Les miARNs, de courts ARNs non codant de 19 à 22 nucleotides, responsablent de la répression traductionnelle, d'approximativement 30 % des ARNm codant. Ils agissent par appariement de base sur des régions situées en 3'UTR des ARNm ciblés. Pour ce faire, les protéines argonautes s'associent aux miARNs et forment le complexe effecteur miRISC (microRNA-Induced Silencing Complex). Les mécanismes d'action de ce complexe ne sont pas bien compris et certains autres facteurs inconnus pourraient avoir un rôle important. Nous avons identifié, par criblage double hybride, plusieurs interacteurs de la protéine ALG-1, une argonaute impliquée dans la voie des miARNs chez C. elegans. Nous avons aussi mis en évidence un groupe de proteases homologues aux cathepsines humaines. Pour évaluer l'implication des cathepsines dans la voie des miARNs, nous avons utilisé un essai luciférase nous permettant d'apprécier l'effet de l'inhibition de ces proteases sur la traduction d'un ARNm réprimé par un miARN.

Présents chez tous les métazoaires, les microARNs jouent un rôle critique dans la régulation de gènes impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire. Ces courtes molécules d'ARN altèrent la production protéique en liant spécifiquement les régions non codantes des ARNm. Les microARNs sont transcrits par l'ARN polymérase II (Pol II) sous forme d'un long transcrit primaire et vont passer par deux étapes de clivage successives pour former le microARN mature. Le microARN mature est pris en charge par une protéine Argonaute pour former le complexe effecteur de la voie, le miRISC. Chacune des étapes de la biogenèse des microARNs peut être régulée pour modifier la production globale ou spécifique des microARNs. Des études récentes ont démontré que la maturation et la stabilité des microARNs sont des facteurs importants pour conserver l'homéostasie cellulaire. De nombreuses évidences supportent qu'une altération du niveau cellulaire de ces petites molécules régulatrices contribue au développement et au maintien de diverses maladies, dont le cancer. À ce jour, il existe peu de connaissance sur le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARNs non codants. Les deux Argonautes, alg-1 et alg-2 impliqués dans la voie des microARNs chez le nématode C. elegans sont synthétiques létaux. Un criblage génétique chez C. elegans visant à identifier de nouveaux gènes synthétiques létaux avec alg-2, a permis d'identifier la protéine DCS-1 comme étant impliqué dans la voie des microARNs. Chez C. elegans, la perte de dcs-1 affecte le niveau de plusieurs microARNs, affectant l'expression génique chez ces animaux. Des analyses biochimiques supportent que DCS-1 affecte l'activité d'une enzyme responsable de la dégradation des microARNs chez le nématode, et ce, de façon indépendante de son activité de dégradation de la coiffe des ARNm. De plus, dans l'optique d'identifier les membres du complexe de dégradation, une analyse par spectrométrie de masse a permis d'identifier plusieurs candidats potentiels. Une analyse préliminaire de l'un de ces candidats a permis de démontrer que sa perte de fonction entraîne l'apparition de phénotype associé à une diminution de l'activité de la voie des microARNs et affecte le niveau de certains microARNs. Cette protéine, PPM-2, est une phosphatase et pourrait affecter le statut de phosphorylation d'une protéine importante pour la stabilité ou la dégradation des microARNs. En conclusion, DCS-1 fait partie d'un complexe de dégradation des microARNs avec la protéine XRN-1. L'identification de ce nouveau complexe de dégradation permet de mieux comprendre les mécanismes responsables du contrôle de ces ARNs. Une meilleure connaissance des mécanismes régulant la production et la stabilité des microARNs pourrait mener au développement de nouvelles avenues thérapeutiques. / In all metazoans, microRNAs play a critical role in the regulation of genes implicated in cell proliferation and differentiation. These small non-coding RNAs form a silencing complex called miRISC and alter protein synthesis upon binding mRNA untranslated regions (UTRs). miRNAs are transcribed by RNA Pol II as a long transcript call the pri-miRNA. The pri-miRNA will go through two steps of cleavage to form the mature miRNA. This mature miRNA is then loaded onto an Argonaute