Les miARNs, de courts ARNs non codant de 19 à 22 nucleotides, responsablent de la répression traductionnelle, d'approximativement 30 % des ARNm codant. Ils agissent par appariement de base sur des régions situées en 3'UTR des ARNm ciblés. Pour ce faire, les protéines argonautes s'associent aux miARNs et forment le complexe effecteur miRISC (microRNA-Induced Silencing Complex). Les mécanismes d'action de ce complexe ne sont pas bien compris et certains autres facteurs inconnus pourraient avoir un rôle important. Nous avons identifié, par criblage double hybride, plusieurs interacteurs de la protéine ALG-1, une argonaute impliquée dans la voie des miARNs chez C. elegans. Nous avons aussi mis en évidence un groupe de proteases homologues aux cathepsines humaines. Pour évaluer l'implication des cathepsines dans la voie des miARNs, nous avons utilisé un essai luciférase nous permettant d'apprécier l'effet de l'inhibition de ces proteases sur la traduction d'un ARNm réprimé par un miARN.

Les plaquettes jouent un rôle majeur dans le maintien de l’hémostase, ainsi que dans les phénomènes de thrombose et d’occlusion vasculaire. Elles ne contiennent pas d’ADN génomique, mais recèlent néanmoins un transcriptome complexe. Bien que les ARN messagers (ARNm) plaquettaires peuvent être traduits de novo, notamment en réponse aux stimuli physiologiques, les mécanismes contrôlant cette synthèse demeurent obscurs. Notre équipe a démontré que les plaquettes humaines contiennent une quantité abondante et diversifiée de microARN, suggérant leur implication dans le contrôle de la traduction des ARNm plaquettaires. Suite à une stimulation, les plaquettes libèrent des microparticules (MP), qui permettent de véhiculer des signaux biologiques, dont du matériel génétique, à des cellules réceptrices. L’implication des microARN plaquettaires dans la communication intercellulaire via les MP reste à être approfondie. Mes travaux de doctorat, portant sur l'étude des complexes ribonucléoprotéiques au sein des plaquettes, ont montré l’implication des microARN et de la protéine T-cell-restricted intracellular antigen-1 (TIA-1) dans la reconnaissance et la régulation des ARNm plaquettaires, apportant ainsi de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation de la synthèse protéique de novo suite à l’activation des plaquettes. De plus, l’étude de la communication intercellulaire entre les plaquettes et les macrophages a permis de montrer que les MP plaquettaires (i) livrent des microARN aptes à réguler l’expression d’ARNm endogènes chez les cellules réceptrices, et (ii) reprogramment les fonctions primaires des macrophages, laissant entrevoir de nombreuses implications physiologiques. Les résultats de ma thèse suggèrent que les microARN plaquettaires contribuent au maintien de l’hémostase, en participant à la régulation de la synthèse protéique des plaquettes et en modulant l’expression génique des cellules environnantes. L’étude de la fonction des microARN plaquettaires a permis de mettre en relief la complexité de la régulation de l’hémostase et du système circulatoire. / Platelets play an important role in hemostasis, as well as in thrombosis and coagulation processes. Lacking genomic DNA, they nevertheless harbor a complex transcriptome. Although platelet messenger RNAs (mRNAs) can be used for de novo protein synthesis, especially in response to physiological stimuli, mechanisms controlling this synthesis remain unclear. Our team demonstrated that human platelets contain an abundant and diverse array of microRNAs, suggesting their involvement in the control of platelet mRNA translation. Following stimulation, platelets release microparticles (MPs) that convey biological signals and genetic material to recipient cells. The involvement of platelet microRNAs in the intercellular communication via MPs remained incompletely understood. The study of microRNA-containing ribonucleoprotein complexes inside platelets revealed the involvement of microRNAs and of the protein T-cell-restricted intracellular antigen-1 (TIA-1) in the recognition and regulation of platelets mRNAs, thereby improving our understanding of the molecular mechanisms regulating de novo protein synthesis upon platelet activation. Moreover, the study of intercellular communication between platelets and macrophages demonstrated that platelet MPs could (i) deliver functional microRNAs capable to regulate endogenous mRNA expression in recipient cells, and (ii) reprogram primary functions of macrophages, suggesting numerous physiological effects. My thesis results suggest that platelet microRNAs contribute to maintain the hemostatic balance, in regulating the synthesis of essential proteins and by modulating gene expression of surrounding cells. The study of platelet microRNA functions underscores the complexity of the regulatory processes of hemostasis and of the circulatory system.

