Les microARNs (miARNs), petits ARNs non codants, sont des fins régulateurs de l’expression des gènes. Les miARNs jouent des rôles essentiels dans les processus biologiques physiologiques mais aussi pathologiques. Cependant, leurs rôles durant l’ovogenèse chez les vertébrés demeurent peu documentés. D’une manière similaire aux gènes ovocytes-spécifiques, nous avons proposé l’hypothèse que les miARNs ovaire-prédominants joueraient des rôles essentiels durant l’ovogenèse et/ou le développement embryonnaire précoce. L’objectif de ma thèse était, dans un premier temps, d’identifier les miARNs ovaire-prédominants chez le médaka (Oryzias latipes). Ensuite, dans un deuxième temps, de caractériser le rôle de MiR202, un miARN gonades-prédominant chez les vertébrés. Par une analyse transcriptionnelle à grande échelle, nous avons identifié 66 miARNs ovaire-prédominants chez le médaka, qui, pour la plupart, n’ont jamais été identifiés ni chez le poisson ni dans l’ovaire. Neuf d’entre eux ont été validés par PCRq. Parmi ces derniers, 3 miARNs (MiR4785, MiR6352 et MiR729) présentent une expression ovarienne stricte. De plus, nous avons mis en évidence une isoforme de MiR202 qui est ovaire-prédominante. L’analyse de l’expression de MiR202 durant l’ovogenèse et le développement embryonnaire a montré une expression de ce dernier durant tous les stades de l’ovogenèse. Cependant, il n’est détecté que durant les premiers stades de développement embryonnaire, précédent l’activation du génome zygotique, en cohérence avec un potentiel effet maternel. Afin de caractériser la fonction de MiR202, nous avons réalisé une inactivation fonctionnelle de ce dernier chez le médaka par le système CRISPR/Cas9. La déplétion de mir202 a causé une baisse de fécondité et un arrêt du développement avant le stade une cellule. Une analyse transcriptionnelle globale des ovaires mir202-/-, nous a permis d’identifier plusieurs gènes modulés par MiR202. Parmi eux, six3, cible potentielle de MiR202, semble réguler plusieurs gènes essentiels durant l’ovogenèse ou le développement embryonnaire. Ces travaux nous ont permis d’identifier plusieurs miARNs ovaire-prédominants. Parmi eux, nous avons montré que MiR202 joue un rôle essentiel durant l’ovogenèse et sa contribution en tant que gène à effet maternel est indispensable au développement embryonnaire précoce chez le médaka. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-codant RNAs that emerged as key regulators of gene expression. MiRNAs play important roles in both normal physiological and pathological pathways in many organisms. The involvement of miRNAs in vertebrate oogenesis remains however poorly documented. Based on the assumption that ovarian-specific or ovarian-predominant genes usually play important roles in oogenesis or early development in vertebrates, we searched for ovarian-predominant miRNAs in the medaka (Oryzias latipes) ovary, in one hand. In another hand, we studied the function of MiR202, a gonadal predominant miRNA in vertebrates. Using genome-wide expression analysis, we identify 66 miRNAs predominantly expressed in the ovary, most of them have never been described neither in fish nor in ovaries. Nine were validated by QPCR. Among them, 3 miRNAs exhibit a strict ovarian expression (MiR4785, MiR6352 and MiR729). Further, we identify a novel miR202 isomiR that exhibits an ovarian predominant expression. MiR202 expression analyses during oogenesis and early embryonic development revealed an expression in all oogenesis stages. However, it was only detected in early developmental stages before onset of zygotic genome activation (ZGA), suggesting that this MiR202 is maternally inherited in medaka. To decipher MiR202 function, CRISPR/Cas9 system was used to functionally inactivate this miRNA in medaka. Mir202 depletion causes a reduced fecundity and an early embryonic developmental arrest. Global gene expression profiling of mir202-/- ovaries revealed that many genes are regulated by MiR202. Among them, six3, that could be a putative target of MiR202, seems to be involved in the regulation pathway of many genes that are essential in oogenesis and embryonic development. During my PhD, we identify many ovarian-predominant miRNAs. Among them, we showed that MiR202 plays an essential role during oogenesis and plays a key role during early embryonic development as a maternal effect gene.

