Le retard mental (RM) est une maladie incurable qui affecte 2 à 3 % de la population. Des mutations dans le gène GDI1, codant pour GDIa, un régulateur des GTPases Rab, sont associées à un RM chez l'homme. Un médicament ayant pour cible un gène ayant une fonction antagoniste à GDI1 pourrait réduire les symptômes de la maladie. Une mutation suppressive est une 2e mutation à un site différent de la mutation à l'étude, qui supprime le phénotype de la première mutation. Afin d'identifier ces suppresseurs génétiques, nous utilisons une approche couplant la génomique intégrative et la génétique chez un animal modèle, le nématode Caenorhabditis elegans. La réduction de l'expression de gdi-1 par traitement des nématodes à l'ARN interférent (ARNi) nous a permis d'observer 7 phénotypes: la stérilité (Ste); une altération de la morphologie de la gonade (Gon); une accumulation d'oocytes endomitotiques (Emo); une diminution de la contraction des cellules myoépithéliales de la gaine de la gonade, un défaut de morphologie des oocytes matures et une inhibition de l'endocytose des particules yolk (YPl70-GFP) par les oocytes. Nous montrons que gdi-1 joue un rôle important dans le contrôle de la morphologie des gonades et des oocytes. Notre laboratoire a récemment développé un outil bioinformatique permettant la prédiction d'interactions génétiques chez C. elegans. Nous avons utilisé les prédictions faites pour gdi-1 afin d'estimer la performance de ce prédicteur. Cette étude nous a permis d'identifier des partenaires fonctionnels de gdi-1 dont les fonctions neurologiques ont déjà été reconnues chez l'homme et de prouver le grand potentiel prédictif de notre outil bioinformatique. Parmi les partenaires fonctionnels identifiés pour gdi-1, il y a dyb-1 (dystrobrevin) qui est l'orthologue le plus près de dystrobrévine chez l'homme, une protéine associée à certaines formes de RM et une dystrophie musculaire. De plus, gdi-1 (ARNi) diminue le phénotype de dystrophie musculaire associé à dyb-1. Plusieurs gènes qui interagissent avec gdi-1, interagissent aussi avec des protéines motrices, dont la myosine qui contrôle la contraction de la machinerie actinemyosine. Ces résultats sont en accord avec le rôle montré pour gdi-1 dans le contrôle de la contraction de la gonade, ainsi que dans la morphologie des gonades et des oocytes. Notre approche nous a permis d'identifier des suppresseurs génétiques de gdi-1 chez le nématode C. elegans qui pourrait s'avérer être des cibles thérapeutiques prometteuses contre certaines formes de RM. De plus, cette approche nous a permis d'identifier une famille d'agents actifs pouvant être testée comme agents thérapeutiques contre les déficits neurologiques associés à la délétion fonctionnelle de GDI-1 chez la souris. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : gdi-1, retard mental, plasticité synaptique, dystrophie musculaire, ML-7, Rab, dystrobrévine, Caenorhabditis elegans, cible thérapeutique.

La myopathie de Duchenne se caractérise principalement par une forte dégénérescence musculaire, due à l'absence de la dystrophine. La fonction de la dystrophine et les causes de la dégénérescence musculaire qui survient en son absence ne sont pas connues. <br />J'ai combiné des études chez les modèles animaux Cænorhabditis elegans et souris de cette maladie, afin d'essayer d'élucider les mécanismes de la dégénérescence musculaire.<br />Nous avons montré que le canal potassium SLO-1 et l'homologue de la syntrophine, STN-1, sont fonctionnellement reliés à l‘homologue de la dystrophine de C. elegans, DYS-1. Nous avons entrepris le crible du génome entier de C. elegans à la recherche de gènes supprimant la dégénérescence musculaire. Au cours de ce crible, nous avons montré que la voie de la dégradation protéique ainsi que plusieurs protéines kinases sont impliqués dans la dégénérescence musculaire. En parallèle, j'ai participé à la recherche de molécules actives sur la dégénérescence musculaire de C. elegans, puis chez la souris mdx. Nous avons notamment confirmé chez la souris mdx l'effet bénéfique de l'activation de la voie sérotoninergique.

