L'expression de canaux sodiques dépendants du voltage (NaV) est associée au caractère invasif de certains cancers épithéliaux. Nous avons montré que dans les cellules de cancer du sein MDA-MB-231, l'expression anormale de NaV1.5 était responsable d'un courant sodique soutenu au potentiel de membrane des cellules. Ces canaux ne régulent pas la prolifération cellulaire, mais augmentent l'invasion de la matrice extra-cellulaire. L'activité de NaV1.5 entraîne une acidification périmembranaire favorable à l'activité protéolytique des cathepsines à cystéine B et S, qui jouent un rôle prédominant dans l'invasivité. La co-localisation du NaV et des régulateurs du pH dans des microdomaines membranaires pourrait favoriser cet effet. L'acide docosahexaènoïque (DHA, 22:6n-3), un acide gras polyinsaturé de la série n-3(AGPI n-3), est connu pour son effet protecteur dans le cancer du sein, mais aussi pour moduler l'activité des canaux ioniques. Nous avons étudié son rôle sur l'invasivité et sur l'activité du NaV. Notre étude suggère que l'apport de DHA réduit l'invasivité des cellules MDA-MB-231 en diminuant l'activité duNaV1.5. Ceci pourrait constituer un nouveau mécanisme des effets protecteurs des AGPI n-3. / Voltage-gated sodium channels (NaV) are expressed in highly metastatic cancer cells derived fromepithelial tissues. In the highly invasive breast cancer cell line MDA-MB-231, we showed that the abnormal expression of NaV1.5 was responsible for a sustained inward sodium current at the steady-state membrane voltage. These channels do not regulate cell multiplication but promote the invasion of the extracellular matrix. We found that NaV1.5 activity leads to a perimembrane acidification favourable for the pH-dependent proteolytic activity of cysteine cathepsins B and S, which play a predominant role incell invasiveness. Colocalisation of NaV and pH regulators in membrane raft domains could promote this effect. Since n-3 polyunsaturated fatty acid (n-3 PUFA) docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) has been reported to reduce the aggressiveness of some breast cancers, and to be a modulator of ion channels, we chose to study its role on cell invasiveness and NaV activity. Our work suggests that a chronic intake of DHA reduces MDA-MB-231 cells invasiveness by decreasing NaV activity. This could be a new mechanism for the metastasis preventing effect of n-3 PUFA.

Les miARNs, de courts ARNs non codant de 19 à 22 nucleotides, responsablent de la répression traductionnelle, d'approximativement 30 % des ARNm codant. Ils agissent par appariement de base sur des régions situées en 3'UTR des ARNm ciblés. Pour ce faire, les protéines argonautes s'associent aux miARNs et forment le complexe effecteur miRISC (microRNA-Induced Silencing Complex). Les mécanismes d'action de ce complexe ne sont pas bien compris et certains autres facteurs inconnus pourraient avoir un rôle important. Nous avons identifié, par criblage double hybride, plusieurs interacteurs de la protéine ALG-1, une argonaute impliquée dans la voie des miARNs chez C. elegans. Nous avons aussi mis en évidence un groupe de proteases homologues aux cathepsines humaines. Pour évaluer l'implication des cathepsines dans la voie des miARNs, nous avons utilisé un essai luciférase nous permettant d'apprécier l'effet de l'inhibition de ces proteases sur la traduction d'un ARNm réprimé par un miARN.

Thèse de doctorat : Neurosciences : Paris 12 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Pagination : 146 f. Bibliogr. f. 118-146.