La mucine MUC4 est un acteur important de la cancérogenèse pancréatique. Elle favorise la progression tumorale et son expression est associée à un mauvais pronostic. Il a également été montré l’implication de la mucine MUC4 dans la résistance aux chimiothérapies. L’ensemble de ces données souligne l’intérêt de la mucine MUC4 comme cible thérapeutique. De plus, sa néoexpression dès les stades précoces de la cancérogenèse pancréatique lui confère un rôle potentiel de marqueur précoce de la carcinogenèse. Les mécanismes moléculaires responsables de l’induction précoce de l’expression de MUC4 sont toutefois encore peu connus.L’étude de la régulation de l’expression de la mucine MUC4 contribuerait donc mieux à comprendre son rôle dans la cancérogenèse. Ainsi, il a été montré que le gène MUC4 est régulé in vitro par des mécanismes transcriptionnels et par des mécanismes épigénétiques de méthylation de l’ADN et des modifications post-traductionnelles des histones. En revanche, la régulation post-transcriptionelle de l’expression de MUC4 notamment par les miARN est peu connue. Nos travaux ont pour but d’identifier les miARN dérégulés dans le cancer du pancréas et/ou ciblant potentiellement MUC4, de déterminer le(s) miARN inhibant l’expression de la protéine oncogénique MUC4 et l’impact de l’administration de ce(s) miARN dans la cancérogenèse pancréatique, et d’identifier les miARN impliqués dans la chimiorésistance médiée par MUC4 dans le cancer du pancréas.Dans un premier temps, nous avons dressé le profil d’expression des miARN dans des lignées cellulaires pancréatiques humaines normales et cancéreuses par puces miARN. Nous avons pu mettre en évidence une signature d’expression de miARN qui a permis de valider nos modèles cellulaires. Puis, à l’aide des bases de données TargetScan, Microcosm et MiRanda, nous avons identifié les miARN ciblant potentiellement MUC4. L’analyse par PCR quantitative a permis de montrer que seuls le miR-145 et miR-219-1-3p étaient sous-exprimés dans l’ensemble des lignées cancéreuses étudiées. Finalement, uniquement miR-219-1-3p est capable d’inhiber l’expression protéique de MUC4 ; c’est pourquoi nous nous sommes intéressés à son rôle dans le cancer du pancréas.Nous avons observé une perte d’expression du miR-219-1-3p dans des tissus de patients atteints d’adénocarcinome pancréatique. Par deux approches complémentaires de surexpression (transitoire ou stable) ou d’inhibition de miR-219-1-3p, nous avons montré qu’il était capable de réprimer l’expression de MUC4 au niveau protéique en se fixant directement sur son 3’-UTR. Nous avons observé une inhibition de la migration et de la prolifération cellulaires associées à une diminution de l’expression de la cycline D1 et de l’activation des voies de signalisation Akt et Erk. In vivo, la croissance tumorale est fortement ralentie après l’injection intratumorale de miR-219-1-3p. Grâce au modèle murin Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D de lésions PanIN, nous avons pu mettre en évidence que la perte d’expression du miR-219-1-3p intervient précocement dès les stades PanIN-1/2 de la cancérogenèse pancréatique et qu’il existait une corrélation inverse entre l’expression de miR-219-1-3p et celle de la mucine Muc4.Par ailleurs, nous avons observé que le traitement des cellules cancéreuses pancréatiques humaines par la gemcitabine induit une forte surexpression du miR-219-1-3p qui laisse penser à un rôle potentiel de ce miARN dans la sensibilité des cellules à la chimiothérapie. Cependant, cette surexpression n’a montré aucun effet