Les microARN sont de courtes molécules d’ARN qui jouent un rôle important dans la régulation posttranscriptionnelle des gènes. Ces molécules ont d’abord été découvertes chez le nématode Caenorhabditis elegans mais sont maintenant reconnues comme des régulateurs importants de l’expression génique chez plusieurs animaux et plantes. Pour accomplir cette fonction, les microARN doivent s’associer à un complexe protéique nommé le miRISC (microRNA-induced silencing complex) qui est composé principalement d’une protéine Argonaute et des protéines GW182. Les microARN sont liés directement par les protéines Argonautes et peuvent ainsi guider celles-ci à la région 3’ nontraduite d’un ARNm cible par complémentarité de base. Le miRISC peut ensuite induire différents mécanismes de répression allant de la répression traductionnelle à la dégradation de la cible. À ce jour, les mécanismes qui modulent l’activité du miRISC ainsi que les interacteurs de ce complexe sont peu caractérisés. L’objectif principal de mon doctorat était donc d’étudier les processus qui régulent l’activité du complexe effecteur des miARN, le miRISC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’importance de composantes connues du miRISC, soit les protéines GW182. Pour ce faire, nous avons aboli l’interaction entre les protéines Argonautes et GW182 et nous avons étudié l’effet de cette perte d’interaction sur la fonction du miRISC au cours du développement de C. elegans. Nous avons ainsi démontré que l’association de GW182 au miRISC n’était pas nécessaire pour le développement embryonnaire de l’animal. Nous avons par la suite confirmé que certaines cibles de microARN embryonnaires n’étaient pas affectées par l’absence de GW182. Nous avons ainsi conclu que le miRISC pouvait exister et fonctionner sous différentes formes et que les protéines GW182 étaient dispensables à l’activité du miRISC dans certains contextes. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d’identifier de nouveaux facteurs qui contribuent à l’activité du miRISC en réalisant un criblage génétique. Nous avons ainsi identifié la RabGAP tbc-11 comme un nouvel acteur contribuant à la fonction des microARN. Nous avons démontré que tbc-11 agit sur la petite GTPase rab-6 et que la régulation de celle-ci est importante pour assurer la localisation intracellulaire adéquate de la protéine Argonaute ALG-1. Nos résultats ont permis de démontrer qu’une localisation inadéquate de la protéine ALG-1 engendre un défaut dans la répression de cibles de iii microARN. Nous avons ainsi pu conclure que le transport vésiculaire joue un rôle important dans la fonction des microARN. Les travaux réalisés au cours de mon doctorat ont permis de démontrer que la localisation et la composition du miRISC contribuent à la modulation de sa fonction. Ces résultats ont pu approfondir nos connaissances sur les mécanismes utilisés par la cellule pour moduler l’activité des microARN, et ouvrent ainsi la voie à d’autres recherches pouvant étudier les fonctions des microARN dans divers contextes. / MicroRNAs are small RNA molecules that play an important role in post-transcriptional gene silencing. These molecules were first discovered in the nematode Caenorhabditis elegans but are now known as important regulators of gene expression in most animals and plants. To accomplish this function, microRNAs interact with a protein complex called the miRISC (microRNA-induced silencing complex) which is formed by an Argonaute protein and GW182 proteins. MicroRNAs interact directly with Argonaute and can guide them to the 3’ UTR region of a target mRNA by base pairing. The miRISC will then induce several repression mechanisms, ranging from translational repression to target decay. To this day, the mechanisms that modulate miRISC activity as well as the proteins that interact with the complex are poorly characterized. The main objective of my PhD was therefore to study the processes that regulate the activity of the effector complex of microRNAs, the miRISC. First, we evaluated the importance of a known component of the miRISC; the GW182 proteins. To accomplish this, we abolished the interaction between Argonaute and GW182 proteins and we studied the effect of this loss of interaction on miRISC function during C. elegans development. We have shown that the association of GW182 to the miRISC is dispensable for the animal’s embryonic development. We then confirmed that certain embryonic microRNA targets were not affected by the loss of GW182. These results allowed us to conclude that the miRISC can exist and function under different forms and that GW182 proteins are dispensable for the miRISC activity under certain conditions. Second, we wanted to identify new factors that contribute to miRISC silencing by performing a forward genetic screen. This allowed us to identify the RabGAP tbc-11 as a new factor contributing to microRNA function. We have shown that tbc-11 acts on the small GTPase rab-6 and that its regulation is important for proper intracellular localization of the Argonaute ALG-1. Our results have shown that an improper localization of ALG-1 leads to defects in microRNA target repression. We have therefore concluded that vesicular transport plays an important role in microRNA function. Our results have shown that the localization and composition of the miRISC contributes to the modulation of its activity. This study has deepened our knowledge on the mechanisms that modulate microRNA activity and opens the door for other research on microRNA function in different contexts.

