L’amaurose congénitale de Leber (ACL) est une maladie génétique touchant la rétine. Les premiers symptômes apparaissent dès les premiers mois de la vie et mènent en quelques années à la cécité. A ce jour, des mutations dans 18 gènes ont été associées à la maladie. Cette hétérogénéité génétique rend difficile l’étude des mécanismes conduisant aux différents symptômes. Les modèles animaux utilisés en laboratoire, notamment les rongeurs, permettent d’étudier certains de ces mécanismes mais présentent des limites liées à l’espèce. Les cellules souches pluripotentes induites (iPSCs), qui proviennent de la reprogrammation de cellules somatiques issues de patients, constituent un nouvel outil pour étudier une maladie génétique dans un contexte humain naturel. Elles permettent d’obtenir tous les phénotypes cellulaires désirés sans limite quantitative ce qui ouvre la porte à des approches d’analyse à large échelle telle que l’analyse transcriptomique qui vise à explorer de manière systématique la modulation des gènes dans une maladie. L’objectif de mon projet de recherche a été de développer un modèle cellulaire humain naturellement porteur de l’ACL. Après avoir produit les iPSCs à partir de fibroblastes de patients, mes travaux ont consisté à les différencier en populations cellulaires homogènes et facilement amplifiables, les cellules souches neurales et les cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces populations ont servi à mener des analyses transcriptomiques à large échelle qui ont permis d’identifier plusieurs gènes candidats, potentiellement impliqués dans le développement de la pathologie, parmi lesquels GSTT1 qui pourrait avoir un rôle dans le stress oxydatif. / Leber congenital amaurosis (LCA) is a genetic disease affecting the retina. The first symptoms appear in the first months of life and lead in few years to blindness. To date, mutations in 18 genes have been associated with the disease. This genetic heterogeneity makes it difficult to study mechanisms leading to different symptoms. Animal models, including rodents, are used to study some of these mechanisms but have limitations mostly related to the species. The induced pluripotent stem cells (iPSCs), which are reprogrammed somatic cells of patients, constitute a new tool for studying genetic diseases in a natural human context. They achieve all desired cell phenotypes without quantitative limits which opens the door to large-scale analysis approaches such as transcriptomic analysis that aims to systematically explore the modulation of genes in a disease. The aim of my research project was to develop a human cell model naturally carries the LCA. After producing the iPSCs from fibroblasts of patients, my work had consisted to differentiate them into homogeneous and easily amplifiable cell populations, neural stem cells and retinal pigment epithelial cells. These populations have served to conduct large-scale transcriptomic analyzes which have identified several candidate genes potentially involved in the development of the disease, including GSTT1 which might have a role in oxidative stress.

L’Ataxie de Friedreich (AF) est une pathologie à hérédité autosomique récessive caractérisée par des troubles neurologiques progressifs (atteinte des neurones cérébelleux et des neurones sensoriels primaires (PSN, Primary Sensory Neurons), une hypertrophie cardiaque et un risque élevé de diabète. La cause la plus fréquente de cette maladie est la présence d’une hyperexpansion homozygote de triplets nucléotidiques GAA au sein du premier intron du gène de la frataxine (FXN), qui code pour une petite protéine mitochondriale, la frataxine. Cette expansion GAA induit la formation de structures secondaires de l’ADN ainsi que la formation d’hétérochromatine, provoquant une diminution de la transcription du gène FXN. Plusieurs modèles cellulaires et animaux AF ont été développés sans toutefois reproduire l’ensemble des caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques de la maladie retrouvé chez le patient AF, à savoir la présence d’une hyperexpansion GAA, au sein du premier intron du gène FXN, accompagnée de la répression du gène FXN conduisant à la diminution de l’expression de la protéine frataxine. Dans la première partie du projet, nous avons généré deux modèles cellulaires, les cellules corticales et les neurones sensoriels primaires dérivés des cellules souches pluripotentes induites (iPSC), générées à partir de biopsies de peau de patients AF. Ces deux modèles cellulaires AF présentent les caractéristiques génétiques, épigénétiques et biochimiques décrites chez les patients AF. D’un point de vue biochimique, nous avons montré que le déficit en frataxine induit une perturbation de l’homéostasie du fer avec un déficit de la biosynthèse des centres [Fe-S] et de l’expression des protéines [Fe-S], qui jouent un rôle au sein de la chaine respiratoire mitochondriale et du cycle de Krebs. De plus, le déficit en frataxine entraine la perturbation des voies antioxydantes sensibilisant les cellules AF au stress oxydatif. Nous avons aussi montré que les cellules corticales AF présentent une sensibilité à l’apoptose pouvant être prévenu par un traitement par la forskoline. Enfin, nous avons étudié l’implication éventuelle de mTOR dans la pathogénèse de l’AF au sein des cellules corticales. Les résultats obtenus n’ont pas permis d’attribuer les désordres de l’homéostasie du fer et du métabolisme lipidique observés au sein des cellules corticales AF, au seul déséquilibre de mTORC1, mais sans doute à la déficience en frataxine elle-même. Ces données font de ces deux modèles cellulaires, dérivés des iPSC, des modèles