la mise en jeu de molécules impliquées dans le guidage cellulaire telles que les sémaphorines, initialement décrites pour leur implication dans le guidage axonal au cours du développement du système nerveux. Leurs fonction s'étendent actuellement au contrôle de l'angiogénèse de la migration des précurseurs nerveux ainsi que du cycle cellulaire. Les voies de signalisation intra-cellulaires des sémaphorines ne sont que partiellement connues. Les CRMP (CollapsinResponse Mediator Protein) font partie de leurs médiateurs intracytoplasmiques, décrites au cours de la rétraction du cône de croissance induit par la sémaphorine 3A (Sema3A). L'implication en pathologie tumorale de ces voies de signalisation a été découverte par l!étude de gènes tel que celui de la sémaphorine 3F (Sema3F), présents dans les régions délétées du chromosome 3 de certains types de tumeurs non neuroendocrines du poumon L'implication des CRMP a été également révélée par les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP). Ces syndromes résultent d'une auto-immunisation humorale des patients contre des antigènes exprimés par la tumeur dont ils sont atteints. C'est le cas de CRMP5, protéine, identifiée dans notre laboratoire comme cible des auto-anticorps anti-CV2/ CRMP5 dans le cadre des SNP associés à des tumeurs neuroendocrines du poumon, les carcinomes à petites cellules (CPC) ainsi qu'à des thymomes. Alors que les thymomes sont des tumeurs bénignes, les CPC représentent 20% des carcinomes pulmonaires et sont, avec les carcinomes neuroendocrines à grandes cellules, les formes les plus agressives des tumeurs du poumon. Notre objectif était d'étudier l'implication physiopathologique des CRMP dans les différents types de carcinomes du poumon et dans les thymomes ainsi que dans les tumeurs du système nerveux central en relation avec la signalisation des sémaphorines. Nous avons ainsi démontré une expression exclusive de CRMP5 par les carcinomes neuroendocrines du poumon et les gliomes de haut grade par comparaison aux carcinomes non neuroendocrines et aux thymomes. CRMP5 n'est pas exprimée dans les carcinomes non neuroendocrines du poumon desquels sont dérivés les lignées H460 et H157. Ces observations ont été complétées par deux collaborations à des études portant sur les voies de signalisation des sémaphorines dans des modèles cellulaires de ces tumeurs. La première étude a montré que Sema3F, surexprimée dans la lignée H157 possède un effet anti-tumoral. La voie de signalisation de Sema3F nécessite neuropiline 2, l'inactivation de la MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) Erk 1/2 et entraîne l!inhibition de l'adhésion des intégrines !vß3, avec participation de CRMP1 et CRMP4 mais pas de CRMP5. La deuxième étude a établi que sous Sema3A la voie de signalisation d'Erk ½ est activée par le complexe de récepteur NRP1/VEGFR1 lors de la migration de précurseurs nerveux. Dans ces conditions Sema3A entraîne des modulations des expressions des CRMP2, CRMP4 et CRMP5 suggérant leur implication. Ainsi, ce travail montre que l!activation de certaines voies de signalisation des sémaphorines sont spécifiques des types histopathologiques et des grades des tumeurs. Ces voies de signalisations sont médiées par des complexes de récepteurs précis et mettent souvent en jeu les CRMP / Tumour growth is a consequence of uncontrolled cell proliferation, cell migration and angiogenesis. These functions are partly controlled by molecules involved in cellular guidance. Among these molecules, the semaphorins, previously described in axonal guidance during development, interestingly control cell migration, angiogenesis, apoptosis and proliferation. Signalling pathways of Semaphorins are only partially known. CRMP (Collapsin Response Mediator Protein) are involved in the signalling semaphoring pathway, precisely as mediator of Sema3A induced growth cone collapse. Implication of these signalling pathways in tumour growth was initially discovered with Sema3F localised in frequently deleted regions of the third chromosome found in non neuroendocrine lung carcinoma. CRMP involvement was also discovered in neurological paraneoplastic syndromes (NPS). These syndromes result of an auto-immunisation against tumour antigens present in some patients. CRMP5 was identified by our laboratory as a target of anti-CV2/CRMP5 auto-antibodies seen in some NPS associated with small cell lung carcinoma (SCLC) and thymoma. While thymoma are benign tumours, SCLC account for 20% of all lung tumour pathological subtypes and represent with large cell neuroendocrine carcinoma the most clinically aggressive subtypes of lung tumours. Our aim was to study the physiopathological role of CRMP among the different subtypes of lung carcinoma, thymoma and central nervous system tumours and their relationship with semaphorin signalling pathways. We showed a specific diffuse expression of CRMP5 by high grade neuroendocrine carcinoma and high grade glioma tumour