Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d’origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l’oncologie pédiatrique. L’extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d’une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d’autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l’aide d’une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L’expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d’expression différentielle. Ainsi, l’expression de miR‐487b et miR‐410 s’est révélée être un facteur pronostique supérieur à l’algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l’amplification de l’oncogène N‐MYC). Le contexte d’empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d’autres microARN d’intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d’expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d’expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu’aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d’anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l’épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l’expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature – rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l’adulte, des anomalies d’expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) – suggèrent très fortement l’implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine. / Neuroblastoma, an embryonal tumour of neuro‐ectodermal origin, stands up with brain tumours as the most worrying cancer of paediatric oncology. The huge heterogeneity of neuroblastic tumours has led i) to find oncogenic mechanisms, and ii) to refine risk stratification of the disease. In using a tumour cohort of patients as well as human NB lines, we sought for microRNA involved in neuroblastoma tumour progression. Comparison of tumours of low‐risk to those of high‐risk resulted to identifying several microRNA composing the C14MC cluster (located within the 14q32.31 locus), whose expression was associated with prognosis; high risk tumours having a differential lower transcript level.Expression of miR‐487b and miR‐410 was a better prognostic factor than the standard algorithm based on age, stage, and N‐MYC genomic content status. As the C14MC cluster belongs to a imprinted locus, the second cluster of microRNAs so far described in the human genome as imprinted, i.e., the C19MC, was analysed: in high‐risk neuroblastoma, miR‐516a‐5p transcript level was differentially up‐regulated (contrasting to microRNAs from C14MC) and was also associated with prognosis. Combination of transcript levels of miR‐487b and miR‐516a‐5p provides a powerful prognostic factor better than only miR expression from C14MC. Therefore, new risk stratification has been proposed.In neuroblastoma, tumour expression deregulation found to be restricted to C14MC and C19MC as well as the DLK1 et MEG3 harboured by the 14q32.31 locus, should result from methylation anomalies. Epigenetic modulators (5‐AZA and PBA) resulted in a significant increase of miR from C14MC as well as DLK1 and MEG3 genes. With regards to target genes, our results point out N‐MYC, TWIST1 and TWIST2 as direct or indirect targets of miR‐487b & miR‐516a‐5p. Our data and literature – indicating relative underexpression of C14MC microRNAs and hyper‐expression of C19MC microRNAs in aggressive forms of various adult cancers – thus stress the potential involvement of the two clusters in human carcinogenesis.

GNAS est un locus soumis à empreinte parentale. Ce locus produit différents transcrits et protéines en utilisant des promoteurs distincts. Le transcrit bialléique Gsα, les transcrits soumis à empreinte maternelle GNAS-AS1, XLαs et A/B et un transcrit soumis à empreinte paternelle NESP55. L’expression de ces transcrits est contrôlée par des régions différentiellement méthylées (DMRs). Le locus GNAS est impliqué dans plusieurs maladies. La PseudoHypoParathyroïdie (PHP) également appelée inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, pour la description de la nouvelle classification) englobe un groupe de maladies rares, très hétérogène caractérisé par la résistance des organes à l'action de la PTH. Les iPPSD2 sont dues à des mutations perte de fonctions de Gsα, les iPPSD3 à des anomalies de méthylation d’une ou plusieurs DMRs. Les tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses du pancréas (TIPMPs) sont des tumeurs kystiques caractérisées par une prolifération papillaire intracanalaire de l’épithélium des canaux pancréatiques. Les TIPMPs sont des précurseurs de l’adénocarcinome pancréatique comprenant trois degrés de dysplasie selon le phénotype histologique, légère, moyenne et haut grade.L’objectif de mon travail était d’étudier l’implication des transcrits non codants et des GNAS-miRNAs à l’aide de deux modèles pathologiques les iPPSD2 et 3 et les TIPMPs.Projet TIPMP :Nous avons identifié que la perte d’empreinte du locus GNAS est un événement fréquent dans les TIPMPs et semble associée à des marques d’activation de la transcription du locus. De plus, d’autres gènes soumis à l’empreinte parentale, comme MEG3 et DIRAS3, présentent également des modifications de leurs marques épigénétiques.Projet iPPSD2 et 3 :Résultat 1 : Croissance longitudinale, taille finale et IMC des patients iPPSD2 et 3. Les patients iPPSD2 naissent hypotrophiques, ont une petite taille finale et développe un