Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Dans notre laboratoire, des études antérieures ont montré que la stimulation du récepteur AT[indice inférieur 2] par l'angiotensine II menait à l'activation des p42/p44[indice supérieur MAPK] (GENDRON et al., 1999) par une voie impliquant les protéines Rapt et B-Raf chez les cellules NG108-15 (GENDRON et al., 2003a) et que cette voie était nécessaire à l'élongation neuritique. Parallèlement à l'activation de la voie MAPK, il a été montré que le R-AT[indice inférieur 2] active la voie NOS/GCs/GMPc (GENDRON et al., 2002). Puisqu'il est connu que les protéines kinases C (PKC) participent à la différenciation neuronale dans certains types cellulaires, le but de mon travail a été de déterminer si les PKC pouvaient participer aux mécanismes initiaux menant à l'activation des voies précédemment décrites. Nos résultats indiquent que les isoformes [alpha], [epsilon], [iota] et [zéta] sont exprimées dans cette lignée cellulaire et que l'inhibiteur de PKC[alpha], le Gö6976, induit une élongation neuritique importante en plus d'une diminution de la prolifération. Lors de traitements courts avec l'Ang II, nos données indiquent qu'il y a translocation de PKC[alpha] de la membrane plasmique à la fraction soluble, entraînant ainsi son inactivation. De plus, le traitement des cellules avec le Gö6976 provoque l'inhibition de p21[indice supérieur ras] mais active Rap1 de façon similaire à l'Ang II. Par contre, l'inhibition de PKC[alpha] n'a pas d'effet sur la capacité de l'Ang II à activer les p42/p44 MAPK . L'ensemble de ces résultats indique que PKC[alpha] serait en amont de la cascade de signalisation des p42/p44[indice supérieur MAPK]. Ainsi, l'inhibition de PKC[alpha] mène à la diminution de l'activité de p21 ras et de la prolifération cellulaire, ce qui pourrait contribuer à favoriser l'activation de la voie menant à p42/p44[indice supérieur MAPK] et l'élongation neuritique. Les isoformes PKC[epsilon], et PKC[zéta] seraient impliquées dans des processus différents de PKC[alpha] puisque l'utilisation d'inhibiteurs pharmacologiques sélectifs, soit le Gö6983 (inhibe PKC[alpha] et PKC[zéta] ou le GF109203X (inhibe PKC[alpha] et PKC[epsilon]), a montré qu'ils induisent l'élongation neuritique de façon similaire à l'Ang II ou l'inhibiteur de PKC[alpha]. En conditions basales, PKC[zéta] est associée à l'actine tandis que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 2] cause sa relocalisation dans le cytosol. Il pourrait s'agir d'un mécanisme de régulation de la polymérisation de l'actine. Pour sa part, l'isoforme [epsilon] semble impliquée dans la production de GMPc induite par le R-AT[indice inférieur 2]. De plus, la différenciation des cellules avec un traitement de 3 jours avec l'Ang II augmente l'association de PKC[epsilon] avec les microtubules. Cette isoforme pourrait être utile à la régulation de la ramification neuritique des cellules NG108-15. Ces résultats indiquent que les PKC sont impliquées dans la physiologie des cellules NG108-15, chacune ayant un rôle précis et distinct à jouer.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le paludisme constitue la première maladie parasitaire au monde, responsable d’environ 800 000 morts chaque année. Il peut entraîner plusieurs complications sévères aggravant le pronostique vital, et pouvant conduire à la mort. Dans ce contexte, l'objectif de ma thèse a été d'étudier, pour une majeur partie, la pathologie cérébrale et dans une moindre mesure la forme pulmonaire. Cette étude a plus particulièrement porté sur le rôle de certaines voies d’activation des lymphocytes T. Mes résultats ont mis en évidence la fonction primordiale, dans le développement du neuropaludisme, de trois molécules impliquées dans l’activation des cellules T : le récepteur LTβR, la protéine PKC-θ et la sous unité β2 du récepteur à l’IL-12. Grâce à l’utilisation d’un modèle murin délété en ces gènes, nous avons pu déterminer par des techniques non invasives (IRM, ARM) ou invasives (test de perméabilité vasculaire, cytométrie en flux) que ces souris étaient résistantes à la forme cérébrale. En revanche elles ne sont pas essentielles à la pathologie pulmonaire. / The malaria is the first parasitic pathology, responsible of 800 000 death a year. It can cause several severe complications which might deteriorating vital forecast and lead to the death. In this context, my thesis objective was to study, for major point, the cerebral pathology and in a lesser measure the lung pathology. This study concernes the role of some signaling pathways of T cells activation. My results show the involvement of three molecules in cerebral malaria development LTβR receptor, PKC-θ kinase and IL-12Rβ2 receptor subunit. With the use of knockout mice for these genes, we proved by non invasive approaches (MRI and MRA) or invasive approaches (vascular permeability test, flow cytometry) that these mice are resistant to cerebral malaria. By contrast they are not protected against lung pathology.