fiables et robustes dans l’étude de l’AF. Dans la seconde partie du projet, nous avons étudié le potentiel effet thérapeutique d’analogues des incrétines ([D-Ala2]-GIP et exendin-4) et de deux générations d’inhibiteurs des HDAC (iHDAC 109 et iHDAC 69, 71 et 89) sur le niveau d’expression de la frataxine, l’homéostasie du fer, le métabolisme protéique et lipidique ainsi que le stress oxydatif, au sein des cellules corticales AF, des PSN AF et de deux modèles murins de l’AF (les souris Knock-In homozygotes (KIKI) et les souris BAC transgéniques). La nouvelle génération d’iHDAC (69, 71 et 89), se distingue du composé 109 par leur capacité supérieure à traverser la barrière hématoencéphalique et leur courte durée de vie prévenant ainsi l’accumulation du composé cardio-toxique au sein de l’organisme. Nous avons observé que l’ensemble des traitements testé dans ce projet, a eu pour effet d’augmenter l’expression de la frataxine et de restaurer l’homéostasie du fer au sein des cellules corticales AF. De la même façon, l’expression de la frataxine a été augmentée suite à l’administration du composé 109 au sein des PSN AF. De plus, nous avons mis en évidence un effet thérapeutique du composé 89 sur le stress oxydatif et le métabolisme lipidique et protéique, au sein des cellules corticales AF. Néanmoins, étant donné l’absence d’un phénotype biochimique de l’AF clair, au sein des deux modèles murins de l’AF utilisés dans cette étude, nous n’avons pas pu étendre l’efficacité des nouveaux iHDAC (69, 71 et 89) au sein de ces deux modèles murins de l’AF. Néanmoins, les résultats obtenus au sein des cellules corticales AF, sur l’induction de l’expression de la frataxine par des analogues des incrétines et par la nouvelle génération des iHDAC, font de ces molécules de nouvelles approches prometteuses dans l’intervention thérapeutique chez les patients AF. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les porphyries érythropoïétiques (PE) : Porphyrie Erythropoïétique Congénitale -PEC- et Protoporphyrie Erythropoïétique -PPE- sont caractérisées par le déficit d’une des enzymes de la voie de biosynthèse de l’hème. Le traitement curatif des formes sévères de PE est la transplantation de moelle osseuse allogénique (TMOA). La PPE est parfois compliquée d’une insuffisance hépatique majeure nécessitant une greffe hépatique. Dans un modèle murin de PPE (Fechm1Pas/Fechm1Pas), nous avons démontré l’apparition progressive de lésions hépatiques dès la 2ème semaine de vie. Une TMO précoce (nouveau-né) a permis de prévenir l’apparition de ces lésions hépatiques et de corriger la photosensibilité cutanée démontrant l’efficacité de cette approche thérapeutique pour les formes sévères de PPE. La thérapie génique par greffe de cellules souches hématopoïétiques autologues corrigées représente une alternative à la TMOA en l’absence de donneur HLA-compatible. Nous avons développé des cellules souches pluripotentes induites (iPS) à partir de cellules épidermiques issues de modèles murins de PE et d’un patient PEC. La correction génique a été obtenue par transfert du gène lentiviral (ferrochélatase ou uroporphyrinogène III synthase (UROS). La pluripotence des cellules iPS a été caractérisée in vitro par la formation de corps embryoïdes et in vivo par la formation de tératomes. In vitro, la correction métabolique a été obtenue après différenciation des cellules iPS humaines en progéniteurs hématopoïétiques. Enfin dans une dernière partie, nous nous sommes intéressés à une approche pharmacologique de la PEC. Nous avons montré que les mutations C73R et P248Q entraînaient une instabilité et une dégradation accélérée de l’UROS par la voie du protéasome. Le traitement de souris UrosP248Q par un inhibiteur du protéasome (Velcade®) a permis la correction de la photosensibilité cutanée. Ces travaux ouvrent de nouvelles perspectives pour le traitement des porphyries érythropoïétiques. / Erythropoietic porphyrias (EP) : Congenital Erythropoietic Porphyria -CEP- and Erythropoietic Protoporphyria -EPP-) are characterized by a deficit of one enzyme implicated in heme biosynthetic pathway. The curative therapy for severe cases of EP is an HLA-compatible Bone Marrow Transplantation (BMT). EPP is sometimes complicated by a major hepatic failure requiring hepatic graft. In a murine model of EPP (Fechm1Pas/Fechm1Pas), we have demonstrated that hepatic lesions progressively appear 2 weeks after birth. Early BMT (in neonates) has made it possible to prevent hepatic lesions and correct skin photosensitivity, demonstrating the efficiency of this therapeutic approach in severe cases of EPP. The gene therapy by graft of corrected autologous hematopoietic stem cells represents an alternative to BMT when HLA-compatible donors are lacking. We have developed induced pluripotent stem cells (iPSC) from epidermic cells of murine models of EP and of one PEC patient. The gene correction was obtained by lentiviral gene transfer (ferrochelatase and uroporphyrinogen III synthase -UROS). The pluripotency of iPSC was characterized in vitro by the formation of embryoid bodies and in vivo by the formation of teratomas. In vitro, the metabolic correction was obtained after differentiation of human IPSC into hematopoietic progenitors. In the last part of this thesis, we have focused on a pharmacological approach of CEP. We have shown that C73R and P248Q mutations lead to instability and accelerated degradation of the UROS protein via the proteasome. Treating UrosP248Q mice with a proteasome inhibitor (Velcade®) has allowed the correction of skin photosensitivity. These works offer new prospects for the treatment of erythropoietic porphyrias.

