Xanthomonas fuscans subsp. fuscans (Xff) est l'un des agents responsables de la graisse commune de haricot, bactériose transmise par les semences. A partir d'une semence contaminée, cet agent pathogène colonise les parties aériennes de son hôte sur la totalité d'un cycle cultural sans enclencher de processus infectieux ; cela aboutit finalement à sa transmission à la graine. Les objectifs de cette thèse ont été d'identifier des déterminants moléculaires de Xff et de caractériser leur rôle dans trois étapes clés de la colonisation asymptomatique du haricot. Deux types de gènes candidats ont été identifiés chez Xff : des gènes induits in planta codant le système de sécrétion de type trois (SST3) et ses effecteurs, des gènes impliqués dans les processus d'adhésion aux surfaces et de formation des biofilms.Contrairement à la phyllosphère, la graine de haricot en germination et les jeunes plantules ne constituent pas des environnements limitant pour la multiplication bactérienne. L'absence d'induction de réactions de défense à cette étape laisse penser que les bactéries se comportent en saprophytes sans dialogue moléculaire avec la plante. La survie de Xff dans la phyllosphère du haricot dépend partiellement des régulateurs HrpG et HrpX du SST3 ; la colonisation active et la transmission aux graines par la voie vasculaire nécessitent quant à elle un SST3 fonctionnel. En situation incompatible non-hôte, X. campestris pv. campestris et ses mutants du SST3 survivent et se transmettent à la graine de haricot, mais peu fréquemment et avec de faibles tailles de populations. Les six adhésines identifiées chez Xff interviennent toutes lors de la colonisation de la phyllosphère ou pour la transmission à la graine de haricot par la voie vasculaire. La transmission à la graine par la voie florale est une voie plus générale, régulée seulement partiellement par HrpG et HrpX.

La pathogénicité de P. aeruginosa (P. a) repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3). Ce complexe multiprotéique est constitué d'une aiguille se terminant par un translocon composé des protéines PopB et PopD. En s'insérant dans les membranes plasmiques, le translocon permet le passage des exotoxines dans le cytoplasme de la cellule cible. L'induction de la synthèse et de la sécrétion des exotoxines est dépendante d'un contact entre P. a et la cellule cible. Dans ce travail, nous avons examiné l'influence de facteurs cellulaires sur l'efficacité de translocation des toxines. L'utilisation d'un système rapporteur fluorescent CCF2/β-lactamase a permis de visualiser l'injection de toxine. En parallèle, l'association des protéines du translocon avec la membrane de la cellule hôte a été évaluée par immunodétection de PopB/D après fractionnement des membranes sur gradient de sucrose. Les cellules promyelocytaires HL-60 et promonocytaires U937 sont résistantes à l'injection de toxine, bien que PopB et PopD soient associées à la membrane. Après différenciation en neutrophiles, or monocytes/macrophages, ces cellules deviennent sensibles à l'injection sans que l'on détecte de variation notable de la quantité de protéines du translocon insérées dans la membrane. Le traitement des cellules HL-60 sensibles avec un agent déplétant le cholestérol, entraine une diminution de l'injection de toxine. De plus, la protéine PopB est retrouvée dans la fraction membranaire, obtenue par purification sur gradient de sucrose, contenant le marqueur des radeaux lipidiques flotilline. Par une approche pharmacologique, nous apportons la preuve que, en plus de la composition de la membrane, des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la polymérisation de l'actine sont essentielles pour la formation d'un pore fonctionnel. / The pathogenesis of Pseudomonas aeruginosa (P.a) implies multiple virulence factors among which the type III secretion system (T3SS). This multiprotein complex is composed of a needle through which four exotoxins are exported. The protein PopB and PopD form an oligomeric structure (translocon) at the end of the needle that inserts into the host cell membrane and translocates the exotoxins into the cytoplasm. Synthesis and toxin secretion is induced on contact with eukaryotic cell. In this work, we examined the influence of host cell elements on exotoxin translocation efficiency. The delivery of T3SS toxins was investigated using a CCF2/β-lactamase fluorescent reporter system In parallel, the association of translocon proteins with host plasma membranes was evaluated by immunodetection of PopB/D following sucrose gradient fractionation of membranes. Promyelocytic HL-60 cells and promonocytic U937 cells were found to be resistant to toxin injection even though PopB/D associated with host cell plasma membranes. Differentiation of these cells to neutrophil- or macrophage-like cells resulted in an injection-sensitive phenotype without any significant change in the level of membrane-inserted translocon proteins. Treatment of sensitive HL-60 cells with a cholesterol-depleting agent, resulted in a diminished injection of toxin. Moreover, the PopB translocator was found in the membrane fraction obtained from sucrose-gradient purifications and containing lipid-raft marker flotillin. Through a pharmacological approach, we brought evidence that, in addition to membrane composition, some general signalling pathways involved in actin polymerization may be critical for the formation of a functional pore.