sur la survie cellulaire après traitement. Nous avons par la suite mis en évidence un profil d’expression différentiel des miARN entre les cellules invalidées pour MUC4 et les cellules contrôles. [...] / The MUC4 mucin is an important actor of pancreatic tumorigenesis as it contributes to tumor progression and its expression correlates with a poor prognosis. It has also been shown that MUC4 is involved in resistance of cells to chemotherapies. In this context, MUC4 is a potential therapeutic target in pancreatic cancer. MUC4 neoexpression at early stages of carcinogenesis confers to this mucin a potential interest as an early marker. Molecular mechanisms responsible for MUC4 induction of expression are not well defined. Thus, studying MUC4 gene expression regulation would contribute to better understand its role in tumorigenesis. MUC4 gene is regulated at the transcriptional level and epigenetically by DNA methylation and histone modifications mechanisms. However, MUC4 post-transcriptional regulation notably by miRNA is largely unknown. Our work aimed at (i) identifying miRNA dysregulated in pancreatic cancer and/or potentially targeting MUC4, (ii) determining miRNA(s) inhibiting MUC4 expression and its (their) impact on pancreatic carcinogenesis and finally (iii) identifying miRNAs involved in chemoresistance mediated by MUC4 in pancreatic cancer.First, using miRNA microarrays we established the miRNA expression profile of normal and cancerous pancreatic cell lines. We showed a cancer-specific miRNA signature which allows us to validate our cellular models. Then, performing in silico studies with TargetScan, Microcosm and MiRanda databases led us to identify miRNA potentially targeting MUC4. Analysis by qRT-PCR showed that miR-145 and miR-219-1-3p were downregulated in human pancreatic cancer cell lines. Finally, only miR-219-1-3p inhibited MUC4 expression thus we focused on its role in pancreatic cancer.We observed a loss of miR-219-1-3p expression in pancreatic cancer tissues. Complementary approaches overexpressing (transiently or stably) and inhibiting miR-219-1-3p expression, led us to show that miR-219-1-3p represses MUC4 protein expression by interacting directly with its 3’-UTR. We observed a decrease of cell migration and cell proliferation which was associated with an inhibition of cyclin D1 expression and an inhibition of Akt and Erk activation. Tumor growth in scid mice was strongly slowed down following miR-219-1-3p intratumoral injection. In the Pdx1-Cre;LSL-KrasG12D mouse model of PanIN, loss of miR-219-1-3p expression was an early event as soon as PanIN1/2 and miR-219-1-3p expression was conversely correlated to Muc4 expression.While the strong induction of miR-219-1-3p following gemcitabine treatment of pancreatic cancer cells suggests a potential role of this miRNA in sensitivity of cells,miR-219-1-3p has no effect on survival rate of cells treated with gemcitabine. We then established the miRNA expression profile of MUC4 knocked-down (MUC4-KD) cells and control cells (Mock) and showed a dysregulation of miRNA expression in MUC4-KD compared to Mock cells.To conclude, our results indicate that miR-219-1-3p, downregulated in pancreatic cancer, negatively regulates MUC4 expression, alters cancer cell biological properties and has an antimoral effect in vivo. Altogether, these results propose miR-219-1-3p as tumor suppressor in pancreatic cancer. Loss of MUC4 leads to an aberrant miRNA expression profile suggesting a potential role of miRNA as markers of chemoresistance in pancreatic cancer.