Les rétinites pigmentaires (RP) sont des pathologies rétiniennes cécitantes d'origine génétique caractérisées par une perte des photorécepteurs. Nous avons ciblé des formes de RP autosomique dominante consécutives à des mutations dans le gène du pigment visuel de la RHODOPSINE, du facteur d'épissage PRPF31 et du facteur de transcription impliqué dans le développement des photorécepteurs NR2E3. Les fibroblastes, issus de biopsies de peau de patients, ont été reprogrammés en cellules iPS par une technique dite non intégrative. Après stabilisation des cellules iPS, nous avons vérifié leur propriété de pluripotence et l'absence d'anomalies caryotypiques.Les cellules iPS porteuses d'une mutation sur le gène RHODOPSINE ont été différenciées dans le lignage des photorécepteurs. Nos résultats montrent que les photorécepteurs porteurs de la mutation P347L du le gène RHODOPSINE récapitulent la dégénérescence observée chez les patients.Nous montrons que les cellules de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) dérivées de cellules iPS porteuses de la mutation Cys294X du gène PRPF31 présentent des problèmes d'adhésion cellulaire due à l'absence de lame basale. Leur activité de phagocytose est alors perturbée, suggérant qu'un dysfonctionnement de l'EPR pourrait être à la base de la RP causée par la mutation Cys294X du gène PRPF31. Les modèles développés nous ont permis de mieux comprendre les processus à la base de la pathogénèse de certaines RP. Ces modèles associés à des protocoles de criblage, pourraient permettre d'évaluer l'efficacité et la toxicité de nouvelles molécules pharmacologiques, mais également être utilisés pour valider des approches de thérapie génique. / Retinitis pigmentosa (RP) is an inherited retinal diseases characterized by a loss of photoreceptors. We focused specific forms of autosomal dominant RP with mutations in the rod visual pigment RHODOPSIN, the ubiquitous splicing factor PRPF31 and the transcription factor involved in the development of photoreceptors NR2E3. Fibroblasts from skin biopsies of patients were reprogrammed into iPS cells by a non-integrative approach. After stabilization of iPS cell lines, we verified their pluripotency property and the absence of karyotype abnormalities. Based on the retinal differentiation protocol, iPS cells carrying a mutation in the RHODOPSIN gene have been differentiated in the photoreceptor lineage. Our results showed that the photoreceptors expressing the mutated form of RHODOPSIN summarizing the process of degeneration observed in RP patients. We show that retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from iPS cells carrying a mutation in the PRPF31 gene lack basal membranes and have cell adhesion disorders. Consequently, their phagocytic activity is disturbed, suggesting that a malfunction of the RPE could be the primary step of the development of RP caused by mutation Cys294X in the PRPF31 gene. The models developed from specific-patient iPS cells have enabled us to better understand the processes underlying the pathogenesis of some RP. These models associated with screening protocols could be used to evaluate the efficacy and toxicity of new pharmacologic compounds but also used to validate new gene therapy approaches.