cells. CRMP5 is neither expressed by non neuroendocrine lung carcinoma nor H460 or H157 derived cell lines, nor thymoma. Additionally, 2 collaborative studies were undertaken, focusing on semaphorin cell signalling in tumour derived cell lines. The first study showed an anti tumour effect of Sema3F over-expressed in H157 cell line mediated by neuropilin 2, CRMP2 and CRMP4 but not by CRMP5. It showed that Sema3F stimulation led to the inactivation of Erk1/2 MAPK (Mitogen Activated Protein Kinase) and inhibition of !vß3 integrin mediated adhesion. The second study showed that Sema3A induced DEV cells migration was mediated by neuropilin1/VEGFR1 receptor complex and activated Erk1/2 pathway. CRMP2, CRMP4 and CRMP5 expression changes suggested their involvement in that pathway. Thus, these data show that some semaphorin pathways activation were specific of tumour pathological subtype and grade. These signalling pathways were precisely mediated by specific receptor complexes and different CRMPs isoforms

La mise en place des projections axonales est une étape clé du développement des circuits de la moelle épinière qui contrôle les fonctions motrices de l’individu. Il s’agit d’un processus complexe impliquant des mécanismes de spécification des neurones moteurs et des signalisations multiples assurant le guidage spécifique de chaque axone jusqu’à sa cible d’innervation. Les Sémaphorines de classe 3 (Sema3) sont des molécules secrétées dans l’environnement qui participent notamment au guidage des axones moteurs de la moelle épinière. De manière surprenante, les motoneurones expriment également eux-mêmes des Sema3. Mon équipe a déjà montré que l’expression intrinsèque de Sema3A par les motoneurones module leur sensibilité au Sema3A de l’environnement. Ce processus s’effectue par une régulation du niveau de son récepteur à la surface du cône de croissance, la structure terminale de l’axone responsable de la perception des signaux de guidage extracellulaires (Moret et al., 2007). Quelle est la portée de ce nouveau mécanisme modulatoire et peut-il être généralisé à d’autres membres de la famille des Sema3 exprimés dans les motoneurones ? Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence ce rôle modulatoire d’un autre membre de la famille Sema3 : Sema3C, dons l’expression est restreinte à une sous-population de motoneurones, en plus d’une expression environnementale. Par des expériences de gain et de perte de fonction dans l’embryon de poulet, nous avons montré que l’expression motoneuronale de Sema3C module de manière différentielle ses deux récepteurs du niveau de récepteur entraînent une modulation de réponse à Sema3C mais aussi à Sema3A et Sema3F, qui se fixent respectivement sur Nrp1 et Nrp2. De plus, nous avons étudié la portée de ce mécanisme de modulation dans l’innervation des membres de l’embryon de poulet, ce modèle permettant l’étude des projections motoneuronales dans un environnement riche en Sema3. Ainsi, l’analyse in vivo des embryons de poulet pour lesquels l’expression intrinsèque de Sema3C dans les motoneurones a été manipulée a permis de montrer que la modulation de réponse aux Sema 3 de l’environnement contribue au positionnement stéréotypé des projection motrices dans le membre antérieur. Ce travail permet donc de proposer que l’expression d’un code de Sema 3 par les motoneurones confère aux différentes sous-populations une sensibilité spécifique aux gradients de Sema 3 présents dans l’environnement et assure ainsi une trajectoire stéréotypée des axones moteurs jusque dans leur territoire cible. / During spinal circuit’s development, the implementation of axonal projections is a key step as it ensures the integrity of motor functions. This complex process implicates several mechanisms such as motoneuton specification and various signaling cascades in order to guide specifically each axon toward its innervation target. Class 3 Semaphorins (Sema3s) are chemotactic cues, secreted in the environment, and contributing to the guidance of spinal motor axons. Surprisingly, these Sema3s are also expressed by motoneurons themselves. Previous work in our team showed that intrinsic expression of Sema 3A. This process arises from the regulation of its receptor availability at the growth cone surface, the terminal end of the axon that enables sensing of extracellular signals (Moret et al., 2007). But in what extent can we generalize this mechanism to other members of the Sema3 family, and what impact could it have, in vivo, during development? My PhD work revealed the modulatory role of another Sema3, Sema3C, expressed in a restricted motoneuronal subpopulation as well as in the environment. By again and loss of function experiments in the chick embryo, we showed that motoneuronal expression of Sema3C modulates differentially its two Neuropilin receptor level, Nrp1 and, Nrp2, at the growth cone surface. These variations of receptors’ availability lead to a response modulation to