La pathogénicité de P. aeruginosa (P. a) repose sur de nombreux facteurs de virulence dont le système de sécrétion de type III (SST3). Ce complexe multiprotéique est constitué d'une aiguille se terminant par un translocon composé des protéines PopB et PopD. En s'insérant dans les membranes plasmiques, le translocon permet le passage des exotoxines dans le cytoplasme de la cellule cible. L'induction de la synthèse et de la sécrétion des exotoxines est dépendante d'un contact entre P. a et la cellule cible. Dans ce travail, nous avons examiné l'influence de facteurs cellulaires sur l'efficacité de translocation des toxines. L'utilisation d'un système rapporteur fluorescent CCF2/β-lactamase a permis de visualiser l'injection de toxine. En parallèle, l'association des protéines du translocon avec la membrane de la cellule hôte a été évaluée par immunodétection de PopB/D après fractionnement des membranes sur gradient de sucrose. Les cellules promyelocytaires HL-60 et promonocytaires U937 sont résistantes à l'injection de toxine, bien que PopB et PopD soient associées à la membrane. Après différenciation en neutrophiles, or monocytes/macrophages, ces cellules deviennent sensibles à l'injection sans que l'on détecte de variation notable de la quantité de protéines du translocon insérées dans la membrane. Le traitement des cellules HL-60 sensibles avec un agent déplétant le cholestérol, entraine une diminution de l'injection de toxine. De plus, la protéine PopB est retrouvée dans la fraction membranaire, obtenue par purification sur gradient de sucrose, contenant le marqueur des radeaux lipidiques flotilline. Par une approche pharmacologique, nous apportons la preuve que, en plus de la composition de la membrane, des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans la polymérisation de l'actine sont essentielles pour la formation d'un pore fonctionnel.

Shigella est l'agent causal de la shigellose, une maladie à transmission oro-fécale, et responsable d'une grande partie des cas diarrhéiques dans les pays en voie de développement. L'infection par Shigella résulte en la colonisation et l'inflammation de la muqueuse colique. Sa virulence est liée à son Système de Sécrétion de Type 3 (SST3) qui agit comme une "seringue" moléculaire pour l'injection des protéines directement dans le cytoplasme de la cellule hôte, via un pore de translocation, provoquant la subversion de sa physiologie et l'internalisation de la bactérie. Le SST3 est composé d'un bulbe cytoplasmique, d'un corps basal et d'une aiguille extracellulaire assemblée suite à la polymérisation hélicoïdale des sous-unités MxiH, formant ainsi un canal qui permet le transit des substrats du SST3. L'extrémité de l'aiguille comprend les translocateurs IpaBCD qui constituent le complexe d’extrémité. IpaD module l'insertion membranaire des protéines hydrophobes IpaB et IpaC, qui forment le pore de translocation, et prévient, avec IpaB, la sécrétion prématurée des effecteurs avant le contact cellulaire. La sécrétion est également contrôlée à la base du SST3 par la protéine cytoplasmique MxiC qui perçoit le contact cellulaire par un signal transmis à travers l'aiguille. Ces deux dispositifs de contrôle participent à l'établissement d'une hiérarchie de sécrétion entre translocateurs, effecteurs précoces et tardifs. <p>Lors de cette étude, nous avons essayé de mieux comprendre le fonctionnement du SST3 en ciblant la protéine IpaD. Des variants obtenus par délétions de 10 acides aminés (Schiavolin, 2013) et par mutations ponctuelles (Meghraoui, 2014) d’IpaD ont été générés pour caractériser leurs effets sur l'exposition à la surface des translocateurs, le contrôle de sécrétion, la formation du pore de translocation, et enfin l'invasion cellulaire. Nos résultats ont permis d’identifier trois phénotypes correspondant à i) une sécrétion contrôlée, similaire à la souche sauvage, ii) une sécrétion constitutive de tous les substrats, et iii) un phénotype de sécrétion intermédiaire. Les variants par délétions nous ont permis de comprendre l'importance de la localisation d'IpaD et IpaB à la surface pour le fonctionnement du SST3. Les variants par mutations ont révélé l'indépendance entre le contrôle de sécrétion et l’invasion cellulaire, ainsi qu’une corrélation entre la sécrétion prématurée des translocateurs/effecteurs précoces et l'augmentation de la virulence in vitro. Nous avons aussi étudié les partenaires d'interaction d'IpaD (Meghraoui, in prep) et MxiC (Cherradi, 2013) respectivement à l'extrémité de l'aiguille et à la base du SST3. L'interaction d'IpaD avec elle-même et avec MxiH a pu être montrée uniquement après délétion du domaine auto-chaperon d’IpaD. Ce domaine semble essentiel au maintien d'IpaB à l'extrémité de l'aiguille, au contrôle de sécrétion, à l'insertion du translocon, mais pas à l'invasion cellulaire. D'autre part, nous avons démontré que l'interaction entre MxiC et le composant de