Le gène H19, soumis à l’empreinte parentale, est fortement exprimé durant le développement embryonnaire, cependant, son expression est réprimée après la naissance dans l’ensemble des tissus à l’exception du muscle squelettique, et plus particulièrement des cellules souches musculaires : les cellules satellites. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du gène H19 dans la mise en place et dans la fonction de ces cellules souches durant la myogénèse adulte. En utilisant un modèle murin présentant une délétion du gène H19, les souris H19∆3, notre laboratoire avait montré que le gène H19 est capable de moduler, dans le muscle embryonnaire, l’expression de neuf gènes appartenant à un réseau de gènes soumis à l’empreinte parentale (IGN) impliqué dans la croissance. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le phénotype des muscles de ces souris mutantes qui présentent une hyperplasie et une hypertrophie des fibres musculaires. Ce phénotype est accompagné d’une diminution du nombre de cellules satellites qui apparait lors de l’entrée en quiescence de ces cellules. De façon étonnante, nous avons observé une meilleure capacité de régénération, malgré le nombre réduit de cellules satellites, dans les muscles H19∆3 comparée à celle des muscles wt. Cela indique que la capacité d’auto-renouvellement des cellules satellites n’est pas influencée par l’absence du gène H19. De même, nous avons observé une surexpression de plusieurs gènes appartenant à l’IGN lors de la régénération musculaire des muscles mutants comparés aux muscles wt. Ces résultats indiquent que le gène H19 module l’expression des gènes de l’IGN durant l’embryogénèse et par la suite, durant les étapes de régénération de la myogénèse adulte. / The imprinted H19 gene is highly expressed during embryonic development. H19 is fully repressed after birth in all tissues, with the exception of skeletal muscle, and especially of the muscle stem cells: the satellite cells. The aim of my thesis was to define the function of the H19 gene in the satellite cells establishment and function during adult myogenesis. Using loss-of-function H19∆3 mice, the laboratory had shown that the H19 gene was able to modulate the expression of several genes belonging to an imprinted gene network (IGN) in the embryonic muscle. During my thesis, I studied the muscle phenotype of these adult mice, which present both fiber hyperplasia and hypertrophy. This phenotype is accompanied by an important reduction of the satellite cell number, probably due to a delay in their entry into quiescence. Unexpectedly, despite the reduction in the number of satellite cells in mutant mice, the self-renewal capacity of the satellite cells is fully retained. In addition, we observe a better regeneration potential of the mutant muscles compared with wt muscles. This is accompanied by the enhanced expression of several genes from the IGN. These results indicate that H19 gene can modulate IGN gene expression both during embryogenesis and after birth, in adult myogenesis.

Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d’origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l’oncologie pédiatrique. L’extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d’une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d’autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l’aide d’une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L’expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d’expression différentielle. Ainsi, l’expression de miR‐487b et miR‐410 s’est révélée être un facteur pronostique supérieur à l’algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l’amplification de l’oncogène N‐MYC). Le contexte d’empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d’autres microARN d’intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d’expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d’expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu’aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d’anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l’épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l’expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature – rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l’adulte, des anomalies d’expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) – suggèrent très fortement l’implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine. / Neuroblastoma, an embryonal tumour of neuro‐ectodermal origin, stands up with brain tumours as the most worrying cancer of paediatric oncology. The huge heterogeneity of neuroblastic tumours has led i) to find oncogenic mechanisms, and ii) to refine risk stratification of the disease. In using a tumour cohort of patients as well as human NB lines, we sought for microRNA involved in neuroblastoma tumour progression. Comparison of tumours of low‐risk to those of high‐risk resulted to identifying several microRNA composing the C14MC cluster (located within the 14q32.31 locus), whose expression was associated with prognosis; high risk tumours having a differential lower transcript level.Expression of miR‐487b and miR‐410 was a better prognostic factor than the standard algorithm based on age, stage, and N‐MYC genomic content status. As the C14MC cluster belongs to a imprinted locus, the second cluster of microRNAs so far described in the human genome as imprinted, i.e., the C19MC, was analysed: in high‐risk neuroblastoma, miR‐516a‐5p transcript level was differentially up‐regulated (contrasting to microRNAs from C14MC) and was also associated with prognosis. Combination of transcript levels of miR‐487b and miR‐516a‐5p provides a powerful prognostic factor better than only miR expression from C14MC. Therefore, new risk stratification has been proposed.In neuroblastoma, tumour expression deregulation found to be restricted to C14MC and C19MC as well as the DLK1 et MEG3 harboured by the 14q32.31 locus, should result from methylation anomalies. Epigenetic modulators (5‐AZA and PBA) resulted in a significant increase of miR from C14MC as well as DLK1 and MEG3 genes. With regards to target genes, our results point out N‐MYC, TWIST1 and TWIST2 as direct or indirect targets of miR‐487b & miR‐516a‐5p. Our data and literature – indicating relative underexpression of C14MC microRNAs and hyper‐expression of C19MC microRNAs in aggressive forms of various adult cancers – thus stress the potential involvement of the two clusters in human carcinogenesis.