Les cathepsines à cystéine (CP) participent à la dégradation du tissu bronchique ainsi qu’à l’inactivation de protéines de l’immunité innée lors de maladies inflammatoires. Lors de la mucoviscidose (CF), on observe un déficit de la protéine du surfactant pulmonaire SP-A, qui participe à la défense antimicrobienne. Nous avons caractérisé les CP dans des expectorations CF et analysé leur capacité à hydrolyser le SP-A. La balance CP/inhibiteurs est déséquilibrée en faveur des CP et la cathepsine B participe à ce déséquilibre en hydrolysant leurs inhibiteurs, les kininogènes. Cependant, les CP ne sont pas des marqueurs de colonisation par Pseudomonas aeruginosa. De plus, la cathepsine S clive sélectivement SP-A dans son site de liaison aux sucres et aux lipides, induisant la perte de ses propriétés antibactériennes et d’agrégation, contribuant au déficit de la défense innée, à la perte d’homéostasie du surfactant et à l’exacerbation de l’inflammation au cours de la mucoviscidose. / Cysteine cathepsins (CP) that are implicated in bronchial tissue injuries and inactivation of antibacterial proteins emerge as key players in pulmonary inflammations. A decrease of pulmonary surfactant protein SP-A which is involved in innate host defence has been reported in patients suffering from cystic fibrosis (CF). We characterized sputum CP and their ability to hydrolyze SP-A. There is an imbalance CP/inhibitor tipped in favor of CP proteolytic activities. Furthermore, cathepsin B, which is able to degrade major plasma CP inhibitor, kininogens, favors this imbalance. However, CP are not biomarkers of colonization by Pseudomonas aeruginosa. Moreover, Cat S cleaves SP-A specifically in its lectin-like domain (CRD) that conducts to the loss of antibacterial and aggregation properties. So, CP, especially cathepsin S, participate to the deficiency of innate immunity, surfactant homeostasis defect and to the exacerbation of inflammatory response in cystic fibrosis.

L'implication des polynucléaires neutrophiles (PN) dans l'hémostase n'est pas un concept nouveau, mais requière encore beaucoup d'éclaircissements. Des données attribuent à ces cellules à la fois une capacité à favoriser (voire à déclencher) les mécanismes et une capacité à limiter voire éliminer le caillot de fibrine. Pour expliquer leur implication, une contribution des enzymes granulaires, et essentiellement la cathepsine G (Cath G) et l'élastase (HNE), est fréquemment citée. L'objet de ces travaux est d'étudier chez des sujets sains l'impact des PN humains et des 2 enzymes granulocytaires (Cath G et HNE) sur la coagulation, à l'aide de tests globaux : thromboélastométrie rotative et test de génération de thrombine. Le potentiel procoagulant des PN a aussi été étudié en thrombinographie chez des patients atteints de syndrome myéloprolifératif (SMP) JAK2V617F positif. Dans les systèmes choisis, les PN font preuve d'une activité procoagulante claire, permettant notamment une réduction systématique du temps de coagulation et une augmentation du travail thrombinique total. Cette activité procoagulante est proportionnelle à la concentration en PN et est exacerbée après stimulation préalable par le fMLP, mais elle n'est pas liée à une activité facteur tissulaire. La Cath G et l'HNE permettent également toutes deux une réduction du temps de coagulation, mais elles font preuve à la fois d'effets procoagulants (par inactivation des inhibiteurs comme le TFPI) et anticoagulants (par inactivation du facteur V ou par dégradation de la (du) fibrin(ogèn)e). Enfin, les données de ce travail ne mettent pas en évidence une hypercoagulabilité liée aux PN dans le contexte de SMP. / Polymorphonuclear neutrophils (PMN) are the most abundant nucleated cells in blood. Their involvement in haemostasis – in particular in coagulation and clot formation – is not a new concept, but is not yet fully understood. Many data from the literature indicate that these cells can enhance (even trigger) coagulation, whereas others indicate it can impair fibrin formation and facilitate clot elimination. Among the hypotheses explaining this involvement, attention has focused on PMN granules enzymes, in particular, Cathepsin G (Cath G) and elastase (HNE). We first aim at studying in healthy subjects the impact of PMN as well as Cath G and HNE on coagulation by use of global tests: rotative thromboelastometry (ROTEM®) and thrombin generation test (CAT®). Second, procoagulant potential of PMN is investigated using CAT® in patients affected by myeloproliferative disorders (MPD), with presence of JAK2V617F mutation. Under our conditions, PMN show an unambiguous procoagulant activity, inducing systematically a decrease in clotting time, along with an increase in total thrombin work. This activity is proportional with PMN concentration; fMLP-induced PMN stimulation enhances also it, but this is not related to tissue factor activity. Both Cath G and HNE induce a decrease in clotting time, but support procoagulant (by inactivation of inhibitors such as TFPI) as well as anticoagulant activity (by inactivation of factor V or fibrin(ogen) degradation). At last, data obtained don't show MPD-associated hypercoagulability which can be attributed to PMN.

