Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie mortelle caractérisée par une dégénérescence des neurones moteurs supérieurs et inférieurs. La présence d’inclusions ubiquitinylées de la protéine TDP-43 (Transactive response DNA-binding protein 43) est une caractéristique de la SLA. Afin de comprendre le mécanisme pathogène impliquant cette protéine, nous avons généré et étudié des souris transgéniques en utilisant des fragments génomiques codant pour la TDP-43 humain, de type sauvage ou mutant, associés aux cas familiaux de la SLA. Ces souris développent de nombreux changements liés au processus pathologique et biochimique de la SLA chez l’homme : présence d’inclusions de la protéine TDP-43 ubiquitinylées, anomalies au niveau des filaments intermédiaires, axonopathie et neuroinflammation. Pour mieux comprendre le rôle de la protéine TDP-43 dans la régénération des axones, nous avons utilisé des souris pré-symptomatiques et effectué une lésion du nerf sciatique sur celles-ci. Suite à cette intervention, les souris transgéniques ont eu une paralysie marquée du membre lésé, ont démontré une redistribution altéré de TDP-43 et une regénération plus lente des axones distaux par rapport aux souris non transgéniques. De plus, nous avons constaté que la protéine TDP-43 interagit et colocalise avec la sous-unité p65 du facteur nucléaire κΒ (NF-κΒ). Cette interaction se produit dans les cellules gliales et les neurones des souris transgéniques TDP-43 et aussi chez les patients atteints de la SLA. Nous avons démontré que les niveaux d’ARNm des protéines TDP-43 et NF-κΒ p65, sont plus élevés dans la moelle épinière des patients atteints de SLA que chez les individus sains et que la protéine TDP-43 agit comme un coactivateur de p65. Finalement, le traitement des souris transgéniques TDP-43 avec la Withaférine A, un inhibiteur de l’activité NF-κΒ, réduit le niveau de dénervation des jonctions neuromusculaires et des symptômes liés à la SLA. Nous suggérons donc que le dérèglement de la protéine TDP-43 contribue à la pathogenèse de la SLA en partie par l'augmentation de l'activation de NF-κΒ, et que NF-κΒ pourrait constituer une cible thérapeutique pour la maladie. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a lethal disease characterized by degeneration of lower and upper motor neurons. Transactive response DNA-binding protein 43 (TDP-43) ubiquitinated inclusions are a hallmark of ALS. In order to understand the pathogenic mechanism caused by TDP-43, we generated transgenic mice with genomic fragments encoding human TDP-43 wild-type or FALS-linked mutants TDP-43G348C and TDP-43A315T. These novel TDP-43 transgenic mice develop many age-related pathological and biochemical changes reminiscent of human ALS including ubiquitinated TDP-43 positive inclusions, intermediate filament abnormalities, axonopathy and neuroinflammation. In order to understand the role of TDP-43 in axon regeneration, we used pre-symptomatic 3-months old mice and performed sciatic nerve crush on them. After axonal crush, TDP-43 transgenic mice were noticeably paralyzed at the injured limb, have altered TDP-43 redistribution and the distal axons regenerated slowly as compared to non-transgenic mice. Moreover, we found that TDP-43 interacts with and colocalizes with p65, a NF-κΒ subunit, in glial and neuronal cells from TDP-43 transgenic mice and also from ALS patients. We report that TDP-43 and NF-κΒ p65 mRNA and protein expression is higher in spinal cords of ALS patients than healthy individuals. TDP-43 acted as a co-activator of p65, and glial cells expressing higher amounts of TDP-43 produced more proinflammatory cytokines and neurotoxic mediators after stimulation with lipopolysaccharide or reactive oxygen species. TDP-43 overexpression in neurons also increased their vulnerability to toxic mediators. Treatment of TDP-43 mice with Withaferin A, an inhibitor of NF-κΒ activity, reduced denervation in the neuromuscular junction and ALS disease symptoms. We propose that TDP-43 deregulation contributes to ALS pathogenesis in part by enhancing NF-κΒ activation, and that NF-κΒ may constitute a therapeutic target for the disease.