Chez les mammifères, l'empreinte génomique parentale est un mécanisme épigénétique restreignant l'expression d'une centaine de gènes à un seul allèle, déterminé selon son origine parentale. Les gènes affectés et les mécanismes sous-jacents à leur expression mono-allélique sont essentiellement déterminés par une marque épigénétique différentielle portés par les allèles maternel et paternel. D'un point de vue fonctionnel et au niveau physiologique, l'empreinte est actuellement comprise comme un mécanisme contrôlant la quantité de ressources attribuées par la mère à sa progéniture. Les gènes soumis à empreinte s'inscrivent dans un même réseau transcriptionnel (IGN), et plusieurs études indiquent qu'ils contrôleraient l'équilibre entre prolifération et quiescence de cellules souches adultes. A travers cette étude, nous montrons une induction coordonnée de la plupart des gènes soumis à empreinte lors de la sortie du cycle cellulaire, que celle-ci soit réversible (quiescence) ou non (différenciation). De plus, dans un modèle de pré-adipocytes 3T3-L1, la perturbation de la dynamique d'expression de plusieurs de ces gènes semble conforter l'hypothèse d'un contrôle des transitions entre différents états cellulaires (prolifération, quiescence et différenciation) par l'IGN. Outre l'identification d'une fonction cellulaire commune aux gènes soumis à empreinte, nos résultats ouvrent la voie d'une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de la quiescence. De plus, nos conclusions permettent de suggérer un nouveau scénario pour la sélection de l'empreinte parentale au cours de l'évolution des mammifères. / Mammalian genomic imprinting is an epigenetic mechanism that restrains the expression of about a hundred genes to a single allele, in a parent-of-origin specific manner. The identity of imprinted genes and the molecular basis of their monoallelic expression mostly rely on a differential epigenetic marking of the parental alleles. Presently, imprinting is understood as a mechanism aimed at controlling the amount of maternal resources allocated to the offspring. Imprinted genes belong to the same transcriptional network (IGN) and, according to different reports, they seem to control the balance between proliferation and quiescence of adult stem cells. In this study, we show that most imprinted genes are induced upon cell cycle exit, whether reversible (quiescence) or not (differentiation). In addition, within the 3T3-L1 preadipocytes cell line, impairing the dynamics of expression of several imprinted genes impairs the transitions between different cellular states, namely proliferation, quiescence and differentiation. Our results highlight the existence of a common cellular function of imprinted genes, and provide a new frame to understand cellular quiescence, at a molecular level. Furthermore, they suggest a new plausible scenario for the implementation of genomic imprinting during mammalian evolution.

