Les microARN sont de courtes molécules d’ARN qui jouent un rôle important dans la régulation posttranscriptionnelle des gènes. Ces molécules ont d’abord été découvertes chez le nématode Caenorhabditis elegans mais sont maintenant reconnues comme des régulateurs importants de l’expression génique chez plusieurs animaux et plantes. Pour accomplir cette fonction, les microARN doivent s’associer à un complexe protéique nommé le miRISC (microRNA-induced silencing complex) qui est composé principalement d’une protéine Argonaute et des protéines GW182. Les microARN sont liés directement par les protéines Argonautes et peuvent ainsi guider celles-ci à la région 3’ nontraduite d’un ARNm cible par complémentarité de base. Le miRISC peut ensuite induire différents mécanismes de répression allant de la répression traductionnelle à la dégradation de la cible. À ce jour, les mécanismes qui modulent l’activité du miRISC ainsi que les interacteurs de ce complexe sont peu caractérisés. L’objectif principal de mon doctorat était donc d’étudier les processus qui régulent l’activité du complexe effecteur des miARN, le miRISC. Dans un premier temps, nous avons évalué l’importance de composantes connues du miRISC, soit les protéines GW182. Pour ce faire, nous avons aboli l’interaction entre les protéines Argonautes et GW182 et nous avons étudié l’effet de cette perte d’interaction sur la fonction du miRISC au cours du développement de C. elegans. Nous avons ainsi démontré que l’association de GW182 au miRISC n’était pas nécessaire pour le développement embryonnaire de l’animal. Nous avons par la suite confirmé que certaines cibles de microARN embryonnaires n’étaient pas affectées par l’absence de GW182. Nous avons ainsi conclu que le miRISC pouvait exister et fonctionner sous différentes formes et que les protéines GW182 étaient dispensables à l’activité du miRISC dans certains contextes. Dans un deuxième temps, nous avons tenté d’identifier de nouveaux facteurs qui contribuent à l’activité du miRISC en réalisant un criblage génétique. Nous avons ainsi identifié la RabGAP tbc-11 comme un nouvel acteur contribuant à la fonction des microARN. Nous avons démontré que tbc-11 agit sur la petite GTPase rab-6 et que la régulation de celle-ci est importante pour assurer la localisation intracellulaire adéquate de la protéine Argonaute ALG-1. Nos résultats ont permis de démontrer qu’une localisation inadéquate de la protéine ALG-1 engendre un défaut dans la répression de cibles de iii microARN. Nous avons ainsi pu conclure que le transport vésiculaire joue un rôle important dans la fonction des microARN. Les travaux réalisés au cours de mon doctorat ont permis de démontrer que la localisation et la composition du miRISC contribuent à la modulation de sa fonction. Ces résultats ont pu approfondir nos connaissances sur les mécanismes utilisés par la cellule pour moduler l’activité des microARN, et ouvrent ainsi la voie à d’autres recherches pouvant étudier les fonctions des microARN dans divers contextes. / MicroRNAs are small RNA molecules that play an important role in post-transcriptional gene silencing. These molecules were first discovered in the nematode Caenorhabditis elegans but are now known as important regulators of gene expression in most animals and plants. To accomplish this function, microRNAs interact with a protein complex called the miRISC (microRNA-induced silencing complex) which is formed by an Argonaute protein and GW182 proteins. MicroRNAs interact directly with Argonaute and can guide them to the 3’ UTR region of a target mRNA by base pairing. The miRISC will then induce several repression mechanisms, ranging from translational repression to target decay. To this day, the mechanisms that modulate miRISC activity as well as the proteins that interact with the complex are poorly characterized. The main objective of my PhD was therefore to study the processes that regulate the activity of the effector complex of microRNAs, the miRISC. First, we evaluated the importance of a known component of the miRISC; the GW182 proteins. To accomplish this, we abolished the interaction between Argonaute and GW182 proteins and we studied the effect of this loss of interaction on miRISC function during C. elegans development. We have shown that the association of GW182 to the miRISC is dispensable for the animal’s embryonic development. We then confirmed that certain embryonic microRNA targets were not affected by the loss of GW182. These results allowed us to conclude that the miRISC can exist and function under different forms and that GW182 proteins are dispensable for the miRISC activity under certain conditions. Second, we wanted to identify new factors that contribute to miRISC silencing by performing a forward genetic screen. This allowed us to identify the RabGAP tbc-11 as a new factor contributing to microRNA function. We have shown that tbc-11 acts on the small GTPase rab-6 and that its regulation is important for proper intracellular localization of the Argonaute ALG-1. Our results have shown that an improper localization of ALG-1 leads to defects in microRNA target repression. We have therefore concluded that vesicular transport plays an important role in microRNA function. Our results have shown that the localization and composition of the miRISC contributes to the modulation of its activity. This study has deepened our knowledge on the mechanisms that modulate microRNA activity and opens the door for other research on microRNA function in different contexts.