La métastase est la cause principale de décès chez les individus atteints de tumeurs solides. Lors d'un criblage pan-génomique d’ARN interférence, 22 gènes candidats suppresseurs de métastase ont été identifiés (Gobeil et al., 2008). Parmi ceux-ci, le gène de la cathepsine O (Ctso) et celui de l’actine alpha des muscles lisses (Acta2), ont été choisis pour être caractérisés. Les résultats obtenus en faisant des études de perte de fonction par ARN interférence et de gain de fonction via une expression ectopique, suggèrent que Ctso et Acta2 sont impliqués dans l’adhésion et la migration et potentiellement dans la survie/croissance cellulaire ainsi que dans l’invasion des cellules tumorales. De plus, mes résultats démontrent que la protéine Ctso est secrétée par des cellules de mélanome murin, suggérant une fonction extracellulaire. Bien que ces résultats tendent à démonter l’implication de Ctso et Acta2 dans la métastase, d’autres études doivent être accomplies pour approfondir leur rôle.

L'activation de cathepsines et la présence de cellules cancéreuses dites souches (CSC) participeraient à l'évolution métastatique du cancer colorectal. L'effet d'inhibiteurs intracellulaire (CA-074 ME) et extracellulaire (CA-074) de la cathepsine B a été analysé dans un système de culture tridimensionnelle (3-D) reproduisant le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du côlon. Le CA-074 ME a été le seul à inhiber de façon significative le processus métastatique. Pour l'étude des CSC, le marquage immunohistochimique de CD 133, CD44 et CD24 a été évalué qualitativement et quantitativement dans la culture 3-D et dans des spécimens histologiques provenant de patients porteurs de cancer du côlon. L'expression de ces marqueurs dans les cellules cultivées en 3-D était variable. Par contre, le marqueur CD 133 était fortement exprimé dans les métastases hépatiques associées à des ganglions lymphatiques envahis, tel que démontré en combinaison avec une coloration fluorescente des noyaux. La conclusion reflète les corrélations possibles de ces résultats.

Lors de pathologies pulmonaires inflammatoires chroniques comme la mucoviscidose ou la BPCO, le déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases aboutit à la dégradation du tissu pulmonaire et à l’inactivation des défenses antimicrobiennes. Les cathepsines à cystéine participent à l’inactivation protéolytique de peptides et protéines antimicrobiens (PAMs) pulmonaires comme le SLPI, la lactoferrine, et les β-défensines HBD-2 et -3 lors de l’emphysème ou de la mucoviscidose. Lors de cette thèse, nous avons étudié la capacité des cathepsines à cystéine B, K, L et S à hydrolyser le peptide LL-37, qui est un PAM important dans l’immunité innée pulmonaire. Seules les cathepsines K et S clivent le LL-37 et inactivent efficacement son activité antimicrobienne. A l’inverse, le LL-37 est un inhibiteur compétitif de la cathepsine L. D’autre part, l’expression pulmonaire de la cathepsine S est fortement augmentée chez les individus fumeurs atteints ou non de BPCO. La fumée de cigarette qui est une source importante de stress oxydatif induit une augmentation significative de l'expression et l'activité de la cathepsine S. Malgré un environnement oxydatif non favorable à l'activité des cathepsines, la cathepsine S parvient à hydrolyser le peptide LL-37 et pourrait ainsi augmenter le risque d’exacerbation lors de la BPCO. / During chronic inflammatory lung diseases like cystic fibrosis or COPD, proteases/antiproteases imbalance leads to pulmonary tissue degradation and compromise antimicrobial barrier. Cysteine cathepsins are involved in the proteolytic inactivation of several lung antimicrobial peptides (AMPs) such as SLPI, lactoferrin and β- defensins -2 and -3 during emphysema or cystic fibrosis. During this thesis, we studied the ability of cathepsins B, K, L and S to degrade LL-37, which is an important AMP in lung immunity. Only cathepsins K and S degrade readily LL-37 and inactivate its antimicrobial property. Conversely, LL-37 is a competitive inhibitor of cathepsin L. Beside, lung expression of human cathepsin S is significantly increased in smokers with or without COPD compared to non-smokers. Cigarette smoke that is a major source of oxidative stress significantly increases the expression and activity of cathepsin S. Despite an unfavorable oxidative environment, cathepsin S retains its proteolytic activity toward LL-37 and thus could participate to COPD exacerbation.