Les gènes soumis à empreinte (GSE) se distinguent du reste du génome par une expression mono-allélique et parent-spécifique. Cette forme de régulation génique dépend de marques de méthylation différentielles héritées des gamètes parentaux au niveau de régions cis-régulatrices appelées ICR (« Imprinting Control Region »). Une centaine de GSE contrôlés par 20 ICR ont été répertoriés chez la souris et sont en général conservés chez l’Homme. Mon projet de thèse a consisté à caractériser de nouvelles ICR maternelles et à analyser leur impact sur la régulation génique, à partir d’un criblage génomique de méthylation réalisé chez la souris. J’ai ainsi participé à la révélation de l’existence de trois formes d’empreinte, qui résultent de sensibilité différente des ICR face aux changements développementaux des profils de méthylation génomique: 1) une empreinte persistante tout au long de la vie et ubiquitaire, qui caractérise les ICR classiques déjà connues, 2) transitoire, avec une existence limitée au développement pré-implantatoire, et 3) persistante tout au long de la vie mais tissu-spécifique. Plus précisément, j’ai déterminé les profils d’histones associées aux ICR des loci Cdh15 et Gpr1/Zdbf2, et mis en évidence la conservation de l’empreinte transitoire au locus GPR1/ZDBF2 chez l’humain. Je me suis ensuite focalisée sur l’ICR candidate associée au gène Socs5, dont l’empreinte s’est avérée être tissu-spécifique mais également, de façon inédite, polymorphique en fonction des lignées de souris. Cette ICR en position intragénique présente les caractéristiques d’une séquence « enhancer », hypothèse que je teste actuellement par invalidation fonctionnelle (système CRISPR/Cas9) chez la souris. La découverte de ces formes atypiques d’empreinte génomique permet de mieux cerner l’étendue du phénomène d’empreinte parentale et d’évaluer son impact sur les phénotypes. / Genomic imprinting refers to the functional non-equivalence of the two parental genomes in mammals. Imprinted genes are expressed only from the paternal or maternal allele: this mono-allelic expression is regulated by parent-inherited DNA methylation of specific cis-regulatory regions called ICRs (Imprinting Control Regions). There are currently around 120 imprinted genes known in the mouse genome, which are under the control of 20 characterized ICRs, and are generally conserved in Human. My thesis project aimed at characterizing new maternal ICRs and at analyzing their impact on gene regulation, based on a genome-wide methylation screen conducted in the mouse. I participated to revealing the existence of three forms of genomic imprinting, which reflects variable susceptibility to developmentally-regulated DNA methylation changes: 1) ubiquitous and life-long imprinting, which refers to the 20 canonical ICRs, 2) transient, whose existence is limited to preimplantation development, and 3) tissue-specific. More specifically, I deciphered the histone modification profiles of two new maternal ICR associated with the Cdh15 and the Gpr1/Zdbf2 loci and confirmed that the GPR1/ZDBF2 locus is also subject to transient imprinting in Human. My main achievement concerns the characterization of a candidate ICR associated with the Socs5 gene, which I found to be tissue-specific but also strain-specific, pointing towards a new form of imprinting polymorphism. This ICR has an intragenic position and has the characteristics of an enhancer, hypothesis that I am functionally testing in vivo by a CRISPR/Cas9-mediated deletion. The discovery of these new forms of genomic imprinting provides a better understanding of this phenomenon and its impact on phenotypes.

GNAS est un locus soumis à empreinte parentale. Ce locus produit différents transcrits et protéines en utilisant des promoteurs distincts. Le transcrit bialléique Gsα, les transcrits soumis à empreinte maternelle GNAS-AS1, XLαs et A/B et un transcrit soumis à empreinte paternelle NESP55. L’expression de ces transcrits est contrôlée par des régions différentiellement méthylées (DMRs). Le locus GNAS est impliqué dans plusieurs maladies. La PseudoHypoParathyroïdie (PHP) également appelée inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, pour la description de la nouvelle classification) englobe un groupe de maladies rares, très hétérogène caractérisé par la résistance des organes à l'action de la PTH. Les iPPSD2 sont dues à des mutations perte de fonctions de Gsα, les iPPSD3 à des anomalies de méthylation d’une ou plusieurs DMRs. Les tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses du pancréas (TIPMPs) sont des tumeurs kystiques caractérisées par une prolifération papillaire intracanalaire de l’épithélium des canaux pancréatiques. Les TIPMPs sont des précurseurs de l’adénocarcinome pancréatique comprenant trois degrés de dysplasie selon le phénotype histologique, légère, moyenne et haut grade.L’objectif de mon travail était d’étudier l’implication des transcrits non codants et des GNAS-miRNAs à l’aide de deux modèles pathologiques les iPPSD2 et 3 et les TIPMPs.Projet TIPMP :Nous avons identifié que la perte d’empreinte du locus GNAS est un