protein to form the effector complex; the miRISC. Each step of miRNA biogenesis is tightly regulated. Recently, miRNA production and stability have been shown to be an important step in this pathway. Several proteins, such as p53, can modulate microRNA biogenesis and many other proteins are implicated in miRNA stabilization and degradation. A tight control of these regulatory RNA is essential since miRNA misregulation is associated with several diseases. Here we identified the ortholog of human decapping enzyme DcpS (DCS-1) as an important regulator of miRNA level in C. elegans by forming a degradation complex with XRN-1, idependantly of its catalytic activity. In C. elegans, the loss of dcs-1 affects the level of several microRNAs leading to a misregulation of their mRNA targets. Biochemical analysis, support that DCS-1 contributes to degradation of unbound microRNA, which is dependent on the 5' to 3' exonuclease XRN-1. In order to better understand the regulation of miRNAs, we sought to identify other members of this complex. An initial study of proteins identified by mass spectrometry revealed that the loss of ppm-2 induces several developmental defects associated with the loss of miRNAs. As PPM-2 is a phosphatase, our results suggest that it could affect the stability of the degradation complex by targeting one of its components or the miRNA loading on the Argonaute protein. In conclusion, our data support that DCS-1 is part of a degradation complex. Importantly, this study identified the first modulators of microRNA degradation in animals and proteins forming this complex are conserved in human suggesting that they could also be implicated in microRNA degradation in higher organisms. Since microRNA are misregulated in many human diseases, identification of factors modulating their stability could lead to new therapeutic approaches.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / Les microARNs sont des petites molécules d'ARN non-codant conservées à travers les espèces qui régulent négativement l'expression génique au niveau post-transcriptionel. Ils figurent parmi les acteurs majeurs du maintien de l'homéostasie cellulaire et leur dérégulation est à l'origine de nombreuses pathologies humaines. Leur biogenèse consiste en deux étapes de maturation successives effectuées par les enzymes Drosha et Dicer, pour générer une molécule effectrice d'ARN d'une longueur de 21-23 nucleotides. La courte molécule produite s'assemble avec une protéine de la famille Argonaute pour former un complexe ribonucléoprotéique capable de cibler spécifiquement un ARNm et d'éteindre son expression. Pour mieux comprendre comment les microARNs régulent l'expression génique, l'objectif principal de mon doctorat a été d'étudier le rôle de la protéine Argonaute ALG-1, en utilisant le nematode Caenorhabditis elegans comme modèle animal. Nous avons dans un premier temps recherché quelles caractéristiques moléculaires étaient importantes pour déterminer la sélection spécifique des protéines Argonautes essentielles à la voie des microARNs parmi les nombreuses Argonautes retrouvées chez le nematode C. elegans. Par une approche génétique, nous avons découvert que la sélection des protéines Argonautes est affectée à la fois par la structure du duplex d'ARN double brins et par les caractéristiques spécifiques de chacune d'elles. Pour étudier plus précisément la fonction de la protéine Argonaute ALG-1, nous avons entrepris un criblage double-hybride pour identifier de nouveaux partenaires protéiques. Parmi eux, nous avons identifié puis prouvé l'importance de la protéine ribosomale RACK1 dans la voie de régulation des microARNs chez le nematode et l'humain. Nous avons démontré que la perte de fonction de RACK1 affecte l'association des microARNs et des protéines Argonaute avec les ribosomes actifs suggérant une contribution de cette protéine dans le recrutement de ces complexes aux sites actifs de traduction. Finalement, nous avons développé une approche génétique systématique permettant d'adresser génétiquement l'implication des partenaires d'ALG-1 dans la voie des microARNs. Collectivement, mes travaux de doctorat nous ont permis de contribuer à l'élargissement des connaissances associées à cette mécanistique complexe de régulation des gènes par les microARNs chez l'animal.