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative qui cause la mort des neurones moteurs, induisant une paralysie progressive et menant à la mort quelques années après l'apparition des premiers symptômes. Comme dans toutes les maladies neurodégénératives, l'inflammation est une composante principale de la pathogénèse de la SLA. Une des cellules effectrices de cette inflammation, la cellule microgliale est le sujet central de cette thèse. Avec l'apparition des symptômes, la microglie passe d'un phénotype anti-inflammatoire et neuroprotecteur à un phénotype aberrant et neurotoxique. Il est nécessaire d'élucider les mécanismes cellulaires responsable du changement de phénotype et l'identification des facteurs maintenant ces phénotypes pour permettre le développement de thérapies efficaces ciblant l'inflammation. Ainsi dans cette thèse, nous tâchons d'identifier, en utilisant divers outils moléculaires et modèles animaux, la signature microgliale à différents stades de la SLA. Durant le stade présymptomatique, nous identifions, par l'étude du sécrétome microglial, la cytokine immunosuppressive interleukine-10 comme responsable du maintien du phénotype anti-inflammatoire. Cette cytokine est à la fois produite par les cellules microgliales et reconnue par celles-ci, grâce au récepteur IL-10R. Le blocage d'IL-10R a pour conséquence d'accélérer la progression de la maladie et de diminuer la survie dans un modèle murin. Aussi, l'augmentation de l'expression de cette cytokine à l'aide d'un vecteur viral mène à une diminution de la vitesse de la progression de la maladie et allonge la durée de vie chez ce même modèle murin. Dans le but de comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans le changement phénotypique de la microglie avec l'apparition des symptômes de la SLA, nous utilisons un système-modèle pour le profilage moléculaire spécifique à la microglie. Cet outil, EDTA TRAP, consiste en l'immunopurification des ribosomes microgliaux et l'identification subséquente des ARNm et des protéines séquestrés sur ces ribosomes. Il a été possible d'identifier une forte disparité dans la nature des ARNm et des protéines les plus régulés. Le profil transcriptomique de la microglie symptomatique dénote une fonction phagocytaire et possiblement neuroprotectrice pour la microglie alors que son profil protéomique est proliférateur et potentiellement neurotoxique. La disparité de ces deux profils s'explique par la répression de la traduction d'ARNm issus de gènes immunitaires par un mécanisme impliquant l'interaction de leur 3'UTR et de la protéine liant l'ARN SRSF3. La forme phosphorylée de cette protéine s'accumule spécifiquement du cytoplasme des cellules microgliales proportionnellement avec la progression de la maladie. La diminution de l'expression de SRSF3 à l'aide d'un oligonucléotide interférent rétablit la traduction des ARNm immunitaires et la fonction phagocytaire de la microglie associée à ces ARNm. Cela mène à une progression plus lente de la maladie et une plus longue survie dans un modèle murin. Ainsi, l'utilisation d'un oligonucléotide interférant contre SRSF3 pourrait être une nouvelle avenue thérapeutique dans le traitement de la SLA. La compréhension des divers mécanismes cellulaires impliquant la protéine SRSF3 est importante pour comprendre son dynamisme dans la SLA. SRSF3 est la plus petite protéine de la famille SR. Cette famille se distingue par leur structure soit un ou deux motifs de reconnaissance de l'ARN en N-terminus et un domaine riche en arginine et en sérine hautement phosphorylable en C-terminus. SRSF3 peut être phosphorylé dans le noyau par la kinase CLK1 ou dans le noyau et dans le cytoplasme par les kinases SRPK. SRSF3 est impliqué dans l'épissage, le transport nucléo-cytoplasmique et la traduction, entre autres. La dérégulation du niveau d'expression ou de la phosphorylation de SRSF3 peut drastiquement changer son rôle dans la cellule. Ainsi, SRSF3 est impliqué dans diverses maladies comme le cancer, les infections virales ou la SLA. Les mécanismes cellulaires régissant le dynamisme de SRSF3 doivent ainsi être bien compris dans le but de faire de l'oligonucléotide interférent contre SRSF3 une thérapie efficace contre la SLA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a neurodegenerative disorder that leads to motoneuron loss, progressive paralysis and death a few years after the first symptoms. As every other neurodegenerative disorder, inflammation is a main component of ALS pathogenesis. One of the cell type implicated in this inflammation, the microglia, is the central subject of this thesis. With the emergence of the symptoms, microglia transforms from an anti-inflammatory and neuroprotective phenotype to an aberrant and neurotoxic phenotype. It is necessary to elucidate the cellular mechanisms underlying this phenotypic change and the factors maintaining these phenotypes to allow the development of effective inflammation-targeting therapies. In this thesis we seek to identify, using multiple molecular tools and animal models, the microglial signature at the different stage of the disease. During the symptomatic stage, we