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde. / Connexin 43 (Cx43) is the basic unit in the composition of Gap junction channels but also of the non-junctional unapposed hemichannels (Hc). Gap junction channels play key roles in cardiac function by allowing conduction of electrical impulses and exchange of biologically important molecules between cells. The unapposed Hc, however, perform functions different from those achieved by Gap junction channels mainly by providing pathways between the cytosol and the extracellular space allowing movement of ions and other small metabolites. Although they are much less studied than Gap junction channels, Hc are believed to remain normally in a closed state and that phosphorylation is an important factor promoting their closure. Under ischemic stress,the amount of non-phosphorylated Cx43 increases resulting in increasing hemichannels opening, an effect that can lead to irreversible tissue injury and cell death. Protein kinase C (PKC) possesses the largest number of phosphorylation sites on Cx43 and exerts significant control on Cx43 channels. Its function depends on the involvement of at least 12 distinct isoformes. Various PKC isoforms exert specific cellular and cardiovascular functions, nonetheless the functional role of PKC isoforms in the modulation of the unapposed Cx43 hemichannels has never been assessed, neither has the therapeutic potential of Cx43Hc modulation in the protection of ischemic heart. In this context, three studies have been performed, they form the body of this thesis. In the first study, a unique set of synthetic PKC isoform-selective activator and inhibitor peptides was utilised. In combination with the patch clamp technique, we have demonstrated that Cx43Hc conductance is strongly inhibited by, among many isoforms, epsilon PKC isoforme, known for its cardioprotective effect against ischemic injury. In the second study, we characterized the effect of a synthetic structural mimetic peptide of Cx43. Using patch clamp technique, we have demonstrated that the peptide Gap26 inhibits directly and specifically Cx43Hc, we also showed that Gap26 can confer resistance to cardiomyocytes (in vitro) and intact heart (ex vivo) against ischemia. In the third study, we investigated for the first time in vivo the capability of a unique pair of structural Cx43 mimetic peptides, Gap26 and Gap27, to protect heart from ischemic injury when administered in single low-dose intravenous boluses. We demonstrated that administration of either one or both peptides, before or after the onset of ischemia renders heart more resistant to ischemia and reduces significantly the size of myocardial infarct. Altogether, our results revealed salvatory effect of Cx43Hc inhibition during ischemia and uncovered therapeutique potentials of the synthetic structural mimetic peptides of Cx43 in ischemic heart disease.

La myopathie de Duchenne est une maladie génétique qui se caractérise principalement par une dégénérescence progressive des muscles squelettiques dont la cause est l'absence de dystrophine fonctionnelle dans les muscles. A ce jour, il n'existe toujours pas de traitement efficace contre ces maladies. Comme le plus grand gène connu chez l'Homme, la dystrophine code pour une protéine de 427kDa. La protéine connecte l'actine avec le DAPC (Dystrophin Associated Protein Complex) dans les muscles striés. Pour l'instant, il y a 3 hypothèses concernant le mécanisme du DMD. L'absence de la dystrophine peut supprimer le lien physique entre les protéines structurales de la membrane basale (laminines) et les protéines structurales du cytosquelette (filaments intermédiaires et actine), ou la distribution et la fonction des canaux ioniques, ou des voies de signalisation nécessaires à la survie du muscle. Caenorhabditis elegans ne possède qu'un homologue du gène de la dystrophine humaine, le gène dys-1. La protéine DYS-1 présente 37% d'homologie avec la dystrophine humaine. Le double mutant dys-1(cx18) ; hlh-1(cc561) présente une forte dégénérescence musculaire. Comme le sarcomère de C. elegans ressemble au sarcomère de mammifère, C. elegans est modèle pertinent d'étude la maladie. En vue de comprendre la raison du DMD chez les mammifères et chez les vers, le groupe L. SEGALAT a effectué des cribles pour identifier les molécules et les gènes qui peuvent supprimer la dégénérescence musculaire. On a trouvé un gène pkc-2 qui est capable de supprimer la dégénérescence musculaire chez C. elegans. La protéine PKC-2 est l'orthologue de la Protein Kinase C Alpha (PKC) humaine et appartient à la famille du serine/threonine protéine kinase. Afin d'étudier la fonction du gène pkc-2, on a analysé l'expression du gène avec les construits différents in vivo et a utilisé la technique de double-hybride dans la levure. De plus, le crible par EMS (éthane méthyle sulfonâtes) a identifié une molécule sérotonine (5-HT) qui est un neuromédiateur, et supprime partiellement la dégénérescence musculaire des doubles mutants dys-1; hlh-1. La sérotonine a aussi un effet fort sur le mutant pkc-2(ok328), puisqu'elle provoque un phénotype blister. Ça nous permet de rechercher le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. Le crible génétique peut contribuer à la connaissance du rôle pkc-2. [...]