Avec le développement récent des variétés végétales transgéniques, la mise au point et l'application d'approches adaptées à l'étude de leur innocuité apparaît importante. L'intégration de nouveaux caractères montrant un impact réel ou possible sur les caractéristiques de la plante modifiée, en particulier, rendent impératif la mise au point de stratégies à la fois exhaustives et efficaces pour une prise en compte correcte de leurs impacts éventuels sur la santé humaine. À titre d'exemple, des lignées de pomme de terre transgéniques exprimant un inhibiteur de protéases de type aspartate, l'inhibiteur CDI (pour Cathepsin D lnhibitor) de tomate, ont été développées dans notre laboratoire dans le double but de protéger la plante contre les insectes et de stabiliser les protéines recombinantes éventuellement exprimées dans ses tissus. Suite à des démonstrations diverses quant à leur efficacité (Brunelle et al., 2004, Rivard et al., 2006), il est apparu clair rapidement que l'expression du transgène cdi avait un impact marqué sur le métabolisme de la plante, avec des effets éventuels possibles sur les caractéristiques de ses tissus comestibles. Afin d'évaluer l'innocuité de ces lignées pour la santé humaine, une étude en plusieurs volets a été réalisée ici, basée sur les normes définies par les agences internationales de sécurité alimentaire. L'évaluation sanitaire des OGM repose en général sur un principe de base appelé équivalence en substance, qui consiste à comparer les teneurs en macronutriments, en micronutriments et en composés anti-nutritionnels et toxiques dans les lignées transgéniques à l'étude et dans leur contrepartie conventionelle. Dans le cadre du présent projet, une analyse compositionnelle de base a été faite pour les composantes majeures, mineures et toxiques de tubercules produits à partir de lignées de pomme de terre CDI et de lignées témoins transgéniques et conventionnels. Toutes les composantes analysées n'ont montré aucune variation significative quant à leur teneur dans les lignées analysées (ANOVA; P < 0.05), à l'exception de variations mineures pour le magnésium. Afin d'obtenir une image plus générale (ou "holistique") et pour augmenter les chances de détecter d'éventuels effets pléiotropiques suite à l'insertion du transgene cdi dans le génome de plante, une analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) a été réalisée pour le suivi comparatif de nombreuses protéines en simultané. Les données obtenues indiquent que les pommes de terre CDI étaient équivalentes aux pommes de terre conventionnelles obtenues de la lignée-mère, exception faite de la protéine recombinante CDI. Etant donné les liens de parenté entre l'inhibiteur CDI et un ensemble de protéines potentiellement allergènes retrouvés naturellement dans les tubercules, il convenait ensuite d'effectuer une évaluation spécifique des risques d'allergénicité associés aux tubercules modifiés. L'évaluation du potentiel allergène des OGM, effectuée généralement selon des normes établies par l'OMS et la FAO, tient compte de l'origine du transgène inséré, de l'homologie de séquence entre la protéine recombinante et les protéines connues comme étant allergènes, des phénomènes de réactivité croisée avec des allergènes connus, des propriétés physico-chimiques de la même protéine et de son immunogénicité potentielle évaluée in vivo dans des modèles animaux. In silico, l'inbiteur CDI de tomate s'est avéré partager un haut degré de similarité avec son équivalent structural de la pomme de terre, et avec d'autres protéines de type Kunitz de la pomme de terre reconnues comme étant allergènes. Ces données nous suggéraient alors d'évaluer plus à fond le comportement de ces différentes protéines dans les différentes lignées testées. Des tests de digestibilité in vitro ont d'abord été réalisés pour étudier la stabilité relative de ces différentes protéines en conditions de pH extrêmes et en présence de protéases de type pepsique et pancréatique. En bref, nous avons observé que les protéines de type Kunitz dans le tubercule cru étaient résistantes à l'hydrolyse pepsique et pancréatique sur une période d'au moins 60 min. Tenant compte des procédés de transformation auxquels la pomme de terre est généralement soumise, des pommes de terre cuites dans l'eau, des pommes de terre cuites au four à micro-ondes et des frites ont été préparées pour estimer la stabilité des protéines endogènes à la chaleur. Toutes les protéines de type Kunitz se sont avérées relativement stables mais néanmoins digérées complètement et en quelques minutes (par les protéases) après un traitement à 100 °C pendant 5 min, ce qui suggère que la protéine CDI et ses homologues de type Kunitz pourraient montrer un potentiel allergène à l'état cru, mais pas après cuisson. Afin de compléter cette évaluation des lignées CDI, des splénocytes isolés de la rate de souris BALB/c naïves ont été mis en culture pour déterminer leur taux de prolifération in vitro et leur profil en cytokines en réponse aux protéines de pomme de terre. Les résultats ont montré une prolifération élevée pour les protéines natives (non dénaturées), en comparaison à celles traitées à la pepsine ou à la chaleur. Une induction plus élevée de l'interféron gamma (IFN-y), au détriment de l'interleukine-4 (IL-4), a aussi été notée. Un autre groupe de souris BALB/c a été administrée oralement des protéines solubles de la plante afin de distinguer 1' immunogénicité des protéines de leurs effets allergènes. Il a été démontré, en bref, que les protéines de pomme de terre sont immunogènes plutôt qu'allergènes chez les souris. Étant donné que la protéine CDI montre une homologie de 30% avec l'inihibeur de trypsine de soya SBTI et que les deux protéines appartiennent à la même famille, la famille Kunitz, un test complémentaire avec le sérum de patients humains allergiques au soya a finalement été réalisé in vitro. En résumé, aucune activité croisée n'a été démontrée, nous suggérant à nouveau que les pommes de terre CDI étudiées dans cette étude n'étaient pas plus (ou moins) allergènes que leur équivalents conventionnels analysés en parallèle. L'ensemble de données obtenues dans le cadre de ce projet suggèrent, en somme, que les tubercules issus de lignées CDI sont équivalents aux tubercules conventionels correspondants, et que le transgène cdi exprimé dans les lignées modifiées n'est à l'origine d'aucun effet immunogène ou allergène particulier à l'inverse des effets parfois observables pour les protéines endogènes de même famille retrouvées dans le tubercule.