Les microARN sont de petits ARN non codant régulant post-transcriptionnellement l’expression de certains gènes. Du fait de leur fort potentiel régulateur, une modification de leur expression peut conduire à l’apparition de pathologies telles que le cancer ou l’inhibition des mécanismes de défense contre des pathogènes. Notre objectif est de caractériser le rôle de certains miARN dans la formation de cancer gastrique dû à Helicobacter pylori. En effet, cette bactérie peut conduire à l’apparition d’adénocarcinome gastrique et de lymphome du MALT. Sa virulence est essentiellement due à la protéine CagA, injectée dans les cellules de la muqueuse gastrique. Par séquençage à haut débit du contenu en miARN d’une lignée épithéliale gastrique humaine, co-cultivée ou non avec H. pylori, nous avons observé que les niveaux de miR-200b/c sont augmentés par l’infection. Ces miARN sont des inhibiteurs puissants de la transition épithélio-mésenchymateurse (TEM), modification morphologique promotrice d’invasion. Ils ciblent les facteurs de transcription ZEB1/2 avec lesquels ils sont impliqués dans une boucle de rétro-action mutuellement répressive. Le niveau basal élevé de miR-200b/c dans ces cellules réprime totalement ZEB1, tandis que l’infection par H. pylori, sous la dépendance de CagA, promeut une TEM en induisant ZEB1. Paradoxalement, les miR-200b/c sont aussi augmentés lors de l’infection transcriptionnellement. Nous avons pu démontrer que l’augmentation des miR-200b/c dans les cellules infectées a pour rôle de modérer l’induction de ZEB1 via l’activation de NF-kB, constituant ainsi un mécanisme de défense des cellules hôte contre la perte de leur identité épithéliale. / MicroRNA are small noncoding RNA that post-transcriptionally regulate gene expression. Due to their high regulator potential, a change in their expression may lead to the emergence of diseases such as cancer or inhibition of defense mechanisms against pathogens. Our aim is to characterize the role of miRNA in the response of gastric eptithelial cells to Helicobacter pylori (H. pylori). Indeed, H. pylori promote gastric adenocarcinoma and MALT lymphoma. Its virulence is essentially mediated by CagA, injected into cells of the gastric mucosa. Thanks to high throughput sequencing of miRNA content of a gastric epithelial cell line, infected or not with H. pylori: miR-200b and -200c appeared up-regulated upon infection. These miRNA are potent inhibitors of the “epithelial-to-mesenchymal transition” (EMT), a process that drastically alters cell morphology and promotes cell invasion. MiR-200b/c target the transcription factors ZEB1 and ZEB2, with which they are involved in a mutually repressive feedback loop. In basal conditions, the high levels miR-200b/c in gastric epithelial cells totally silence ZEB1 mRNA whereas H. pylori promotes EMT via ZEB1 expression, on the dependence of CagA translocation into host cells. But, paradoxically, miR-200b/c levels were also up-regulated upon infection. The increased miR-200b/c levels in infected cells moderate ZEB1 induction thanks to NF-kB activation and constitute a self-defense mechanism to thwart the loss of their epithelial phenotype upon infection.

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65. / In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

L’atteinte des muscles locomoteurs est une manifestation systémique de la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC). Ce mémoire a pour objectif général l’étude des microARN (miR) impliqués 1) dans la myogenèse et 2) dans l’angiogenèse musculaire squelettique. Tout d’abord, l’expression de miR-1 influence la myogenèse dans les muscles locomoteurs chez des patients atteints d’une MPOC, un effet qui ne serait pas médié par IGF-1 ni par HDAC4. Ensuite, nous avons montré que l’expression de miR-1 semble négativement reliée à l’expression de VEGF dans le vastus lateralis chez les patients atteints d’une MPOC. L’ensemble de ces résultats suggère que miR-1 joueraient un rôle important dans les voies de signalisation impliquée dans la régulation de la myogenèse et de l’angiogenèse des muscles locomoteurs dans la MPOC. / Limb muscle dysfunction is a systemic manifestation of COPD. This master’s thesis has for objective the investigation of microRNAs (miRs) involved 1) in myogenesis and 2) in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. First, we showed that miR-1 appears to influence myogenesis in COPD, but not through IGF-1 or by HDAC4. We also showed that miR-1 negatively influences protein expression of VEGF in skeletal muscle angiogenesis of patients with COPD. Overall, these results suggest that miR-1 may play an important role in the regulation of limb muscle myogenesis and angiogenesis in COPD.