La dermite atopique, une maladie inflammatoire de la peau, est connue pour son implication dans la sensibilisation aux allergènes via la barrière cutanée endommagée. Cette sensibilisation est associée au développement de certaines maladies allergiques, dont la rhinite allergique et l'asthme allergique. La cascade inflammatoire caractéristique de ces maladies inclut le recrutement de cellules pro-inflammatoires dont les éosinophiles qui sont alors augmentés et activés dans le sang. Jusqu'ici, très peu d'études ont analysé le transcriptome de ce type cellulaire et encore moins d'études se sont concentrées sur le profil différentiel des microARN (miARN) qui pourrait réguler la transcription et donc avoir un impact sur le niveau de certaines protéines et subséquemment sur la pathogénèse et la symptomatologie des maladies allergiques. Le but de cette étude était de mesurer les niveaux différentiels de miARN primaires (pri-miARN) dans les éosinophiles isolés de prélèvements sanguins d'individus atteints de maladies allergiques (dermite atopique, d'atopie, de rhinite allergique et d'asthme) et d'individus témoins (sans maladies allergiques). Les comptes différentiels ont également été évalués pour une série d'autres phénotypes liés aux maladies allergiques incluant des données de la fonction respiratoire et des données immunologiques. Dix-huit pri-miARN ont été identifiés comme différemment exprimés dans les éosinophiles d'individus atteints comparativement aux témoins. Ces 18 pri-miARN ont ensuite été groupés à l'aide de l'algorithme de Ward afin de les associer à un phénotype. Les groupes constitués ont été expliqués par le diagnostic d'asthme, l'historique familial de maladies respiratoires, l'historique familial de rhinite allergique et le compte cellulaire des neutrophiles sanguins. Cette étude a donc permis d'identifier 18 pri-=miARN primaires associés aux maladies allergiques ce qui contribue à documenter une part des mécanismes épigénétiques qui sous-tendent ces maladies. / The atopic dermatitis, an inflammatory disease affecting skin, is known to play an important role in allergen sensitization via the damaged skin barrier. This sensitization can lead to allergic diseases such as allergic rhinitis and allergic asthma. The inflammatory reactions leading to these diseases recruit a number of pro-inflammatory cells, including eosinophils, a cell type known for contributing to the damaging of epithelial cells. Few studies have focused on the impacts of the transcriptome on this cell type, and even fewer on the differential microRNA (miRNA) profiles that could regulate clinical manifestations and pathogenesis of diseases of the atopic march. Actually, the effect of miRNAs on these diseases is not entirely understood, but they could influence inflammatory pattens in these diseases and the proliferation of epithelial cells, thereby regulating these diseases in a post-transcriptional matter. The aim of this study was to find differential counts for primary miRNAS (pri-miRNAs) in eosinophil cells sampled isolated from blood of individuals affected with allergic diseases in order to better understand epigenetic mechanisms of these diseases. In order to do so, RNAs from individuals affected with atopic dermatitis, allergic rhinitis and asthma, as well as from non-affected individuals, were sequenced to evaluate differential pri-miRNA counts. These counts were also evaluated for respiratory function measures and immunology. 18 miRNAs from eosinophils were identified as differentially expresses between afflicted individuals and controls. These 18 miRNAs were then clustered using Ward's algorithm in order to find a phenotypic explanation to these miRNAs. Clusters were found to be explained by asthma diagnostic, familial history of respiratory diseases, familial history of allergic rhinitis and neutrophil cell count. These 18 miRNAs therefore allow to better understand epigenetic mechanisms underlying allergic diseases.