identified the immunosuppressive cytokine IL-10 to be responsible for maintaining the anti-inflammatory phenotype. This cytokine is at the same time produced and recognized by microglial cells. Blocking IL-10 receptor accelerated disease progression and shortened survival in a mouse model. Moreover, the augmentation of the expression of IL-10, using a viral vector, slowed disease progression and lengthened lifespan in the same mouse model. In order to understand the cellular mechanisms implicated in the microglial phenotypic change in ALS, we used a system-model for the microglia-specific molecular profiling. This tool, EDTA-TRAP, consists in the microglial poly-ribosome immunopurification and the subsequent identification of in-translation mRNAs and proteins sequestered on these ribosomes. It was possible to identify a strong mismatch in the nature of the most regulated mRNAs and proteins. The transcriptomic profile of symptomatic microglia denotes a phagocytic and possible neuroprotective function for microglia while its proteomic profile is proliferative and potentially neurotoxic. The discrepancy between these two profiles is explained by the repression of immune gene mRNA translation by a mechanism implicating the interaction of their 3'UTR and the RNA-binding protein SRSF3. The phosphorylated form of SRSF3 specifically accumulates in microglia cytoplasm proportionally with disease progression. The decrease of SRSF3 expression by an interfering oligonucleotide restores immune mRNA translation and the microglial phagocytic function. This leads to and slower disease progression and a longer survival in a mouse model. Hence, the use of an interfering oligonucleotide against SRSF3 could be a new therapeutic avenue in ALS treatment. The understanding of the diverse cellular mechanisms implicating SRSF3 is important in elucidating its dynamic function in ALS. SRSF3 is the shortest protein from the SR family. This family can be distinguished by their structure : one or two N-terminal RNA recognition motif and a C-terminal highly phosphorylatable arginine and serine rich domain. SRSF3 can be phosphorylated in the nucleus by the CLK1 kinase or in the nucleus and the cytoplasm by the SRPK kinases. SRSF3 is implicated in splicing, nucleocytoplasmic transport and translation, among others. The deregulation of the expression level or the phosphorylation of SRSF3 can drastically change its role in the cell. Hence, SRSF3 is implicated in many diseases such as cancer, viral infection and ALS. The cellular mechanisms governing SRSF3 dynamism should then by well understood in order to make the interfering oligonucleotide against SRSF3 an efficient therapy to treat ALS.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodegenerative chronique caractérisée par la dégénérescence des motoneurones corticaux, bulbaires et spinaux. Environ 5 à 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAf), avec un mode de transmission autosomique dominant, tandis que les 90 à 95% restants sont des cas sporadiques (SLAs), sans composante génétique connue. Approximativement 20% des cas familiaux de SLA sont associés à plus de 100 mutations du gène codant pour la superoxyde dismutase de type 1 (SOD1). Des données récentes indiquent que les chromogranines, composants majeurs de la matrice des granules de sécrétion, peuvent lier spécifiquement les formes mutées de la SOD1 et promouvoir leur sécrétion. Une fois sécrétée, la SOD1 mutée peut induire la microgliose ainsi que la mort des motoneurones. Afin de confirmer cette nouvelle hypothèse pathologique, nous avons testé une approche d'immunisation visant à réduire les niveaux extracellulaires de la SOD1 mutée dans le tissu nerveux de souris modèles de la SLA. Cette approche s'est avérée efficace pour retarder l'apparition de la maladie et prolonger la durée de vie des souris vaccinées. Nos travaux montrent également que la SOD1 peut être transloquée dans le réseau RE-Golgi sous forme monomérique et en présence d'ATP. Dans le but de mieux comprendre le rôle et l'implication des chromogranines dans la toxicité de la SOD1 mutée et par conséquent dans la pathogenèse de la SLA, nous avons généré des souris SOD1G37R dans le contexte de surexpression neuronale de la chromogranine A (CgA). Nos résultats montrent que la surexpression de la CgA chez les souris SOD1G37R accélère l'apparition des troubles moteurs et augmente la dégénérescence des motoneurones. Les souris TCgA; SOD1G37R présentent un niveau plus élevé d'espèces protéiques mal repliées de SOD1, ce qui refléterait une stabilisation des espèces toxiques de la SOD1 par l'excès de CgA. Ces résultats suggèrent un rôle des chromogranines comme modulateurs de la survenue de la maladie dans la pathogenèse de la SLA.