Résumé Les plaquettes jouent un rôle central dans le maintien de l’hémostase et sont impliquées dans les maladies cardiovasculaires. Ces éléments sont anucléés, mais contiennent des ARN messagers (ARNm), dont la traduction pourrait être régulée par leurs microARN. Au cours de ce projet, je me suis concentrée à mieux caractériser ces microARN, afin de déterminer leur rôle dans la fonction plaquettaire. L’étude du répertoire complet des microARN plaquettaires humains, réalisée par séquençage à haut débit, montre un profil caractérisé par la forte expression de microARN impliqués dans la différentiation cellulaire et la mégacaryopoïèse. La diversité des microARN plaquettaires est enrichie par l’expression d’isoformes décalées en 5’, tel que miR-140-3p, ce qui leur confère la capacité de réguler des ARNm différents de l’isoforme principale. Beaucoup de microARN plaquettaires sont modifiés en 3’, ce qui peut altérer leur stabilité et influencer leur fonction. La présence de deux nucléotidyl-transférases et l’activité d’uridylation, observées dans des extraits protéiques de plaquettes in vitro, démontrent la capacité des plaquettes à modifier et à réguler leurs microARN. Dans un second temps, j’ai étudié l’implication des microARN dans les défauts plaquettaires observés chez les patients urémiques, dialysés ou non. Bien que les complexes impliqués dans la biogenèse et la fonction des microARN demeurent fonctionnels, le profil des microARN plaquettaires est altéré chez les patients urémiques, et semble rétabli par la dialyse. Deux gènes ont été identifiés comme étant régulés par des microARN altérés chez les patients urémiques, suggérant que l’altération de la régulation de certains ARNm par les microARN pourrait contribuer aux défauts plaquettaires chez ces patients. Militant en faveur d’un rôle des microARN dans la traduction des ARNm plaquettaire, j’ai mis en évidence (i) l’association des complexes effecteurs Argonaute 2 (Ago2)•microARN avec les ARNm, et (ii) la régulation de certains ARNm, traduits dans les plaquettes, par des microARN abondamment retrouvés dans celles-ci. Suite à l’activation des plaquettes, ces dernières sécrètent des microARN, essentiellement dans des microparticules, à l’intérieur desquelles ils sont associés à Ago2. Globalement, mes résultats laissent entrevoir un rôle important pour les microARN plaquettaires dans la régulation de leurs ARNm et la communication intercellulaire. / Platelets play a central role in hemostasis and are involved in cardiovascular diseases. Devoid of a nucleus, platelets nevertheless contain messenger RNAs (mRNAs) and are capable of de novo protein synthesis. MicroRNAs are particularly abundant in platelets, suggesting that they may regulate mRNA translation. In this project, I characterized further the microRNA repertoire and pathway of human platelets in order to gain more insights into their role in platelet function. High-throughput sequencing analysis of human platelet small RNAs revealed an abundant array of microRNAs involved in cell differentiation or megakaryopoiesis. The diversity of platelet microRNAs is expanded by the expression of 5’ shifted isoforms, as observed with miR-140-3p that may regulate mRNAs different than the reference sequence. Most platelet microRNAs are extensively modified at their 3’ extremity, a process that is thought to alter their stability and function. The detection of two nucleotidytranferases, as well as uridylation activity in platelets, demonstrate their ability to modify and regulate their microRNAs. I then studied the implication of microRNAs in the platelet defects observed in uremic patients, undergoing dialysis or not. Although the complexes involved in microRNA biogenesis and function remain functional, the platelet microRNA profile of uremic patients was