Au printemps, la seiche commune Sepia officinalis effectue des migrations du large vers la côte pour se reproduire et mourir. La ponte a lieu en zone côtière, sujette à la contamination métallique d'origine anthropique, ce qui pose la question de la toxicité des éléments traces sur le développement embryonnaire. Dans ce travail, l'exposition à neuf radiotraceurs (110mAg, 241Am, 109Cd, 57Co, 134Cs, 203Hg, 54Mn, 210Pb et 65Zn) durant toute la durée du développement révèle que l'œuf de seiche possède de grandes capacités de bioaccumulation des éléments traces. Dans ce contexte, la capsule glycoprotéique de l'œuf joue un rôle majeur en fixant la plus grande proportion de ces éléments. La distribution des radiotraceurs dans l'œuf montre que cette capsule constitue une barrière protectrice contre la pénétration des métaux depuis la ponte jusqu'à la fin de l'organogenèse. Cependant, lorsque la phase de croissance de l'embryon et de l'œuf commence, la capsule montre progressivement une perméabilité sélective aux éléments traces jusqu'à l'éclosion. La disposition des composants de la capsule à les laisser diffuser à travers les différentes enveloppes qui la composent semble dépendante des propriétés chimiques des éléments traces mais aussi des processus biologiques liés à l'embryogenèse. Ainsi, certains éléments pénètrent dans l'œuf et s'accumulent dans l'embryon avec une affinité variable (i.e. Ag >> Zn > Hg > Mn > Co ≈ Cd > 134Cs ≠ 241Am, Pb).<br />Des expositions sur le long terme à l'Ag, au Cd et au Cu dissous (1, 0,5 et 250 µg.l-1, respectivement) en condition expérimentale, n'ont aucun effet sur la croissance de l'œuf et n'induisent ni malformation, ni mortalité des embryons, confirmant l'effet protecteur de la capsule pendant les stades sensibles de l'embryogenèse. Néanmoins, pendant la période de croissance de l'embryon, l'Ag et le Cd semblent ralentir l'augmentation de l'activité des phosphatases acides, impliquée dans les processus digestifs alors que le Cu révèle un effet stimulateur. De même, l'activité de type phénoloxydase, impliquée dans les fonctions immunitaires des Invertébrés, décrite pour la première fois dans l'embryon de seiche, est modulée par l'Ag et le Cu, lors de la phase post-organogenèse. <br />Malgré le rôle protecteur de la capsule durant l'organogenèse, les éléments traces peuvent s'accumuler dans les embryons dès les premiers stades de développement du fait de leur apport par transfert maternel. Dans ce contexte, l'utilisation des radiotraceurs montre que le transfert de la mère à l'œuf est sélectif, 1) seuls l'Ag, le Se et le Zn étant transférés suite à une exposition de la mère par de la nourriture marquée au 110mAg, à l'241Am, au 109Cd, au 60Co, au 134Cs, au 54Mn, au 75Se et au 65Zn et 2) le Se et du Zn étant stockés dans le vitellus de l'œuf alors que l'Ag se retrouve à la fois dans le vitellus et la capsule.