L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées situés entre la rétine neurale et la membrane de Bruch et joue un rôle important dans le maintien et la survie des photorécepteurs. Des malformations, le dysfonctionnement ou bien la mort de l'EPR provoque la mort des photorécepteurs. Orthodenticle homéoboîte 2 (Otx2) est un facteur de transcription exprimé par l’EPR chez l’animal adulte joue un rôle important dans l’EPR puisque son inactivation chez les souris [CreERT2 : Otx2flox] provoque la dégénérescence des photorécepteurs. En outre, les patients présentant des mutations dans le gène OTX2 souffrent de microphtalmie ou d'anophtalmie et développent généralement des maladies oculaires comme la rétinopathie pigmentaire (RP) ou l’amaurose congénitale de Leber. La délivrance par un vecteur AAV d’OTX2 dans des cellules primaires de l’EPR de porc mais aussi de cellules pluripotentes humaines différenciés en EPR nous a permis d’identifier de nouveaux gènes régulés par OTX2 et un variant d’épissage connu OTX2L. Nous avons par ailleurs identifié un nouveau variant d’épissage OTX2S par analyse bioinformatique de banques d'ADNc normalisées de RPE de rat. OTX2S présente une délétion d’une partie de l’homéodomaine. Nous avons étudié l'expression de ce variant dans la rétine et étudié ses propriétés transcriptionnelles en utilisant le promoteur du gène de la tyrosinase couplé à un gène rapporteur dans les cellules HEK293 et les cellules de l’EPR primaires de porcs. OTX2S exerce un effet transdominant négatif uniquement dans les cellules de l’EPR. Son rôle physiologique doit encore être précisé car il semble participer à la transition épithélio-mésenchymateuses qui survient après décollement de la rétine, une pathologie rétinienne fréquente. L’analyse par immunoprécipitation de la chromatine sur des cellules de l'EPR de porc montre que la plupart de ces gènes sont des cibles directes d’OTX2.Notre laboratoire a identifié un facteur neuroprotecteur sécrétée par photorécepteurs à bâtonnets, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) qui est une stratégie prometteuse pour le traitement de RP lorsque les patients portent des mutations dans les gènes exprimés sélectivement photorécepteurs à bâtonnets, ce qui est le plus fréquemment rencontré. Cette stratégie thérapeutique ne s’appliquera pas aux RP causés par les mutations de gènes spécifiquement exprimés par l’EPR, comme le gène MERTK. Afin d'étudier le bénéfice potentiel du gène Otx2, nous avons utilisé un rongeur modèle de RP avec une mutation dans le gène Mertk, les rats RCS. Nous montrons que la transplantation d'EPR génétiquement modifié pour sur-exprimer Otx2, améliore la protection des photorécepteurs et la vision de l’animal. Une augmentation de la réponse électrophysiologique (ERG) des photorécepteurs (ERG) et la protection de la couche nucléaire externe représentant les photorécepteurs a pu être mise en évidence, cette dernière par tomographie par cohérence optique (OCT). Nos résultats indiquent que cette approche pourrait être applicable pour le traitement des maladies de la rétine avec le dysfonctionnement de l'EPR comme la RP ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge. / Retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of pigmented epithelial cells located between the neural retina and Bruch’s membrane and has an important function in the maintenance and survival of photoreceptor cells. Abnormalities, dysfunction and/or death of the RPE ultimately lead to death of retinal photoreceptors. Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) is expressed in adult RPE and known to have an important role in RPE function since loss of function in Otx2flox/CreERT2 mice, leads to rapid photoreceptor degeneration. Furthermore, patients having mutations in this gene suffer from microphthalmia or anophthalmia and usually develop eye diseases as retinitis pigmentosa (RP) and Leber congenital amaurosis.Using ectopic expression involving AAV-mediated gene transfer in primary pig RPE cells and human induced pluripotent RPE derived cells, we have identified novel gene targets of Otx2 and Otx2L. The physiological role of Otx2S still needs to be addressed since it potentially participates in the epithelial to mesenchymal transition that occurs after retinal detachment, a frequent retinal pathology. Chromatin immunoprecipitation analysis using pig RPE cells shows that most of these genes are direct targets of OTX2.Our lab has previously identified a neuroprotective factor secreted by rod photoreceptors, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) which is a promising strategy for treatment of RP for patients with mutations in photoreceptor cells. This therapeutic strategy will not cover RP caused in genes specifically expressed by RPE, as for example MERTK gene.In order to study the potential benefit of Otx2 for gene-cell therapy, we used an animal model of RP with a mutation in the rdy (Mertk) gene, the RCS rats. Transplantation of genetically engineered RPE cells expressing Otx2, enhances the protection of photoreceptors and vision in this model. We demonstrate an improvement in electroretinograph (ERG) recordings and thickness of outer nuclear layer as measured in optical coherence tomography (OCT). Our findings indicate that this approach might be applicable treatment for retinal diseases with RPE dysfunction like RP and/or age related macular degeneration. Furthermore, using bioinformatic tools and gene screening of normalized cDNA libraries from rat RPE we identified Otx2S, a novel-splicing variant of Otx2 that lacks a part of a homeodomain. Otx2L, another splice variant of Otx2 with an insertion was also studied. We have shown the expression of this variant in NR and RPE and studied its transcriptional properties using gene reporter assay in HEK293 cells and pig primary RPE cells. In addition, we have found that Otx2S exerts a transdominant negative effect on tyrosinase promoter only in primary RPE cells.

