La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés issus du venin de scorpion Scorpio maurus palmatus. Ce peptide a initialement été étudié pour son activité pharmacologique en tant qu'activateur du récepteur à la ryanodine (RyR1) des muscles squelettiques. En étudiant comment cette toxine pouvait atteindre le RyR qui est localisé à l'intérieur des cellules, il a été montré que la maurocalcine pouvait être classé dans la liste croissante des peptides de pénétration cellulaire. Depuis la découverte que la maurocalcine peut servir de vecteur à la délivrance intracellulaire de streptavidine fluorescente, les données se sont accumulées pour illustrer l'incroyable valeur biotechnologique de cette toxine. Plusieurs nouveaux analogues ont été produits qui séparent les propriétés pharmacologiques et de pénétration cellulaire du peptide comme une maurocalcine sans ponts disulfulres, synthétisée en remplaçant les résidus cystéine par des acides aminobutyriques, ou en remplaçant tous les acides aminés par leur isomère de conformation D. La maurocalcine s'est avérée efficace pour la délivrance cellulaire de nanoparticules ouvrant ainsi une myriade possible d'applications high-tech. Enfin, la maurocalcine a été couplé à la doxorubicine, un agent anti-tumoral, pour rendre chimio-sensibles des cellules cancéreuses devenues chimio-résistantes. Il semble donc que la maurocalcine débute sa carrière comme outil biotechnologique, mais aussi que cette toxine s'avèrera utile pour déchiffrer finement les détails mécanistiques du fonctionnement du récepteur à la ryanodine. / Maurocalcine (MCa) is a 33 mer toxin initially identified from a tunisian scorpion venom, scorpio maurus palmatus. This peptide initially triggered our interest for its pharmacological activity on Ryanodine Receptor type 1 (RyR1) of skeletal muscles. In studying how this toxin reaches the intracellular RyR1, it has been shown that MCa could be placed in the growing family of cell penetrating peptides. Since the discovery that MCa can act as a transport agent for the intracellular delivery of fluorescent streptavidine, data have accumulated to illustrate the amazing biotechnological properties of this toxin. Several new analogs have been produced that keep cell penetration properties and lose pharmacological activity of the native molecule. This is the case for a linear analog of MCa synthesized by replacing internal cysteine residues by aminobutyric acid, or by the synthesis of a MCa analog with all its amino acid in D conformation. MCa proved efficient for the intracellular delivery of nanoparticles leading to a myriad of hi-tech applications. Finally, MCa has been grafted on an anti-tumor agent, doxorubicin, to made chemo-resistant tumor cells chemo-sensitive. So it seems that MCa begins its career as a biotechnological tool, and that this toxin will be helpful to see the light on the mechanistic aspects of RyR function.

La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés issus du venin de scorpion Scorpio maurus palmatus. Ce peptide a initialement été étudié pour son activité pharmacologique en tant qu'activateur du récepteur à la ryanodine (RyR1) des muscles squelettiques. En étudiant comment cette toxine pouvait atteindre le RyR qui est localisé à l'intérieur des cellules, il a été montré que la maurocalcine pouvait être classé dans la liste croissante des peptides de pénétration cellulaire. Depuis la découverte que la maurocalcine peut servir de vecteur à la délivrance intracellulaire de streptavidine fluorescente, les données se sont accumulées pour illustrer l'incroyable valeur biotechnologique de cette toxine. Plusieurs nouveaux analogues ont été produits qui séparent les propriétés pharmacologiques et de pénétration cellulaire du peptide comme une maurocalcine sans ponts disulfulres, synthétisée en remplaçant les résidus cystéine par des acides aminobutyriques, ou en remplaçant tous les acides aminés par leur isomère de conformation D. La maurocalcine s'est avérée efficace pour la délivrance cellulaire de nanoparticules ouvrant ainsi une myriade possible d'applications high-tech. Enfin, la maurocalcine a été couplé à la doxorubicine, un agent anti-tumoral, pour rendre chimio-sensibles des cellules cancéreuses devenues chimio-résistantes. Il semble donc que la maurocalcine débute sa carrière comme outil biotechnologique, mais aussi que cette toxine s'avèrera utile pour déchiffrer finement les détails mécanistiques du fonctionnement du récepteur à la ryanodine.