Présents chez tous les métazoaires, les microARNs jouent un rôle critique dans la régulation de gènes impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ces courtes molécules d'ARN altèrent la production protéique en liant spécifiquement les régions non codantes des ARNm. Les microARNs sont transcrits par l'ARN polymérase II (Pol II) sous forme d'un long transcrit primaire et vont passer par deux étapes de clivage successives pour former le microARN mature. Le microARN mature est pris en charge par une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur de la voie, le miRISC. Chacune des étapes de la biogenèse des microARNs peut être régulée pour modifier la production globale ou spécifique des microARNs. Des études récentes ont démontré que la maturation et la stabilité des microARNs sont des facteurs importants pour conserver l'homéostasie cellulaire. De nombreuses évidences supportent qu'une altération du niveau cellulaire de ces petites molécules régulatrices contribue au développement et au maintien de diverses maladies, dont le cancer. À ce jour, il existe peu de connaissance sur le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARNs non codants. Les deux Argonautes, alg-1 et alg-2 impliqués dans la voie des microARNs chez le nématode C. elegans sont synthétiques létaux. Un criblage génétique chez C. elegans visant à identifier de nouveaux gènes synthétiques létaux avec alg-2, a permis d'identifier la protéine DCS-1 comme étant impliqué dans la voie des microARNs. Chez C. elegans, la perte de dcs-1 affecte le niveau de plusieurs microARNs, affectant l'expression génique chez ces animaux. Des analyses biochimiques supportent que DCS-1 affecte l'activité d'une enzyme responsable de la dégradation des microARNs chez le nématode, et ce, de façon indépendante de son activité de dégradation de la coiffe des ARNm. De plus, dans l'optique d'identifier les membres du complexe de dégradation, une analyse par spectrométrie de masse a permis d'identifier plusieurs candidats potentiels. Une analyse préliminaire de l'un de ces candidats a permis de démontrer que sa perte de fonction entraîne l'apparition de phénotype associé à une diminution de l'activité de la voie des microARNs et affecte le niveau de certains microARNs. Cette protéine, PPM-2, est une phosphatase et pourrait affecter le statut de phosphorylation d'une protéine importante pour la stabilité ou la dégradation des microARNs. En conclusion, DCS-1 fait partie d'un complexe de dégradation des microARNs avec la protéine XRN-1. L'identification de ce nouveau complexe de dégradation permet de mieux comprendre les mécanismes responsables du contrôle de ces ARNs. Une meilleure connaissance des mécanismes régulant la production et la stabilité des microARNs pourrait mener au développement de nouvelles avenues thérapeutiques. / In all metazoans, microRNAs play a critical role in the regulation of genes implicated in cell proliferation and differentiation. These small non-coding RNAs form a silencing complex called miRISC and alter protein synthesis upon binding mRNA untranslated regions (UTRs). miRNAs are transcribed by RNA Pol II as a long transcript call the pri-miRNA. The pri-miRNA will go through two steps of cleavage to form the mature miRNA. This mature miRNA is then loaded onto an Argonaute protein to form the effector complex; the miRISC. Each step of miRNA biogenesis is tightly regulated. Recently, miRNA production and stability have been shown to be an important step in this pathway. Several proteins, such as p53, can modulate microRNA biogenesis and many other proteins are implicated in miRNA stabilization and degradation. A tight control of these regulatory RNA is essential since miRNA misregulation is associated with several diseases. Here we identified the ortholog of human decapping enzyme DcpS (DCS-1) as an important regulator of miRNA level in C. elegans by forming a degradation complex with XRN-1, idependantly of its catalytic activity. In C. elegans, the loss of dcs-1 affects the level of several microRNAs leading to a misregulation of their mRNA targets. Biochemical analysis, support that DCS-1 contributes to degradation of unbound microRNA, which is dependent on the 5' to 3' exonuclease XRN-1. In order to better understand the regulation of miRNAs, we sought to identify other members of this complex. An initial study of proteins identified by mass spectrometry revealed that the loss of ppm-2 induces several developmental defects associated with the loss of miRNAs. As PPM-2 is a phosphatase, our results suggest that it could affect the stability of the degradation complex by targeting one of its components or the miRNA loading on the Argonaute protein. In conclusion, our data support that DCS-1 is part of a degradation complex. Importantly, this study identified the first modulators of microRNA degradation in animals and proteins forming this complex are conserved in human suggesting that they could also be implicated in microRNA degradation in higher organisms. Since microRNA are misregulated in many human diseases, identification of factors modulating their stability could lead to new therapeutic approaches.