événement fréquent dans les TIPMPs et semble associée à des marques d’activation de la transcription du locus. De plus, d’autres gènes soumis à l’empreinte parentale, comme MEG3 et DIRAS3, présentent également des modifications de leurs marques épigénétiques.Projet iPPSD2 et 3 :Résultat 1 : Croissance longitudinale, taille finale et IMC des patients iPPSD2 et 3. Les patients iPPSD2 naissent hypotrophiques, ont une petite taille finale et développe un surpoids. Les patients iPPSD3 naissent macrosomiques mais atteignent une taille finale normale et un IMC moyen normal. Mes résultats suggèrent un rôle majeur de Gsα et de Xlαs dans la croissance fœtale, postnatale, pubertaire et l’accumulation de la masse grasse.Résultat 2 : Cibles des GNAS-miRNAs et phénotype des patients iPPSD3. Mes données d’expression des GNAS-miRNAs dans les lymphocytes et les fibroblastes de patients matUPD20/patUPD20 montrent qu’ils sont soumis à l’empreinte parentale. In silico, les cibles de ces miRNAs sont classées en 3 groupes : signalisation de l’AMPc, signalisation du calcium et croissance. La transfection dans les cellules HEK des GNAS-miRNAs m’a permis de confirmer certaines cibles moléculaires comme la cible du miR-296-3p, PRKAG1 et la cible des miRs 296-5p et 296-3p, GNB2 tous les deux impliqués dans la voie de l’AMPc.Résultat 3 : étude d’une nouvelle DMR : GNAS-AS2. Cette DMR récemment identifiée présente une perte de méthylation chez la plupart des patients iPPSD3 comparés aux contrôles. Nous avons identifié pour la première fois, un sous-groupe de patients iPPSD3 qui présente une perte de méthylation de la DMR GNAS-AS1:TSS-DMR, mais pas de GNAS-AS2. Ces patients ont un profil de iPPSD3 autosomique dominant, sans délétion du centre d’empreinte STX16. Mes résultats montrent : 1-absence de délétion ou remaniement génomique en whole genome sequencing dans une famille atteinte, 2-la DMR GNAS-AS2 possède deux sous domaines distincts et 3-la transmission de cette anomalie est maternelle.Les transcrits de GNAS jouent un rôle important dans des phénomènes fondamentaux comme la croissance ante et post natale, la tumorigenèse, la signalisation endocrine AMPc dépendante et l’acquisition de la masse grasse. Afin de mieux comprendre les pathologies de l’empreinte il est important d’identifier des biomarqueurs comme les miRNAs et de les corréler aux phénotypes des patients iPPSD. / GNAS is a locus subjected to parental imprinting. This locus produces different transcripts and proteins using distinct promoters: the Gsα biallelic transcript, the maternally imprinted transcripts GNAS-AS1, XLαs and A/B and a paternal imprinted transcript NESP55. The expression of these transcripts is controlled by differentially methylated regions (DMRs). The GNAS locus is involved in several diseases. PseudoHypoParathyroidism (PHP) also called inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, for the description of the new classification) encompasses a group of heterogeneous rare diseases, characterized by the resistance of organs to the action of PTH. IPPSD2 are due to Gsα loss of function mutations, iPPSD3 to methylation abnormalities at one or several GNAS DMRs. Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm (IPMN) are cystic tumors characterized by Intraductal papillary proliferation of the pancreatic duct epithelium. IPMNs are precursors of pancreatic adenocarcinoma comprising three degrees of dysplasia according to the histological phenotype, low, medium and high grade.The aim of my work was to study the implication of non-coding transcripts and GNAS-miRNAs using two pathological models, iPPSD2 and 3 and IPMN.IPMN project:We have identified that loss of imprinting at the GNAS locus is a common trait in IPMN and appears to be associated with transcriptional activation events of the GNAS transcripts. In addition, other genes subjected to parental imprinting, such as MEG3 and DIRAS3, also show changes in their epigenetic marks.Project iPPSD2 and 3:Result 1: Longitudinal growth, final height and BMI of iPPSD2 and 3 patients. iPPSD2 patients are born hypotrophic, display a final short stature and are overweight. IPPSD3 patients are born macrosomic but reach a normal final height and normal mean BMI. My results suggest a major role of Gsα and Xlαs in fetal, postnatal, pubertal growth and fat mass accumulation.Result 2: Targets of GNAS-miRNAs and phenotype of iPPSD3 patients. Expression of GNAS-miRNAs in lymphocytes and fibroblasts of matUPD20/patUPD20 patients suggested that GNAS-miRNAs are subjected to parental imprinting. In silico, the targets of these miRNAs are classified in 3 groups: cAMP signaling, calcium signaling and growth. Transfection of the GNAS-miRNAs into HEK cells confirmed certain molecular targets such as the miR-296-3p target, PRKAG1 and the miRs 296-5p and 296 -3p target, GNB2, both transcripts being involved in cAMP pathway.Result 3: characterization of a new DMR: GNAS-AS2. GNAS-AS2 is a recent characterized DMR with loss of methylation in most iPPSD3 patients compared to controls. We have identified for the first time a subset of iPPSD3 patients with loss of methylation at the GNAS-AS1:TSS-DMR but not at the GNAS-AS2 DMR. These patients have an autosomal dominant form of iPPSD3, without deletion of the STX16 imprinting control element. My results show: 1- lack of deletion or genomic rearrangement through whole genome sequencing in an affected family, 2- GNAS-AS2 DMR has two distinct subdomains and 3- this anomaly is maternally inherited.GNAS transcripts play an important role in fundamental biological processes such as ante and postnatal growth, tumorigenesis, endocrine cAMP dependent signaling pathways and fat mass acquisition. It is important to identify new biomarkers such as miRNAs and correlate them with phenotypical factors of iPPSD patients.

