Nous assistons actuellement à un vieillissement global de la population. Dans la majorité des pays, le groupe d’âge des 60 ans et plus est celui qui croît le plus rapidement. L’OMS estime que d’ici 2050, plus d’une personne sur cinq sera âgée de plus de 60 ans. Le vieillissement se caractérise par une perte graduelle de fonction de nombreux processus physiologiques. Ce processus biologique touche chaque espèce et chaque individu de manière spécifique. De nombreux facteurs, autant individuels (comportement, génétique, maladie), qu’environnementaux (situation géographique, socio-économique, pollution) vont influencer le vieillissement. Le vieillissement est d’ailleurs un facteur de risque important pour le développement de nombreuses maladies telles que le diabète de type 2, l’athérosclérose et les maladies cardiovasculaires. Il a déjà été démontré dans la littérature que la modulation d’un seul gène peut influencer, autant positivement que négativement, le vieillissement d’un individu. Les gènes ayant des effets sur ce processus sont habituellement des gènes jouant un rôle important dans une voie de signalisation et donc, sont souvent conservés à travers l’évolution. Les travaux décrits dans cette thèse montrent l’implication du gène R148.3 dans le processus de vieillissement du nématode C. elegans. Ce gène semble être impliqué dans différentes voies métaboliques pouvant avoir un impact sur la santé à long terme des nématodes. R148.3 semble réguler le métabolisme lipidique et les dépôts lipidiques dans les vers ainsi que la résistance au stress. L’inactivation de ce gène provoque des effets néfastes qui mènent à la dégradation rapide de plusieurs fonctions métaboliques et à la mort prématurée des vers. Les résultats obtenus dans cette étude confirment le lien entre R148.3 et le contrôle du vieillissement en santé chez C. elegans. Les prochaines étapes de cette recherche seraient de démontrer ces mêmes fonctions chez les mammifères. / We are currently witnessing the global aging of the population. In almost every country, the age group of 60 and over is growing faster than any other group. The WHO estimates that by 2050, more than 1 in 5 people will be 60 years or older. Aging is characterized by a gradual loss of function of many physiological processes. This biological process affects each species and each individual independently. Many factors, both individual (behavior, genetics, disease) and environmental (geographical location, socio-economic, pollution) will influence aging. Aging is also an important risk factor for the development of many diseases such as type 2 diabetes, atherosclerosis and cardiovascular diseases. It has already been reported in the literature that modulation of a single gene can influence, both positively and negatively, the aging process of an individual. Genes with effects on this process are usually genes that play an important role in a signalling pathway, and therefore are often conserved across evolution. The work described in this thesis shows the involvement of the R148.3 gene in the aging process of the nematode C. elegans. This gene appears to be involved in various metabolic pathways that may impact on long-term health of nematodes. R148.3 appears to regulate lipid metabolism and fat depots, as well as the resistance to stress. Inactivation of this gene causes adverse effects that lead to rapid degradation of several metabolic functions and the premature death of worms. The results obtained in this study confirm the link between R148.3 and healthy aging control in C. elegans. The next steps in this research would be to demonstrate these functions in mammals.

