Avec le développement récent des variétés végétales transgéniques, la mise au point et l'application d'approches adaptées à l'étude de leur innocuité apparaît importante. L'intégration de nouveaux caractères montrant un impact réel ou possible sur les caractéristiques de la plante modifiée, en particulier, rendent impératif la mise au point de stratégies à la fois exhaustives et efficaces pour une prise en compte correcte de leurs impacts éventuels sur la santé humaine. À titre d'exemple, des lignées de pomme de terre transgéniques exprimant un inhibiteur de protéases de type aspartate, l'inhibiteur CDI (pour Cathepsin D lnhibitor) de tomate, ont été développées dans notre laboratoire dans le double but de protéger la plante contre les insectes et de stabiliser les protéines recombinantes éventuellement exprimées dans ses tissus. Suite à des démonstrations diverses quant à leur efficacité (Brunelle et al., 2004, Rivard et al., 2006), il est apparu clair rapidement que l'expression du transgène cdi avait un impact marqué sur le métabolisme de la plante, avec des effets éventuels possibles sur les caractéristiques de ses tissus comestibles. Afin d'évaluer l'innocuité de ces lignées pour la santé humaine, une étude en plusieurs volets a été réalisée ici, basée sur les normes définies par les agences internationales de sécurité alimentaire. L'évaluation sanitaire des OGM repose en général sur un principe de base appelé équivalence en substance, qui consiste à comparer les teneurs en macronutriments, en micronutriments et en composés anti-nutritionnels et toxiques dans les lignées transgéniques à l'étude et dans leur contrepartie conventionelle. Dans le cadre du présent projet, une analyse compositionnelle de base a été faite pour les composantes majeures, mineures et toxiques de tubercules produits à partir de lignées de pomme de terre CDI et de lignées témoins transgéniques et conventionnels. Toutes les composantes analysées n'ont montré aucune variation significative quant à leur teneur dans les lignées analysées (ANOVA; P < 0.05), à l'exception de variations mineures pour le magnésium. Afin d'obtenir une image plus générale (ou "holistique") et pour augmenter les chances de détecter d'éventuels effets pléiotropiques suite à l'insertion du transgene cdi dans le génome de plante, une analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) a été réalisée pour le suivi comparatif de nombreuses protéines en simultané. Les données obtenues indiquent que les pommes de terre CDI étaient équivalentes aux pommes de terre conventionnelles obtenues de la lignée-mère, exception faite de la protéine recombinante CDI. Etant donné les liens de parenté entre l'inhibiteur CDI et un ensemble de protéines potentiellement allergènes retrouvés naturellement dans les tubercules, il convenait ensuite d'effectuer une évaluation spécifique des risques d'allergénicité associés aux tubercules modifiés. L'évaluation du potentiel allergène des OGM, effectuée généralement selon des normes établies par l'OMS et la FAO, tient compte de l'origine du transgène inséré, de l'homologie de séquence entre la protéine recombinante et les protéines connues comme étant allergènes, des phénomènes de réactivité croisée avec des allergènes connus, des propriétés physico-chimiques de la même protéine et de son immunogénicité potentielle évaluée in vivo dans des modèles animaux. In silico, l'inbiteur CDI de tomate s'est avéré partager un haut degré de similarité avec son équivalent structural de la pomme de terre, et avec d'autres protéines de type Kunitz de la pomme de terre reconnues comme étant allergènes. Ces données nous suggéraient alors d'évaluer plus à fond le comportement de ces différentes protéines dans les différentes lignées testées. Des tests de digestibilité in vitro ont d'abord été réalisés pour étudier la stabilité relative de ces différentes protéines en conditions de pH extrêmes et en présence de protéases de type pepsique et pancréatique. En bref, nous avons observé que les protéines de type Kunitz dans le tubercule cru étaient résistantes à l'hydrolyse pepsique et pancréatique sur une période d'au moins 60 min. Tenant compte des procédés de transformation auxquels la pomme de terre est généralement soumise, des pommes de terre cuites dans l'eau, des pommes de terre cuites au four à micro-ondes et des frites ont été préparées pour estimer la stabilité des protéines endogènes à la chaleur. Toutes les protéines de type Kunitz se sont avérées relativement stables mais néanmoins digérées complètement et en quelques minutes (par les protéases) après un traitement à 100 °C pendant 5 min, ce qui suggère que la protéine CDI et ses homologues de type Kunitz pourraient montrer un potentiel allergène à l'état cru, mais pas après cuisson. Afin de compléter cette évaluation des lignées CDI, des splénocytes isolés de la rate de souris BALB/c naïves ont été mis en culture pour déterminer leur taux de prolifération in vitro et leur profil en cytokines en réponse aux protéines de pomme de terre. Les résultats ont montré une prolifération élevée pour les protéines natives (non dénaturées), en comparaison à celles traitées à la pepsine ou à la chaleur. Une induction plus élevée de l'interféron gamma (IFN-y), au détriment de l'interleukine-4 (IL-4), a aussi été notée. Un autre groupe de souris BALB/c a été administrée oralement des protéines solubles de la plante afin de distinguer 1' immunogénicité des protéines de leurs effets allergènes. Il a été démontré, en bref, que les protéines de pomme de terre sont immunogènes plutôt qu'allergènes chez les souris. Étant donné que la protéine CDI montre une homologie de 30% avec l'inihibeur de trypsine de soya SBTI et que les deux protéines appartiennent à la même famille, la famille Kunitz, un test complémentaire avec le sérum de patients humains allergiques au soya a finalement été réalisé in vitro. En résumé, aucune activité croisée n'a été démontrée, nous suggérant à nouveau que les pommes de terre CDI étudiées dans cette étude n'étaient pas plus (ou moins) allergènes que leur équivalents conventionnels analysés en parallèle. L'ensemble de données obtenues dans le cadre de ce projet suggèrent, en somme, que les tubercules issus de lignées CDI sont équivalents aux tubercules conventionels correspondants, et que le transgène cdi exprimé dans les lignées modifiées n'est à l'origine d'aucun effet immunogène ou allergène particulier à l'inverse des effets parfois observables pour les protéines endogènes de même famille retrouvées dans le tubercule.