surpoids. Les patients iPPSD3 naissent macrosomiques mais atteignent une taille finale normale et un IMC moyen normal. Mes résultats suggèrent un rôle majeur de Gsα et de Xlαs dans la croissance fœtale, postnatale, pubertaire et l’accumulation de la masse grasse.Résultat 2 : Cibles des GNAS-miRNAs et phénotype des patients iPPSD3. Mes données d’expression des GNAS-miRNAs dans les lymphocytes et les fibroblastes de patients matUPD20/patUPD20 montrent qu’ils sont soumis à l’empreinte parentale. In silico, les cibles de ces miRNAs sont classées en 3 groupes : signalisation de l’AMPc, signalisation du calcium et croissance. La transfection dans les cellules HEK des GNAS-miRNAs m’a permis de confirmer certaines cibles moléculaires comme la cible du miR-296-3p, PRKAG1 et la cible des miRs 296-5p et 296-3p, GNB2 tous les deux impliqués dans la voie de l’AMPc.Résultat 3 : étude d’une nouvelle DMR : GNAS-AS2. Cette DMR récemment identifiée présente une perte de méthylation chez la plupart des patients iPPSD3 comparés aux contrôles. Nous avons identifié pour la première fois, un sous-groupe de patients iPPSD3 qui présente une perte de méthylation de la DMR GNAS-AS1:TSS-DMR, mais pas de GNAS-AS2. Ces patients ont un profil de iPPSD3 autosomique dominant, sans délétion du centre d’empreinte STX16. Mes résultats montrent : 1-absence de délétion ou remaniement génomique en whole genome sequencing dans une famille atteinte, 2-la DMR GNAS-AS2 possède deux sous domaines distincts et 3-la transmission de cette anomalie est maternelle.Les transcrits de GNAS jouent un rôle important dans des phénomènes fondamentaux comme la croissance ante et post natale, la tumorigenèse, la signalisation endocrine AMPc dépendante et l’acquisition de la masse grasse. Afin de mieux comprendre les pathologies de l’empreinte il est important d’identifier des biomarqueurs comme les miRNAs et de les corréler aux phénotypes des patients iPPSD. / GNAS is a locus subjected to parental imprinting. This locus produces different transcripts and proteins using distinct promoters: the Gsα biallelic transcript, the maternally imprinted transcripts GNAS-AS1, XLαs and A/B and a paternal imprinted transcript NESP55. The expression of these transcripts is controlled by differentially methylated regions (DMRs). The GNAS locus is involved in several diseases. PseudoHypoParathyroidism (PHP) also called inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, for the description of the new classification) encompasses a group of heterogeneous rare diseases, characterized by the resistance of organs to the action of PTH. IPPSD2 are due to Gsα loss of function mutations, iPPSD3 to methylation abnormalities at one or several GNAS DMRs. Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm (IPMN) are cystic tumors characterized by Intraductal papillary proliferation of the pancreatic duct epithelium. IPMNs are precursors of pancreatic adenocarcinoma comprising three degrees of dysplasia according to the histological phenotype, low, medium and high grade.The aim of my work was to study the implication of non-coding transcripts and GNAS-miRNAs using two pathological models, iPPSD2 and 3 and IPMN.IPMN project:We have identified that loss of imprinting at the GNAS locus is a common trait in IPMN and appears to be associated with transcriptional activation events of the GNAS transcripts. In addition, other genes subjected to parental imprinting, such as MEG3 and DIRAS3, also show changes in their epigenetic marks.Project iPPSD2 and 3:Result 1: Longitudinal growth, final height and BMI of iPPSD2 and 3 patients. iPPSD2 patients are born hypotrophic, display a final short stature and are overweight. IPPSD3 patients are born macrosomic but reach a normal final height and normal mean BMI. My results suggest a major role of Gsα and Xlαs in fetal, postnatal, pubertal growth and fat mass accumulation.Result 2: Targets of GNAS-miRNAs and phenotype of iPPSD3 patients. Expression of GNAS-miRNAs in lymphocytes and fibroblasts of matUPD20/patUPD20 patients suggested that GNAS-miRNAs are subjected to parental imprinting. In silico, the targets of these miRNAs are classified in 3 groups: cAMP signaling, calcium signaling and growth. Transfection of the GNAS-miRNAs into HEK cells confirmed certain molecular targets such as the miR-296-3p target, PRKAG1 and the miRs 296-5p and 296 -3p target, GNB2, both transcripts being involved in cAMP pathway.Result 3: characterization of a new DMR: GNAS-AS2. GNAS-AS2 is a recent characterized DMR with loss of methylation in most iPPSD3 patients compared to controls. We have identified for the first time a subset of iPPSD3 patients with loss of methylation at the GNAS-AS1:TSS-DMR but not at the GNAS-AS2 DMR. These patients have an autosomal dominant form of iPPSD3, without deletion of the STX16 imprinting control element. My results show: 1- lack of deletion or genomic rearrangement through whole genome sequencing in an affected family, 2- GNAS-AS2 DMR has two distinct subdomains and 3- this anomaly is maternally inherited.GNAS transcripts play an important role in fundamental biological processes such as ante and postnatal growth, tumorigenesis, endocrine cAMP dependent signaling pathways and fat mass acquisition. It is important to identify new biomarkers such as miRNAs and correlate them with phenotypical factors of iPPSD patients.