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF. Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette maladie encore incurable. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable disease.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodegenerative incurable. Un seul médicament existe pour traiter la SLA et il ne fait que prolonger la durée de vie des patients de 3 à 6 mois, sans en diminuer les symptômes. Parmi les meilleurs modèles pour étudier la SLA, les souris S0D1G93A sont largement utilisées, notamment pour tester de nouveaux composés. Aussi, le modèle murin TDP-43 , récemment généré dans notre laboratoire, représente très bien la pathologie observée dans une autre sous-portion des patients atteints de SLA (protéinopathies TDP-43). Dans une tentative de découvrir un nouveau traitement pour la SLA, nous avons administré à des souris S0D1G93A et TDP-43 du bleu de méthylène, médicament connu pour traiter une variété des désordres neurologiques et ayant des propriétés neuroprotectrices toutes indiquées pour traiter la SLA. Nous l'avons aussi administré conjointement avec le lithium qui est connu pour avoir des effets synergiques avec certains composés.

La plupart des mutations qui ont lieu sur la séquence protéique de FUS et qui lie la protéine à la SLA se trouvent dans le signal de localisation nucléaire (NLS), ce qui rend la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d'autres observations, il est suggéré qu'un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l'origine de la neurodégénérescence. Alors que FUS est principalement une protéine nucléaire impliquée dans les processus de transcriptions, il possède également plusieurs fonctions cytoplasmiques. FUS est impliqué dans l'activité traductionnelle. Son rôle dans la traduction n'est pas encore entièrement compris. Il a été rapporté que FUS à la capacité de se lier au polyribosome pour avoir une action répressive sur la synthèse des protéines. La voie de signalisation mTOR impacte l'association de FUS avec les polyribosomes dans des cellules HEK293T. La SLA étant une maladie qui impacte les neurones du système nerveux central, nous voulons savoir si FUS y sera régulé par cette voie de signalisation. Les modifications post-traductionnelles (PTM) sont connues pour être impliquées dans l'interaction entre les protéines. L'une des hypothèses est que les PTMs et interactions protéines-protéines sont impliqués dans l'association entre FUS et les polyribosomes. Ainsi, l'objectif de mon étude est de déterminer comment la répression de l'activité traductionnelle par les FUS est régulée en étudiant les PTMs, les protéines et les voies de signalisation provoquant l'association de FUS aux polyribosomes. Mes résultats ont montré que la statut phosphorylation de FUS est impliquée dans sa localisation cytoplasmique et est en corrélation avec l'inhibition de la synthèse protéique. De plus, la voie de signalisation mTOR joue un rôle dans la localisation cytoplasmique de FUS en corrélation avec l'inhibition de la synthèse des protéines montrant le rôle de mTOR sur la modulation de FUS face à l'inhibition traductionnelle. De plus, mes résultats ont montré que le rôle de FUS dans la régulation de la traduction dans les régions éloignées telles que les synapses est influencée par la voie de signalisation mTOR. Par conséquent, des composants protéiques de mTOR serait impliqué dans l'association de FUS et son rôle d'inhibiteur traductionnel. / Most of the mutations that take place on the protein sequence of FUS that links the protein to ALS are in the nuclear localization signal (NLS), which makes the protein abnormally abundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it is suggested that a toxic gain-of-function of FUS in the cytoplasm is the cause of neurodegeneration. While FUS is primarily a nuclear protein involved in transcription processes, it also has several cytoplasmic functions. FUS is involved in translational regulation. Its role in translation is not yet fully understood. FUS has been reported to have the ability to bind to the polyribosome to have a repressive action on protein synthesis. The mTOR signaling pathway impacts the association of FUS with polyribosomes in HEK293T cells. Since ALS is a disease that impacts the neurons of the central nervous system, we want to know if FUS will be regulated by thissignaling pathway. Post-translational modifications (PTMs) are known to be involved in the interaction between proteins. One of the hypotheses is that PTMs and protein-protein interactions