Dans l'environnement, l'évolution contemporaine des organismes vivants est de plus en plus dépendante des perturbations d'origine anthropique. En particulier, la pollution amplifie l'intensité ou la quantité des pressions de sélection auxquelles sont soumises les populations. Or ces changements peuvent avoir des effets négatifs sur la vie, la reproduction et la croissance des individus. La démographie des populations peut aussi être affectée, tout comme au cours des générations, les caractéristiques phénotypiques et génétiques de ces populations. Ainsi en réponse aux pressions de sélection, des changements microévolutifs sont susceptibles de se manifester. Mais ces phénomènes entraînent en parallèle la mise en place de coûts adaptatifs. Par exemple, une réduction de la diversité génétique d'une population induit une diminution du potentiel adaptatif face à d'autres contraintes. Ceci peut fragiliser le maintien de populations vivant dans des environnements toujours plus changeants, notamment avec l'accroissement des activités humaines. Dans une démarche d'évaluation des risques écologiques, il ne suffit donc plus d'étudier les mécanismes d'action et les effets néfastes immédiats des polluants sur les organismes vivants. Il est également nécessaire de développer nos connaissances sur l'évolution des populations en milieu pollué, et plus globalement en milieu stressant. Dans ce contexte, cette étude vise à déterminer les réponses microévolutives de populations d'un organisme modèle, Caenorhabditis elegans, exposées à des stress environnementaux et à mesurer les coûts adaptatifs de ces microévolutions. Ces populations ont été exposées expérimentalement, durant 22 générations, à une forte concentration en uranium, en chlorure de sodium ou à une alternance de ces deux polluants. L'analyse des modifications phénotypiques et génétiques observées, au travers des mesures de traits d'histoire de vie, a été accomplie grâce à plusieurs techniques de génétique quantitative. Nous avons notamment mis en évidence une différentiation génétique des populations exposées, associée à augmentation de la résistance, au cours du temps. La vitesse des réponses évolutives était dépendante des conditions d'exposition et de leurs effets sur l'expression de la structure génétique des traits (matrice G). Ces phénomènes microévolutifs ont pu être reliés à des coûts adaptatifs, tels qu'une réduction de la fertilité, dans de nouveaux environnements stressants (ex : augmentation de la température) ou en l'absence de stress. Ainsi, même après plusieurs générations sans la présence de polluant, les populations adaptées voient leur fragilité augmenter par rapport à des populations non adaptées. Toutefois, nous n'avons pas identifié de coûts supplémentaires pour les populations adaptées à l'environnement d'alternance par rapport à celles adaptées à une pollution constante. Ce projet nous a permis de mieux identifier comment une exposition à un ou deux polluants peut affecter la réponse évolutive de populations de C. elegans et d'évaluer les conséquences sur leur sensibilité aux conditions environnementales. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : évolution expérimentale, génétique quantitative, coûts adaptatifs, stress environnementaux, traits d'histoire de vie, structure génétique, adaptation locale, évolution du généralisme, Caenorhabditis elegans, pollution, uranium

L'utilisation de la biologie moléculaire pour la caractérisation des enzymes impliquées dans le métabolisme des hormones stéroïdiennes a fait progresser de manière importante les connaissances en endocrinologie. L'étude de la stéroïdogenèse a mené à d'importantes découvertes, notamment en ce qui a trait au traitement du cancer de la prostate et à diverses avenues thérapeutiques pour lutter contre le cancer du sein. Récemment, notre laboratoire a décrit la 17P-HSD de type 12, une enzyme impliquée dans la formation de l'estradiol chez l'humain. Ce mémoire poursuit les analyses amorcées en caractérisant l'orthologue murin de cette enzyme tout en identifiant un ancêtre commun chez C. elegans. La faible taille de la chaîne latérale de l'acide aminé en position 234 (alanine et méthionine) chez ces deux homologues comparativement à l'enzyme humaine (phénylalanine) permet l'entrée de substrats plus gros au site actif, ce qui affecte la spécificité. Je démontrerai donc que la 17P-HSD de type 12 chez la souris et chez C. elegans catalyse aussi bien la formation des androgènes que des estrogènes. / The use of molecular biology in the characterisation of enzymes involved in steroid hormone biosynthesis has led to great advances in endocrinology. Prostate cancer treatment and breast cancer therapies are some examples of tremendous discoveries which took place due to our understanding of steroidogenesis. Recently, our research group described type 12 17P-HSD which activates estrone by transforming it into estradiol, a powerful estrogen in human. This thesis focuses on the characterisation of its mouse and C. elegans homologs. The smaller size of amino acid 234 permits the entry of a wider variety of substrates into the active site of those two homologs compared to the human enzyme, thus affecting the specificity. In this work, I will prove that mouse and C. elegans type 12 17PHSD catalyzes the formation of both androgens and estrogens