la tige interne MxiI participe au contrôle interne de la sécrétion. En conclusion, nos travaux contribuent à une meilleure compréhension du lien entre différents composants et fonctions du SST3 et de l'implication d'IpaD dans la régulation allostérique de la sécrétion. Ces résultats dépassent le cadre de Shigella puisque les composants étudiés dans le cadre de cette thèse sont conservés chez d’autres bactéries utilisant le SST3 comme dispositif principal de virulence./<p><p>Shigella is the causative agent of shigellosis, an oro-fecally transmitted disease, among major causes of diarrhoea in developing countries. Infection by Shigella results in the colonisation and inflammation of colonic mucosa. The virulence of this bacterium is related to a Type 3 Secretion System (T3SS) that acts as a molecular syringe to inject proteins directly into host cell cytoplasm, through a translocation pore, leading to subversion of cell physiology and bacterial internalisation. The T3S apparatus (T3SA) is composed of a cytoplasmic bulb, a basal body and an extracellular needle. The needle is assembled through the helical polymerisation of MxiH subunits that form a channel allowing the passage of T3S substrates and topped by the translocators IpaBCD (needle tip complex). IpaD is a hydrophilic protein that modulates the membrane insertion of the hydrophobic IpaB and IpaC (translocation pore) and prevents, along with IpaB, the leakage of proteins before cell contact. Secretion is also controlled at the base of the T3SA by cytoplasmic MxiC that senses cell contact through the transmission of a signal along the needle. These two control devices are involved in the establishment of a secretion hierarchy between translocators, early and late effectors.<p>In this study, we aimed to better understand the function of the T3SS by targeting the tip protein IpaD. Ten amino-acid deletion (Schiavolin, 2013) and point mutation (Meghraoui, 2014) variants of IpaD were generated to characterise their effects on translocators exposure, secretion control, pore formation and cell invasion. Three secretion phenotypes were identified and correspond to wild-type like secretion control, constitutive secretion and an intermediate secretion phenotype. Deletion variants allowed us to understand the requirement of IpaB and IpaD surface exposure for the T3SS functions. Mutation variants highlighted the uncoupling between secretion control and cell entry and the correlation between the premature secretion of translocators/early effectors and the enhanced in vitro virulence. We also studied interaction partners of IpaD (Meghraoui, in prep) and MxiC (Cherradi, 2013) at the needle tip and T3SA base, respectively. The bindings of IpaD to itself and to the needle subunit MxiH were only possible after deletion of the self-chaperoning domain. This domain was essential for the correct maintenance of IpaB at the needle tip, the secretion control, the insertion of the translocon, but not for cell entry. Besides, we showed that the interaction of MxiC with inner rod component MxiI participates in the internal control of secretion. In conclusion, these observations facilitated our understanding of the links between the different components and functions of the T3SS and the involvement of IpaD in the allosteric regulation of secretion. Our work is relevant beyond the Shigella field as genes studied here are conserved among several pathogenic bacteria using T3SS as a virulence weapon. <p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Les cellules souches pluripotentes induites (iPS) partagent avec les cellules souches embryonnaires la capacité à se différencier en tous les types cellulaires d'un organisme, mais leur obtention ne nécessite pas l'utilisation d'embryons. Elles sont générées par la surexpression de facteurs de transcription embryonnaires au sein de cellules somatiques. Les iPS représentent un outil de choix en biologie fondamentale et appliquée ainsi qu'en médecine régénérative.La plupart des protocoles de génération d'iPS reposent sur un transfert des séquences nucléotidiques codant les facteurs de transcription embryonnaires impliqués dans la mise en place du réseau de pluripotence. Bien qu'efficaces, ces méthodes présentent des problèmes de sécurité majeurs, incompatibles avec une utilisation clinique des iPS générées. La voie la plus rationnelle pour produire des iPS de manière parfaitement sécurisée est d'apporter les facteurs exogènes directement sous leur forme protéique. Des protocoles de reprogrammation par transfert de protéines ont été récemment développés, mais les efficacités associées sont relativement faibles et les protocoles relativement fastidieux.L'objectif de ce projet de thèse était de mettre au point une nouvelle approche de transfert de protéines, sécurisée et simplifiée, pour la génération de cellules souches pluripotentes induites utilisables en clinique. Les cellules