Ce projet vise à cartographier la machinerie de régulation des Rho GTPases chez C. elegans afin de mieux comprendre les mécanismes d'intégration des voies de signalisation au cours du développement des organismes multicellulaires. La première partie du projet consistait à caractériser la spécificité catalytique des Rho GAP envers les Rho GTPases in silico et in vitro. En adaptant un programme de prédiction de structures tridimensionnelles, Combinatorial Extension (CE), nous avons pu faire corréler une similitude structurelle avec la spécificité catalytique des GAP. Ce prédicteur amélioré a validé des interactions GAP-GTPase connues: cinq chez les mammifères et quatre avec des GAP homologues chez C. elegans. Les résultats de conservation des interactions que nous avons obtenus, permettent de justifier l'utilisation de ce nématode comme modèle d'étude pour l'humain. Par la suite, nous avons optimisé les essais expérimentaux pour tester la spécificité catalytique des Rho GAP de C. elegans en vue de valider le prédicteur. Dans la deuxième partie nous avons étudié les interactions fonctionnelles des Rho GAP au cours du développement embryonnaire du C. elegans in vivo. Les résultats obtenus nous ont aidés à mieux comprendre le réseau de régulation de la GTPase rho-1 par les GAP rga-5, gei-1 et rga-13 au cours de l'élongation embryonnaire. De plus, nous savons désormais qu'ocrl-1 est dans une voie antagoniste à rga-5. Enfin, dans la troisième partie de notre travail, nous avons mis au point une méthode d'analyse haut débit des interactions génétiques des Rho GAP sur le cytomètre en flux pour vers (le COPAS Biosort) avec des transgéniques histone::GFP. Puis cette méthode a été adaptée pour permettre d'utiliser des souches non fluorescentes, en colorant les noyaux des cellules des embryons fixés. Ce travail a apporté un nouvel outil de prédictions et a permis de simplifier les méthodes de travail pour l'étude des machineries de régulation de GTPases Rho. La technique haut-débit que nous avons développée pourrait aussi s'adapter à l'étude d'autres régulateurs (GEF, etc). ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Caenorhabditis elegans, Rho GAP, prédicteur, développement embryonnaire, haut débit

Le nématode Caenorhabditis elegans est un organisme polyvalent et unique pour l'étude de la biologie du développement, de la neurologie et des mécanismes complexes de signalisation des GTPases. Ce modèle animal offre une opportunité unique pour l'étude du rôle des protéines dans le développement neurologique et les maladies. Les recherches portaient sur trois gènes : pix-1, git-1 et pak-1. Chez les mammifères, GIT / PIX / PAK agissent comme une plateforme d'intégration de la signalisation des GTPases Rho et Arf dans les processus biologiques tels que : la polarité cellulaire, la migration, le trafic vésiculaire, la formation des synapses et la morphologie des épines dendritiques. Ces recherches ont amené l'utilisation des approches génétiques et microscopiques pour établir que pix-1, git-1 et pak-1 contrôlent les phases précoces et tardives de l'élongation de l'embryon par la régulation de l'activité des chaînes légères de myosine (CLM). Les résultats de recherche suggèrent un positionnement de pix-1 et pak-1 dans l'une des voies de signalisation contrôlant la phosphorylation de ces CLMs en parallèle de la voie mel-11 / let-502. MEL-11 est une phosphatase des CLMs agissant de façon antagoniste à LET-502 (une kinase effectrice des Rhos) dans l'une des deux voies de signalisation redondantes qui assurent l'étape précoce d'élongation embryonnaire. Les résultats suggèrent, de plus, l'implication de mel-11 et let-502 au cours de la phase tardive de l'allongement. Un certain nombre de résultats suggèrent aussi une implication des intégrines ina-1 dans ces processus. La caractérisation fonctionnelle de pix-1, git-1 et pak-1 chez les nématodes adultes démontre leur implication dans le contrôle du comportement de recherche de nourriture (comportement de forage). Ce comportement dépend de la neutotransmission glutamatergique et dopaminergique et implique des mécanismes cellulaires similaires à la plasticité synaptique chez les mammifères. Un lien a été établi entre l'expression des récepteurs au glutamate AMPA homologue de GLR-l et PIX-l en utilisant la microscopie quantitative, la cytométrie de flux et des tests de comportement dans des labyrinthes micro-fluidiques secs. Les résultats suggèrent que les animaux mutants pour pix-1 contrôleraient la neurotransmission glutamatergique de façon indirecte. La conservation fonctionnelle du complexe GIT / PIX / PAK chez les invertébrés permettrait d'utiliser notre modèle dans l'identification de cibles thérapeutiques et de composés actifs contre les pathologies associées à des mutations dans aPIX et PAK3. Il aidera en outre à fournir des éclaircissements sur la fonction et les mécanismes de régulation des GTPases. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : GTPases monomériques, GIT/PIX/PAK., C. elegans, signalisation cellulaire, développement embryonnaire, neuro-transmission glutamatergique.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2003. / Bibliogr.: f. 72-87. Publié aussi en version électronique.