extrinsic Sema3, but also to Sema3A and Sema3F, that bind to Nrp1 and Nrp2, respectively. Moreover, we analyzed the role of such modulation mechanisms during limb innervation in the chick embryo. Indeed, this model enables the study of motor axon growth in a complex Semaphorin environment. In vivo analysis of chick embryos after intrinsic Sema3C manipulations revealed that response modulation to environmental Sema3s takes part in the stereotyped positioning motor axon projections in the forelimb. Hence, this Study suggest a model in which the expression of a Semaphorin code by motoneurons enables specific subpopulations to modulate their sensitivity Sema3 gradients expressed in their environment, thus contributing to the stereotyped trajectories of motor axon projections towards their final target.

Les Sémaphorines constituent une grande famille de protéines sécrétées et membranaires, qui ont été initialement impliquées dans le guidage axonal au cours du développement du système nerveux, mais qui jouent aussi un rôle important dans la cancérogenèse. Ainsi, les Sémaphorines agissent via leurs récepteurs, qui font partie de la famille des Neuropilines et des Plexines, pour réguler des fonctions multiples qui contribuent au développement des cancers et à la progression métastatique, telles que l'adhésion cellulaire, la motilité, la survie, l'angiogenèse et la réponse immunitaire. Mon travail de thèse a visé à mieux comprendre le rôle de la signalisation induite par la Sémaphorine-3E (Sema3E) et son récepteur Plexine-D1 dans le cancer du sein. Il a été proposé récemment, que la signalisation autocrine induite par le couple Sema3E/Pleixne-D1 dans les cellules tumorales, favorise l’apparition de métastases via l’augmentation de leurs capacités de migration et d’intravasation/extravasation.Dans ce travail de recherche, nous avons trouvé qu’une nouvelle signalisation autocrine induite par Sema3E/Plexine-D1 régit à la fois la tumorigenèse et la formation de métastases. Ainsi, la sécrétion de Sema3E par les cellules tumorales favorise leur survie grâce à l’inhibition d’une voie de mort induite par le récepteur à dépendance Plexine-D1. Bloquer l’interaction entre Sema3E et son récepteur Plexine-D1, via l’utilisation d’un ligand TRAP dans des modèles murins de cancer du sein, permet de tuer spécifiquement les cellules tumorales et exerce une action anti-tumorale et anti-métastatique. Des données préliminaires sur la voie de mort induite par le récepteur Plexine-D1, suggèrent un rôle important du clivage de son domaine intracellulaire par les Caspases et/ou une translocation nucléaire. Ensemble, ces résultats indiquent que l’expression de Sema3E dans les cancers du sein chez la femme, permet un avantage sélectif pour la survie des cellules tumorales. Bloquer l’interaction entre Sema3E/Plexine-D1 apparaît donc comme une stratégie thérapeutique prometteuse pour traiter ces cancers. De plus, ces données permettent une nouvelle approche dans l’étude des fonctions du couple Sema3E/Plexine-D1 dans d’autres contextes physiologiques et pathologiques. / The Semaphorins constitute a large family of secreted and membrane-bound proteins, which have initially been implicated in axon guidance during development of the nervous system, but also have an important role in cancer. Semaphorins signal through Neuropilin and Plexin receptors to regulate multiple functions contributing to cancer development and progression, including cell adhesion and motility, cell survival, angiogenesis and immune response. My work is aimed at better understanding the role of the secreted glycoprotein Semaphorin 3E (Sema3E) and its binding receptor PlexinD1 in breast cancer. It has been recently proposed that Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling in tumor cells promotes metastasis by enhancing cancer cell migration and intravasation/extravasion steps. Here we found another mechanism by which Sema3E/PlexinD1 autocrine signaling regulates both tumorigenesis and metastasis. We show that release of Sema3E by tumor cells promoted their survival through inhibition of an endogenous cell death pathway triggered by the unbound PlexinD1 “dependence receptor”. Interrupting Sema3E/PlexinD1 binding using a ligand-TRAP for PlexinD1 receptor specifically increased tumor cell death and exerted anti-tumoral and anti-metastatic activities in animal models of breast cancers. Preliminary investigations of the underlying cell death pathway suggested a crucial role of PlexinD1 intracellular domain via its cleavage by caspases or its possible translocation to the nucleus. Together, the results indicate that up-regulation of Sema3E in human breast cancers provides a selective advantage for tumor cell survival and that antagonizing Sema3E binding to PlexinD1 may represent a promising therapeutic strategy. Moreover, these data may provide new insight into the functions of Sema3E/PlexinD1 in other physiological and pathological contexts.