Chez le nématode Caenorhabditis elegans (C. elegans), le cofacteur mdt-15, orthologue à Med15 chez le mammifère, est essentiel à l’homéostasie des lipides. Aussi, l’inhibition pharmacologique de l’interaction entre Med15 et le facteur de transcription SREBP améliore le profil lipidique chez des souris obèses. Le foie, organe important du métabolisme énergétique, peut subir des dérèglements lors du vieillissement et dans l’obésité. La modulation des niveaux hépatiques de Med15 dans ces conditions pathologiques est toutefois inconnue. Cette étude visait donc à évaluer l’expression de Med15 au foie dans le vieillissement et l’obésité. Les modèles de vieillissement étaient des souris C57Black/6J (B6), des rats Sprague-Dawley (SD) et des rats Lou (modèle de vieillissement réussi) de différents groupes d’âges et sous diète faible en gras (LFD). MED15 a également été mesuré dans du foie humain provenant de 3 groupes de patients obèses jeunes, d’âge intermédiaire et vieux. Afin de dissocier les effets du vieillissement de ceux de l’obésité, Med15 a été mesuré dans des souris ob/ob ou db/db sous LFD et des souris B6 sous diète riche en gras (HFD) âgées de 4 mois. L’expression de Med15 était diminuée chez les souris B6 et les rats SD âgés mais demeurait stable chez les rats Lou vieux et les patients âgés. Les niveaux de Med15 étaient diminués chez les souris ob/ob et db/db. En revanche, ses niveaux protéiques hépatiques étaient augmentés chez les souris sous HFD. La conclusion générale, tirée des liens établis entre les résultats présentés ici et la littérature, est que l’expression de Med15 serait bénéfique chez un organisme sain mais que sa diminution permettrait de freiner les troubles métaboliques associés au vieillissement et à l’obésité. Des études in vitro et in vivo sur les impacts des variations observées dans cette étude permettraient de caractériser Med15 comme modulateur métabolique chez le mammifère. / In the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans), the mdt-15 cofactor, orthologous to the mammalian Med15, is essential for lipid homeostasis. Furthermore, pharmacological inhibition of the interaction between Med15 and Sterol Regulatory Element Binding Protein (SREBP) transcription factor improves the lipid profile in obese mice. The liver, important organ of energy metabolism, may undergo disorders during aging and in obesity. Modulation of Med15 hepatic levels under these two conditions is however unknown. This study aimed therefore to evaluate hepatic Med15 expression in several aging and obesity models. The aging models were C57Black/6 Jackson (B6) mice, Sprague-Dawley (SD) rats and Lou rats (a successful aging model) in different age groups and under low-fat diet (LFD). MED15 was also measured in human liver from 3 groups of obese young, middle-aged and old patients. In order to dissociate the effects of aging from those of obesity, Med15 expression was measured in 4 months old ob/ob or db/db mice under LFD and B6 mice under high-fat diet (HFD). Med15 expression was decreased in old B6 mice and SD rats but remained stable in old Lou rats and elderly patients. Med15 levels were diminished in ob/ob and db/db mice. However, Med15 protein levels were increased in mice under HFD. The general conclusion, drawn from links established between the results presented here and the literature, is that Med15 expression would be beneficial in a healthy organism but its decrease would curb the metabolic disorders associated with aging and obesity. In vitro and in vivo studies on the impacts of the variations observed in this study would allow for the Med15 characterization as a key metabolic modulator in mammals. / Résumé en espagnol

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l'absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n'existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l'Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l'actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l'instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L'absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu'un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d'homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d'étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l'orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d'étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l'expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu'elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. [...]