La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / Les microARN (miARN) sont des courts ARN non codants qui régulent l'expression des gènes, au niveau post-transcriptionnel. Ces molécules d'environ 22 nucléotides de long s'associent aux protéines Argonautes (AGO) pour former un complexe appelé microRNA induced silencing complex (miRISC). Ensuite, les miARN recrutent le miRISC à des séquences partiellement complémentaires, dans les régions 3' non traduites d'ARN messagers (ARNm). Le miRISC peut ainsi réprimer la traduction d'ARNm spécifiques et souvent induire leur dégradation. Ce mécanisme est notamment important pour le développement animal et des défauts dans cette voie moléculaire sont liés à diverses pathologies chez l'humain. Des évidences récentes montrent que les interacteurs du miRISC et son mode d'action sur les ARNm peuvent diverger à différents moments du développement du nématode Caenorhabditis elegans. Nous avons donc posé l'hypothèse que des modifications post-traductionnelles pourraient expliquer certaines de ces différences moléculaires et fonctionnelles. Les objectifs de ce projet de recherche étaient donc d'identifier les événements de phosphorylation sur la protéine Argonaute ALG-1 de C. elegans et de déterminer leur fonction biologique au cours du développement animal. À cette fin, nous avons purifié la protéine Argonaute ALG-1 chez C. elegans avec un anticorps spécifique, ainsi que ses orthologues humains AGO 1-4, à partir de cellules humaines en culture. Nous avons déterminé par spectrométrie de masse les modifications post-traductionnelles sur ces protéines. En utilisant des méthodes de mutagenèse par édition du génome chez C. elegans, nous avons criblé l'importance de nombreux sites de phosphorylation en s'attardant aux phénotypes associés à la perte de fonction des miARN. Ceci nous a permis de mettre en évidence l'importance d'une région phosphorylable conservée de cinq résidus sérines/thréonine sur le domaine PIWI des Argonautes. La perte de phosphorylation de ALG-1, lorsque ces acides aminés sont mutés en alanines, produit des phénotypes développementaux beaucoup plus sévères que chez des animaux déplétés du gène alg-1. Au niveau moléculaire, nous avons montré, à partir de cellules humaines en culture, que l'hyperphosphorylation de ces acides aminés réduit l'association aux ARNm. De plus, nous avons montré que des mutants AGO2 qui ne sont pas en mesure de lier les miARN, ne sont pas hyperphosphorylés sur ces résidus dans les cellules humaines en culture. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de miARN, dans lequel l'hyperphosphorylation du domaine PIWI de l'Argonaute permet la dissociation du miRISC de sa cible. Nous proposons donc que la phosphorylation de cette région permettrait au miRISC d'être recyclé et de réprimer l'expression d'autres ARNm après sa déphosphorylation. En second lieu, notre crible a permis d'identifier une sérine phosphorylable sur le domaine MID de ALG-1 qui régule l'association de la protéine aux miARN, lors du développement du nématode. Nous avons montré que lorsque cette sérine est mutée en glutamate (phospho-mimétique) ALG-1 perd son association aux miARN. Par ailleurs, les animaux qui portent cette mutation présentent des niveaux de miARN moins élevés que chez les animaux sauvages, ainsi qu'une accumulation de brins passagers qui sont issus des duplex de miARN et normalement dissociés par AGO. Nous avons ensuite identifié l'enzyme qui produit la phosphorylation de cette sérine. Avec des expériences de phosphorylation in vitro, nous avons montré que cette phosphorylation pourrait être induite par la protéine kinase A (PKA). De surcroît, nos expériences soutiennent que alg-1 et PKA interagissent génétiquement. Précisément, le mutant non phosphorylable alg-1(S642A) supprime des phénotypes développementaux observés lors de la perte de fonction de la sous-unité régulatrice de PKA, kin-2. En somme, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence un mécanisme conservé au cours de l'évolution qui régule l'association du miRISC aux ARNm par la phosphorylation des Argonautes, ainsi qu'un mécanisme qui régule l'association de ALG-1 aux miARN chez C. elegans. Notre étude indique d'ailleurs que le miRISC serait possiblement inhibé à des moments précis lors du développement animal, par exemple lors de la phosphorylation par PKA. Les études futures des voies signalétiques qui activent PKA chez le nématode nous permettra de mieux comprendre la fonction biologique et le contexte cellulaire qui requerrait l'inactivation du miRISC. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotes. These molecules are ~22 nucleotides in length and associate with Argonaute proteins (AGO) to guide them to mRNAs that contain sequences with partial complementarity, commonly found in the 3' untranslated region (UTR). The interaction between the miRISC (miRNA induced silencing complex) and the mRNA inhibits protein synthesis and often leads to degradation of the transcripts. While the function and importance of this gene regulation pathway has been studied in plant and animal models, mechanisms that modulate the miRISC gene silencing efficiency in different biological settings are still poorly understood. The hypothesis of my research project conveys the idea that post-translational modifications of Argonaute proteins modulate gene silencing during animal development. To test this hypothesis, we aimed to identify phosphorylation events on the Argonaute ALG-1 in the nematode C. elegans and uncover how these modifications affect its function during animal development. We purified ALG-1 protein from C. elegans extracts with a specific antibody and human Argonautes AGO1-4 from human cell cultures. We identified phosphorylated Argonaute peptides using mass spectrometry analysis and then we screened which modification affected ALG-1 function using gene editing. This led to the discovery of a highly conserved serine/threonine phosphorylation cluster on the PIWI domain of the Argonaute that when mutated into non-phosphorylatable amino-acids (alanine) caused phenotypes that were more severe than the loss of alg-1 in C. elegans. Molecular analysis of these phosphorylation sites showed that they modulate association to miRNA targets. Specifically, when using phospho-mimicking mutations on human AGO2, we showed that the hyperphosphorylation of this cluster causes the Argonaute to lose interaction with mRNAs. Furthermore, we showed that AGO mutants that are deficient for miRNA binding do not undergo hyperphosporylation. These results revealed a new mechanism that regulate miRNA-mediated gene silencing by which unphosphorylated AGO binds miRNA targets and following hyperphosporylation the miRISC is released from mRNAs. We proposed that this mechanism could be used by cells to recycle the complex and permit multiple rounds of silencing by the miRISC after dephosphorylation. Our forward genetic screen of ALG-1 phosphorylation sites identified a serine on the MID domain that modulates association to miRNAs. We showed that phospho-mimicking mutation of ALG-1 at this position impaired the ability of ALG-1 to bind most miRNAs. Furthermore, we found that this mutation led to accumulation of passenger strands miRNAs in the total RNA. Since the passenger strands are not bound by the phospho-mimicking mutant, we suggested that they accumulate as duplexes which would render them refractory to degradation by single stranded nucleases. Last we showed that the protein kinase A (PKA) phosphorylates this residue in vitro and interacts genetically with alg-1. Altogether, this research project uncovered new mechanisms that regulate the miRNA pathway through the phosphorylation of the Argonaute proteins. Our study also suggests that ALG-1 is inhibited at specific timing by PKA during C. elegans development, and further study of the biological settings that require this inactivation will be crucial to understand its function.