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d’élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l’inhibition de la voie mTOR par l’évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l’évérolimus n’a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l’inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d’expression de ces sema3 montre que l’expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs / GEP-NETs are heterogeneous tumors for which therapeutic options are limited and must therefore be enlarged. Targeted therapies, and mainly everolimus-directed mTOR inhibition, constitute standard treatments for GEP-NETs of pancreatic origin. Nevertheless, the therapeutic benefits of everolimus have not been evaluated in the poorly-differentiated GEP neuroendocrine carcinomas (pdGEP-NECs) subgroup. By using a preclinical in vivo model, we demonstrated that mTOR inhibition could be considered as a therapeutic option for pdGEP-NECs. Then, a proteomic study highlighted novel proteins involved in GEP-NETs progression with all identified factors displaying function in cytoskeleton regulation. Among them, CRMP2 is a key member of class 3 semaphorin (sema3) signaling. An expression profile of sema3 revealed that sema3F expression was decreased in GEP-NETs. The re-expression of this protein in TNE-GEPs cellular models showed that sema3F is responsible of the reduction of cell viability and proliferation. In vivo, sema3F hampered tumor development. Further studies are thus needed to better understand the role of the sema3F signaling pathway in the progression of GEP-NETs

Au cours de la réponse immunitaire, comme au cours de la sélection thymique, les interactions cellulaires sont dépendantes de la formation d'un contact étroit entre cellules caractérisé par une synapse. De nombreuses molécules associées aux synapses neurologiques ou neuro-musculaires se sont également exprimées au niveau des cellules immunitaires et impliquées dans la régulation des contacts. Nous avons donc recherché la présence d'autres récepteurs neurologiques au niveau des cellules immunitaires. La neuropilin-1 (Np-1), responsable de la régulation de l'orientation et des contacts des neurones, a été mise en évidence à la fois sur les cellules dendritiques (DC) et les lymphocytes T (LT). De même, la sémaphorin-3A (Sema-3A), un de ces principaux ligands, est exprimée et sécrétée au niveau de ces cellules. La Np-1 est impliquée dans la formation des contacts entre les LT-DC et Thymocytes-cellules épithéliales thymiques. Sa régulation est dépendante de l'activation T médiée par le TcR et/ou par l'interleukine-7 concernant les thymocytes. La production et la sécrétion de la Sema-3A, est exclusivement dépendante de la stimulation du TcR. La Sema-3A interfère avec la prolifération des LT via l'inhibition de la polymérisation de l'actine ce qui empêche la polarisation du TcR au site du contact cellulaire. Le blocage de la Sema-3A, par des anticorps neutralisants provoque une augmentation de la prolifération T. La Sema-3A joue également un rôle au niveau de l'adhésion des thymocytes en bloquant la capacité d'adhésion de ces derniers aux molécules de la matrice extracellulaire (laminine et fibronectine). De plus, la Sema-3A induit la chemorépulsion des thymocytes Np-1 positifs.