. Elle sert aussi de plate-forme de voie de signalisation intracellulaire. L'identification de Y59A8A.3 propose la possibilité que pkc-2 modifie la filamin A par l'intermédiaire de la filamin A interacting protéine 1. Le crible génétique par EMS pour rechercher des suppresseurs de l'effet blister de la sérotonine sur les mutants pkc-2(ok328) a donné 8 candidats sur 5000 F1s : cx253, cx254, cx259, cx263, cx267, cx268, cx270, cx276. Les mutations ont été localisées sur les chromosomes par SNP mapping avec une souche de C. elegans très polymorphe, mais le temps a manqué pour leur identification exacte. L'expérience valide notre approche à étudier le lien entre la signalisation sérotoninergique et pkc-2. En résumé, le but de la thèse était de rechercher la fonction du gène pkc-2 dans les mécanismes moléculaires conduisant à la nécrose musculaire en absence de dystrophine. Les résultats présentés dans la thèse apportent des réponses aux questions fondamentales sur pkc-2 et aussi demandent des expériences supplémentaires afin de élucider plus avant les mécanismes de la dégénérescence musculaire dystrophine-dépendante.

Le trouble bipolaire est une maladie invalidante caractérisée par une alternance d'épisodes maniaques et dépressifs. Malgré des efforts de recherche notables, la physiopathologie et les mécanismes d'action des traitements du trouble bipolaire demeurent peu connus. La protéine kinase C (PKC) est récemment apparue comme une cible moléculaire potentielle pour le traitement du trouble bipolaire. Dans ce travail de thèse, nous avons cherché à étudier le rôle de la PKC dans les phases maniaque et dépressive du trouble bipolaire. Nous avons montré que l'inhibition de la PKC a un effet antimaniaque non seulement chez le rat naïf, mais aussi dans un modèle de manie basé sur une privation de sommeil, que nous avons validé au cours de notre étude. De plus, les inhibiteurs de la PKC sont capables de rétablir les déficits de prolifération cellulaire hippocampique que présentent les rats privés de sommeil. Ces effets prolifératifs et antimaniaques seraient indépendants, puisque le blocage de la prolifération cellulaire n'abolit pas l'efficacité antimaniaque des inhibiteurs de la PKC dans le modèle de privation de sommeil. En parallèle, nous avons montré que l'activation de la PKC a un effet antidépresseur chez le rat naïf, alors que son inhibition provoque un phénotype pseudodépressif qui s'accompagne d'une diminution de la prolifération cellulaire hippocampique. L'ensemble de ces données révèle une implication de la PKC dans les deux phases du trouble bipolaire, et soutient l'hypothèse qu'une suractivation du système PKC serait à l'origine des perturbations de neuroplasticité associées à la manie.

La connexine 43 (Cx43) est l’unité protéique de base dans la formation des canaux des jonctions gap (JG) responsables des échanges intercellulaires. Toutefois, elle forme aussi des canaux non-jonctionnels à large conductance, nommés hémicanaux (Hc), qui fournissent un accès entre l’intérieure des cellules et le milieu extracellulaire. Bien qu’ils soient beaucoup moins étudiés que les JG, on estime que les Hc restent normalement à l’état fermé, et ce, grâce à la phosphorylation des connexines qui les forment. Suite à un stress ischémique, les Cx43 se déphosphorylent et entraînent ainsi l’ouverture des Hc de Cx43 (HcCx43), un effet qui compromet la survie des cellules. La protéine kinase C (PKC) est l’enzyme de phosphorylation qui possède le plus grand nombre de sites de phosphorylation sur la Cx43 en comparaison avec les autres kinases. Ses fonctions dépendent de la mise en jeu d’un répertoire d’au moins 12 isoformes distinctes. Dans les cardiomyocytes, les isoformes de PKC participent au développement des réponses adaptées ou mésadaptées au stress ischémique. Malgré que la régulation des canaux de Cx43 par la PKC lors d’une ischémie soit bien documentée, il n’existe pas à l’heure actuelle de connaissances sur les effets fonctionnels spécifiques qu’exercent des différentes isoformes de PKC sur les HcCx43, ni sur la valeur thérapeutique de la modulation de ses derniers. Dans ce contexte, nous avons proposé que les HcCx43 sont régulés sélectivement et différentiellement par les différentes isoformes de PKC et que l’inhibition spécifique de ces hémicanaux peut protéger le coeur