L'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche de cellules épithéliales pigmentées situés entre la rétine neurale et la membrane de Bruch et joue un rôle important dans le maintien et la survie des photorécepteurs. Des malformations, le dysfonctionnement ou bien la mort de l'EPR provoque la mort des photorécepteurs. Orthodenticle homéoboîte 2 (Otx2) est un facteur de transcription exprimé par l’EPR chez l’animal adulte joue un rôle important dans l’EPR puisque son inactivation chez les souris [CreERT2 : Otx2flox] provoque la dégénérescence des photorécepteurs. En outre, les patients présentant des mutations dans le gène OTX2 souffrent de microphtalmie ou d'anophtalmie et développent généralement des maladies oculaires comme la rétinopathie pigmentaire (RP) ou l’amaurose congénitale de Leber. La délivrance par un vecteur AAV d’OTX2 dans des cellules primaires de l’EPR de porc mais aussi de cellules pluripotentes humaines différenciés en EPR nous a permis d’identifier de nouveaux gènes régulés par OTX2 et un variant d’épissage connu OTX2L. Nous avons par ailleurs identifié un nouveau variant d’épissage OTX2S par analyse bioinformatique de banques d'ADNc normalisées de RPE de rat. OTX2S présente une délétion d’une partie de l’homéodomaine. Nous avons étudié l'expression de ce variant dans la rétine et étudié ses propriétés transcriptionnelles en utilisant le promoteur du gène de la tyrosinase couplé à un gène rapporteur dans les cellules HEK293 et les cellules de l’EPR primaires de porcs. OTX2S exerce un effet transdominant négatif uniquement dans les cellules de l’EPR. Son rôle physiologique doit encore être précisé car il semble participer à la transition épithélio-mésenchymateuses qui survient après décollement de la rétine, une pathologie rétinienne fréquente. L’analyse par immunoprécipitation de la chromatine sur des cellules de l'EPR de porc montre que la plupart de ces gènes sont des cibles directes d’OTX2.Notre laboratoire a identifié un facteur neuroprotecteur sécrétée par photorécepteurs à bâtonnets, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) qui est une stratégie prometteuse pour le traitement de RP lorsque les patients portent des mutations dans les gènes exprimés sélectivement photorécepteurs à bâtonnets, ce qui est le plus fréquemment rencontré. Cette stratégie thérapeutique ne s’appliquera pas aux RP causés par les mutations de gènes spécifiquement exprimés par l’EPR, comme le gène MERTK. Afin d'étudier le bénéfice potentiel du gène Otx2, nous avons utilisé un rongeur modèle de RP avec une mutation dans le gène Mertk, les rats RCS. Nous montrons que la transplantation d'EPR génétiquement modifié pour sur-exprimer Otx2, améliore la protection des photorécepteurs et la vision de l’animal. Une augmentation de la réponse électrophysiologique (ERG) des photorécepteurs (ERG) et la protection de la couche nucléaire externe représentant les photorécepteurs a pu être mise en évidence, cette dernière par tomographie par cohérence optique (OCT). Nos résultats indiquent que cette approche pourrait être applicable pour le traitement des maladies de la rétine avec le dysfonctionnement de l'EPR comme la RP ou la dégénérescence maculaire liée à l'âge. / Retinal pigment epithelium (RPE) is a monolayer of pigmented epithelial cells located between the neural retina and Bruch’s membrane and has an important function in the maintenance and survival of photoreceptor cells. Abnormalities, dysfunction and/or death of the RPE ultimately lead to death of retinal photoreceptors. Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) is expressed in adult RPE and known to have an important role in RPE function since loss of function in Otx2flox/CreERT2 mice, leads to rapid photoreceptor degeneration. Furthermore, patients having mutations in this gene suffer from microphthalmia or anophthalmia and usually develop eye diseases as retinitis pigmentosa (RP) and Leber congenital amaurosis.Using ectopic expression involving AAV-mediated gene transfer in primary pig RPE cells and human induced pluripotent RPE derived cells, we have identified novel gene targets of Otx2 and Otx2L. The physiological role of Otx2S still needs to be addressed since it potentially participates in the epithelial to mesenchymal transition that occurs after retinal detachment, a frequent retinal pathology. Chromatin immunoprecipitation analysis using pig RPE cells shows that most of these genes are direct targets of OTX2.Our lab has previously identified a neuroprotective factor secreted by rod photoreceptors, Rod-derived Cone Viability Factor (RdCVF) which is a promising strategy for treatment of RP for patients with mutations in photoreceptor cells. This therapeutic strategy will not cover RP caused in genes specifically expressed by RPE, as for example MERTK gene.In order to study the potential benefit of Otx2 for gene-cell therapy, we used an animal model of RP with a mutation in the rdy (Mertk) gene, the RCS rats. Transplantation of genetically engineered RPE cells expressing Otx2, enhances the protection of photoreceptors and vision in this model. We demonstrate an improvement in electroretinograph (ERG) recordings and thickness of outer nuclear layer as measured in optical coherence tomography (OCT). Our findings indicate that this approach might be applicable treatment for retinal diseases with RPE dysfunction like RP and/or age related macular degeneration. Furthermore, using bioinformatic tools and gene screening of normalized cDNA libraries from rat RPE we identified Otx2S, a novel-splicing variant of Otx2 that lacks a part of a homeodomain. Otx2L, another splice variant of Otx2 with an insertion was also studied. We have shown the expression of this variant in NR and RPE and studied its transcriptional properties using gene reporter assay in HEK293 cells and pig primary RPE cells. In addition, we have found that Otx2S exerts a transdominant negative effect on tyrosinase promoter only in primary RPE cells.

Rôle de la NADPH oxydase NOX4 dans la régulation de l'expression du symporteur sodium/iode (NIS) dans le cas du cancer papillaire de la thyroïde (PTC). L’activation autocrine de la voie TGF-β induite par BRAFV600E régule négativement l’expression du symporteur sodium/iode (NIS) via une production de ROS dépendante de la NOX4 dans le cancer papillaire de la thyroïde. Résumé : Le cancer papillaire de la thyroïde (PTC) est la pathologie thyroïdienne la plus répandue. Les mutations ponctuelles de BRAF sont retrouvées dans 40 à 60 % des cas de PTC. La transversion BRAFT1799A est la mutation de BRAF la plus fréquente. Les tumeurs porteuses de la mutation BRAFV600E sont souvent associées avec une diminution significative de l’expression du transporteur sodium/iode (NIS). Les résultats cliniques sur les patients atteints d’un cancer de la thyroïde porteur de la mutation BRAFV600E ont montré que l’inhibition de la voie MAPK ne permet pas de rétablir de manière assez importante l’expression du NIS induite par BRAFV600E. L’expression de BRAFV600E induit la sécrétion de TGF-β fonctionnel, qui inhibe l’expression des protéines thyroïdiennes impliquées dans le métabolisme de l’iode, et particulièrement le NIS. La NOX4 est surexprimée dans un nombre croissant de tumeurs, et particulièrement dans les cas de PTC. Dans le cas du cancer du sein, les mécanismes critiques pour le développement du cancer impliquent la régulation par