Les voies de régulation dépendant des courts ARN non-codants contrôlent plusieurs processus biologiques. Ces courts ARNs sont important dans le développement des cellules germinales de plusieurs espèces ainsi que dans la régulation génique et la résistance virale. Néanmoins, la contribution de la voie de régulation dépendant des microARNs dans la biogénèse des cellules germinales demeure peu comprise. Étant donné que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont exclusivement impliquées et indispensables à la voie des microARNs, nous avons décidé de manipuler génétiquement ces gènes afin de déterminer si la voie des microARNs est importante dans la prolifération et différentiation des cellules germinales des animaux en utilisant le nématode Caenorhabditis elegans comme modèle d’étude. La perte de fonction des gènes alg-1 et alg-2 rend les animaux stériles, ce qui est similaire aux phénotypes observés chez les nématodes mutant pour Drosha et Dicer (deux enzymes essentielles à la production des microARNs). Ainsi, ceci supporte que la voie de régulation des microARNs joue un rôle essentiel pour le maintien des cellules germinales. Pour définir le rôle précis de ALG-1 et ALG-2 dans les processus complexes de régulation des cellules germinales, nous avons tout d’abord établi la descendance des souches mutantes alg-1(gk214) et alg-2(ok304). Ces deux souches de nématodes ont un faible nombre de descendant qui peut s’expliquer par un problème dans la prolifération des cellules germinales, de méiose ou dans la formation de gamètes. Une analyse précise des gonades de ces animaux indique une plus petite région mitotique avec un nombre de cellules germinales en prolifération inférieur à celui retrouvé chez les animaux de type sauvage. Nous avons aussi observé que les cellules entrent en méiose de manière plus précoce dans les animaux alg-1 et alg-2 mutants, que ces mutants ont des défaut dans la formation de gamètes et qu’ils ont un nombre plus élevé de cellules germinales apoptotiques. En utilisant l’immunofluorescence et des rapporteurs d’expression, nous avons confirmé que ALG-1 et ALG-2 sont exprimées dans la DTC, une cellule spécialisée situé à l’extrémité distale des gonades de C. elegans qui est au cœur de la régulation de la transition mitose-méiose des cellules germinales. En utilisant une lignée transgénique qui exprime ALG-1 exclusivement dans la DTC, nous pouvons partiellement rétablir le nombre de descendants ainsi que rétablir totalement le nombre de cellules retrouvé dans la région mitotique. De façon intéressante, nous observons que la perte de cinq microARNs exprimés dans la DTC mène à des phénotypes similaires à ceux observés dans les mutants alg-1 et alg-2. Finalement, l’analyse de l’expression génique par micropuces des gonades de vers alg-1 mutant indique que la voie des microARNs contribue à la régulation de différentes voies moléculaires importantes pour la prolifération et la différentiation des cellules germinales. L’ensemble de ces études supporte l’implication de la voie des microARNs dans le contrôle de la biogénèse des cellules germinales chez C. elegans. / Small non-coding RNA pathways assume pleiotropic roles in the regulation of multitude of biological processes. These non-coding RNAs have been shown to be involved in germline development in diverse species, in addition to their well-known participation in gene regulation and viral resistance pathways. However, the contribution of the miRNA, one of the small non-coding RNA pathways in germline biogenesis has remained elusive. Since ALG-1 and ALG-2 are exclusively involved in the miRNA pathway and indispensible for miRNA mediated gene silencing, we decided to genetically manipulate these genes to address whether miRNA pathway plays an important role in germline proliferation and differentiation using C. elegans as animal model. As double knockout of alg-1 and alg-2 leads to sterility, which mirrors the phenotypes of Drosha and Dicer mutants, we reasoned that the miRNA pathway proteins are crucial in germline maintenance. To delineate the role of ALG-1 and ALG-2 in the complex processes of germline regulation, we first investigated the brood size of alg-1(gk214) and alg-2(ok304) animals. Both mutants had significantly decreased brood size, which could result from defects in germline proliferation, meiosis or gamete formation. An extensive analysis of the germline of these mutants revealed a smaller mitotic region with less number of proliferating germ cells compared to the wild type. We also observed early entry into meiosis in alg-1(gk214) and alg-2(ok304). Using immunofluorescence and transgenic reporters, we confirmed ALG-1 and ALG-2 expression in DTC, a specialized cell located at the tip of both C. elegans gonadal arms that regulates mitosis-meiosis transition. Using transgenic line with alg-1 expressed exclusively in the DTC, we were able to partially rescue the brood size defect and completely restored the number of cells in the mitotic region. These mutants also presented defects in gamete formation and an increase in germ cell apoptosis. Interestingly, we observed that the disruption of five miRNAs expressed in the DTC display similar phenotypes as observed in alg-1 and alg-2 mutants. Finally, gene expression analysis by microarray of alg-1 mutant gonads indicates that the miRNA pathway is involved in the regulation of different pathways important for germline proliferation and differentiation. Together, our data supports the role of miRNA pathway in controlling germline biogenesis in C. elegans.