lors d’un événement ischémique. Le présent travail comporte trois études qui ont été entreprises spécialement dans le but de valider ces hypothèses. Dans la première étude, nous avons profité de l’expertise du laboratoire du Dr Baroudi dans la dissection des isoformes de PKC pour étudier le rôle fonctionnel de chacune d’elles dans la régulation des HcCx43 en utilisant une gamme unique de peptides synthétiques inhibiteurs et activateurs spécifiques des isoformes de PKC, en combinaison avec la technique du patch-clamp. Nous avons démontré, entre autre, que les HcCx43 sont particulièrement inhibés par l’isoforme PKC epsilon, connue pour son effet cardioprotecteur contre les dommages ischémiques lors d’un préconditionnement ischémique. Dans la deuxième étude, nous avons caractérisé l’effet d’un peptide synthétique mimétique structural de la Cx43 sur la fonction des HcCx43. En plus d’avoir élucidé ces effets sur les propriétés fonctionnelles du canal, nous avons démontré d’une manière directe et indéniable que le peptide Gap26 inhibe et spécifiquement les HcCx43 et que son administration in vitro (cardiomyocytes isolés) et ex vivo (coeur intact) confère à ces modèles expérimentaux une résistance importante contre le stress ischémique. Dans la troisième étude, nous avons investigué pour la première fois in vivo le potentiel de deux peptides uniques mimétiques structuraux de la Cx43, Gap26 et Gap27, dans la cardioprotection contre les lésions ischémiques lorsqu’ils sont administrés à basse dose sous forme d’un bolus intraveineux unique. Nous avons démontré que l’injection de ces peptides avant ou après la survenue de l’ischémie réduit significativement la taille de l’infarctus qui en résulte.En conclusion, l’ensemble de ces résultats révèlent le rôle bénéfique de l’inhibition des HcCx43 lors d’une ischémie et dévoilent un potentiel thérapeutique prometteux des mimétiques structuraux de Cx43 dans la prévention et le traitement de l’infarctus du myocarde. / Connexin 43 (Cx43) is the basic unit in the composition of Gap junction channels but also of the non-junctional unapposed hemichannels (Hc). Gap junction channels play key roles in cardiac function by allowing conduction of electrical impulses and exchange of biologically important molecules between cells. The unapposed Hc, however, perform functions different from those achieved by Gap junction channels mainly by providing pathways between the cytosol and the extracellular space allowing movement of ions and other small metabolites. Although they are much less studied than Gap junction channels, Hc are believed to remain normally in a closed state and that phosphorylation is an important factor promoting their closure. Under ischemic stress,the amount of non-phosphorylated Cx43 increases resulting in increasing hemichannels opening, an effect that can lead to irreversible tissue injury and cell death. Protein kinase C (PKC) possesses the largest number of phosphorylation sites on Cx43 and exerts significant control on Cx43 channels. Its function depends on the involvement of at least 12 distinct isoformes. Various PKC isoforms exert specific cellular and cardiovascular functions, nonetheless the functional role of PKC isoforms in the modulation of the unapposed Cx43 hemichannels has never been assessed, neither has the therapeutic potential of Cx43Hc modulation in the protection of ischemic heart. In this context, three studies have been performed, they form the body of this thesis. In the first study, a unique set of synthetic PKC isoform-selective activator and inhibitor peptides was utilised. In combination with the patch clamp technique, we have demonstrated that Cx43Hc conductance is strongly inhibited by, among many isoforms, epsilon PKC isoforme, known for its cardioprotective effect against ischemic injury. In the second study, we characterized the effect of a synthetic structural mimetic peptide of Cx43. Using patch clamp technique, we have demonstrated that the peptide Gap26 inhibits directly and specifically Cx43Hc, we also showed that Gap26 can confer resistance to cardiomyocytes (in vitro) and intact heart (ex vivo) against ischemia. In the third study, we investigated for the first time in vivo the capability of a unique pair of structural Cx43 mimetic peptides, Gap26 and Gap27, to protect heart from ischemic injury when administered in single low-dose intravenous boluses. We demonstrated that administration of either one or both peptides, before or after the onset of ischemia renders heart more resistant to ischemia and reduces significantly the size of myocardial infarct. Altogether, our results revealed salvatory effect of Cx43Hc inhibition during ischemia and uncovered therapeutique potentials of the synthetic structural mimetic peptides of Cx43 in ischemic heart disease.