Chez les plantes à graine, l'albumen est un tissu nourricier surprenant, puisqu'il résulte de la double fécondation, qui est la fécondation concomitante de l'oosphère d'une part, et de la cellule mère de l'albumen, la cellule centrale, d'autre part. Dans cette thèse, nous étudions les pressions de sélection qui déterminent l'évolution de l'albumen et pourraient expliquer l'évolution (1) de la double fécondation, (2) d'un doublement des contributions maternelles dans la cellule centrale, (3) de la polysporie, qui consiste en la participation de plusieurs produits de méiose à la formation du gamétophyte, et (4) de l'empreinte parentale, l'expression différentielle des allèles maternels et paternels.Ces innovations modifient l'hétérozygotie dans le tissu nourricier et par conséquent, ont le potentiel de changer l'hétérosis de la graine. Dans cette thèse, nous commençons par étudier comment les changements génétiques qui découlent de la double fécondation, du doublement des contributions maternelles, de la polysporie et de l'empreinte parentale modifient l'hétérosis, ce qui peut jouer en faveur ou en défaveur de leurs évolutions. Puis, nous faisons une revue des données disponibles dans la littérature pour tester si ces traits sont le résultat d'un conflit mâle-femelle sur l'allocation des ressources. Enfin, nous étudions de manière expérimentale les patrons de l'allocation des ressources chez le maïs, pour tester si les embryons sont en compétition pour les ressources, ce qui est une des conditions nécessaires pour qu'un conflit sur l'allocation des ressources ait lieu.Nos modèles théoriques nous permettent de décrire un conflit mâle-femelle sur l'exposition des allèles délétères dans les tissus pour lesquels l'expression des gènes est asymétrique. Ce conflit n'avait jamais été décrit auparavant, et ouvre de nouvelles perspectives pour la compréhension de l'évolution de l'expression génétique. L'analyse des données indique que les théories alternatives à la théorie du conflit sur l'allocation des ressources ont parfois un bon pouvoir explicatif, et méritent par conséquent d'être d'avantage explorées. Enfin, notre étude expérimentale sur le maïs montre que la compétition entre embryons est prédominante lors de l'allocation des ressources chez cette espèce, ce qui est concordant avec les prédictions de la théorie du conflit sur l'allocation. / In seed plants, the endosperm is a surprising nutritive tissue, because it results from double fertilization, an eccentricity which results from the parallel fertilization of the egg cell on the one hand, and of the mother cell of the endosperm, the central cell, on the other hand. In this thesis, we study the selective pressures which drive the evolution of the endosperm and may explain the evolution of (1) double fertilization, (2) a doubling of maternal contributions in the central cell, (3) polyspory, the participation of several meiotic products to the gametophyte and (4) imprinting, the differential expression of maternal and paternal alleles. These innovations modify heterozygosity in the endosperm and as a consequence, have the potential to change heterosis in the seed. In this thesis, we first investigate how genetic changes that result from double fertilization, doubling of maternal contribution, polyspory and imprinting modify heterosis, which may play in favour or against the evolution of these traits. Second, we review the available data to test whether these traits are the result of a male-female conflict over resource allocation. Finally, we study experimentally patterns of resource allocation in maize to assess whether embryos compete for resources, which is a necessary condition for the conflict over resource allocation to occur. Our theoretical models allow us to describe a male-female conflict over the exposition of deleterious alleles in tissues with asymmetrical gene expression. This conflict had never been described before and opens perspectives for understanding the evolution of gene expression. We conclude from our analysis of data that theories which are alternative to the conflict theory over resource allocation may have a better explanatory power and therefore deserve to be further explored. Finally, our experimental study in maize shows that competition between embryos drives resource allocation in this species, which is consistent with predictions of the conflict over resource allocation theory.