La voie des microARNs est un mécanisme post-transcriptionnel de régulation génique qui contrôle divers aspects développementaux et physiologiques chez de nombreux eucaryotes supérieurs. Afin de mieux comprendre les rôles et modes d’actions des microARNs, nous avons entrepris l'exploration des interactions génétiques de cette voie chez le nématode \textit{Caenorhabditis elegans}. Nous nous sommes ainsi concentrés sur les gènes codant pour les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2, qui sont les principaux constituants effecteurs de cette voie. Premièrement, nous avons caractérisé la relation entre ces deux paralogues, en étudiant respectivement leur expression spatio-temporelle, leur association avec des microARNs, ainsi que les phénotypes associés à leur perte de fonction. Nous avons ainsi pu définir des caractéristiques communes et spécifiques pour chacune de ces deux protéines Argonautes et décrire de manière précise leurs rôles essentiels lors du développement embryonnaire. En effet, nous avons démontré que l'absence d'expression zygotique des protéines ALG-1/2 provoque un arrêt du processus morphogénétique lors de l'allongement des embryons et un défaut dans les structures de fixation épidermique-musculaires. Deuxièmement, nous avons realisé un criblage génétique dans le but d'identifier des nouveaux partenaires des protéines Argonautes ALG-1/2. Nous avons découvert le gène codant pour la protéine VPS-52, qui est un composant du complexe GARP (\textit{Golgi Associated Retrograde Protein}). La caractérisation de ce gène nous a permis de démontrer que VPS-52 interagit génétiquement avec le gène \textit{alg-1} et se comporte comme un modulateur positif de l'activité de certains miARNs impliqués dans le développement larvaire. Les mutants de \textit{vps-52} aggravent les défauts des cellules souches épidermales observés dans les mutants de \textit{alg-1} et du microRNA \textit{mir-48}. Ils augment également la létalité du mutant \textit{let-7(n2853)} et ce dépendement de sa cible. Ces augmentations phénotypiques sont liées à une baisse des niveaux des microARNs miR-48, miR-241 et des protéines GW182. Cette étude nous amène donc à proposer que l'activité des microARNs peut être contrôlée en partie par un mécanisme de transport rétrograde dépendant du complexe GARP. / The microRNA pathway is a post-transcriptional gene regulatory system that controls multiple developmental and physiological processes in many eukaryotes. We have undertaken the exploration of the genetic interactions of this pathway in the nematode \textit{Caenorhabditis elegans}, with the goal of unveiling processes controlled by microRNAs and the mechanisms of microRNA action. We focused on the genetic interactions of the \textit{alg-1} and \textit{alg-2} genes, that encode the microRNA-specific Argonaute proteins, key effector constituents of this pathway. In the first place, we characterized the relationship between these two argonaute paralogs, with respect to their spatio-temporal expression, association to microRNAs, and loss-of-function phenotypes. Thus, we defined shared and gene-specific features of these Argonautes and defined in detail their essential role during embryonic development. The absence of zygotic \textit{alg-1} and \textit{alg-2} expression causes arrest during the morphogenetic process of elongation with defects in the epidermal-muscle attachment structures. Addressing another aspect, we sought to elucidate novel genetic interactors of these argonautes using a forward genetics approach. We identified \textit{vps-52}, a component of the GARP (Golgi Associated Retrograde Protein) complex, as a genetic interactor of the \textit{alg-1} gene and established that, through its GARP complex function, it effects a positive modulatory role on miRNA activity. Mutants of \textit{vps-52} exacerbate the seam cell defects in the loss-of-function alleles of \textit{alg-1} and the \textit{let-7} miRNA family member \textit{mir-48} and enhance the lethality of the \textit{let-7(n2853)} hypomorph in a target dependent manner. These phenotypic enhancements related to decreased levels of the \textit{let-7} family microRNAs (miR-48 and miR-241) and the worm GW182 protein. Furthermore, the positive effect of \textit{vps-52} on microRNA activity seems to be conserved in mammalian cells, where VPS52 co-fractionates with miRISC components. Our analyses allow us to propose that VPS-52 as part of the GARP complex participates in membrane-related processes of the miRNA pathway, which facilitate miRNA activity and operate at the effector miRISC level.