à reprogrammer ont été choisies en fonction des applications potentielles des iPS générées : (i) les fibroblastes, faisant référence dans la bibliographie et permettant d'envisager des thérapies autologues avec notamment de nombreuses applications en hématologie ; (ii) les cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, l'un des matériaux biologiques les plus sûrs, afin de générer des globules rouges in vitro, dans la perspective de répondre aux demandes croissantes en terme de transfusion, en particulier pour les groupes sanguins rares.Nous avons donc comparé les différents vecteurs de transduction de protéines développés par l'équipe TheREx du laboratoire TIMC-IMAG, en termes de facilité de production, d'efficacité de transfert ainsi que sur l'activité des facteurs de transcription associés. Le vecteur sélectionné est une micro-seringue naturelle portée par la bactérie Pseudomonas aeruginosa, capable d'injecter les facteurs Oct4, Sox2, Nanog et Lin28 (facteurs de Thomson) mais aussi c-Myc, directement dans le cytoplasme des cellules cibles, sans étape de purification nécessaire. Les facteurs de transcription injectés sont adressés jusqu'au noyau des cellules en moins de 2h, où ils activent rapidement la transcription des gènes de pluripotence, avec des réponses significatives mesurées dès 24h après injection. Nous avons également mis en évidence le caractère sécurisé et contrôlable du vecteur puisque nous sommes capables d'éliminer complètement les bactéries des cultures grâce à un traitement antibiotique, et ce dès quelques heures après l'injection. Des optimisations des conditions de reprogrammation ont été réalisées en modifiant les principaux paramètres que sont, le choix des facteurs de transcription, la fréquence des injections et le ratio bactéries : cellules.Ainsi, bien que nous ne soyons pas parvenus à générer des iPS à ce jour avec ce système, la micro-seringue naturelle que nous avons développé et optimisé se positionne comme un vecteur de choix pour le transfert de protéines dans l'optique de générer des iPS, en termes d'efficacité de vectorisation et d'induction transcriptionnelle, de sécurité mais aussi de facilité d'utilisation. / Like embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPS) are characterized by their ability to differentiate into any cell type in an organism. However their use doesn't raise the ethical issue linked to the use of embryos. iPS are generated from somatic cells by overexpression of embryonic transcription factors. iPS are thereby very promising in fundamental and applied biology as well as for regenerative medicine.Most of the protocols used to generate iPS are based on the delivery of nucleic acid sequences encoding embryonic transcription factors responsible for the activation of the pluripotency gene network. In spite of their efficiency, these methods are associated with major safety concerns incompatible with clinical applications. The more rational path to safely produce iPS is to deliver the exogenic transcription factors under their protein form. Recently some protocols using protein delivery have been developed to produce iPS. However associated efficiencies are very low and protocols are quite fastidious.The aim of this Ph.D. project was to develop a new efficient and simplified protein delivery method for the safe generation of iPS compatible with clinical applications. Cell sources were selected depending of the final applications of iPS: (i) fibroblasts, extensively used and described in bibliography and allowing autologous therapies with many applications in the field of hematology; (ii) cord blood hematopoietic stem cells, one of the safest biomaterials, with the aim to generate red blood cells in vitro in order to respond to increasing needs for transfusion products, particularly for rare blood types.First, different protein vectors developed by the TheREx team of the TIMC-IMAG laboratory were compared for their efficiency of production and delivery as well as for the activity of associated factors. The selected vector is a natural micro-syringe expressed by Pseudomonas aeruginosa, able to inject the transcription factors Oct4, Sox2, Nanog and Lin28a (Thomson combination) with c-Myc directly into the cytoplasm of target cells, without the need for any purification step. Once injected, transcription factors are addressed to the nucleus in less than 2 hours where they efficiently activate transcription of pluripotency genes, with significant responses observed as early as 24h after injection. We also highlighted the secured and controllable nature of this vector by completely eliminating the bacteria from the cultures in a few hours after injection with an antibiotic treatment. Optimizations of the reprogramming conditions were also made by adjusting many parameters such as the combination of transcription factors, the injection frequency and the bacteria : cell ratio.