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65. / In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

Résumé Les plaquettes jouent un rôle central dans le maintien de l’hémostase et sont impliquées dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments sont anucléés, mais contiennent des ARN messagers (ARNm), dont la traduction pourrait être régulée par leurs microARN. Au cours de ce projet, je me suis concentrée à mieux caractériser ces microARN, afin de déterminer leur rôle dans la fonction plaquettaire. L’étude du répertoire complet des microARN plaquettaires humains, réalisée par séquençage à haut débit, montre un profil caractérisé par la forte expression de microARN impliqués dans la différentiation cellulaire et la mégacaryopoïèse. La diversité des microARN plaquettaires est enrichie par l’expression d’isoformes décalées en 5’, tel que miR-140-3p, ce qui leur confère la capacité de réguler des ARNm différents de l’isoforme principale. Beaucoup de microARN plaquettaires sont modifiés en 3’, ce qui peut altérer leur stabilité et influencer leur fonction. La présence de deux nucléotidyl-transférases et l’activité d’uridylation, observées dans des extraits protéiques de plaquettes in vitro, démontrent la capacité des plaquettes à modifier et à réguler leurs microARN. Dans un second temps, j’ai étudié l’implication des microARN dans les défauts plaquettaires observés chez les patients urémiques, dialysés ou non. Bien que les complexes impliqués dans la biogenèse et la fonction des microARN demeurent fonctionnels, le profil des microARN plaquettaires est altéré chez les patients urémiques, et semble rétabli par la dialyse. Deux gènes ont été identifiés comme étant régulés par des microARN altérés chez les patients urémiques, suggérant que l’altération de la régulation de certains ARNm par les microARN pourrait contribuer aux défauts plaquettaires chez ces patients. Militant en faveur d’un rôle des microARN dans la traduction des ARNm plaquettaire, j’ai mis en évidence (i) l’association des complexes effecteurs Argonaute 2 (Ago2)•microARN avec les ARNm, et (ii) la régulation de certains ARNm, traduits dans les plaquettes, par des microARN abondamment retrouvés dans celles-ci. Suite à l’activation des plaquettes, ces dernières sécrètent des microARN, essentiellement dans des microparticules, à l’intérieur desquelles ils sont associés à Ago2. Globalement, mes résultats laissent entrevoir un rôle important pour les microARN plaquettaires dans la régulation de leurs ARNm et la communication intercellulaire. / Platelets play a central role in hemostasis and are involved in cardiovascular diseases. Devoid of a nucleus, platelets nevertheless contain messenger RNAs (mRNAs) and are capable of de novo protein synthesis. MicroRNAs are particularly abundant in platelets, suggesting that they may regulate mRNA translation. In this project, I characterized further the microRNA repertoire and pathway of human platelets in order to gain more insights into their role in platelet function. High-throughput sequencing analysis of human platelet small RNAs revealed an abundant array of microRNAs involved in cell differentiation or megakaryopoiesis. The diversity of platelet microRNAs is expanded by the expression of 5’ shifted isoforms, as observed with miR-140-3p that may regulate mRNAs different than the reference sequence. Most platelet microRNAs are extensively modified at their 3’ extremity, a process that is thought to alter their stability and function. The detection of two nucleotidytranferases, as well as uridylation activity in platelets, demonstrate their ability to modify and regulate their microRNAs. I then studied the implication of microRNAs in the platelet defects observed in uremic patients, undergoing dialysis or not. Although the complexes involved in microRNA biogenesis and function remain functional, the platelet microRNA profile of uremic patients was altered, but seems to be restored by dialysis. The identification of two genes that are regulated by microRNAs altered in uremic patients suggests that an alteration of microRNA-based mRNA regulatory mechanisms may underlie the platelet response to uremia. Consistent with a role for microRNAs in regulating platelet mRNAs, Ago2•microRNA complexes are associated with platelet mRNAs. In addition, certain mRNAs translated in platelets can be regulated by microRNAs that are particularly abundant in platelets. Following their activation, platelets secrete microRNAs, mainly via microparticles, in which they are found associated with Ago2. Altogether, my results suggest that platelet microRNAs may play an important role in the regulation of platelet mRNAs as well as in intercellular communications.

Au sein de l'ensemble des protéines Argonautes codées par les génomes des organismes métazoaires, certains membres de cette famille de protéines ont conservé des acides aminés importants pour l'activité endonucléasique. La signification fonctionnelle de ces résidus (composés des résidus DDH), pour les Argonautes spécifiques des miARN chez les animaux, est encore inconnue puisque le ciblage des ARNm par les miARN ne provoque pas de clivage site spécifique comme c'est le cas pour les siARN. In vitro, nous avons mis en évidence, chez le nematode C. elegans, que les protéines Argonautes spécifiques aux miARN, ALG-1 et ALG-2, conservant ce motif, possèdent une activité de clivage similaire à celle impliquée dans la voie des si ARN. Nous démontrons également que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 ont la capacité de lier et d'utiliser comme substrats différents duplexes de courts ARN, similaires aux duplexes de miARN produits par l'enzyme DCR-1. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont capables de coupure endonucléolytique sur ces duplexes, lorsque le degré de complémentarité entre les deux brins le permet, et de séparer les deux brins d'un duplex de courts ARN contenant des mésappariements. In vivo, l'activité endonucléasique de ALG-1 ou ALG-2 est essentielle pour la voie des miARN, et la perte de cette activité conduit à une accumulation des précurseurs de miARN tronqués et une altération de la formation de miRISC fonctionnel. Prises dans leur ensemble, nos données indiquent que l'activité endonucléasique des protéines Argonaute ALG-1 ou ALG-2 contribue à la maturation des miARN chez le nematode C. elegans.