NOTICE EN COURS DE TRAITEMENT / Les microARN (miARN) sont des courts ARN non codants qui régulent l'expression des gènes, au niveau post-transcriptionnel. Ces molécules d'environ 22 nucléotides de long s'associent aux protéines Argonautes (AGO) pour former un complexe appelé microRNA induced silencing complex (miRISC). Ensuite, les miARN recrutent le miRISC à des séquences partiellement complémentaires, dans les régions 3' non traduites d'ARN messagers (ARNm). Le miRISC peut ainsi réprimer la traduction d'ARNm spécifiques et souvent induire leur dégradation. Ce mécanisme est notamment important pour le développement animal et des défauts dans cette voie moléculaire sont liés à diverses pathologies chez l'humain. Des évidences récentes montrent que les interacteurs du miRISC et son mode d'action sur les ARNm peuvent diverger à différents moments du développement du nématode Caenorhabditis elegans. Nous avons donc posé l'hypothèse que des modifications post-traductionnelles pourraient expliquer certaines de ces différences moléculaires et fonctionnelles. Les objectifs de ce projet de recherche étaient donc d'identifier les événements de phosphorylation sur la protéine Argonaute ALG-1 de C. elegans et de déterminer leur fonction biologique au cours du développement animal. À cette fin, nous avons purifié la protéine Argonaute ALG-1 chez C. elegans avec un anticorps spécifique, ainsi que ses orthologues humains AGO 1-4, à partir de cellules humaines en culture. Nous avons déterminé par spectrométrie de masse les modifications post-traductionnelles sur ces protéines. En utilisant des méthodes de mutagenèse par édition du génome chez C. elegans, nous avons criblé l'importance de nombreux sites de phosphorylation en s'attardant aux phénotypes associés à la perte de fonction des miARN. Ceci nous a permis de mettre en évidence l'importance d'une région phosphorylable conservée de cinq résidus sérines/thréonine sur le domaine PIWI des Argonautes. La perte de phosphorylation de ALG-1, lorsque ces acides aminés sont mutés en alanines, produit des phénotypes développementaux beaucoup plus sévères que chez des animaux déplétés du gène alg-1. Au niveau moléculaire, nous avons montré, à partir de cellules humaines en culture, que l'hyperphosphorylation de ces acides aminés réduit l'association aux ARNm. De plus, nous avons montré que des mutants AGO2 qui ne sont pas en mesure de lier les miARN, ne sont pas hyperphosphorylés sur ces résidus dans les cellules humaines en culture. Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la voie de miARN, dans lequel l'hyperphosphorylation du domaine PIWI de l'Argonaute permet la dissociation du miRISC de sa cible. Nous proposons donc que la phosphorylation de cette région permettrait au miRISC d'être recyclé et de réprimer l'expression d'autres ARNm après sa déphosphorylation. En second lieu, notre crible a permis d'identifier une sérine phosphorylable sur le domaine MID de ALG-1 qui régule l'association de la protéine aux miARN, lors du développement du nématode. Nous avons montré que lorsque cette sérine est mutée en glutamate (phospho-mimétique) ALG-1 perd son association aux miARN. Par ailleurs, les animaux qui portent cette mutation présentent des niveaux de miARN moins élevés que chez les animaux sauvages, ainsi qu'une accumulation de brins passagers qui sont issus des duplex de miARN et normalement dissociés par AGO. Nous avons ensuite identifié l'enzyme qui produit la phosphorylation de cette sérine. Avec des expériences de phosphorylation in vitro, nous avons montré que cette phosphorylation pourrait être induite par la protéine kinase A (PKA). De surcroît, nos expériences soutiennent que alg-1 et PKA interagissent génétiquement. Précisément, le mutant non phosphorylable alg-1(S642A) supprime des phénotypes développementaux observés lors de la perte de fonction de la sous-unité régulatrice de PKA, kin-2. En somme, ce projet de recherche a permis de mettre en évidence un mécanisme conservé au cours