are coordinating the association between FUS and polyribosomes. Thus, the objective of my study is to determine how the repression of translational activity by FUS is regulated by studying the PTMs, FUS protein interactions and signaling pathways causing the association of FUS with polyribosomes. My results showed that the phosphorylation status of FUS is involved in its cytoplasmic localization. Moreover, the cytoplasmic localization of FUS correlates with inhibition of protein synthesis. Moreover, the mTOR signaling pathway plays a role in the cytoplasmic localization of FUS correlating with the inhibition of protein synthesis showing the role of mTOR on the modulation of FUS to translational inhibition. Furthermore, my results showed that the role of FUS in regulating translation in remote regions such as the synapse is influenced by the mTOR signaling pathway.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative affectant les neurones moteurs supérieurs et inférieurs menant éventuellement à une paralysie générale du patient. Le décès du patient survient généralement entre 2 à 5 ans subséquemment à l’apparition des premiers symptômes. La SLA consiste en la maladie neurologique causant le plus décès chez l’adulte et il est estimé qu’environ 10% des cas sont familiaux (fSLA) et 90% sont sporadiques (sSLA). De plus, 15% des patients souffrant de la SLA développent également une démence fronto-temporale (DFT) s’illustrant par des troubles de comportements ainsi qu’un changement de personnalité majeur. Il a été démontré que la SLA et la DFT partagent un spectre génétique commun et les patients atteints de DFT démontrent une protéinopathie caractérisée par une accumulation anormale de certaines protéines dans le cytoplasme des neurones et des cellules gliales, tout comme pour les patients souffrant de SLA. Plusieurs gènes mutés ont été identifiés au cours des dernières années pour la forme fSLA, notamment superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), ubiquilin-2 (UBQLN2), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), etc. Un des gènes le plus étudié et le mieux décrit est celui codant la protéine TDP-43. Cette protéine nucléaire, lorsque mutée, est délocalisée dans le cytoplasme, où elle forme des inclusions anormales et persistantes. Ces agrégats, lorsque formés, renferment également plusieurs autres composés, notamment d’autres protéines telles qu’UBQLN2, différentes nucléoporines, ubiquitine, etc. UBQLN2 est une protéine ayant un rôle primordial dans le système de dégradation du protéasome (UPS) ainsi que pour l’autophagie. Cette protéine est responsable de la liaison entre les protéines destinées à être dégradées avec l’UPS. Il a été démontré dernièrement in vitro et in vivo que la mutation d’UBQLN2 est liée à l’agrégation de TDP-43. Cependant, le mécanisme exact de ce phénomène reste grandement incompris et nécessite encore beaucoup d’attention et de travail. Dans ce mémoire, nous avons utilisé pour notre étude des cellules en culture afin de surexprimer les formes natives et mutantes d’UBQLN2 humain (hUBQLN2) pour étudier l’effet d’UBQLN2 sur la protéine TDP-43. Notre équipe a réussi à démontrer dernièrement dans les cellules de neuroblastome de souris (Neuro2a) que la surexpression de l’UBQLN2 entraînait une délocalisation de TDP-43 du noyau vers le cytoplasme en plus de son accumulation anormale dans des agrégats. De plus, l’effet synergique entre les formes mutées de TDP-43 et UBQLN2 a également été démontré dans un modèle murin dans notre article paru en 2018 comme quoi la mutation d’UBQLN2 influence grandement la protéinopathie de TDP-43. À la suite de ces constats, nous avons orienté nos études sur le phénomène synergique entre UBQLN2 et TDP-43 qui est encore grandement méconnu. Pour ce faire, une analyse complète et exhaustive de la littérature a été effectuée afin de bien comprendre la mutation UBQLN2 et consiste en la première revue littéraire couvrant la totalité des ouvrages publiés sur la mutation d’UBQLN2 dans la SLA. Par la suite, nous avons convenu d’étudier l’effet de la mutation d’UBQLN2P497H sur le transport nucléo-cytoplasmique dans les cellules Neuro2a ainsi que dans les tissus de souris transgéniques. Les souris utilisées sont les mêmes que pour l’article Picher-Martel et al., 2018, soit des souris simple transgénique UBQLN2P497H et TDP-43G348C ainsi que la première souris double transgénique arborant UBQLN2P497H/TDP-43G348C. Les souris doubles transgéniques se sont avérées très intéressantes. En effet, elles ont développé les caractères typiques retrouvés chez les patients SLA/DFT avec une perte motoneuronale accompagnée de