Le neuroblastome, tumeur embryonnaire d'origine neuro‐ectodermique, représente, après les tumeurs cérébrales, la tumeur maligne la plus préoccupante de l'oncologie pédiatrique. L'extrême hétérogénéité des tumeurs neuroblastiques conduit d'une part, à rechercher les mécanismes de son oncogenèse, d'autre part, à améliorer la prédiction du risque de gravité, au diagnostic de la maladie.Le travail de thèse a consisté, à l'aide d'une cohorte tumorale de patients et de lignées de neuroblastome, à rechercher les microARN impliqués dans la progression tumorale. En comparant des tumeurs de bas risque à celles de haut risque, plusieurs microARN du cluster C14MC, situés au locus 14q32.31, ont été identifiés. L'expression de ces microARN corrèle le pronostic ; les tumeurs de haut risque présentant une perte d'expression différentielle. Ainsi, l'expression de miR‐487b et miR‐410 s'est révélée être un facteur pronostique supérieur à l'algorithme de risque standard actuel (âge, stade, statut de l'amplification de l'oncogène N‐MYC). Le contexte d'empreinte génomique parentale du cluster C14MC a conduit à rechercher d'autres microARN d'intérêt sur le second cluster de microARN du génome, C19MC, lui aussi soumis à empreinte. Dans les tumeurs de haut risque, une hyper‐expression relative du miR‐516a‐5p est significativement associée au pronostic. La combinaison des niveaux d'expression de miR‐487b et miR‐516a‐5p se révèle être un facteur pronostique supérieur aux seuls microARN du cluster C14MC : elle offre une nouvelle stratification de risque.Dans les tumeurs neuroblastiques, la dérégulation d'expression serait circonscrite aux microARN des deux clusters C14MC et C19MC ainsi qu'aux gènes vicinaux DLK1 et MEG3 du locus 14q 32.31, elle résulterait d'anomalies de méthylation. Le traitement de lignées de neuroblastome de phénotype neuronal par des modulateurs de l'épigénome (5‐Azacytidine et acide phényl‐butyrique) lève l'expression des microARN du C14MC et des gènes DLK1 et MEG3. Quant aux gènes cibles des miR‐487b et miR‐516a‐5p, les recherches désignent les gènes N‐MYC, TWIST1 et TWIST2 comme candidats directs ou indirects. Ces résultats et la littérature - rapportant, dans les formes agressives de plusieurs types de cancers de l'adulte, des anomalies d'expression des microARN des clusters C14MC (hypo‐expression) et C19MC (hyperexpression) - suggèrent très fortement l'implication de ces deux clusters dans la carcinogenèse humaine.