de l'évolution qui régule l'association du miRISC aux ARNm par la phosphorylation des Argonautes, ainsi qu'un mécanisme qui régule l'association de ALG-1 aux miARN chez C. elegans. Notre étude indique d'ailleurs que le miRISC serait possiblement inhibé à des moments précis lors du développement animal, par exemple lors de la phosphorylation par PKA. Les études futures des voies signalétiques qui activent PKA chez le nématode nous permettra de mieux comprendre la fonction biologique et le contexte cellulaire qui requerrait l'inactivation du miRISC. / MicroRNAs (miRNAs) are a class of short non-coding RNAs that regulate gene expression in eukaryotes. These molecules are ~22 nucleotides in length and associate with Argonaute proteins (AGO) to guide them to mRNAs that contain sequences with partial complementarity, commonly found in the 3' untranslated region (UTR). The interaction between the miRISC (miRNA induced silencing complex) and the mRNA inhibits protein synthesis and often leads to degradation of the transcripts. While the function and importance of this gene regulation pathway has been studied in plant and animal models, mechanisms that modulate the miRISC gene silencing efficiency in different biological settings are still poorly understood. The hypothesis of my research project conveys the idea that post-translational modifications of Argonaute proteins modulate gene silencing during animal development. To test this hypothesis, we aimed to identify phosphorylation events on the Argonaute ALG-1 in the nematode C. elegans and uncover how these modifications affect its function during animal development. We purified ALG-1 protein from C. elegans extracts with a specific antibody and human Argonautes AGO1-4 from human cell cultures. We identified phosphorylated Argonaute peptides using mass spectrometry analysis and then we screened which modification affected ALG-1 function using gene editing. This led to the discovery of a highly conserved serine/threonine phosphorylation cluster on the PIWI domain of the Argonaute that when mutated into non-phosphorylatable amino-acids (alanine) caused phenotypes that were more severe than the loss of alg-1 in C. elegans. Molecular analysis of these phosphorylation sites showed that they modulate association to miRNA targets. Specifically, when using phospho-mimicking mutations on human AGO2, we showed that the hyperphosphorylation of this cluster causes the Argonaute to lose interaction with mRNAs. Furthermore, we showed that AGO mutants that are deficient for miRNA binding do not undergo hyperphosporylation. These results revealed a new mechanism that regulate miRNA-mediated gene silencing by which unphosphorylated AGO binds miRNA targets and following hyperphosporylation the miRISC is released from mRNAs. We proposed that this mechanism could be used by cells to recycle the complex and permit multiple rounds of silencing by the miRISC after dephosphorylation. Our forward genetic screen of ALG-1 phosphorylation sites identified a serine on the MID domain that modulates association to miRNAs. We showed that phospho-mimicking mutation of ALG-1 at this position impaired the ability of ALG-1 to bind most miRNAs. Furthermore, we found that this mutation led to accumulation of passenger strands miRNAs in the total RNA. Since the passenger strands are not bound by the phospho-mimicking mutant, we suggested that they accumulate as duplexes which would render them refractory to degradation by single stranded nucleases. Last we showed that the protein kinase A (PKA) phosphorylates this residue in vitro and interacts genetically with alg-1. Altogether, this research project uncovered new mechanisms that regulate the miRNA pathway through the phosphorylation of the Argonaute proteins. Our study also suggests that ALG-1 is inhibited at specific timing by PKA during C. elegans development, and further study of the biological settings that require this inactivation will be crucial to understand its function.