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les microARNs sont des petites molécules d'ARN non-codant conservées à travers les espèces qui régulent négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionel. Ils figurent parmi les acteurs majeurs du maintien de l'homéostasie cellulaire et leur dérégulation est à l'origine de nombreuses pathologies humaines. Leur biogenèse consiste en deux étapes de maturation successives effectuées par les enzymes Drosha et Dicer, pour générer une molécule effectrice d'ARN d'une longueur de 21-23 nucleotides. La courte molécule produite s'assemble avec une protéine de la famille Argonaute pour former un complexe ribonucléoprotéique capable de cibler spécifiquement un ARNm et d'éteindre son expression. Pour mieux comprendre comment les microARNs régulent l'expression génique, l'objectif principal de mon doctorat a été d'étudier le rôle de la protéine Argonaute ALG-1, en utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal. Nous avons dans un premier temps recherché quelles caractéristiques moléculaires étaient importantes pour déterminer la sélection spécifique des protéines Argonautes essentielles à la voie des microARNs parmi les nombreuses Argonautes retrouvées chez le nematode C. elegans. Par une approche génétique, nous avons découvert que la sélection des protéines Argonautes est affectée à la fois par la structure du duplex d'ARN double brins et par les caractéristiques spécifiques de chacune d'elles. Pour étudier plus précisément la fonction de la protéine Argonaute ALG-1, nous avons entrepris un criblage double-hybride pour identifier de nouveaux partenaires protéiques. Parmi eux, nous avons identifié puis prouvé l'importance de la protéine ribosomale RACK1 dans la voie de régulation des microARNs chez le nematode et l'humain. Nous avons démontré que la perte de fonction de RACK1 affecte l'association des microARNs et des protéines Argonaute avec les ribosomes actifs suggérant une contribution de cette protéine dans le recrutement de ces complexes aux sites actifs de traduction. Finalement, nous avons développé une approche génétique systématique permettant d'adresser génétiquement l'implication des partenaires d'ALG-1 dans la voie des microARNs. Collectivement, mes travaux de doctorat nous ont permis de contribuer à l'élargissement des connaissances associées à cette mécanistique complexe de régulation des gènes par les microARNs chez l'animal.

Notre travail s’inscrit dans un projet de recherche dont l’objectif global est de mieux caractériser les modifications moléculaires impliquées dans les cancers thyroïdiens et de déterminer des signatures diagnostiques et pronostiques mais également des cibles moléculaires potentielles pour améliorer leur traitement. Le cancer papillaire thyroïdien (PTC) est le plus fréquent des cancers endocriniens, avec une incidence qui augmente en continu depuis des décennies. Il est de bon pronostic mais peut présenter des récidives et des métastases distantes et lymphatiques qui diminuent les chances de survie des patients. Les nodules thyroïdiens sont fréquents mais seulement 5% sont cancéreux. Cependant, jusqu’à 30% des ponctions de nodules thyroïdiens ne donnent pas de certitude sur le diagnostic. Cela conduit à des opérations qui se révèlent à postériori inutiles chez un nombre conséquent de patients. Les microARNs sont une famille de petits ARNs simple brin (18 à 24 nucléotides) très conservés dans l’évolution et qui régulent de façon négative l’expression génique.Ils agissent de façon post-transcriptionnelle en empêchant la traduction d’ARNm cibles et/ou en provoquant leur dégradation. Cette famille d’ARNs joue un rôle dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques dont la tumorigenèse. Les microARNs ont montré leur implication dans la tumorigenèse thyroïdienne et leur potentielle utilité dans des signatures diagnostiques des cancers thyroïdiens. Néanmoins, aucune étude n’avait encore analysé le transcriptome global des microARNs dans les PTC et leurs métastases ganglionnaires lymphatiques. Dans un premier temps, nous avons montré que la sous-expression de microARNs dans les PTC et dans leurs métastases ganglionnaires lymphatiques est un phénomène tout aussi présent que la surexpression de microARNs qui était déjà connue. De plus, ces microARNs sous-exprimés montrent une expression différentielle entre des tumeurs de sous-types histopathologiques différents et ils montrent une diminution accrue de leur expression dans les tumeurs décrites comme