dégénérescence axonale, atrophie musculaire, gliose, trouble moteur ainsi que cognitif en plus d’agrégations cytoplasmique de TDP-43 importantes. À l’aide de ce modèle unique nous avons approfondi notre compréhension des déficits observés au niveau du transport nucléo-cytoplasmique, déficit grandement observé chez les patients SLA. Nous avons observé que le transport nucléo-cytoplasmique était davantage et significativement altéré dans les cellules co-transfectées avec les gènes encodant pour les deux protéines mutées plutôt que transfectées avec une seule. Nous avons également observé pour les souris double transgéniques comparées aux souris simples pour l’une ou l’autre de ces protéines. Nos résultats suggèrent donc que la mutation d’UBQLN2 exacerbe significativement la protéinopathie de TDP-43 et engendre une perturbation importante du transport nucléo-cytoplasmique ainsi que des complexes du pore nucléaire. En conclusion, ce mémoire démontre un rôle important de la mutation d’UBQLN2 sur TDP-43 et leur grande affinité à augmenter les déficits du transport nucléo-cytoplasmique. Ceci suggère donc qu’UBQLN2 et TDP-43 sont intimement liés et peuvent jouer un rôle synergique dans la physiopathologie de la SLA. Le modèle murin double transgénique pourra indubitablement être utilisé en laboratoire afin de tester de nouvelles approches thérapeutiques.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est la maladie du motoneurone la plus fréquente chez les adultes. Elle se caractérise par une perte progressive des motoneurones supérieurs et inférieurs menant à une paralysie et au décès entre deux à cinq ans après le début des symptômes. Environ 10% des patients ont une forme familiale (fSLA). Jusqu’à 15% des patients atteints de la SLA peuvent également présenter une démence fronto-temporale (DFT). La DFT se présente par des troubles de comportement et un changement de personnalité. Plusieurs gènes sont identifiés dans fSLA, incluant superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), Tank-binding kinase 1 (TBK1) et ubiquiline-2 (UBQLN2). Ces mutations ont mené à la compréhension de plusieurs mécanismes pathologiques. L’un des mécanismes les mieux décrit est la formation d’inclusions cytoplasmiques de TDP-43. Ces inclusions contiennent d’autres protéines telles qu’UBQLN2 et ubiquitine et représentent le marqueur neuropathologique classique de la maladie. UBQLN2 est une protéine impliquée dans le système de dégradation du protéasome (UPS) et l’autophagie. Des mutations dans le gène UBQLN2 ont été lié à l’agrégation de TDP-43 dans des cellules en culture. En revanche, nous possédons très peu de connaissances sur les mécanismes pathologiques impliquant UBQLN2. Dans cette thèse, nous avons utilisé des neurones en culture pour surexprimer les formes native et mutante d’UBQLN2 humain et pour étudier l’effet sur la délocalisation cytoplasmique et l’agrégation de TDP-43. La surexpression d’UBQLN2WT ou d’UBQLN2P497H entraînait une accumulation cytoplasmique et une agrégation de TDP-43. Puisque notre groupe a déjà démontré une interaction entre la sous-unité p65 de NF-κB et TDP-43, nous avons analysé l’activation du facteur NF-κB par la surexpression d’UBQLN2 WT ou P497H. Nous avons observé une activation du facteur avec l’expression des deux formes d’UBQLN2. Cette activation était dépendante de la MAPK p38 en réponse à un stress cellulaire et une accumulation cytoplasmique d’UBQLN2/TDP- 43. L’augmentation de l’activité de NF-κB causait une mort neuronale et celle-ci était réversible par le traitement des cellules avec la Withaferine A, un inhibiteur de NF-κB. Puisque nous avons déterminé qu’il y avait un effet synergique important sur l’agrégation de TDP- 43 par la surexpression d’UBQLN2, nous avons décidé de générer un nouveau modèle de souris transgénique avec mutation dans UBQLN2 et dans TDP-43. Les souris ont été générées par l’introduction du gène UBQLN2P497H sous le contrôle du promoteur du gène neurofilament lourd (NFH). Les souris simples transgéniques UBQLN2P497H étaient ensuite croisées avec nos souris TDP-43G348C précédemment décrites pour produire des souris double transgénique UBQLN2P497H; TDP-43G348C. Bien que les souris simples transgéniques UBQLN2P497H développaient seulement un trouble cognitif léger, les souris doubles transgéniques développaient les caractéristiques classiques de la SLA/DFT avec agrégation cytoplasmique de TDP-43, perte de motoneurones, dégénérescence axonale et atrophie musculaire, troubles moteurs et cognitifs et une gliose entourant les motoneurones. Nous avons ensuite utilisé ce modèle pour approfondir notre compréhension des mécanismes d’agrégation