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L'identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l'intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l'effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L'expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l’absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n’existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l’Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l’actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l’instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L’absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu’un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d’homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d’étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l’orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d’étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l’expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu’elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. […]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L’identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l’intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l’effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L’expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante. / Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is an X-linked progressive muscle disease which is caused by mutations in the dystrophin gene. Until now, there is no effective therapy for DMD. As the largest gene in human beings, it produces a 427-kDa cytoskeleton protein: Dystrophin. Dystrophin links actin and dystrophin associated protein complex (DAPC) in muscles. Currently, there are 3 hypotheses to explain the mechanisms of DMD. They suggest that the absence of dystrophin could lead to periodic muscle cell membrane ruptures, or affect the distribution and function of ion channels, or perturb signal transduction pathways. In Caenorhabditis elegans, there is only one homologue of mammalian dystrophin gene named dys-1, and the nematode protein DYS-1 presents 37% similar to the human one. The double mutant dys-1; hlh-1 exhibits a severe progressive muscle degeneration. The protein composition of the sarcomere has been studied and it has revealed a high degree of similarity with mammalian sarcomere. These allow C. elegans be a relevant animal model to study DMD.To understand why the lack of dystrophin induces muscle degeneration in mammals and worms, and to find new drugs that might help in reducing muscle degeneration, L. Ségalat and his coworkers performed several screens for drugs and genes suppressing muscle degeneration. An interesting gene pkc-2 came out and was considered as a possible regulator in the process of muscle degeneration in C. elegans. The protein that is encoded by this gene in C. elegans is an orthologous of the human gene Protein Kinase C Alpha (PKC), which belongs to the family of serine/threonine specific protein kinases. To study the function of pkc-2, we generated different recombinant constructs, analyzed the expression pattern of pkc-2 with immunocytochemistry, and performed yeast two-hybrid to search for PKC-2 binding partners. In addition, a neurotransmitter serotonin (5-HT) was found by drug screening to be an active blocker of striated muscle degeneration. As C. elegans lacking PKC-2 displays a severe blister phenotype in exogenous 5-HT, studying the correlation between PKC-2 and 5-HT therefore seems to be an opportunity to explore the reasons of muscle degeneration. A genetic screen with EMS (ethane methyl sulfonate) to search serotonin resistant mutant in strain pkc-2 (ok328) would help us study further about the role of pkc-2.In this thesis, different clones myo3::pkc-2 and pkc-2::gfp were made to inject into wild-type animals. The results revealed that pkc-2 expressed intensely in neurons and pharynx, but was not found in body-wall muscles. Mutants dys-1;hlh-1 fed with pkc-2 RNAi did not reduce muscle degeneration statistically comparing to triple mutant pkc-2;dys-1;hlh-1. This indicated that PKC-2 may be dominantly acting in neurons. A yeast two-hybrid screen identified the gene Y59A8A.3, which is a homologue to mammalian filamin A interacting protein 1 isoform 3, as a binding partner of PKC-2. Filamin A is a cytoskeleton protein, anchoring various trans-membrane proteins to the actin cytoskeleton and may also function as an important signaling scaffold. The result suggested that PKC-2 may therefore modulate filamin A activity through the filamin interacting protein 1. Genetic screen by EMS presented 8 candidates named cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276, which were mapped on chromosomes by SNP mapping using a polymorphic C. elegans strain, but time was too short to identify these genes formally. The experiment also offered possibilities of searching links between PKC-2 and serotonin pathways.In summary, this work studied the gene pkc-2 in order to reveal the function of PKC-2 and its involvement in muscle degeneration. The present results answered some questions about pkc-2, and needed further researches to elucidate the in vivo role of PKC-2 protein and its interaction with other proteins in the mechanism of muscle dystrophy in C. elegans.