altered, but seems to be restored by dialysis. The identification of two genes that are regulated by microRNAs altered in uremic patients suggests that an alteration of microRNA-based mRNA regulatory mechanisms may underlie the platelet response to uremia. Consistent with a role for microRNAs in regulating platelet mRNAs, Ago2•microRNA complexes are associated with platelet mRNAs. In addition, certain mRNAs translated in platelets can be regulated by microRNAs that are particularly abundant in platelets. Following their activation, platelets secrete microRNAs, mainly via microparticles, in which they are found associated with Ago2. Altogether, my results suggest that platelet microRNAs may play an important role in the regulation of platelet mRNAs as well as in intercellular communications.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2007-2008. / Chez C. elegans, les caractéristiques moléculaires des différentes voies des courts ARN divergent. Dans la voie du RNAi, une molécule d’ARN double-brin linéaire mène à la production de siARN, initiant la dégradation de l’ARNm. Quant aux microARN, le précurseur du microARN présente une structure « épingle à cheveux » et le microARN mature induit un blocage de la traduction de cet ARNm. Ces deux voies requièrent leurs protéines Argonautes spécifiques. Nous avons conçu une molécule d’ARNdb linéaire contenant à la fois une séquence d’un microARN et une séquence d’un siARN, et suggérons que la spécificité des Argonautes n’est pas déterminée par la molécule de départ. Nous tentons aussi de comprendre le rôle des Argonautes ALG-1 et ALG-2. Une immunoprécipitation et une analyse des facteurs protéiques et ribonucléiques associés ont été effectués. Cette expérience pourrait aussi s’avérer un outil simple permettant l’identification de nouvelles cibles potentielles des microARN. / The molecular characteristics of the RNAi and microRNA pathways are different. In the RNAi pathway, fully base-paired dsRNA molecules trigger the production of small interfering RNAs (siRNAs), which lead to the degradation of the complementary targeted mRNA. On the other hand, the stem-looped miRNA precursor is processed in mature miRNA, which then imperfectly interacts with the mRNA target, leading to the blocking of its translation. In the worm C. elegans, each of the RNAi and miRNA pathways needs its specific Argonautes proteins. RNAi requires RDE-1, while ALG-1 and ALG-2 act in the miRNA pathway. The restriction of siRNAs and miRNAs to specific Argonaute proteins might reflect the recognition of the trigger by specific factors targeting it to the correct Argonaute protein. To better understand the importance of the trigger in the selection of the adequate Argonaute and pathway, we designed a dsRNA trigger containing both miRNA and siRNA sequences. This chimeric molecule can rescue successfully the loss of function of the miRNA let-7, and can also initiate the gfp gene silencing by RNAi. We demonstrated that RDE-1 and the dsRNA-binding protein RDE-4 are essential for RNAi induced with our trigger, but are not involved in the let-7 function of the chimera molecule. On the other hand, we showed that ALG-2 is strictly required for the miRNA function, but not for the RNAi function. Interestingly, we also found that the let-7 miRNA processed from our molecule has a limited lifetime, while the RNAi response, initiated from the same dsRNA, is maintained for a longer period. We suggest that the specificity of the Argonautes and thus the choice of the small RNA pathway is not determined by the type of RNA trigger, but rather by their respective molecular response. Furthermore, we also tried to understand the roles of ALG-1 and ALG-2. An immunoprecipitation of these proteins and an analysis of the protein and RNA interactors were carried out.