d’UBQLN2 et de TDP-43 et de leur rôle dans l’inflammation. Nous avons observé que les microglies provenant des souris doubles transgéniques étaient plus sensibles à la stimulation aux lipopolysaccharides (LPS) et que l’activité NF-κB était plus importante dans les cerveaux provenant des souris doubles transgéniques. Nos résultats ont également suggéré que l’agrégation d’UBQLN2 entraînait une séquestration d’ubiquitine, réduisant ainsi l’efficacité du protéasome et la clairance de TDP-43. D’ailleurs, l’augmentation du pool d’ubiquitine a permis d’améliorer l’efficacité du protéasome et favoriser le retrait de TDP-43 des agrégats et d’augmenter sa dégradation. En conclusion, cette thèse démontre un rôle important de la protéine UBQLN2 dans la délocalisation de TDP-43 sous formes d’agrégats en culture cellulaire et en modèle animaux. Cela suggère qu’UBQLN2 et TDP-43 possède un rôle synergique dans la physiopathologie de la SLA et dans la neuroinflammation qui leur est associée. Notre modèle double transgénique pourra certainement être utilisé pour tester des possibilités thérapeutiques. De plus, l’interaction entre UBQLN2 et TDP-43 pourrait être ciblé pour traiter la SLA/DFT. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is the most common motor neuron disease in adults. It is characterized by progressive lost of upper and lower motor neurons leading to paralysis and eventually death from 2 to 5 years after the onset of the symptoms. Approximately 10% of the patients have a family history and the remaining patients have a sporadic form of the disease. Up to 15% also have fronto-temporal dementia (FTD) with prominent behavioral and personality changes. Numerous genes are known to be mutated in the familial form of the disease. This includes mutation in superoxide dismutase 1 (SOD1), TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43), Fused in sarcoma (FUS), optineurin (OPTN), Tank-binding kinase 1 (TBK1) and ubqiquilin-2 (UBQLN2). These mutations lead to various pathological mechanisms. One of the most defined mechanism is the formation of cytoplasmic aggregates of TDP-43. These inclusions are positive for other proteins such as UBQLN2 and ubiquitin and are the pathological hallmark of the disease. UBQLN2 plays a central role in the ubiquitin proteasome system (UPS). Mutations in UBQLN2 have been link to TDP-43 pathology in vitro. However, the mechanisms underlying TDP-43 pathology induced by UBQLN2 are still unknown. In this thesis, we used neurons in culture and overexpressed human UBQLN2WT and human UBQLN2P497H to study the interaction between TDP-43 and UBQLN2. We demonstrated that the overexpression of UBQLN2 species enhanced TDP-43 cytoplasmic accumulation and aggregation. Since TDP-43 is known to interact with the p65 subunit of the NF-κB transcriptional factor, we analyzed the effect of UBQLN2 overexpression on the p65 activation. We observed an increase in NF-κB activation in cells transfected with either UBQLN2WT or UBQLN2P497H. We observed that the hyperactivation of NF-κB was caused by the action of the p38 MAPK in response to cellular stress and UBQLN2/TDP-43 cytoplasmic accumulation. This increase in NF-κB activity enhanced motor neuron death which was reversible by treatment with Withaferin A, a known NF-κB inhibitor. Because we observed an important synergistic effect in TDP-43 aggregation with UBQLN2 overexpression, we decided to generate a new transgenic mouse model with mutations in both UBQLN2 and TDP-43. Mice were generated with the expression of UBQLN2P497H gene under the control of the neurofilament heavy (NFH) promoter. The single transgenic UBQLN2P497H were then bred with our previously described TDP-43G348C transgenic mice. Whereas the single UBQLN2P497H transgenic mice developed only mild cognitive impairment, the double transgenic UBQLN2P497H; TDP-43G348C mice developed typical features of ALS/FTD with important TDP- 43 cytoplasmic aggregation, motor neurons loss, axonal degeneration, muscle atrophy, as well as motor and cognitive symptoms and gliosis. We took advantage of our new generated double transgenic mice to analyze the interaction between UBQLN2 and TDP-43 and to study the effect of aggregation of both proteins on inflammatory pathways. We observed that microglia from double transgenic mice were hyperresponsive to intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) and that NF-κB activity was increased in double transgenic mice. Our results also suggested that UBQLN2 up-regulation induced TDP-43 aggregation by the sequestering of ubiquitin proteins into aggregates and the reduction of the UPS efficacy. Thus, increasing the pool of ubiquitin promoted the UPS function with ensuing reduction of TDP-43 cytosolic accumulation. In conclusion, this thesis demonstrates an important role of UBQLN2 species in TDP-43 mislocalization and aggregation in vitro and in vivo. It also suggests that UBQLN2 and TDP-43 possess a synergic role in neuroinflammation. Certainly, our double transgenic mice could be used to study future therapeutic avenues and these mechanisms could be targeted to treat TDP-43- associated ALS/FTD pathology.