L'élongation embryonnaire contrôle la transformation embryonnaire de C. elegans qui passe d'un embryon ovoïde à une larve vermiforme. C'est un modèle idéal pour la dissection de voies de signalisation qui contrôlent la morphogénèse des tissus et l'intégration de ces signaux dans les diverses couches cellulaires. L'élongation peut être divisée en deux parties : l'élongation précoce qui implique la contraction de l'hypoderme, alors que l'élongation tardive implique l'action synergique des muscles et de l'hypoderme. La contraction des filaments d'actines est régulée par le niveau de phosphorylation des chaînes légères de la myosine (mlc-4). Les GTPases Rho sont des protéines de signalisation régulées par l'action de 3 familles protéiques : les « GTPase-activating proteins » (GAPs), les « Guanine nucléotide exchange factors » (GEFs) et les « Guanine nucléotide dissociation inhibitors » (GDI). Les GTPases Rho contrôlent un large éventail de processus biologiques. Il y a trois GTPases Rho qui contrôlent l'élongation de C. elegans. Notre laboratoire a identifié une quatrième GTPase contrôlant l'élongation, CDC-42 et son régulateur, RGA-7. CDC-42 a été associée à la polymérisation de filaments d'actines dans les évènements de polarisation, de migration et de trafic membranaire (Harris KP. et Ulrich Tepass U., 2010). Nos résultats suggèrent que le gène rga-7 coderait pour trois formes protéiques résultant d'une initiation alternative de la transcription et que ces trois protéines seraient impliquées dans le contrôle de l'élongation. La délétion ok1498 induit un phénotype de létalité embryonnaire ayant une pénétrance variant entre 25 et 30%. Cette létalité est le résultat d'hypercontractions dorsales pendant l'élongation. L'activité catalytique du domaine GAP de rga-7 a révélé une affinité élevée pour la GTPases CDC-42 et faible pour les GTPases RHO-1 et MIG-2. Des analyses d'épistasies suggèrent que rga-7 contrôlerait l'activité de cdc-42 ainsi que de ses effecteurs wsp-1 et mrck-1 au cours de l'élongation. Nous émettons l'hypothèse que rga-7 pourrait contrôler la dynamique du recyclage des jonctions adhérentes (cadhérines) comme son orthologue humain probable PARG1, hypothèse que nous testerons lors d'études subséquentes. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : RGA-7, élongation, CDC-42, endocytose, GTPases, signalisation cellulaire, développement embryonnaire, filaments d'actine, jonctions adhérentes.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 82-91. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Chez C. elegans, les caractéristiques moléculaires des différentes voies des courts ARN divergent. Dans la voie du RNAi, une molécule d’ARN double-brin linéaire mène à la production de siARN, initiant la dégradation de l’ARNm. Quant aux microARN, le précurseur du microARN présente une structure « épingle à cheveux » et le microARN mature induit un blocage de la traduction de cet ARNm. Ces deux voies requièrent leurs protéines Argonautes spécifiques. Nous avons conçu une molécule d’ARNdb linéaire contenant à la fois une séquence d’un microARN et une séquence d’un siARN, et suggérons que la spécificité des Argonautes n’est pas déterminée par la molécule de départ. Nous tentons aussi de comprendre le rôle des Argonautes ALG-1 et ALG-2. Une immunoprécipitation et une analyse des facteurs protéiques et ribonucléiques associés ont été effectués. Cette expérience pourrait aussi s’avérer un outil simple permettant l’identification de nouvelles cibles potentielles des microARN. / The molecular characteristics of the RNAi and microRNA pathways are different. In the RNAi pathway, fully base-paired dsRNA molecules trigger the production of small interfering RNAs (siRNAs), which lead to the degradation of the complementary targeted mRNA. On the other hand, the stem-looped miRNA precursor is processed in mature miRNA, which then imperfectly interacts with the mRNA target, leading to the blocking of its translation. In