Les cellules souches portent de grandes promesses envers la médecine régénératrice, tandis que leur perturbation peut mener au cancer. Ainsi, il est fondamental de définir les interactions qui prennent place au sein d'un organisme entre les cellules souches et leur micro- et macro-environnement. Chez le nématode Caenorhabditis elegans, les niveaux de prolifération des cellules souches germinales (CSG) sont régis par l'abondance de leur progéniture différenciée à travers une interaction entre la voie de signalisation ERK/MAPK et la kinase activée par l'AMP (AMPK). Cependant, l'intersection moléculaire entre AMPK et la voie MAPK demeure toujours inconnue. En regard aux déterminants embryonnaires précoces et PAR-4/LKB1, principale kinase activant AMPK, nos travaux ont démontré l'expression ubiquitaire de par-4 et l'enrichissement cytoplasmique et cortical de PAR-4 dans la lignée germinale et les embryons précoces, en plus d'une décroissance transitoire de l'enrichissement cortical de PAR-4 dans la zone pachytène. De plus, nos travaux suggèrent que par-4b est suffisant pour établir la polarité embryonnaire et maintenir la fonction essentielle de par-4. Par ailleurs, quant aux déterminants régissant la prolifération des CSG, nous avons constaté que chez les adultes porteurs d'ovocytes, LIN-3/EGF et LET-23/EGFR sont nécessaires pour promouvoir la prolifération des CSG. De surcroit, nous avons démontré que DAF-18/PTEN prévient l'ovulation d'ovocytes non-fécondés et contribue au mécanisme de rétroaction de la prolifération des CSG. Nos résultats indiquent aussi que l'état de prolifération des CSG est corrélé, de manière inversement proportionnelle, à la quantité d'ovocytes anovulés, et ne forme donc pas une régulation binaire, mais plutôt progressive. Finalement, nous avons démontré que DAF-18/PTEN prévient la prolifération des CSG en l'absence de sperme de façon strictement zygotique, potentiellement à travers son rôle dans la gonade somatique, car sa perte de fonction altère légèrement les contractions des cellules de la gaine. Ainsi, ces travaux approfondissent globalement les principales voies de signalisation physiologiquement impliquées dans la régulation homéostatique de la prolifération des cellules souches germinales chez le nématode C. elegans, et pourraient avoir des retombées envers la médecine humaine. / Stem cells hold great promises for regenerative medicine, whilst their disruption may lead to cancer. Therefore, it is fundamental to define the interactions between stem cells and their micro- and macro-environment. In the nematode Caenorhabditis elegans, retroactive control of germline stem cells (GSC) proliferation levels is governed by the abundance of their differentiated progeny through an interaction between ERK/MAPK signaling pathway and AMP-activated kinase (AMPK). However, the molecular intersection between AMPK and the MAPK pathway still remains unknown. With regard to early embryonic determinants and PAR-4/LKB1, the main kinase activating AMPK, our work has demonstrated the ubiquitous expression of par-4 and the cytoplasmic and cortical enrichment of PAR-4 in the germline and early embryos, in addition to a transient decrease in cortical PAR-4 enrichment in the pachytene zone. Furthermore, our work suggests that par-4b is sufficient to establish embryonic polarity and maintain essential par-4 function. Moreover, regarding the determinants governing GSC proliferation, we found that in oocyte-bearing adults, LIN-3/EGF and LET-23/EGFR are required to promote GSC proliferation. Additionally, we demonstrated that DAF-18/PTEN is involved in ovulation of fertilized oocytes and contributes to germline stem cell proliferation feedback mechanism. Our results also indicate that GSC proliferation status correlates, in a inversely proportional manner, to the amount of anovulated oocytes, and consequently does not form a binary regulation, but rather a progressive one. Finally, we demonstrated that the strictly zygotic effect of DAF-18/PTEN promotes GSC proliferation, potentially through its role in the somatic germline, since its loss of function slightly alters sheath cells contractions. Thus, this work broadly deepens the main signaling pathways physiologically involved in the homeostatic regulation of stem cell in the nematode C. elegans, but could have implications for human medicine.

