La génération de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) est très prometteuse en médecine régénérative, pour la modélisation physiopathologique et le criblage de nouveaux médicaments. A l’origine, des cellules somatiques ont été reprogrammées en iPSC par l'expression forcée de facteurs de transcription (FT) impliqués dans les cellules souches embryonnaires. Depuis, de nombreuses lignées d’iPSC ont été générées mais les vecteurs actuels les plus représentés et efficaces pour exprimer les FT sont les virus intégratifs. Ils comportent du matériel génétique. Des stratégies alternatives ont été développées dans un contexte de sécurisation et de transfert clinique mais sont ont encore besoin d’être acceptées par les comités d’éthique. La méthode la plus sûre et rationnelle serait alors d’apporter ces FT directement sous forme protéique mais le défi est de traverser les membranes. Dans ce contexte, notre laboratoire a développé un peptide de pénétration cellulaire (CPP) basé sur le FT ZEBRA du virus d’Epstein-Barr. La séquence impliquée dans la prise en charge cellulaire a été caractérisée au laboratoire et se nomme MD (Minimal Domain). Elle est capable de vectoriser des protéines et des biomolécules de haut poids moléculaire via un mécanisme indépendant de l'endocytose, permettant leur internalisation sous une forme biologiquement active. Dans ce projet, nous avons produit et purifié les protéines Oct4, Sox2, Nanog, Lin28, Klf4 et c-Myc chacune fusionnée au CPP MD. Ce domaine n'interfère pas avec la capacité d'Oct4 à lier sa séquence cible d’ADN. Le traitement in vitro de cellules primaires conduit à l’internalisation des protéines MD en 30 minutes à 1 heure. MD-Oct4 et MD-Nanog peuvent être localisés au noyau en 3 heures. Dans un contexte de reprogrammation, la combinaison de MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog et MD-Lin28 lors de traitements répétés conduit à l'activation transcriptionnelle de gènes cibles composant le réseau de pluripotence. / The generation of induced Pluripotent Stem Cell (iPSC) holds great promise for regenerative medicine, disease modelling and drug screening. Leading the original cell to an iPSC has been originally made by the forced expression of Transcription Factors (TF) involved in embryonic stem cells. Since the discovery of those mechanisms, many teams have engineered iPSC by well-defined cell culture tools such as the use of retroviruses in order to express TF. Those techniques use genetic material. Delivery techniques have evolved but most of reprogramming experiments still need TF. Development of alternative strategies has been conducted in a context of clinical application but still needs to be accepted by ethics comities. Thus, the use of recombinant proteins instead of genetic material is safe and rational but the challenge is to access the intracellular medium. In this context, our laboratory has developed a cell-penetrating peptide (CPP) based on the Epstein-Barr virus ZEBRA TF. The sequence implicated in cellular uptake has been characterized and is named MD (Minimal Domain). It is able to translocate high molecular weight proteins in an endocytosis-independent mechanism, allowing the internalization of cargos in fully biologically active form. Here we develop 6 MD fusions at the N-terminus of the following TF: Oct4, Sox2, Klf4, cMyc, Nanog & Lin28. This domain does not interfere with Oct4 capacity to associate with its own DNA sequence. Moreover, MD fused proteins transduce in vitro treated cells in 30 minutes to 1 hour ; MD-Oct4 & MD-Nanog can be localized in the nucleus after 3 hours only. In a context of reprogramming experiences, the combination of MD-Oct4, MD-Sox2, MD-Nanog and MD-Lin28 in repeated treatment leads to the activation of target genes transcription such as those constituting the pluripotency network.