Les réticences de la société à l'égard de l'utilisation pharmaceutique de protéines purifiées à partir de sources potentiellement porteuses d'agents pathogènes ont contribué à l'émergence d'une nouvelle approche pour l'expression hétérologue des protéines, baptisée "moléculture végétale" (de l'anglais : molecular farming). Prometteuse à plusieurs égards, cette nouvelle discipline a attiré l'attention de plusieurs équipes de recherche en biotechnologie végétale, qui se sont aussi penchées, depuis quelques années, sur les limites associées à cette approche. En dépit des avantages évidents associés à la production des protéines recombinantes dans les tissus végétaux, l'activité biologique de la protéine recombinante et les mécanismes de protection endogène de la cellule hôte contre les protéines étrangères [la reconnaissance du non-soi] constituent, notamment, des contraintes souvent importantes pour la production efficace de protéines in planta. L'expression de certaines protéines recombinantes chez les plantes pourrait par exemple, en théorie, interrompre des interactions protéine-protéine spécifiques ou créer des réactions métaboliques indésirables en altérant des processus biochimiques ou des sentiers métaboliques essentiels au bon fonctionnement de la cellule hôte. Dans le but de mieux comprendre l'impact de l'expression des protéines recombinantes chez les plantes, le présent projet visait à étudier l'effet de la compartimentation cellulaire sur l'intégrité structurale et l'activité biologique in planta d'un inhibiteur de protéases à large spectre d'action, l'aprotinine bovine, exprimé chez la pomme de terre, Solanwn tuberosum L. Des lignées de pomme de terre accumulant l'aprotinine dans trois compartiments cellulaires - le cytosol, le réticulum endoplasmique (RE) et le milieu extracellulaire - ont d'abord été développées, après quoi le niveau d'expression du transgène et le taux d'accumulation de la protéine ont été déterminés par des procédures courantes de PCR en temps réel et d'immunodétection sur membrane solide. Une nouvelle technique pour la détection, la quantification et la caractérisation des protéines a ensuite été développée pour l'étude de la protéine recombinante exprimée, basée sur l'emploi conjoint de biopuces à protéines et d'un spectromètre de masse, le système SELDI-TOF/MS. Afin de cerner l'impact métabolique possible de la protéine recombinante sur la plante hôte, des analyses protéomiques basées sur l'électrophorèse bidimensionnelle, l'analyse d'images et la spectrométrie de masse ont finalement été réalisées afin de détecter et d'identifier, le cas échéant, les composantes du protéome endogène éventuellement modulées dans la plante modifiée. La rapidité et la précision de l'approche de détection des protéines par SELDITOF/MS font de la nouvelle approche d'analyse une technique prometteuse dans le domaine de la moléculture, utile pour l'étude préliminaire rapide des formes protéiques accumulées. En bref, cette approche nous a permis de détecter trois formes tronquées d'aprotinine bovine chez les plantes dirigeant cette protéine dans le RE, démontrant que la stabilité des protéines recombinantes dans ce compartiment cellulaire n'est pas universelle, à l'inverse des théories courantes. Malgré l'absence d'effet notable de l'inhibiteur recombinant sur la croissance et la morphologie des clones produits, des analyses protéomiques- subséquentes ont révélé, par ailleurs, que plusieurs protéines montrant une teneur altérée chez ces clones étaient impliquées dans la synthèse et la maturation des protéines endogènes au niveau cellulaire, suggérant un effet d'interférence de l'aprotinine sur la synthèse protéique cellulaire et expliquant possiblement une baisse significative de la teneur en protéines foliaires totales observée chez les mêmes clones. En dépit d'un taux d'accumulation plus faible chez les clones accumulant l'inhibiteur dans le milieu extracellulaire, ce dernier compartiment s'est avéré mieux adapté à l'accumulation d'aprotinine, générant une protéine entière et non tronquée montrant peu d'effets sur le métabolisme générale de la plante hôte. Ces résultats, qui illustrent la complexité des interactions moléculaires et cellulaires pouvant survenir in planta entre une protéine recombinante et la plante hôte, mettent aussi en évidence l'importance d'études empiriques détaillées sur l'impact des signaux d'adressage ajoutés aux constructions génétiques développées à des fins de moléculture.