the worm C. elegans, each of the RNAi and miRNA pathways needs its specific Argonautes proteins. RNAi requires RDE-1, while ALG-1 and ALG-2 act in the miRNA pathway. The restriction of siRNAs and miRNAs to specific Argonaute proteins might reflect the recognition of the trigger by specific factors targeting it to the correct Argonaute protein. To better understand the importance of the trigger in the selection of the adequate Argonaute and pathway, we designed a dsRNA trigger containing both miRNA and siRNA sequences. This chimeric molecule can rescue successfully the loss of function of the miRNA let-7, and can also initiate the gfp gene silencing by RNAi. We demonstrated that RDE-1 and the dsRNA-binding protein RDE-4 are essential for RNAi induced with our trigger, but are not involved in the let-7 function of the chimera molecule. On the other hand, we showed that ALG-2 is strictly required for the miRNA function, but not for the RNAi function. Interestingly, we also found that the let-7 miRNA processed from our molecule has a limited lifetime, while the RNAi response, initiated from the same dsRNA, is maintained for a longer period. We suggest that the specificity of the Argonautes and thus the choice of the small RNA pathway is not determined by the type of RNA trigger, but rather by their respective molecular response. Furthermore, we also tried to understand the roles of ALG-1 and ALG-2. An immunoprecipitation of these proteins and an analysis of the protein and RNA interactors were carried out.

Les dommages génotoxiques sont très dangereux pour nos cellules. L'incapacité de détecter et de réparer adéquatement ces dommages avant que l'ADN ne soit répliqué peut mener à l'apparition de cellules cancéreuses. Chez le nématode Caenorhabditis elegans un orthologue de la tankyrase, la poly(ADP-ribose) metabolism enzyme-5 (pme-5), a été identifié et sous-cloné. Il est bien établi que C. elegans est un outil formidable pour la biologie moléculaire et la génétique. Afin de faire progresser plus rapidement les connaissances sur les tankyrases et le métabolisme du poly(ADP-ribose), le nématode est l'outil tout indiqué. L'objectif général de mon étude est de vérifier si C. elegans est un modèle approprié pour l'étude du rôle des tankyrases. Afin d'y arriver, mon premier objectif était de cloner pme-5 dans différents vecteurs afin de caractériser des anticorps monoclonaux et polyclonaux. Nous voulions vérifier la spécificité des anticorps avec la protéine recombinante et native. Ensuite, afin d'observer la localisation intracellulaire de PME-5, il nous a fallu trouver un vecteur convenable afin d'exprimer PME-5::GFP et ensuite de microinjecter la construction dans le nématode afin d'obtenir une lignée portant la construction extra-chromosomale. Nous avons ensuite utilisé les anticorps nouvellement caractérisés afin d'hybrider des extraits de vers par western Mot et de faire des immunohistochimies. Puis, nous avons effectué un microarray afin d'observer la réponse transcriptionelle générale suivant une irradiation gamma de 120 Gy. L'étude par immunohistochimie a permis d'observer la localisation de PME-5 lors de chaque stade du développement de même que dans chaque tissu et cellules et de confirmer que l'allèle ok446 est bien nulle. Ces études ont démontré que : (1) PME-5 est une protéine ubiquitaire et nucléaire chez le nématode, (2) qu'elle semble interagir avec la chromatine et les chromosomes condensés (bivalents) soit par l'intermédiaire de protéines associées à l'ADN ou par un domaine spécifique de liaison à l'ADN, ceci reste à déterminer, (3) sa transcription et sa traduction sont augmentées à la suite d'une exposition à des rayons gamma (120 Gy) et (4) elle fait partie des cinq gènes dont la transcription est la plus augmentée suivant une exposition à des rayons gamma (120 Gy). Compte tenu de ces résultats, nous concluons que C. elegans semble un modèle approprié pour l'étude des fonctions nucléaires des tankyrases.