GNAS est un locus complexe soumis à l'empreinte parentale. Il code pour cinq transcrits alternatifs dont l’expression est régulée de manière parentale, tissulaire et développementale : la sous-Unité alpha stimulatrice de la protéine G hétérotrimérique (Gαs), XLαs, NESP55, et deux ARNnc, A/B et GNAS-AS1. Gαs est une protéine clé dans la transduction hormonale partageant avec XLαs la capacité de produire l'AMPc intracellulaire après stimulation des récepteurs couplés à Gαs.Dans la première partie de ma thèse, je me suis concentrée sur l'étude du rôle des transcrits de GNAS, en particulier XLαs, dans la croissance fœtale et post-Natale. J’ai profité du modèle unique des pseudohypoparathyroïdies (PHPs), pathologies humaines rare de l’empreinte, causées par des anomalies génétiques ou épigénétiques du locus GNAS altérant le dosage génique des transcrits de GNAS. La croissance anormale est une caractéristique majeure des PHPs.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié le profil épigénétique du locus GNAS (méthylation de l'ADN et expression des transcrits) dans les cellules souches humaines embryonnaires -HESCs-, dans les cellules pluripotentes induites dérivées à partir de fibroblastes de sujets sains -IPSCs- et dans les cellules redifférenciées en cellules souches neurales et mésenchymateuses. La caractérisation précise du locus humain GNAS en physiologie (cellules souches) et pathologie (PHP) est essentielle pour une meilleure compréhension des processus développementaux importants comme la croissance. L'exploration du phénotype "croissance" de différents types de PHPs a permis de mieux comprendre le rôle des transcrits du locus GNAS dans la physiologie et la physiopathologie. L'analyse de cellules des PHPs a permis de mieux caractériser l’impact des anomalies moléculaires du locus GNAS en pathologie humaine. Les hiPSCs peuvent être un outil utile pour étudier les modifications épigénétiques au niveau du locus GNAS. / GNAS is a complex locus subjected to parental imprinting encoding five parental-, tissue- and developmental-Manner regulated transcripts : the alpha stimulatory subunit of the G protein (Gαs), XLαs, NESP55, and two ncRNAs, A/B and the antisens GNAS-AS1. Gαs is a key protein in hormonal signaling sharing with XLαs the ability to produce intracellular cAMP upon stimulation of Gαs-Coupled receptors. In the first part of my thesis, I focused on studying the role of the GNAS transcripts, particularly XLαs, in fetal and postnatal growth. I took advantage of the unique model of pseudohypoparathyroidism (PHP), a rare human disease, caused by genetic or epigenetic abnormalities at the GNAS locus leading to various combinations of GNAS transcripts alterations. Abnormal growth appears to be a major feature of PHP. In the second part of my thesis, I studied the epigenetic pattern of GNAS (DNA methylation and transcripts expression) in human embryonic stem cells -HESCs-, in induced pluripotent stem cells -IPSCs- derived from fibroblasts from healthy individuals, and in cells re-Differentiated from these stem cells in neuronal and mesenchymal cells. The precise characterization of the human GNAS locus in physiology (stem cells) and pathology (PHP) is critical for a better understanding of major processes like growth. Through exploration of the "growth" phenotype of different groups of PHPs we have participated to the better understanding of the role of the GNAS transcripts in the physiology and pathophysiology. Human iPSCs may be an useful tool to study epigenetic modifications at the GNAS locus.