agressives, ce qui semble principalement associé au taux de mutation BRAF V600E, qui est plus élevé dans les tumeurs agressives. Ensuite, nous avons caractérisé in vitro la fonction cellulaire de 3 microARNs très conservés dans l’évolution des espèces, fortement sous-exprimés dans les PTC par rapport aux tissus normaux adjacents mais également sous-exprimés dans les métastases ganglionnaires par rapport aux tumeurs primaires de PTC :miR-7-5p, miR-204-5p et miR-204-3p. Nous avons montré que ces microARNs ont un rôle de suppresseur de tumeur dans les thyrocytes. Le miR-7-5p inhibe la prolifération cellulaire, le miR-204-5p inhibe l’invasion et la migration cellulaires et le miR-204-3p inhibe l’invasion dans des lignées cellulaires thyroïdiennes humaines (TPC-1 et HTori). Le croisement de nos données avec celles de la littérature nous a montré que la diminution de l’expression de nos microARNs d’intérêt semble s’exercer principalement via une réduction de leur transcription suite à des délétions génomiques ou via l’action répressive de facteurs de transcription. Nos données indiquent que ces microARNs pourraient être utilisés comme agents thérapeutiques pour le traitement des PTC. Enfin, nous avons montré que les microARNs sous-exprimés dans les PTC sont d’aussi bons, voire de meilleurs marqueurs moléculaires diagnostiques que les microARNs surexprimés dans ces mêmes tumeurs. En analysant, dans des ponctions nodulaires, l’expression de 5 microARNs surexprimés et 9 microARNs sous-exprimés dans les PTC par rapport aux tissus normaux,nous avons déterminé 2 listes de microARNs qui maximalisent l’efficacité d’une prédiction du statut histopathologique (bénin ou malin) du nodule. Nos données suggèrent que le niveau d’expression du miR-7-5p combiné à ceux d’autres microARNs sur et sous-exprimés pourraient être utilisés dans un futur test diagnostique des nodules malins. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le syndrome de détresse respiratoire du nouveau-né (SDR) est l’une des pathologies les plus fréquentes dont souffrent les bébés prématurés. Le SDR est causé par un déficit dans la synthèse du surfactant pulmonaire en raison de l’immaturité du poumon lors d’une naissance prématurée. Plusieurs éléments régulent le développement pulmonaire notamment les stéroïdes sexuels et les corticostéroïdes. Le sexe est aussi un élément régulateur du développement pulmonaire. En effet, les garçons sont plus atteints que les filles par le SDR. Ce dimorphisme sexuel est attribué aux androgènes. Le traitement anténatal aux glucocorticoïdes est prescrit aux femmes qui sont à risque d’accoucher prématurément. En effet, les corticostéroïdes favorisent la maturation pulmonaire anténatale. Également, il a été démontré que les microARNs sont primordiaux pour le développement pulmonaire. Ceci nous a conduit à étudier l’impact des androgènes sur le profil d’expression des microARNs lors de la transition du stade canaliculaire au stade sacculaire (jour gestationnel (JG)17.0 au JG18.0), période qui coïncide avec la montée de la synthèse et de la sécrétion du surfactant chez la souris. Tout d’abord, nous avons étudié la stabilité des gènes de normalisation (snoRNAs) afin de quantifier les microARNs par qPCR. Cette analyse a été effectuée avec 3 logiciels différents et sur plusieurs stades du développement notamment de la période pseudoglandulaire jusqu’au stade alvéolaire chez les deux sexes. On a identifié les meilleures combinaisons de gènes de normalisation les plus stables pour chaque stade du développement étudié ainsi que pour la période couvrant tous les stades étudiés. Ensuite nous avons analysé à GD17.0 et GD18.0 le profil d’expression des microARNs chez des fœtus mâles dont les mères ont été traitées au flutamide (anti-androgènes pure). Les résultats ont montré que 43 microARNs matures sont modulés par les androgènes à GD17.0 et 35 microARNs à GD18.0. Pour certains microARNs, nous avons identifié des cibles potentielles qui sont inversement modulées par les androgènes par rapport aux microARNs. Ces cibles sont impliquées dans plusieurs processus biologiques tels que le métabolisme des lipides et la prolifération cellulaire ainsi que dans des fonctions moléculaires tels que la liaison des facteurs de transcription. Des expériences de validation ont été effectuées par qPCR. Nos résultats ont montré que les androgènes régulent des processus qui peuvent être impliqués dans la maturation pulmonaire via la régulation des microARNs. En plus de l’intérêt porté aux androgènes dans la maturation pulmonaire, nous avons analysé l’expression d’enzymes de synthèse des corticostéroïdes dans le poumon fœtal humain. L’expression de l’enzyme 21-hydroxylase a été étudiée par qPCR et par immunobuvardage. Également la localisation de l’ARNm de cette enzyme clé de la synthèse des glucocorticoïdes, a été