le TGF-β de la NOX4 au niveau transcriptionnel via le facteur de transcription Smad3. Ces données nous mènent à considérer la NOX4 comme un candidat sérieux pour le rôle de système générateur de ROS contrôlé par la boucle autocrine TGF-β induite par BRAFV600E. Dans cette étude, nous avons tout d’abord observé une corrélation entre la présence de l’oncogène BRAFV600E, la surexpression de la NOX4 et l’inhibition de l’expression du NIS dans les cancers papillaires de la thyroïde. Puis, en utilisant la lignée BCPAP comme modèle in vitro de PTC, nous avons démontré BRAFV600E contrôle l’expression de la NOX4 et de la p22phox par l’intermédiaire de la signalisation TGF-β/Smads. La boucle TGF-β induite par BRAFV600E induit l’expression de la NOX4 et de la p22phox au niveau transcriptionnel via phosphorylated SMAD3. L’expression constitutive de la NOX4 et de la p22phox, qui forment ensemble un complexe NADPH oxydase fonctionnel, contribue au stress oxydatif observé dans les cellules BCPAP. Le traitement des cellules BCPAP par des scavengers de ROS comme le N-acetyl cysteine (NAC) et le Tiron permettent d’augmenter l’expression du NIS au niveau transcriptionnel et de rétablir l’expression d’une protéine fonctionnelle permettant la captation d’iode, ce qui indique que les ROS sont impliqués dans l’inhibition de l’expression du NIS. L’inhibition spécifique de la NOX4 par siRNA permet de réinduire l’expression de l’ARN messager et de la protéine NIS. Ces résultats montrent pour la première fois que les ROS produits par la NOX4 jouent un rôle critique dans l’inhibition de l’expression du NIS induite par BRAFV600E via la signalisation TGF-β/SMAD3. / BRAFV600E induced-TGF-β secretion down-regulates sodium iodide symporter (NIS) expression via NOX4-dependent ROS generation in papillary thyroid carcinoma. Abstract : Papillary thyroid cancer (PTC) is the most common thyroid pathology and BRAF point mutations account for 40-60% of tumors. BRAFT1799A is the most frequent BRAF mutation and BRAFV600E positive tumors are often associated with a significant loss of sodium/iodide symporter (NIS) expression. Clinical results on patients harboring thyroid cancer with BRAF mutation have recently shown that MAPK pathway inhibition does not fully reverts the BRAF-induced NIS repression. BRAFV600E expression induces secretion of functional TGF-β which is a repressor of thyroid specific genes such as NIS. Importantly, NOX4 has been shown to be prominently expressed in an increasing number of tumors, in particular in PTCs. In breast cancer cells, a critical mechanism for cancer development involves the transcriptional regulation of NOX4 by TGF-β. This result prompted us to test NOX4 as a ROS-producing candidate induced by BRAF-induced TGF-β. In this report, we first show in PTCs a correlation between BRAFV600E status, NOX4 overexpression, and low NIS expression level. Then, using BCPAP cells as an in vitro PTC model, we demonstrate that BRAFV600E controls NOX4 and p22phox expression via TGF-β signalling. The TGF-β autocrine loop activated by BRAFV600E induces NOX4 and p22phox expression at the transcriptional level via phosphorylated SMAD3. Both constitutively expressed proteins form a functional NADPH oxidase which produces high intracellular ROS levels. ROS scavengers increase the NIS expression at both mRNA and protein levels, and rescue a functional NIS, indicating that ROS are involved in the repression of NIS. Knocking down NOX4 with specific siRNAs reinduces NIS expression at both mRNA and protein levels. Altogether, these results show for the first time that NOX4-dependent ROS generation has a critical role in BRAF-induced NIS repression via the TGF-β/SMAD3 oncogenic signalling.