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / Les microARN (miARN) sont des courts ARN non codants qui régulent l'expression des gènes, au niveau post-transcriptionnel. Ces molécules d'environ 22 nucléotides de long s'associent aux protéines Argonautes (AGO) pour former un complexe appelé microRNA induced silencing complex (miRISC). Ensuite, les miARN recrutent le miRISC à des séquences partiellement complémentaires, dans les régions 3' non traduites d'ARN messagers (ARNm). Le miRISC peut ainsi réprimer la traduction d'ARNm spécifiques et souvent induire leur dégradation. Ce mécanisme est notamment important pour le développement animal et des défauts dans cette voie moléculaire sont liés à diverses pathologies chez l'humain. Des évidences récentes montrent que les interacteurs du miRISC et son mode d'action sur les ARNm peuvent diverger à différents moments du développement du nématode Caenorhabditis elegans. Nous avons donc posé l'hypothèse que des modifications post-traductionnelles pourraient expliquer certaines de ces différences moléculaires et fonctionnelles. Les objectifs de ce projet de recherche étaient donc d'identifier les événements de phosphorylation sur la protéine Argonaute ALG-1 de C. elegans et de déterminer leur fonction biologique au cours du développement animal. À cette fin, nous avons purifié la protéine Argonaute ALG-1 chez C. elegans avec un anticorps spécifique, ainsi que ses orthologues humains AGO 1-4, à partir de cellules humaines en culture. Nous avons déterminé par spectrométrie de masse les modifications post-traductionnelles sur ces protéines. En utilisant des méthodes de mutagenèse par édition du génome chez C. elegans, nous avons criblé l'importance de nombreux sites de phosphorylation en s'attardant aux phénotypes associés à la perte de fonction des miARN. Ceci nous a permis de mettre en évidence l'importance d'une région phosphorylable conservée de cinq résidus sérines/thréonine sur le domaine PIWI des Argonautes. La perte de phosphorylation de ALG-1, lorsque ces acides aminés sont mutés en alanines, produit des phénotypes développementaux beaucoup plus sévères que chez des animaux déplétés du gène alg-1. Au niveau moléculaire, nous avons montré, à partir de cellules humaines en culture, que l'hyperphosphorylation de ces acides aminés réduit l'association aux ARNm. De plus, nous avons montré que des mutants AGO2 qui ne sont pas en mesure de lier les miARN, ne sont pas hyperphosphorylés sur ces résidus dans les cellules humaines en culture. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de miARN, dans lequel l'hyperphosphorylation du domaine PIWI de l'Argonaute permet la dissociation du miRISC de sa cible. Nous proposons donc que la phosphorylation de cette région permettrait au miRISC d'être recyclé et de réprimer l'expression d'autres ARNm après sa déphosphorylation. En second lieu, notre crible a permis d'identifier une sérine phosphorylable sur le domaine MID de ALG-1 qui régule l'association de la protéine aux miARN, lors du développement du nématode. Nous avons montré que lorsque cette sérine est mutée en glutamate (phospho-mimétique) ALG-1 perd son association aux miARN. Par ailleurs, les animaux qui portent cette mutation présentent des niveaux de miARN moins élevés que chez les animaux sauvages, ainsi qu'une accumulation de brins passagers qui sont issus des duplex de miARN et normalement dissociés par AGO. Nous avons ensuite identifié l'enzyme qui produit la phosphorylation de cette sérine. Avec des expériences de phosphorylation in vitro, nous avons montré que cette phosphorylation pourrait être induite par la protéine kinase A (PKA). De surcroît, nos expériences soutiennent que alg-1 et PKA interagissent génétiquement. Précisément, le mutant non phosphorylable alg-1(S642A) supprime des phénotypes développementaux observés lors de la perte de fonction de la sous-unité régulatrice de PKA, kin-2. En somme, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence un mécanisme conservé au cours de l'évolution qui régule l'association du miRISC aux ARNm par la phosphorylation des Argonautes, ainsi qu'un mécanisme qui régule l'association de ALG-1 aux miARN chez C. elegans. Notre étude indique d'ailleurs que le miRISC serait possiblement inhibé à des moments précis lors du développement animal, par exemple lors de la phosphorylation par PKA. Les études futures des voies signalétiques qui activent PKA chez le nématode nous permettra de mieux comprendre la fonction biologique et le contexte cellulaire qui requerrait l'inactivation du miRISC. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotes. These molecules are ~22 nucleotides in length and associate with Argonaute proteins (AGO) to guide them to mRNAs that contain sequences with partial complementarity, commonly found in the 3' untranslated region (UTR). The interaction between the miRISC (miRNA induced silencing complex) and the mRNA inhibits protein synthesis and often leads to degradation of the transcripts. While the function and importance of this gene regulation pathway has been studied in plant and animal models, mechanisms that modulate the miRISC gene silencing efficiency in different biological settings are still poorly understood. The hypothesis of my research project conveys the idea that post-translational modifications of Argonaute proteins modulate gene silencing during animal development. To test this hypothesis, we aimed to identify phosphorylation events on the Argonaute ALG-1 in the nematode C. elegans and uncover how these modifications affect its function during animal development. We purified ALG-1 protein from C. elegans extracts with a specific antibody and human Argonautes AGO1-4 from human cell cultures. We identified phosphorylated Argonaute peptides using mass spectrometry analysis and then we screened which modification affected ALG-1 function using gene editing. This led to the discovery of a highly conserved serine/threonine phosphorylation cluster on the PIWI domain of the Argonaute that when mutated into non-phosphorylatable amino-acids (alanine) caused phenotypes that were more severe than the loss of alg-1 in C. elegans. Molecular analysis of these phosphorylation sites showed that they modulate association to miRNA targets. Specifically, when using phospho-mimicking mutations on human AGO2, we showed that the hyperphosphorylation of this cluster causes the Argonaute to lose interaction with mRNAs. Furthermore, we showed that AGO mutants that are deficient for miRNA binding do not undergo hyperphosporylation. These results revealed a new mechanism that regulate miRNA-mediated gene silencing by which unphosphorylated AGO binds miRNA targets and following hyperphosporylation the miRISC is released from mRNAs. We proposed that this mechanism could be used by cells to recycle the complex and permit multiple rounds of silencing by the miRISC after dephosphorylation. Our forward genetic screen of ALG-1 phosphorylation sites identified a serine on the MID domain that modulates association to miRNAs. We showed that phospho-mimicking mutation of ALG-1 at this position impaired the ability of ALG-1 to bind most miRNAs. Furthermore, we found that this mutation led to accumulation of passenger strands miRNAs in the total RNA. Since the passenger strands are not bound by the phospho-mimicking mutant, we suggested that they accumulate as duplexes which would render them refractory to degradation by single stranded nucleases. Last we showed that the protein kinase A (PKA) phosphorylates this residue in vitro and interacts genetically with alg-1. Altogether, this research project uncovered new mechanisms that regulate the miRNA pathway through the phosphorylation of the Argonaute proteins. Our study also suggests that ALG-1 is inhibited at specific timing by PKA during C. elegans development, and further study of the biological settings that require this inactivation will be crucial to understand its function.