Première cause de baisse d'acuité visuelle dans les pays industrialisés, la dégénérescence maculaire liée l'âge (DMLA) est une pathologie de la rétine touchant principalement les personnes après 55 ans. Elle est caractérisée par une dégénérescence de la zone maculaire de la rétine et par la formation de drusens. Il existe deux formes de la maladie : la forme exsudative et la forme atrophique. Dans notre étude, nous nous sommes focalisés sur la DMLA atrophique, actuellement sans traitement curatif et qui correspond à environ 50% des cas cliniques en Europe. Malgré de nombreuses recherches, les causes de la DMLA restent encore mal comprises même si des facteurs environnementaux (sénescence, accumulation de lipofuscine, stress oxydatif) et génétiques sont probablement combinés. Selon l'hypothèse étiopathogénique, le dysfonctionnement des cellules de l'épithélium pigmenté de la rétine (EPR) est au centre des événements physiopathologiques de la DMLA. A partir de sujets sains et de patients atteints de la DMLA atrophique, nous avons obtenu des cellules de l'EPR dérivées de cellules souches pluripotentes induites et développé un modèle cellulaire humain utile pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques de la DMLA. Ainsi, l'étude morphologique et fonctionnelle de ces deux populations de cellules a souligné un phénotype particulier des cellules de l'EPR provenant de patients atteints pas la DMLA en condition basale et en milieu pro-oxydant. Ce modèle cellulaire pourra nous permettre d'approfondir nos connaissances sur les mécanismes amenant au développement de la DMLA et pourra aussi être utilisé pour le screening des molécules au cours des étapes précliniques. / First cause of irreversible visual dysfunction in industrialized countries, age-related macular degeneration (AMD) is a retinal disease affecting people after 55 years old. AMD is characterized by the macular degeneration of retina and by formation of drusen. There exist two forms of the disease: the exudative and the atrophic forms. In our study, we focused only on the atrophic one, corresponding to approximately 50% of the clinical cases in Europe, that still today without curative therapy. Despite many researches, AMD's etiology remains unclear even if environmental and genetics factors would be involved. According to the etiopatogenic hypothesis, RPE cells dysfunction has a central role in the physiopathological events leading to AMD. From healthy subjects and patients affected by atrophic AMD, we obtained RPE cells derived from induced pluripotent stem cells and developed a useful human cellular model for the understanding of AMD mechanisms. Indeed, the morphological and functional study of the two types of cells populations underlined a particular phenotype for the RPE cells derived from AMD patients. This cellular model will allow us to have a better understanding of mechanisms leading to AMD and will also be used to screen therapeutic molecules before clinical studies.

La génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) est très prometteuse en médecine régénérative, pour la modélisation physiopathologique et le criblage de nouveaux médicaments. A l’origine, des cellules somatiques ont été reprogrammées en iPSC par l'expression forcée de facteurs de transcription (FT) impliqués dans les cellules souches embryonnaires. Depuis, de nombreuses lignées d’iPSC ont été générées mais les vecteurs actuels les plus représentés et efficaces pour exprimer les FT sont les virus intégratifs. Ils comportent du matériel génétique. Des stratégies alternatives ont été développées dans un contexte de sécurisation et de transfert clinique mais sont ont encore besoin d’être acceptées par les comités d’éthique. La méthode la plus sûre et rationnelle serait alors d’apporter ces FT directement sous forme protéique mais le défi est de traverser les membranes. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé un peptide de pénétration cellulaire (CPP) basé sur le FT ZEBRA du virus d’Epstein-Barr. La séquence impliquée dans la prise en charge cellulaire a été caractérisée au laboratoire et se nomme MD (Minimal Domain). Elle est capable de vectoriser des protéines et des biomolécules de haut poids moléculaire via un mécanisme indépendant de l'endocytose, permettant leur internalisation sous une forme biologiquement active. Dans ce projet, nous avons produit et purifié les protéines Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4 et c-Myc chacune fusionnée au CPP MD. Ce domaine n'interfère pas avec la capacité d'Oct4 à lier sa séquence cible d’ADN. Le traitement in vitro de cellules primaires conduit à l’internalisation des protéines MD en 30 minutes à 1 heure. MD-Oct4 et MD-Nanog peuvent être localisés au noyau en 3 heures. Dans un contexte de reprogrammation, la combinaison de MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog et MD-Lin28 lors de traitements répétés conduit à l'activation transcriptionnelle de gènes cibles composant le réseau de pluripotence. / The generation of induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) holds great promise for regenerative medicine, disease modelling and drug screening. Leading the original cell to an iPSC has been originally made by the forced expression of Transcription Factors (TF) involved in embryonic stem cells. Since the discovery of those mechanisms, many teams have engineered iPSC by well-defined cell culture tools such as the use of retroviruses in order to express TF. Those techniques use genetic material. Delivery techniques have evolved but most of reprogramming experiments still need TF. Development of alternative strategies has been conducted in a context of clinical application but still needs to be accepted by ethics comities. Thus, the use of recombinant proteins instead of genetic material is safe and rational but the challenge is to access the intracellular medium. In this context, our laboratory has developed a cell-penetrating peptide (CPP) based on the Epstein-Barr virus ZEBRA TF. The sequence implicated in cellular uptake has been characterized and is named MD (Minimal Domain). It is able to translocate high molecular weight proteins in an endocytosis-independent mechanism, allowing the internalization of cargos in fully biologically active form. Here we develop 6 MD fusions at the N-terminus of the following TF: Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog & Lin28. This domain does not interfere with Oct4 capacity to associate with its own DNA sequence. Moreover, MD fused proteins transduce in vitro treated cells in 30 minutes to 1 hour ; MD-Oct4 & MD-Nanog can be localized in the nucleus after 3 hours only. In a context of reprogramming experiences, the combination of MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog and MD-Lin28 in repeated treatment leads to the activation of target genes transcription such as those constituting the pluripotency network.