Chez les mammifères, une centaine de gènes sont soumis à une régulation épigénétique où seule la copie maternelle, ou paternelle, est exprimée. Ce phénomène appelé empreinte parentale alimente encore différentes théories liées à la reproduction, notamment celles du conflit parental et de la coadaptation entre mère et enfant. Pw1/Peg3 est un gène d'empreinte paternellement exprimé. Cependant, à l'aide de deux modèles de souris bien distincts, une souris rapporteur (Pw1IRESnLacZ) et une nouvelle souris knockout pour Pw1/Peg3, nous avons détecté des transcrits Pw1/Peg3 maternels dans le cerveau périnatal. Plus précisément, nous avons mis en évidence une expression bi-allélique du gène rapporteur Pw1IRESnLacZ restreinte aux deux futures niches de cellules souches neurales adultes. In vitro, nous avons conclu, via des cultures primaires de cellules souches neurales, que l'expression bi-allélique endogène de Pw1/Peg3 est un évènement ponctuel rare. D'ailleurs lors de la caractérisation de notre modèle de souris Pw1/Peg3 knockout, nous avons observé un retard de croissance uniquement lors de la délétion de l'allèle Pw1/Peg3 paternel. Ce phénotype n'est pas lié à un problème de prise alimentaire chez les nouveaux-nés et contrairement à ce qui a été précédemment décrit, nous n'avons détecté aucun défaut de comportement maternel chez les femelles mutantes pour Pw1/Peg3. La lactation n'est pas non plus impactée par la délétion de Pw1/Peg3. Ces résultats démontrent que Pw1/Peg3 favorise intrinsèquement la croissance postnatale et que, désormais, ce gène d'empreinte ne peut plus être utilisé afin d'illustrer la théorie de coadaptation entre mère et enfant. / In mammals, a hundred of genes are preferentially expressed from one specific parental allele; a phenomenon referred as genomic imprinting. Establishing theories to explain the emergence of such a gene dosage strategy is challenging. Pw1/Peg3 is a paternally expressed gene. Using both a reporter mouse model and a novel constitutive knockout mouse model, we detected Pw1/Peg3 transcription from the maternal allele, which is normally silent, in the perinatal brain. Specifically, we observed that a putative Pw1/Peg3 bi-allelic expression is mainly restricted to the two future adult neural stem cells niches. In vitro experiments on primary neural stem cells allowed us to conclude that imprinting relaxation of the Pw1/Peg3 maternal allele is a rare event. Whether it affects the mouse phenotype is currently under investigation. In parallel, consistent with previously established mutant mouse models we confirmed that paternal Pw1/Peg3 deletion leads to growth retardation. However we did not find any impairment in maternal behaviors upon heterozygous or homozygous loss of Pw1/Peg3. Lactation was also not disrupted and mutant pups exhibited a normal suckling ability. Taken together, PW1/PEG3 promotes growth intrinsically and can no longer be used to illustrate the popular coadaptation theory between mother and infant.

La croissance fœtale et postnatale est un processus finement régulé par des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux complexes. Le système des IGFs (insulin-like growth factors) est l’un des acteurs principaux jouant un rôle crucial dans le développement fœtal et postnatal. Chez l’humain, plusieurs mutations des gènes IGF1 et IGF-1R ainsi qu’une mutation d’origine paternelle d’IGF2 ont été rapportées chez des patients ayant un retard de croissance intra-utérin (RCIU) qui peut persister et/ou s’aggraver en postnatal. Par ailleurs, les phénomènes épigénétiques comme la méthylation de l’ADN et le code histone jouent également un rôle prépondérant dans le développement fœtal et postnatal. L’empreinte parentale, mise en place grâce à des marques épigénétiques, est un des mécanismes important pour le développement fœtal. Chez l’humain, une anomalie de régulation de gènes soumis à empreinte parentale est associée à plusieurs syndromes de retard de croissance intra-utérin et postnatal ou à l’inverse de croissance excessive. Ce travail comporte deux parties: nous nous sommes dans un premier temps particulièrement intéressés à l’étude génétique et épigénétique de la région 11p15.5 et de son centre d’empreinte régulant le domaine IGF2/H19 dans une population de patients ayant une croissance excessive ou bien un RCIU (syndromes de Beckwith-Wiedemann et Silver-Russell respectivement), afin de mieux comprendre la régulation de ce domaine. Puis, la deuxième partie de notre étude a porté sur l’identification de nouvelles causes génétiques et épigénétiques de syndrome de Silver-Russell, altérant l’expression d’IGF2 mais n’étant pas directement secondaires à un défaut moléculaire de la région 11p15.5. / Fetal and postnatal growth is a process finely regulated by genetic, epigenetic and environmental complex. The IGFs system (insulin-like growth factors) is one of the main actors playing a crucial role in fetal and postnatal development. In humans, several mutations of IGF1 and IGF-1R genes and a paternal IGF2 mutation have been reported in patients with intrauterine growth restriction (IUGR), which can persist and/or worsen in postnatal life. Moreover, epigenetic phenomena such as DNA methylation and histone code also play a major role in fetal and postnatal development. Genomic imprinting, established due to epigenetic marks, is one of the major mechanisms for fetal development. In humans, abnormal regulation of genes subject to imprinting is associated with several syndromes of intrauterine and postnatal growth restriction or conversely excessive growth. This work has two parts: we initially particularly interested in the genetic and epigenetic study of the 11p15.5 region and its imprinting control region regulating the IGF2/H19 domain in a population of patients with overgrowth or IUGR (Beckwith-Wiedemann syndrome and Russell-Silver respectively), to better understand the regulation of this area. Then, the second part of our study focused on the identification of new genetic and epigenetic causes of Silver-Russell syndrome, altering the expression of IGF2, without being directly caused by a molecular defect of 11p15.5 region.