effectuée par hybridation in situ. L’ARNm de CYP21A2 a été détecté par qPCR dans les 34 échantillons analysés et dont les âges variaient entre 17 et 40 semaines de grossesse. Aucune corrélation, avec l’âge gestationnel ou le sexe, n’a été observée. Des niveaux significatifs de la protéine 21-hydroxylase ont été détectés dans nos échantillons. Nous avons investigué l’expression d’autres enzymes impliquées dans la voie de synthèse des glucocorticoïdes notamment CYP11B1, CYP11B2 et CYP17A1. Les ARNm des gènes CYP11B1, CYP11B2 n’ont pas été détectés dans nos échantillons, contrairement à CYP17A1 dont l’ARNm a été détecté dans tous nos tissus fœtaux analysés. La protéine de la 17α-hydroxylase a été détectée à de faibles niveaux. Nos résultats d’hybridation in situ ont montré que l’expression de CYP21A2 est localisée presqu’exclusivement dans l’épithélium pulmonaire distal. Nos résultats suggèrent que les produits de la 21-hydroxylase agiront via une action intracrine sur l’épithélium distal en activant le récepteur des glucocorticoïdes (GR). L’activation du récepteur des minéralocorticoïdes (MR) ne semble pas dépendre de produits de la 21-hydroxylase en raison des quantités importantes d’aldostérone circulante. / Respiratory distress syndrome of the newborn (RDS) is one of the most common diseases affecting preterm babies. RDS is caused by a deficiency in the synthesis and secretion of pulmonary surfactant as a result of lung immaturity caused by a premature birth. Several elements and factors regulate lung development including sex steroids and corticosteroids and the sex of the infant. In fact, boys are more affected than girls by RDS. This sexual dimorphism is attributed to the presence of androgens in male lungs. In contrast, corticosteroids are given to mother at higher risk to deliver prematurely to promote antenatal lung maturation of the fetuses. As other factors, it has been shown that microRNAs are essential to lung development. This led us to study the impact of androgen on the expression profile of microRNAs in the transition period between canalicular and saccular stages (gestational day (GD)17.0 and GD18.0). This period overlap the surge of surfactant synthesis in the mouse. First, we studied the stability of normalization genes (snoRNAs) to quantify microRNAs by qPCR. This analysis was performed by 3 methods of calculation at several stages of lung development from the pseudoglandular to the alveolar stages and this for both sexes. We identified the best combinations of the most stable normalization genes for each individual developmental stage studied as well as for the period covering all the studied stages. Then, we analyzed the expression profile of microRNAs on GD17.0 and GD18.0 in male fetuses whose mothers were treated with flutamide (pure anti-androgen). The results showed that 43 mature microRNAs are modulated by endogenous androgens on GD17.0 whereas 35 microRNAs on GD18.0. We have identified some microRNAs and potential targets that are inversely modulated by androgens compared with microRNAs. These targets are involved in several biological processes such as lipid metabolism and cell proliferation as well as in molecular functions such as transcription factor binding. Validation experiments were performed by qPCR. Our results showed that androgens regulate processes that may be involved in lung maturation via the regulation of microRNAs. In addition to the interest in the impact of androgens on lung maturation, we analyzed the expression of corticosteroid synthesis enzymes in the human fetal lung. Expression of the CYP21A2 and the presence of its corresponding 21-hydroxylase enzyme have been studied by qPCR and immunoblot. Also mRNA localization of this key enzyme in the synthesis of glucocorticoids has been also assessed by in situ hybridization. CYP21A2 mRNA was detected by qPCR in all the 34 analyzed samples, whose ages ranged between 17 and 40 weeks of pregnancy. No correlation with gestational age or sex was observed. Significant levels of 21-hydroxylase protein were detected in our samples. We investigated the expression of other enzymes involved in the pathway of glucocorticoid synthesis including CYP11B1, CYP11B2 and CYP17A1. CYP11B1, CYP11B2 mRNA were not detected in our samples, unlike CYP17A1 whose mRNA was detected in all our analyzed fetal tissues. CYP17A1 protein was detected at low levels. In situ hybridization data showed that CYP21A2 expression is localized almost exclusively in the distal epithelium of human fetal lung. Our results suggest that 21-hydroxylase products act via an intracrine action on the distal epithelium by activating the glucocorticoid receptor (GR). Activation of the mineralocorticoid receptor (MR) at this site does not seem to depend on the 21-hydroxylase products due to the large amounts of circulating aldosterone.