La mise en place des projections axonales est une étape clé du développement des circuits de la moelle épinière qui contrôle les fonctions motrices de l'individu. Il s'agit d'un processus complexe impliquant des mécanismes de spécification des neurones moteurs et des signalisations multiples assurant le guidage spécifique de chaque axone jusqu'à sa cible d'innervation. Les Sémaphorines de classe 3 (Sema3) sont des molécules secrétées dans l'environnement qui participent notamment au guidage des axones moteurs de la moelle épinière. De manière surprenante, les motoneurones expriment également eux-mêmes des Sema3. Mon équipe a déjà montré que l'expression intrinsèque de Sema3A par les motoneurones module leur sensibilité au Sema3A de l'environnement. Ce processus s'effectue par une régulation du niveau de son récepteur à la surface du cône de croissance, la structure terminale de l'axone responsable de la perception des signaux de guidage extracellulaires (Moret et al., 2007). Quelle est la portée de ce nouveau mécanisme modulatoire et peut-il être généralisé à d'autres membres de la famille des Sema3 exprimés dans les motoneurones ? Mon travail de thèse a permis de mettre en évidence ce rôle modulatoire d'un autre membre de la famille Sema3 : Sema3C, dons l'expression est restreinte à une sous-population de motoneurones, en plus d'une expression environnementale. Par des expériences de gain et de perte de fonction dans l'embryon de poulet, nous avons montré que l'expression motoneuronale de Sema3C module de manière différentielle ses deux récepteurs du niveau de récepteur entraînent une modulation de réponse à Sema3C mais aussi à Sema3A et Sema3F, qui se fixent respectivement sur Nrp1 et Nrp2. De plus, nous avons étudié la portée de ce mécanisme de modulation dans l'innervation des membres de l'embryon de poulet, ce modèle permettant l'étude des projections motoneuronales dans un environnement riche en Sema3. Ainsi, l'analyse in vivo des embryons de poulet pour lesquels l'expression intrinsèque de Sema3C dans les motoneurones a été manipulée a permis de montrer que la modulation de réponse aux Sema 3 de l'environnement contribue au positionnement stéréotypé des projection motrices dans le membre antérieur. Ce travail permet donc de proposer que l'expression d'un code de Sema 3 par les motoneurones confère aux différentes sous-populations une sensibilité spécifique aux gradients de Sema 3 présents dans l'environnement et assure ainsi une trajectoire stéréotypée des axones moteurs jusque dans leur territoire cible.

Les TNE-GEPs constituent un groupe de tumeurs hétérogènes pour lesquelles il convient d'élargir les approches thérapeutiques. Les thérapies ciblées, particulièrement l'inhibition de la voie mTOR par l'évérolimus, sont la référence pour les TNE-GEPs pancréatiques. Néanmoins, le bénéfice thérapeutique de l'évérolimus n'a pas été évalué dans le sous-groupe des carcinomes neuroendocrines GEPs peu différenciés (pdCNE-GEPs). A travers un modèle préclinique in vivo, nous montrons que l'inhibition de mTOR pourrait constituer une option thérapeutique pour les pdCNEGEPs. Ensuite, une étude protéomique a mis en évidence de nouveaux facteurs impliqués dans la progression de TNE-GEPs. Certaines protéines identifiées présentent un rôle dans la régulation du cytosquelette. Parmi celles-ci, CRMP2 est un acteur clé de la voie de signalisation des sémaphorines de classe 3 (sema3). Un profil d'expression de ces sema3 montre que l'expression de la sema3F est diminuée dans les TNE-GEPs. La ré-expression de ce facteur dans des modèles cellulaires de TNEGEPs montre que la sema3F induit une baisse de la survie et de la prolifération. In vivo, la sema3F permet de ralentir le développement tumoral. Des études complémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre le rôle de la voie de signalisation de la sema3F dans la progression des TNE-GEPs

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.