La Granulomatose Septique Chronique (CGD) est une maladie génétique rare de l’immunodéficience innée affectant les cellules phagocytaires (neutrophiles, macrophages). Elle est causée par des mutations dans les sous-unités du complexe NADPH oxydase formé du cytochrome b558 membranaire (NOX2 associé à p22phox) et de facteurs cytosoliques (p47phox, p67phox et p40phox). La déficience de ce complexe enzymatique va conduire à l’absence de formation de formes réactives de l’oxygène (FRO) microbicides et donc à l’apparition d’infections graves et récurrentes très tôt dans l’enfance. La chimioprophylaxie à vie permet de protéger ces patients mais peut être responsable d’effets indésirables. La seule thérapie curative est la transplantation de moelle osseuse mais tous les patients ne peuvent en bénéficier, et la thérapie génique n’est pas encore envisageable. Il y a donc un manque réel de nouvelles thérapies pour cette maladie. Cependant pour développer de nouveaux traitements, il faut disposer de modèles physiopathologiques pertinents. Or, les modèles existants sont imparfaits ou manquants. Le but de notre travail est donc de produire des modèles cellulaires et animaux de la CGD pour développer dans un second temps, une nouvelle approche thérapeutique basée sur l’utilisation de protéoliposomes.Grâce à leurs propriétés de pluripotence et d’auto-renouvellement à l’infini, les cellules souches pluripotentes induites (iPS) sont un outil puissant pour la modélisation physiopathologique. Ainsi, à partir de fibroblastes de patients atteints de CGD reprogrammés en cellules iPS, nous avons mis au point un protocole efficace de différenciation hématopoïétique in vitro en neutrophiles et macrophages. Nous avons montré que ces cellules phagocytaires sont matures et reproduisent parfaitement le phénotype déficient en FRO des patients CGD. Nous avons donc obtenu des modèles cellulaires pertinent modélisant trois formes génétiques de CGD, la CGD liée à l’X et deux formes autosomiques récessives, CGDAR22 et CGDAR47.Nous avons ensuite réalisé la preuve du concept de l’efficacité de protéoliposomes thérapeutiques sur les macrophages modélisés de la forme CGDX, la forme génétique la plus fréquente (70 % des cas) due à l’absence du cytochrome b558 membranaire (NOX2/p22phox). Grâce à une collaboration avec la start-up Synthelis SAS, des liposomes contenant le cytochrome b558 au niveau de la membrane lipidique ont été produits dans un système d’expression acellulaire basé sur l’utilisation d’extraits d’Escherichia coli. Ces liposomes NOX2/p22phox sont capables de reconstituer une enzyme NADPH oxydase fonctionnelle in vitro et de délivrer le cytochrome b558 à la membrane plasmique des macrophages CGDX qui présentent alors une restauration de l’activité NADPH oxydase avec la production de FRO.Enfin, nous nous sommes proposés de générer des souris dites « humanisées » par transplantation de cellules souches hématopoïétiques CD34+ capables de prise de greffe et de reconstitution hématopoïétique dans des souris immunodéficientes. A partir de cellules iPS saines, nous avons réussi à produire des cellules hématopoïétiques CD34+ possédant un potentiel hématopoïétique in vitro. Cependant, malgré des résultats encourageants, aucune prise de greffe in vivo n’a pu être réellement confirmée à ce jour.Pour conclure, nous avons donc montré au cours de ce projet, la production de modèles cellulaires de trois formes génétiques de CGD à partir de cellules iPS. Puis le modèle de macrophages CGDX nous a permis de faire la preuve de l’efficacité d’une nouvelle thérapie in vitro, une « enzymothérapie substitutive liposomale », qui pourrait à terme, offrir une alternative thérapeutique pour le traitement des infections aigües pulmonaires des patients CGD réfractaires aux traitements antibiotiques et antifongiques conventionnels. / Chronic Granulomatous Disease (CGD) is a rare inherited pathology of the innate immune system that affects the phagocytic cells (neutrophils, macrophages). This disease is caused by mutations in the subunits of the NADPH oxidase complex composed of the membrane cytochrome b558 (NOX2 associated with p22phox) and the cytosolic components (p47phox, p67phox et p40phox). Dysfunction in this enzymatic complex leads to the absence of microbicidal reactive oxygen species (ROS) and therefore to the development of recurrent and life-threatening infections in early childhood. Life-long prophylaxis is used to protect these patients but it may be responsible for side effects. Bone marrow transplantation is the only curative treatment but it can not be proposed to all the patients. In addition, gene therapy is not possible up to now. So there is a real lack of new therapies for this disease. However, to develop new therapeutic approaches, relevant physiopathological models must be available. Actually, existing models are imperfect or missing. Thus, the goal of our work is to produce cellular and animal models of CGD to develop a new proteoliposome-based therapy.Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are a powerful tool for physiopathologic modeling due to their pluripotency and self-renewal properties. Using CGD patient-specific iPSCs regrogrammed from fibroblasts, we developped an efficient protocol for in vitro hematopoietic differentiation into neutrophils and macrophages. We showed that the phagocytic cells produced are mature and reproduce the ROS-deficient phenotype found in CGD patients. Thus, we obtained relevant cellular models for three genetic forms of CGD: X-linked CGD and the two autosomal recessive forms AR22CGD and AR47CGD.Then, we demonstrated the proof-of-concept of the efficacy of therapeutic proteoliposomes on X-CGD iPS-derived macrophages. Indeed, X-CGD is the main form of the disease (70% of cases) and is caused by the absence of the membrane cytochrome b558 (NOX2/p22phox). Thanks to a collaboration with the start-up Synthelis SAS, liposomes integrating the cytochrome b558 into lipid bilayers were produced in an E. coli-based cell-free protein expression system. These NOX2/p22phox liposomes were able to reconstitute a functional NADPH oxidase enzyme in vitro and to deliver the cytochrome b558 at the plasma membrane of X-CGD macrophages, leading to restore the NADPH oxidase activity with a ROS production.Finally, we proposed to generate « humanized » mice models with a human immune system after transplantation of CD34+ hematopoietic stem cells able to engraft and reconstitute long-term hematopoiesis in immunodeficient mice. Using healthy iPSCs, we successfuly produced CD34+ hematopoietic cells with in vitro hematopoietic potential. However, no in vivo engraftment was really confirmed yet.In conclusion, during this project, we produced cellular models of three genetic forms of CGD using patient-specific iPSCs. Then, X-CGD macrophages were used to demonstrate in vitro the efficacy of a new therapy. This « liposomal replacement enzymotherapy » could, in the future, represents a curative alternative against life-threatening lung infections refractory to conventional antibiotic and antifungal therapy.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable de l’adulte qui affecte principalement les motoneurones. Les mécanismes conduisant à la mort des motoneurones restent mal connus, notamment du fait de l'hétérogénéité de la maladie et du manque d'accès aux neurones humains affectés. La technologie des cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSc) est un outil prometteur pour la modélisation de la SLA, car elle offre la possibilité unique d'obtenir et d’étudier des motoneurones humains.Des clones d’iPSc de deux sujets témoins ont été générés et nous avons comparé plusieurs protocoles afin de mettre au point un protocole efficace de différenciation des iPSc en motoneurones. Les cultures obtenues étaient hétérogènes et contenaient différents types de neurones et des précurseurs neuraux. Afin de pouvoir étudier des mécanismes intrinsèques aux motoneurones dans la SLA, nous avons développé une nouvelle technique pour purifier les motoneurones. Cette technique a consisté à trier les motoneurones par FACS en combinant l'utilisation d'un vecteur lentiviral rapporteur exprimant une protéine fluorescente sous le contrôle d'un promoteur spécifique des motoneurones, et d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur aux neurotrophines p75. Cette double sélection a permis l'isolement efficace de motoneurones purs. En parallèle, la technologie iPSc a été utilisée pour établir des modèles cellulaires de la SLA. Des clones de cellules iPS ont été générés à partir d’un patient avec une forme familiale de la SLA présentant une mutation dans le gène TARDBP (codant pour une protéine de liaison à l’ADN, TDP-43) et un patient atteint d’une forme sporadique de SLA. Afin de valider nos modèles, nous avons recherché des phénotypes caractéristiques de la maladie au cours de la différenciation des iPSc : i) la formation d’agrégats cytoplasmiques, ii) des altérations de génération et de survie des motoneurones, iii) des défauts de croissance neuritique. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal adult-onset neurodegenerative disorder primarily affecting motor neurons. Mechanisms leading to motor neuron death in ALS are poorly understood mostly because of disease heterogeneity and lack of access to affected cells. The induced pluripotent stem cell (iPSc) technology provides the opportunity to obtain and study human motor neurons and is therefore a promising tool for ALS modeling.IPSc clones from control subjects were generated, and we compared several protocols in order to set up an efficient protocol for iPSc differentiation into motor neurons. The obtained cultures were heterogenous, comprising different neuron subtypes and neural precursors. To allow investigation of intrinsic disease mechanisms in ALS motor neurons, we developed a new technique to purify motor neurons by FACS sorting. By combining the use of a lentiviral vector expressing a fluorescent protein under control of a motoneuron-specific promoter and of a monoclonal antibody directed against the p75 neurotrophin receptor, isolation of exquisitely pure motor neurons was achieved. In parallel, iPSc technology was used to establish cellular models of ALS. IPSc were generated from one patient with familial ALS carrying a mutation in the TARDBP gene (encoding a DNA-binding protein, TDP-43) and one patient with sporadic ALS. To validate our models, we investigated characteristic disease phenotypes during iPSc differentiation, including i) cytoplasmic aggregate formation, ii) motor neuron generation and survival defects, iii) neurite growth alterations.