La maurocalcine (MCa) est une toxine de 33 acides aminés initialement issue du venin du scorpionScorpio maurus palmatus, et est considérée comme faisant partie de la famille des CPP(Cell Penetrating Peptides) depuis de nombreuses années déjà. La MCa présente donc un intérêtthérapeutique certain dans le domaine de la délivrance intracellulaire de cargos, et lestravaux exposés ici cherchent à caractériser au mieux les propriétés de pénétration de la moléculenative ainsi que celle de certains de ses variants.Après avoir quantifié l’internalisation de plusieurs variants tronqués (linéaires), j’ai pu mettreen évidence le fait que tous ces analogues testés ont une capacité à être internalisés bien plusélevée que celle des CPP de référence (notamment Tat et la pénétratine). Parmi ces variants,l’analogue MCaUF1−9 présente l’avantage d’un temps de rétention relativement élevé au seindes cellules, ainsi que d’une accumulation légèrement accrue en environnement acide (ce quiadvient lors de la formation tumeurs solides). Ce nouveau CPP possède donc un certain potentielthérapeutique mais l’étude de la MCa native, remarquablement stable in vivo, reste plusque jamais d’actualité. / Maurocalcine (MCa) is a 33-mer toxin originally isolated from the venom of the scorpioScorpio maurus palmatus, and has been considered as a cell-penetrating peptide (CPP) for severalyears. MCa presents a therapeutic interest for the intracellular delivery of cargoes, andthis thesis aims to characterise the cell penetration properties of the native molecule as well assome of its variants’.After quantifying several truncated (linear) variants’ internalisation, I have been able tohighlight the fact that all of those analogs possess a higher internalization ability than those ofstandard CPP (especially Tat and penetratin). Among those variants, the analog MCaUF1−9 hasa relatively high rentention time within cells, as well as a slightly increased accumulation whenin an acidic environment (which occurs during solid tumours formation). This new CPP showsa certain therapeutic potential but the study of nativeMCa, remarkably stable in vivo, remainsa priority.

La génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) est très prometteuse en médecine régénérative, pour la modélisation physiopathologique et le criblage de nouveaux médicaments. A l’origine, des cellules somatiques ont été reprogrammées en iPSC par l'expression forcée de facteurs de transcription (FT) impliqués dans les cellules souches embryonnaires. Depuis, de nombreuses lignées d’iPSC ont été générées mais les vecteurs actuels les plus représentés et efficaces pour exprimer les FT sont les virus intégratifs. Ils comportent du matériel génétique. Des stratégies alternatives ont été développées dans un contexte de sécurisation et de transfert clinique mais sont ont encore besoin d’être acceptées par les comités d’éthique. La méthode la plus sûre et rationnelle serait alors d’apporter ces FT directement sous forme protéique mais le défi est de traverser les membranes. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé un peptide de pénétration cellulaire (CPP) basé sur le FT ZEBRA du virus d’Epstein-Barr. La séquence impliquée dans la prise en charge cellulaire a été caractérisée au laboratoire et se nomme MD (Minimal Domain). Elle est capable de vectoriser des protéines et des biomolécules de haut poids moléculaire via un mécanisme indépendant de l'endocytose, permettant leur internalisation sous une forme biologiquement active. Dans ce projet, nous avons produit et purifié les protéines Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4 et c-Myc chacune fusionnée au CPP MD. Ce domaine n'interfère pas avec la capacité d'Oct4 à lier sa séquence cible d’ADN. Le traitement in vitro de cellules primaires conduit à l’internalisation des protéines MD en 30 minutes à 1 heure. MD-Oct4 et MD-Nanog peuvent être localisés au noyau en 3 heures. Dans un contexte de reprogrammation, la combinaison de MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog et MD-Lin28 lors de traitements répétés conduit à l'activation transcriptionnelle de gènes cibles composant le réseau de pluripotence. / The generation of induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) holds great promise for regenerative medicine, disease modelling and drug screening. Leading the original cell to an iPSC has been originally made by the forced expression of Transcription Factors (TF) involved in embryonic stem cells. Since the discovery of those mechanisms, many teams have engineered iPSC by well-defined cell culture tools such as the use of retroviruses in order to express TF. Those techniques use genetic material. Delivery techniques have evolved but most of reprogramming experiments still need TF. Development of alternative strategies has been conducted in a context of clinical application but still needs to be accepted by ethics comities. Thus, the use of recombinant proteins instead of genetic material is safe and rational but the challenge is to access the intracellular medium. In this context, our laboratory has developed a cell-penetrating peptide (CPP) based on the Epstein-Barr virus ZEBRA TF. The sequence implicated in cellular uptake has been characterized and is named MD (Minimal Domain). It is able to translocate high molecular weight proteins in an endocytosis-independent mechanism, allowing the internalization of cargos in fully biologically active form. Here we develop 6 MD fusions at the N-terminus of the following TF: Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog & Lin28. This domain does not interfere with Oct4 capacity to associate with its own DNA sequence. Moreover, MD fused proteins transduce in vitro treated cells in 30 minutes to 1 hour ; MD-Oct4 & MD-Nanog can be localized in the nucleus after 3 hours only. In a context of reprogramming experiences, the combination of MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog and MD-Lin28 in repeated treatment leads to the activation of target genes transcription such as those constituting the pluripotency network.