Les courts ARN non codants tels que les microARN, les piARN et les siARN sont de petites molécules d’ARN de 20 à 30 nucléotides de long qui sont très bien conservées au cours de l’évolution. Elles s’associent à des protéines Argonautes afin de former un complexe effecteur appelé RISC (RNA induced silencing complex). Ces courtes séquences, ne codant pour aucune protéine, agissent comme de puissants régulateurs de l’expression des gènes. De nombreuses évidences supportent qu’une dérégulation du niveau d’expression de ces courts ARN non codants contribue au développement et au maintien de nombreuses pathologies telles que le cancer. De ce fait, il est essentiel pour la cellule de contrôler la stabilité des courts ARN non codants. Le contrôle de la maturation et de la stabilité de ces courts ARN non codants sont des mécanismes peu connus. L’objectif principal de mon doctorat a donc été de mieux comprendre comment le niveau des courts ARN non codants est contrôlé. Afin d’étudier plus en détail comment le niveau des microARN est régulé, nous avons identifié la phosphatase PPM-2 (PP2Cα chez l’humain) et l’E3 ubiquitine ligase HECD-1 (HectD1 chez l’humain) comme étant de nouveaux interacteurs du complexe de dégradation des microARN. Nous avons utilisé des approches de génétique et de biologie moléculaire chez le nématode C. elegans, pour étudier le rôle de la perte de fonction de ppm-2 et d’hecd1 dans la voie des courts ARN non codants. Nos travaux ont montré que la perte de fonction de ppm-2 induit des défauts développementaux qui sont associés à des défauts de la voie des microARN. De plus, l’absence de ppm-2 exacerbe les phénotypes développementaux observés dans des animaux où la voie des microARN est altérée. De manière intéressante, chez le mutant ppm-2, nous avons constaté que d’autres voies de courts ARN non codants, telles que la voie des piARN et celle de l’endosiARN nucléaire, sont affectées. Du point de vue moléculaire, nous avons observé une déstabilisation du niveau d’expression de plusieurs protéines Argonautes dans le mutant ppm-2. En effet, ces dernières sont envoyées à la dégradation par la voie du protéasome seulement chez des animaux mutés pour ppm-2. Concernant l’étude de HECD1, nous avons remarqué que la perte de fonction de cette ubiquitine ligase entrainait une diminution de la progéniture et une létalité embryonnaire attribuable à des défauts dans la gamétogénèse. De plus, nous avons observé une accumulation de miARN fonctionnels chez des animaux mutés pour hecd-1. L’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la transcription ou la dégradation des miARN. En conclusion, nos résultats suggèrent que PPM-2 permet de contrôler la stabilité des protéines Argonautes en les dirigeant dans une voie alternative de dégradation et que l’ubiquitine ligase HECD-1 pourrait être impliquée dans la régulation des miARN en modulant leur transcription ou leur dégradation. Mes travaux de doctorat nous ont permis de mettre en lumière un nouveau modulateur des courts ARN non codants, PPM-2, qui agit via le contrôle de la régulation des Argonautes. Les avancées de la recherche dans le domaine des courts ARN non codants pourra permettre le développement de nouvelles thérapies. / Small non-coding RNAs, like microRNAs, piRNAs or siRNAs, are small RNA molecules, 20 to 30 nucleotides long that are conserved during evolution. They form an induced silencing complex (RISC) in association with Argonaute proteins to regulate gene expression. Small non-coding RNAs are involved in the regulation of genes implicated in cell proliferation, differentiation and development. Many evidences support that deregulation of the expression level of those small non-coding RNAs contribute to the development of pathologies such as cancer. It is therefore essential for cells to control small non-coding RNA stability. The control of maturation and stability of those small molecules are poorly understood. The main objective of my doctorate was to better understand how the stability of small non-coding RNAs is controlled. In order to study in more detail how miRNAs are regulated, we identified two factors involved in miRNA turnover in C. elegans. We found that the phosphatase PPM-2 (PP2Cα in human) and the E3 ubiquitin ligase HECD-1 (HectD1 in human) are new components of the miRNA degradation complex. Using the power of the nematode C. elegans and molecular biology, we characterized the role of the loss of function of PPM-2 and HECD-1 in small non-coding RNA pathways. Loss of this phosphatase induces developmental defects which are associated with a defect in the miRNA pathway. Genetically, the phosphatase mutant exacerbates the phenotypes that are observed in animals where the miRNA pathway is affected. Interestingly, we further observed that the loss of the phosphatase affects other small non-coding RNA pathways like the piRNA and the siRNA pathways. At the molecular level, we observed a decrease in the expression level of many Argonaute proteins in phosphatase mutant animals. Upon blocking proteasomal degradation with MG132, we noticed that Argonaute proteins are sent to proteasomal degradation in phosphatase mutant animals. Concerning HECD-1, we noticed that the loss of function of the E3 ubiquitin ligase leads to the decrease of progeny and embryonic lethality due to defects in gametogenesis. Moreover, we observed an accumulation of functional miRNAs. This protein can be implicated in transcription or turnover of miRNAs. VIIn conclusion, our data suggest that PPM-2 controls the stability of Argonaute proteins by sending them through an alternative degradation pathway and that HECD-1 could be implicated in miRNA regulation by modulating their transcription or degradation. My doctoral work helped to highlight a new modulator of small non-coding RNAs, PPM-2, which acts through the regulation of Argonaute protein. A better understanding of the mechanisms controlling the stability and the function of these strong regulators will be useful to develop new therapies.

La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.