La poly(ADP-ribose) polymérase (PARP) est une enzyme nucléaire capable de catalyser la formation de polymères d'ADP-ribose sur plusieurs protéines acceptrices en utilisant le NAD comme substrat. Cette modification post-traductionnelle est notamment impliquée dans la régulation de la réparation, de la transcription et de la réplication de l'ADN. L'enzyme responsable de l'hydrolyse du polymère d'ADP-ribose se nomme la poly(ADPribose) glycohydrolase (PARG) et son action est essentielle afin de permettre aux protéines modifiées de regagner leurs fonctions. Toutefois, la régulation de la dégradation du polymère et les rôles précis de la PARG ne sont pas très bien connus. Ce projet de recherche décrit pour la première fois une caractérisation détaillée des deux gènes qui codent pour des PARG chez C. elegans, soient pme-3 et pme-4. Via un essai PARG, nous avons d'abord prouvé que le ver était capable d'hydrolyser le polymère et que les enzymes responsables de cette dégradation étaient PME-3 et PME-4. Une expérience de RT-PCR a démontré que ces gènes sont exprimés dans tous les stades de développement du ver, un résultat qui fut confirmé par l'utilisation de plasmides recombinants de fusion GFP. De plus, ces plasmides recombinants ont également été utilisés pour montrer que PME-3 semble être exprimée principalement dans les cellules neuronales ainsi que dans l'intestin et qu'elle se retrouve en grande majorité au noyau. PME-4 est également exprimée dans les cellules neuronales mais sa localisation sous-cellulaire semble exclusivement cytoplasmique. L'inactivation de pme-3 et pme-4 via l'interférence à l'ARN indique que ces enzymes sont importantes dans la réponse aux dommages à l'ADN. En effet, les vers dont l'expression de ces gènes est réduite montrent un taux de survie significativement plus faible que les vers contrôles suite à une induction de dommages à l'ADN. Via des expériences de double hybride de levure, nous avons effectué un criblage afin de trouver des partenaires protéiques de PME-3 et PME-4. Nous avons identifié un partenaire à PME3, soit la protéine de fonction inconnue MATH-41, mais aucun partenaire pour PME-4. Le patron d'expression de MATH-41 semble indiquer que cette protéine est principalement exprimée dans l'intestin du ver. Ces résultats montrent que les PARG semblent avoir un rôle dans la réponse aux dommages à l'ADN et dans la survie. De plus, ils constituent d'importants avancements dans l'étude des rôles que pourraient jouer les PARG dans plusieurs événements métaboliques.

Au sein de l'ensemble des protéines Argonautes codées par les génomes des organismes métazoaires, certains membres de cette famille de protéines ont conservé des acides aminés importants pour l'activité endonucléasique. La signification fonctionnelle de ces résidus (composés des résidus DDH), pour les Argonautes spécifiques des miARN chez les animaux, est encore inconnue puisque le ciblage des ARNm par les miARN ne provoque pas de clivage site spécifique comme c'est le cas pour les siARN. In vitro, nous avons mis en évidence, chez le nematode C. elegans, que les protéines Argonautes spécifiques aux miARN, ALG-1 et ALG-2, conservant ce motif, possèdent une activité de clivage similaire à celle impliquée dans la voie des si ARN. Nous démontrons également que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 ont la capacité de lier et d'utiliser comme substrats différents duplexes de courts ARN, similaires aux duplexes de miARN produits par l'enzyme DCR-1. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont capables de coupure endonucléolytique sur ces duplexes, lorsque le degré de complémentarité entre les deux brins le permet, et de séparer les deux brins d'un duplex de courts ARN contenant des mésappariements. In vivo, l'activité endonucléasique de ALG-1 ou ALG-2 est essentielle pour la voie des miARN, et la perte de cette activité conduit à une accumulation des précurseurs de miARN tronqués et une altération de la formation de miRISC fonctionnel. Prises dans leur ensemble, nos données indiquent que l'activité endonucléasique des protéines Argonaute ALG-1 ou ALG-2 contribue à la maturation des miARN chez le nematode C. elegans.