GNAS est un locus complexe soumis à l'empreinte parentale. Il code pour cinq transcrits alternatifs dont l’expression est régulée de manière parentale, tissulaire et développementale : la sous-Unité alpha stimulatrice de la protéine G hétérotrimérique (Gαs), XLαs, NESP55, et deux ARNnc, A/B et GNAS-AS1. Gαs est une protéine clé dans la transduction hormonale partageant avec XLαs la capacité de produire l'AMPc intracellulaire après stimulation des récepteurs couplés à Gαs.Dans la première partie de ma thèse, je me suis concentrée sur l'étude du rôle des transcrits de GNAS, en particulier XLαs, dans la croissance fœtale et post-Natale. J’ai profité du modèle unique des pseudohypoparathyroïdies (PHPs), pathologies humaines rare de l’empreinte, causées par des anomalies génétiques ou épigénétiques du locus GNAS altérant le dosage génique des transcrits de GNAS. La croissance anormale est une caractéristique majeure des PHPs.Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai étudié le profil épigénétique du locus GNAS (méthylation de l'ADN et expression des transcrits) dans les cellules souches humaines embryonnaires -HESCs-, dans les cellules pluripotentes induites dérivées à partir de fibroblastes de sujets sains -IPSCs- et dans les cellules redifférenciées en cellules souches neurales et mésenchymateuses. La caractérisation précise du locus humain GNAS en physiologie (cellules souches) et pathologie (PHP) est essentielle pour une meilleure compréhension des processus développementaux importants comme la croissance. L'exploration du phénotype "croissance" de différents types de PHPs a permis de mieux comprendre le rôle des transcrits du locus GNAS dans la physiologie et la physiopathologie. L'analyse de cellules des PHPs a permis de mieux caractériser l’impact des anomalies moléculaires du locus GNAS en pathologie humaine. Les hiPSCs peuvent être un outil utile pour étudier les modifications épigénétiques au niveau du locus GNAS. / GNAS is a complex locus subjected to parental imprinting encoding five parental-, tissue- and developmental-Manner regulated transcripts : the alpha stimulatory subunit of the G protein (Gαs), XLαs, NESP55, and two ncRNAs, A/B and the antisens GNAS-AS1. Gαs is a key protein in hormonal signaling sharing with XLαs the ability to produce intracellular cAMP upon stimulation of Gαs-Coupled receptors. In the first part of my thesis, I focused on studying the role of the GNAS transcripts, particularly XLαs, in fetal and postnatal growth. I took advantage of the unique model of pseudohypoparathyroidism (PHP), a rare human disease, caused by genetic or epigenetic abnormalities at the GNAS locus leading to various combinations of GNAS transcripts alterations. Abnormal growth appears to be a major feature of PHP. In the second part of my thesis, I studied the epigenetic pattern of GNAS (DNA methylation and transcripts expression) in human embryonic stem cells -HESCs-, in induced pluripotent stem cells -IPSCs- derived from fibroblasts from healthy individuals, and in cells re-Differentiated from these stem cells in neuronal and mesenchymal cells. The precise characterization of the human GNAS locus in physiology (stem cells) and pathology (PHP) is critical for a better understanding of major processes like growth. Through exploration of the "growth" phenotype of different groups of PHPs we have participated to the better understanding of the role of the GNAS transcripts in the physiology and pathophysiology. Human iPSCs may be an useful tool to study epigenetic modifications at the GNAS locus.