Au sein de l'ensemble des protéines Argonautes codées par les génomes des organismes métazoaires, certains membres de cette famille de protéines ont conservé des acides aminés importants pour l'activité endonucléasique. La signification fonctionnelle de ces résidus (composés des résidus DDH), pour les Argonautes spécifiques des miARN chez les animaux, est encore inconnue puisque le ciblage des ARNm par les miARN ne provoque pas de clivage site spécifique comme c'est le cas pour les siARN. In vitro, nous avons mis en évidence, chez le nematode C. elegans, que les protéines Argonautes spécifiques aux miARN, ALG-1 et ALG-2, conservant ce motif, possèdent une activité de clivage similaire à celle impliquée dans la voie des si ARN. Nous démontrons également que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 ont la capacité de lier et d'utiliser comme substrats différents duplexes de courts ARN, similaires aux duplexes de miARN produits par l'enzyme DCR-1. Les Argonautes ALG-1 et ALG-2 sont capables de coupure endonucléolytique sur ces duplexes, lorsque le degré de complémentarité entre les deux brins le permet, et de séparer les deux brins d'un duplex de courts ARN contenant des mésappariements. In vivo, l'activité endonucléasique de ALG-1 ou ALG-2 est essentielle pour la voie des miARN, et la perte de cette activité conduit à une accumulation des précurseurs de miARN tronqués et une altération de la formation de miRISC fonctionnel. Prises dans leur ensemble, nos données indiquent que l'activité endonucléasique des protéines Argonaute ALG-1 ou ALG-2 contribue à la maturation des miARN chez le nematode C. elegans.

L’extravasation des cellules cancéreuses circulantes est importante pour la dissémination métastatique qui est initiée par l’adhérence de cellules cancéreuses aux cellules endothéliales vasculaires. Elle nécessite l’interaction entre les récepteurs d’adhérence comme E-sélectine sur les cellules endothéliales et leurs ligands sur les cellules cancéreuse. Notamment, E-sélectine influence le potentiel métastatique des cancers du sein, de la vessie, de l’estomac, du pancréas et du côlon, des leucémies et lymphomes. Ici on montre que l’expression de E-sélectine est ciblée par deux groupes distinctifs de microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, qui cible directement le mRNA de E-sélectine, et miR-146a et -181a/b, qui répriment l’expression de E-sélectine, indirectement en ciblant la voie de NF-κB en amont. La voie des MAP kinases joue un rôle pivot dans la transcription de deux de ces miRNAs en réponse à l’IL-1β, étant donné que p38 et JNK contrôlent la transcription de miR-31, et que p38, ERK et JNK médient la transcription de miR- 146a. Les facteurs de transcription en aval des MAP kinases, GATA2, c-Fos et c-Jun, modulent la transcription de ces deux miRNAs. L’inhibition de p38 augmente l’activité de NF-κB au moins partiellement par miR-146a. L’inhibition de p38 augmente aussi l’expression de Esélectine au niveau post-transcriptionnel en diminuant miR-31. En réponse à l’IL-1β, p38 MAP kinase réprime donc l’expression de E-sélectine aux niveaux transcriptionnel et posttranscriptionnel via miR-146a et miR-31, respectivement. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel p38 inhibe l’expression de E-sélectine par les miRNAs suivant une stimulation pro-inflammatoire. L’inhibition de E-sélectine médiée par miR-31/-146a diminue le potentiel métastatique de cellules de cancer du côlon en réduisant leur adhérence à l’endothélium, et leur migration transendothéliale. Ces résultats soulignent pour la première fois que les miRNAs médient l’extravasation des cellules du cancer du côlon dépendante de E-sélectine. / Extravasation of circulating cancer cells is a key event of metastatic dissemination that is initiated by the adhesion of cancer cells to vascular endothelial cells. It requires the interaction between adhesion receptors such as E-selectin present on endothelial cells and their ligands on cancer cells. Notably, E-selectin influences the metastatic potential of breast, bladder, gastric, pancreatic, and colorectal carcinoma as well as of leukemia and lymphoma. Here, we show that E-selectin expression is targeted by two distinct sets of microRNAs (miRNAs); i.e. miR-31, which targets E-selectin mRNA directly, and miR-146a and -181a/b, which repress E-selectin expression indirectly by targeting the upstream pro-inflammatory NF-κB pathway. MAP kinases play pivotal roles in the transcription of some of these miRNAs in response to IL-1β, in that p38 and JNK control the transcription of miR-31, and that p38, ERK