La régulation post-transcriptionnelle joue un rôle essentiel dans le contrôle du développement des animaux et des maladies. Parmi les mécanismes de régulation posttranscriptionnelle identifiés à ce jour, les microARNs jouent un rôle central. Ils constituent une large classe de courts ARNs régulateurs qui ont été découverts chez le nématode C. elegans et ont été répertoriés chez tous les métazoaires. Les microARN sont transcrits par l'ARN polymérase II sous forme d'un long transcrit primaire et vont subir deux étapes de clivage successives pour former le microARN mature. Le microARN mature est pris en charge par une protéine Argonaute pour former un complexe effecteur, le miRISC. Les microARN s’associent avec la région 3' non traduite de leurs ARNm cibles pour réprimer leur traduction et/ou initier leur dégradation. L'orchestration dynamique de ces processus n'est pas bien comprise, mais on pense actuellement qu'elle dépend en grande partie d'un partenaire clé des Argonautes, GW182. Les cellules germinales sont la source d’ARNm maternels dont la régulation est essentielle aux premières étapes de l’embryogénèse. Le maintien de la stabilité de ces transcrits est assuré par des mécanismes posttranscriptionnels. Les microARNs sont abondants dans la lignée germinale et donc pourraient potentiellement participer à cette régulation. C’est ce qui nous amène à étudier la fonction des microARNs dans les cellules germinales. L’objectif de mon doctorat a été de comparer les mécanismes moléculaires utilisés par les microARN dans les cellules germinales et somatiques afin de mieux comprendre comment ils régulent l’expression des gènes. Grâce à une combinaison d’analyses protéomiques et de rapporteurs de l’activité des microARN in vivo, nous avons pu disséquer la composition et la fonction des miRISC germinaux et somatiques. Nous avons découvert un mécanisme de répression indépendant de GW182 qui réprime et stabilise les cibles de microARN. De façon intéressante, nous démontrons que des sites de liaison des miARN sont suffisants pour localiser un transcrit germinal à la région périnucléaire. Finalement, nous identifions GLH-1, une composante des granules P germinaux, comme étant un cofacteur de la fonction des microARN germinaux. Collectivement, mes travaux de doctorat nous ont permis de contribuer à améliorer les connaissances des mécanismes de la régulation des gènes par les microARN. / Post-transcriptional regulation plays a key role in controlling animal development and diseases. Among all post-transcriptional regulatory mechanisms identified to date, microRNAs play a central role. They constitute a large class of short non-coding RNAs that were discovered in C. elegans and have been reported in all metazoans. MicroRNAs are transcribed by RNA polymerase II as a long primary transcript that will undergo two successive cleavage steps to form the mature microRNA. The mature microRNA is the loaded onto an Argonaute protein to form an effector complex, the miRISC. MicroRNAs associate with the 3' untranslated region of their target mRNAs to repress their translation and/or initiate their degradation. The dynamic orchestration of these processes is not well understood, but at the moment is thought to be largely dependent on a key Argonaute partner, GW182. In developmental contexts such as oogenesis and early embryogenesis, the expression of maternally supplied mRNAs is tightly controlled. In oocytes, translational repression rather than irreversible mRNA decay, is preferred to accumulate and maintain a pool of maternal mRNAs whose timely expression is critical later in development. MicroRNAs are abundant in the germ line and therefore could potentially participate in this regulation. This leads us to study the function of microRNAs in germ cells. The aim of my PhD was to compare the molecular mechanisms used by microRNAs in germline and somatic cells to better understand how they regulate gene expression. Using a combination of proteomic analyzes and in vivo microRNA activity reporters, we were able to dissect the composition and function of germline and somatic miRISCs. We uncover a GW182- independent silencing mechanism used by germline miRNAs to both repress and unexpectedly stabilize their target mRNA. Interestingly, miRNA binding sites are sufficient to localize a germline reporter transcript to the perinuclear region. Finally, we identify GLH-1, a germline P granule component, as an miRISC cofactor involved in the repression of germline microRNA targets. Collectively, my doctoral work helps us gain new insights about the mechanisms used by microRNAs to regulate gene expression.

No description available.