Les dystrophies rétiniennes héréditaires (DRH) sont des maladies qui conduisent à une perte de la vision au cours de leur évolution. Les premiers essais cliniques utilisant la thérapie génique pour traiter ces maladies ont été réalisés et apportent des résultats encourageants. En amont de telles études, les essais précliniques s'effectuent le plus souvent sur modèle animal. Cependant, pour un certain nombre de DRH, il n'existe pas de modèle animal approprié ce qui compromet l'arrivée d'un traitement à un stade clinique. C'est le cas de la Choroïdérémie, qui représente 2% des DRH. La choroïdérémie est caractérisée par une perte de la vision nocturne dès la petite enfance et conduit à la cécité autour des 40-50 ans. Son diagnostic précoce et son évolution lente résultent en une grande fenêtre thérapeutique qui fait de la choroïdérémie une bonne candidate pour la thérapie génique. Sur le plan génétique, la maladie est causée par une mutation dans le gène CHM qui est localisé sur le chromosome X et code pour la Rab Escort Protein 1 (REP1). Cette protéine est impliquée dans le processus de prénylation de petites protéines GTPases, les protéines Rab. Afin de pallier au manque de modèle animal, nous avons généré au cours de ce travail de thèse, un modèle cellulaire humain de la choroïdérémie pour évaluer l'efficacité d'un protocole de thérapie génique sur le tissu réellement atteint in vivo. Pour cela, nous avons reprogrammé des fibroblastes de patient CHM-/y en cellules souches pluripotentes induites (iPS), que nous avons ensuite différenciées en Epithélium Pigmentaire Rétinien (EPR). Nous avons caractérisé cet EPR, montrant que c'est une couche monocellulaire polarisée possédant une morphologie et une expression de marqueurs caractéristiques. De plus, ce tissu est fonctionnel, sur le plan du transport de fluide et de la phagocytose, et possède le même phénotype biochimique que celui observé chez les patients. Dans un but de thérapie génique et afin d'évaluer le vecteur viral le plus efficace sur nos cellules, j'ai testé un panel de 5 sérotypes d'AAV et démontré que l'AAV2/5 est le plus efficient pour transduire un EPR dérivé de cellules iPS humaines. J'ai ensuite utilisé un AAV2/5-CAG-CHM afin d'évaluer l'efficacité fonctionnelle du vecteur et j'ai pu montrer qu'outre une expression correcte du transgène, le traitement de cellules de patients déficientes pour REP1 avec ce vecteur permet de restaurer une activité normale de prénylation. Nous avons donc démontré la supériorité d'efficacité de transduction de l'AAV2/5 dans des cellules d'EPR humain et soulignons le potentiel d'un modèle d'EPR pathologique dérivé de cellules iPS pour apporter une preuve de concept de thérapie génique en absence d'un modèle animal approprié. / Inherited retinal dystrophies (IRDs) lead to a progressive vision loss. The first clinical trials using gene transfer to treat such diseases have been performed with positive results. Prior to clinical trials, preclinical studies are usually performed on animal models. However, for many IRDs, appropriate animal models do not exist, which compromises their progress towards a clinical trial. An example of an IRD that lacks an appropriate model is choroideremia, which represents 2% of IRD patients. It is characterized by night blindness in childhood, followed by progressive loss of the visual field resulting in blindness by 40–50 years of age. Its early diagnosis and slow evolution result in a large therapeutic window making choroideremia a good candidate for gene therapy. Genetically, the disease is caused by a mutation in the CHM gene located on the X chromosome and encoding the Rab Escort Protein 1 (REP1). This protein is involved in the prenylation of small GTPases, the Rab proteins. To palliate the lack of an animal model, we generated a human cellular model of choroideremia in order to evaluate the efficacy of a gene therapy approach in the tissue that is affected in vivo.Towards this aim, we reprogrammed REP1-deficient fibroblasts from a CHM-/y patient into induced pluripotent stem cells (iPScs), which we differentiated into retinal pigment epithelium (RPE). We characterized the iPSc-derived RPE that is a polarized monolayer with a classic morphology, expresses characteristic markers, is functional for fluid transport and phagocytosis, and mimics the biochemical phenotype of patients. In terms of gene therapy and to evaluate the most efficient viral vector, I assayed a panel of 5 adeno-associated virus (AAV) vector serotypes and showed that AAV2/5 is the most efficient at transduce the iPSc-derived RPE. I then transduced the iPSc-derived RPE of a choroideremia patient with an AAV2/5-CAG-CHM and demonstrated that this vector is able to restore a normal prenylation function to the cells.To conclude, I demonstrated the superiority of the transduction efficiency of AAV2/5 in the iPSc-derived RPE and highlight the potential of a diseased RPE model derived from iPS cells to provide a proof of concept of gene therapy in the absence of a suitable animal model.