and JNK mediate the transcription of miR-146a. The downstream transcription factors of MAK kinases, namely GATA2, c-Fos and c-Jun modulate the transcription of both miRNAs. Inhibiting p38 MAP kinase increases NF-κB activity, at least partially via miR-146a. Inhibiting p38 also increases the expression of E-selectin at the post-transcriptional level via decreasing miR-31. In response to IL-1β, p38 MAP kinase hence represses the expression of E-selectin at the transcriptional and the post-transcriptional levels, via miR-146a and miR-31, respectively. These results highlight a novel mechanism by which p38 downregulates the expression of E-selectin through microRNAs following inflammatory stimuli. The miR-31/-146a-mediated repression of E-selectin impairs the metastatic potential of colon cancer cells by decreasing their adhesion to, and migration through, the endothelium. These results highlight for the first time that miRNAs mediate E-selectindependent extravasation of colon cancer cells.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants qui répriment la traduction de leurs gènes cibles par hybridation à leur ARN messager (ARNm). L'identification de cibles biologiquement actives de miARN est cruciale afin de mieux comprendre leurs rôles. Ce problème est cependant difficile parce que leurs sites ne sont définis que par sept nucléotides. Dans cette thèse je montre qu'il est possible de modéliser certains aspects des miARN afin d'identifier leurs cibles biologiquement actives à travers deux modélisations d'un aspect des miARN. La première modélisation s'intéresse aux aspects de la régulation des miARN par l'identification de boucles de régulation entre des miARN et des facteurs de transcription (FT). Cette modélisation a permis, notamment, d'identifier plus de 700 boucles de régulation miARN/FT, conservées entre l'humain et la souris. Les résultats de cette modélisation ont permis, en particulier, d'identifier deux boucles d'auto-régulation entre LMO2 et les miARN miR-223 et miR-363. Des expériences de transplantation de cellules souches hématopoïétiques et de progéniteurs hématopoïétiques ont ensuite permis d'assigner à ces deux miARN un rôle dans la détermination du destin cellulaire hématopoïétique. La deuxième modélisation s'intéresse directement aux interactions des miARN avec les ARNm afin de déterminer les cibles des miARN. Ces travaux ont permis la mise au point d'une méthode simple de prédiction de cibles de miARN dont les performances sont meilleures que les outils courant. Cette modélisation a aussi permis de mettre en lumière certaines conséquences insoupçonnées de l'effet des miARN, telle que la spécificité des cibles de miARN au contexte cellulaire et l'effet de saturation de certains ARNm par les miARN. Cette méthode peut également être utilisée pour identifier des ARNm dont la surexpression fait augmenter un autre ARNm par l'entremise de miARN partagés et dont les effets sur les ARNm non ciblés seraient minimaux. / microRNAs (miRNAs) are small non coding RNAs that repress the translation of their target genes by pairing to their messenger RNA (mRNA). The identification of miRNAs' biologically active targets is a difficult problem because their binding sites are defined by only seven nucleotides. In this thesis, I show that it is possible to model specific aspects of miRNAs to identify their biologically active targets through two modeling of each one aspect of miRNAs. The first modeling considers the miRNAs regulations through the identification of regulatory loops between miRNAs and transcription factors (TFs). Through this modeling, we identified over 700 miRNA/TF regulatory loops conserved between human and mouse. With the results of this modeling, we were able to identify, in particular, two regulatory loops between LMO2 and the miRNAs miR-223 and miR-363. Using hematopoietic stem cells and progenitor cells transplantation experiment we showed that miR-223 and miR-363 are involved in hematopoietic cell fate determination. The second modeling focuses directly on the interaction between miARN and messenger RNA (mRNA) to determine the miRNA targets. With this work, we developed a simple method for predicting miRNA targets that outperforms the current state of the art tool. This modeling also highlighted some unsuspected consequences of miRNA effects such as the cell context specificity and the saturation of mRNA targets by miRNA. This method can also be used to identify mRNAs whose overexpression increases the expression level of another mRNA through their shared miRNA and whose global effects on other genes are minimal.