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) partagent avec les cellules souches embryonnaires la capacité à se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme, mais leur obtention ne nécessite pas l'utilisation d'embryons. Elles sont générées par la surexpression de facteurs de transcription embryonnaires au sein de cellules somatiques. Les iPS représentent un outil de choix en biologie fondamentale et appliquée ainsi qu'en médecine régénérative.La plupart des protocoles de génération d'iPS reposent sur un transfert des séquences nucléotidiques codant les facteurs de transcription embryonnaires impliqués dans la mise en place du réseau de pluripotence. Bien qu'efficaces, ces méthodes présentent des problèmes de sécurité majeurs, incompatibles avec une utilisation clinique des iPS générées. La voie la plus rationnelle pour produire des iPS de manière parfaitement sécurisée est d'apporter les facteurs exogènes directement sous leur forme protéique. Des protocoles de reprogrammation par transfert de protéines ont été récemment développés, mais les efficacités associées sont relativement faibles et les protocoles relativement fastidieux.L'objectif de ce projet de thèse était de mettre au point une nouvelle approche de transfert de protéines, sécurisée et simplifiée, pour la génération de cellules souches pluripotentes induites utilisables en clinique. Les cellules à reprogrammer ont été choisies en fonction des applications potentielles des iPS générées : (i) les fibroblastes, faisant référence dans la bibliographie et permettant d'envisager des thérapies autologues avec notamment de nombreuses applications en hématologie ; (ii) les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, l'un des matériaux biologiques les plus sûrs, afin de générer des globules rouges in vitro, dans la perspective de répondre aux demandes croissantes en terme de transfusion, en particulier pour les groupes sanguins rares.Nous avons donc comparé les différents vecteurs de transduction de protéines développés par l'équipe TheREx du laboratoire TIMC-IMAG, en termes de facilité de production, d'efficacité de transfert ainsi que sur l'activité des facteurs de transcription associés. Le vecteur sélectionné est une micro-seringue naturelle portée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, capable d'injecter les facteurs Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 (facteurs de Thomson) mais aussi c-Myc, directement dans le cytoplasme des cellules cibles, sans étape de purification nécessaire. Les facteurs de transcription injectés sont adressés jusqu'au noyau des cellules en moins de 2h, où ils activent rapidement la transcription des gènes de pluripotence, avec des réponses significatives mesurées dès 24h après injection. Nous avons également mis en évidence le caractère sécurisé et contrôlable du vecteur puisque nous sommes capables d'éliminer complètement les bactéries des cultures grâce à un traitement antibiotique, et ce dès quelques heures après l'injection. Des optimisations des conditions de reprogrammation ont été réalisées en modifiant les principaux paramètres que sont, le choix des facteurs de transcription, la fréquence des injections et le ratio bactéries : cellules.Ainsi, bien que nous ne soyons pas parvenus à générer des iPS à ce jour avec ce système, la micro-seringue naturelle que nous avons développé et optimisé se positionne comme un vecteur de choix pour le transfert de protéines dans l'optique de générer des iPS, en termes d'efficacité de vectorisation et d'induction transcriptionnelle, de sécurité mais aussi de facilité d'utilisation. / Like embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS) are characterized by their ability to differentiate into any cell type in an organism. However their use doesn't raise the ethical issue linked to the use of embryos. iPS are generated from somatic cells by overexpression of embryonic transcription factors. iPS are thereby very promising in fundamental and applied biology as well as for regenerative medicine.Most of the protocols used to generate iPS are based on the delivery of nucleic acid sequences encoding embryonic transcription factors responsible for the activation of the pluripotency gene network. In spite of their efficiency, these methods are associated with major safety concerns incompatible with clinical applications. The more rational path to safely produce iPS is to deliver the exogenic transcription factors under their protein form. Recently some protocols using protein delivery have been developed to produce iPS. However associated efficiencies are very low and protocols are quite fastidious.The aim of this Ph.D. project was to develop a new efficient and simplified protein delivery method for the safe generation of iPS compatible with clinical applications. Cell sources were selected depending of the final applications of iPS: (i) fibroblasts, extensively used and described in bibliography and allowing autologous therapies with many applications in the field of hematology; (ii) cord blood hematopoietic stem cells, one of the safest biomaterials, with the aim to generate red blood cells in vitro in order to respond to increasing needs for transfusion products, particularly for rare blood types.First, different protein vectors developed by the TheREx team of the TIMC-IMAG laboratory were compared for their efficiency of production and delivery as well as for the activity of associated factors. The selected vector is a natural micro-syringe expressed by Pseudomonas aeruginosa, able to inject the transcription factors Oct4, Sox2, Nanog and Lin28a (Thomson combination) with c-Myc directly into the cytoplasm of target cells, without the need for any purification step. Once injected, transcription factors are addressed to the nucleus in less than 2 hours where they efficiently activate transcription of pluripotency genes, with significant responses observed as early as 24h after injection. We also highlighted the secured and controllable nature of this vector by completely eliminating the bacteria from the cultures in a few hours after injection with an antibiotic treatment. Optimizations of the reprogramming conditions were also made by adjusting many parameters such as the combination of transcription factors, the injection frequency and the bacteria : cell ratio.