Il est généralement admis que le cancer du sein représente un ensemble de plusieurs maladies, définies comme des sous-types ayant des caractéristiques moléculaires et cliniques qui leurs sont propres. Une meilleure compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'hétérogénéité du cancer du sein est essentielle au développement de thérapies mieux ajustées. Le concept de cellules souches cancéreuses (CSC) pourrait être un des clés de cette compréhension. A ce jour, un certain nombre de marqueurs ont été proposés pour isoler et caractériser les cellules souches dans le cancer du sein, mais aucun ne semble totalement satisfaisant.Le but de mon travail était de déterminer un marqueur ou une combinaison de marqueurs avec lesquels les fractions enrichies en CSC pourraient être isolées de manière reproductible dans le cancer du sein de sous-types basal (BLBC). En effet, les tumeurs basales représentent 15% de toutes les tumeurs mammaires, mais constituent le sous-type le plus agressif. À cet effet, j'ai analysé un certain nombre de marqueurs par analyse FACS et tri cellulaire et utilisé la capacité de formation de mammosphères (MS) comme critère de validation pour la présence de CSC. Les lignées cellulaires utilisées comme modèles étaient les SUM 159, MDA-MB-231, MDA-MB-436, HCC1143, MDA-MB-468, Hs578T et BT-549 correspondant aux modèles basal-A et B. J'ai également testé trois lignées luminales les MCF7, T47D et BT474.De tous les marqueurs testés, seules, la combinaison des protéines de surface cellulaire CD44/CD24/EpCAM et l’activité enzymatique ALDH élevée ont permis d’obtenir un enrichissement significatif en CSC. Toutefois, le niveau de l'activité ALDH est apparu inconstant d’une lignée cellulaire à une autre et selon le type de tumeurs. D'autres marqueurs membranaires ont donné des résultats mitigés dans le cancer du sein ER-. En effet, la plupart des lignées basales ont montré des profils FACS assez homogènes avec des proportions élevées de cellules CD44+. Cependant, l'association de la positivité de CD44 avec l'EMT et la souchitude, ainsi que la bonne corrélation observée dans les modèles luminaux de la population de cellules CD44+/CD24- avec l’enrichissement en CSC, nous a incité à déterminer si le niveau d'expression en CD44 faisait une différence dans les tumeurs basales. Sur cette base, j’ai montré que les cellules CD44 high présentent une forte capacité à former des MS dans toutes les lignées cellulaires testées. Cette constatation nous a incités à utiliser CD44high vs. CD44low comme critère de tri cellulaire et à utiliser ces fractions pour effectuer une analyse du transcriptome afin d'identifier d'autres marqueurs non encore déterminés, pouvant isoler des fractions cellulaires plus faibles avec un enrichissement plus élevé en CSC. / It is now accepted that breast cancer is a compendium of several diseases defined as subtypesthat are associated with different clinical outcomes and molecular characteristics. A betterunderstanding of the mechanisms underlying breast cancer heterogeneity is critical to the development of better adjusted therapies. One of the keys to breast cancer heterogeneity may be explained by cancer stem cells (CSC). A number of markers have been proposed to isolate and characterize breast cancer stem cells, but none appears totally satisfactory.The purpose of my work was determine a marker or combination of markers with which CSC enriched fractions could be reproducibly isolated in basal like breast cancer (BLBC). BLBC represent 15% of all breast tumors, but are the most aggressive subtype. To this aim, I have analyzed a number of markers by FACS analysis and cell sorting and used the capacity to form mammospheres (MS) as a validation criterion for the presence of CSCs. The cell lines used as models were SUM 159, MDA-MB-231, MDA-MB-436, HCC1143, MDA-MB-468, Hs578T and BT-549 comprising both Basal A and Basal B models. I also tested three luminal models MCF7, T47D and BT474.Of all the markers tested those that most consistently allowed enrichment of CSCs were the combination of cell surface proteins CD44/CD24/EpCAM and elevated ALDH enzyme activity. However, ALDH activity appeared irregular, ranging from good to inconsistent according to the cell line. Other cell surface markers gave mixed results in ER- breast cancer because the elevated fraction of CD44+ cells found in most of basal breast cancer cell lines and their propensity to show rather homogenous FACS labeling patterns. However, the association of CD44 positivity with EMT and stemness, as well as the good correlation, we observed in luminal models, of CD44+/CD24- cell population with CSC enrichment incited us to determine whether the level of expression of CD44 could make a difference in basal like models. I show that CD44high cells present higher capacity to form MS in all cell line models tested. This prompted us to use CD44high vs. CD44low as a cell sorting criterion and use these fractions to perform transcriptome analysis in order to identify other markers yet not determined, that may point to smaller cell fractions with a higher CSC enrichment.