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une pathologie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive des neurones moteurs et par de l’atrophie musculaire menant à de la paralysie. Bien que plusieurs mécanismes pathologiques aient été élucidés, la SLA reste un mystère médical puisqu’il n’existe toujours pas de traitement efficace. Nous avons développé deux stratégies dans le but de traiter la SLA. La première stratégie fut de cibler la protéine SOD1 mal repliée (chapitre 2) et la deuxième consistait à traiter la neuroinflammation présente dans la maladie (chapitre 3). Dans le chapitre 2, nous avons tenté de diminuer le niveau de la protéine SOD1 mal repliée présent dans le système nerveux de souris transgéniques développant un phénotype de SLA. Pour ce faire, nous avons testé une nouvelle approche thérapeutique basée sur l’utilisation d’ « adeno-associated virus (AAV) ». Ce virus contient une séquence d’ADN qui encode pour un anticorps à chaîne unique variable (scFv). Cet anticorps est composé d’une des deux chaînes légères et lourdes de l’anticorps D3H5 ciblant de manière spécifique la protéine SOD1 mal repliée. Une injection intra-thécale unique de l’AAV encodant l’anticorps à chaîne unique dans des souris SOD1G93A repousse le début de la maladie et augmente la survie des souris de 28%. Nous avons démontré que la Withaferin A (WA), un inhibiteur du facteur NF-κB, diminuait le phénotype neurologique retrouvé chez le modèle de souris transgénique TDP-43. Donc, nous avons testé la Withaferin A sur deux autres lignées de souris transgéniques exprimant des mutations dans la protéine SOD1, soit la lignée de souris SOD1G93A et la lignée de souris SOD1G37R. L’effet bénéfique de la WA chez les souris SOD1G93A était accompagné d’un soulagement de la neuroinflammation, d’une diminution du niveau de protéine SOD1 mal repliée dans la moelle épinière et d’une baisse de la mortalité des neurones moteurs. En considérant ces résultats, l’utilisation d’AAV encodant un anticorps à chaîne unique contre la protéine SOD1 mal repliée ainsi que l’utilisation de Withaferin A devrait toutes les deux être considérées comme des approches pour traiter la SLA. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive neurodegenerative disease associated with motor neuron degeneration, muscle atrophy and paralysis. Although numerous pathological mechanisms have been elucidated, ALS still remains a medical mystery in the absence of any effective therapy. Riluzole is the only therapeutic drug approved for ALS with regard to prolonging survival. Here, we have developed two strategies for treatment of ALS, first targeting the misfolded SOD1 (chapter 2) and other targeting neuroinflammation (chapter 3). In chapter 2, we aimed to reduce the level of misfolded SOD1 species in the nervous system. We tested a novel therapeutic approach based on adeno-associated virus (AAV)-mediated tonic expression of a DNA construct encoding a secretable single chain fragment variable (scFv) antibody composed of the variable heavy and light chain regions of a monoclonal antibody (D3H5) binding specifically to misfolded SOD1. A single intrathecal injection of the adeno-associated virus encoding the single chain antibody in SOD1G93A mice delayed disease onset and extended the life span by up to 28%, in direct correlation with scFv titers in the spinal cord. Our second treatment strategy which is aimed to target neuroinflammation is based on previous reports from our lab where it has been shown that Withaferin A (WA), an inhibitor of NF-κB activity was efficient in reducing disease phenotype in TDP-43 transgenic mouse model of ALS. We tested WA in mice from two transgenic lines expressing different ALS-linked SOD1 mutations, SOD1G93A and SOD1G37R. The beneficial effects of WA in SOD1G93A mice model was accompanied by alleviation of neuroinflammation, decrease in level of misfolded SOD1 species in spinal cord, a reduction in loss of motor neurons, resulting in delayed disease progression and mortality. Based on these evidences, AAV encoding a secretable scFv against misfolded SOD1 and WA should be considered as a potential treatment for ALS.