Le diabète, caractérisé notamment par une atteinte neuro-vasculaire, représente aujourd’hui un réel problème de santé publique. Cependant plus de 30% des patients, ne peuvent bénéficier des traitements actuels (chirurgie et pharmacothérapie) d’où, la nécessité de développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes. L’objectif de ce travail a été de caractériser un modèle murin de neuro-angiopathie diabétique, représentatif de la pathologie humaine puis, d’évaluer les effets des molécules guidance neuronale dans la récupération de la fonction neuro-vasculaire. Dans un premier temps, nous avons mis en place un modèle et des techniques exploratoires de l’étude de la fonction neuro-vasculaire chez les souris diabétiques. Nous avons observé que suite à l’ischémie du membre inférieur, la revascularisation est altérée chez les animaux diabétiques par comparaison aux animaux non-diabétiques. A ce défaut de la fonction vasculaire, s’ajoute également un défaut de la fonction nerveuse. En effet, les paramètres électrophysiologiques, le flux sanguin nerveux, le nombre de capillaires dans le nerf sciatique et la régénération nerveuse sont fortement impactés chez les animaux diabétiques. Afin de palier au défaut de revascularisation et/ou de régénération nerveuse, nous avons proposé que le ciblage thérapeutique des molécules de guidance neuronale, éphrine-B2 et Sémaphorine-3A (Séma-3A) améliorerait la fonction neuro-vasculaire. Après ischémie, les cellules mononuclées du sang périphérique (CM-SP) provenant de patients diabétiques ou de sujets contrôles, traitées préalablement avec l’éphrine-B2/Fc, ont été ensuite injectées aux animaux diabétiques. Une nette amélioration de la revascularisation a été observée dans les groupes d’animaux traités avec l’éphrine-B2/Fc par rapport aux animaux non-traités ou traités avec des CM-SP non stimulées. Enfin, nous avons administré un inhibiteur de Séma-3A, SM-345431 (Vinaxanthone) à des animaux contrôles et diabétiques après ischémie du membre inférieur. Ce qui nous a permis de montrer que cette inhibition améliore significativement la revascularisation et régule notamment la voie de signalisation des MAPK, Erk1/2 et p38 ainsi que, les niveaux de VEGF et de TGF-β1. Dans l’ensemble, l’effet sur la fonction nerveuse périphérique n’a pas montré de différences majeures entre les groupes traités et non-traités. En somme, nos travaux ont permis de montrer que la thérapie cellulaire utilisant les CM-SP stimulées avec l’éphrine-B2/Fc, ou bien l’injection intramusculaire d’un inhibiteur de Séma-3A, à visée pro-angiogénique et/ou pro-neurorégénérative, apparaît comme une stratégie prometteuse et susceptible d’améliorer la qualité de vie des malades atteints de diabète. / Diabetes, characterized by neuro-vascular damages, is a real public health problem. More than 30% of diabetic patients can benefit from existing therapies (surgery and drug therapy), therefore, the need to develop new innovative therapeutic approaches. The objective of this work was to characterize a diabetic neuro-angiopathy mouse model, reproducible of human pathology and to assess the effects of neuronal guidance molecules in recovery of the neuro-vascular function. Firstly, we characterized a model and exploratory techniques to study the neuro-vascular functions in diabetic mice. After hindlimb ischemia induction, we observed that revascularization were impaired in diabetic animals compared to non diabetic animals. This alteration is associated of the nerve function defect. Indeed, the electrophysiological parameters, nerve blood flow, the number of capillaries in sciatic nerve and nerve regeneration are strongly affected in diabetic animals. Then, to rescue the revascularization or nerve regeneration, we proposed that the therapeutic targeting of molecules of neuronal guidance, ephrin-B2 and Semaphorin-3A (Sema-3A) would improve neuro-vascular functions. After ischemia induction, peripheral mononuclear blood mononuclear cells (PBMNC) from diabetic patients or subjects controls, pre-treated with ephrin-B2/Fc, were then injected in diabetic animals. A significant improvement of revascularization was observed in both groups, animals treated with ephrin-B2/Fc compared to untreated animals or treaties with PBMNC unstimulated. Finally, after hindlimb ischemia, we administrated a pharmacological inhibitor of Sema-3A, the SM-345431 (Vinaxanthone) in diabetic and control animals. We showed this selective inhibition significantly improved the post-ischemic revascularization, regulates the MAPK Erk1/2 and p38 signaling pathway, increased the levels of CXCL12, VEGF and TGF-β1. In our experiment conditions, we did not observe the significant effects of SM-345431 on peripheral nerve function between treated and untreated animal groups. Finally, our work showed that cell therapy using PBMNC stimulated with ephrin-B2/Fc, or the intramuscular injection of Sema-3A inhibitor referred to pro-angiogenic and/or pro-neuroregenerative, appears as a strategy promising and likely to improve the quality of life of diabetic patients.