La méthylation des cytosines de l’ADN est un niveau de contrôle essentiel de la transcription génique. Elle joue un rôle primordial dans plusieurs étapes du développement comme l’inactivation du chromosome X et l’empreinte génomique. De plus, il est de plus en plus évident que la méthylation de l’ADN participe à la cancérogenèse. Actuellement, le monde de la méthylation de l’ADN n’en est encore qu’à l'aube de son histoire. En effet, les mécanismes moléculaires la gouvernant sont encore peu connus. La méthylation de l’ADN est caractérisée par deux concept clés : le verrouillage de la transcription des gènes et le ciblage en des régions spécifiques du génome. Au cours de notre travail de thèse de doctorat, nous avons poursuivi les avancées réalisées dans ces deux domaines. Dans un premier temps, nous nous sommes attachés à l’étude de la répression transcriptionnelle entraînée par la méthylation de l’ADN. Grâce à plusieurs études récentes, il paraît de plus en plus clair que la méthylation agit de paire avec la structure de la chromatine. Nous avons donc concentré nos recherches sur l’interconnexion de celle-ci avec deux machineries impliquées dans la régulation de son degré de compaction : la désacétylation et la méthylation des histones. Par diverses expérimentations, nous avons démontré un lien étroit entre ces machineries répressives pour l’imposition d’un état silencieux de la transcription. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons dirigé notre attention sur le ciblage des Dnmt. Pour cela, nous avons mené deux stratégies de front. La première est une approche ciblée et consiste en l’étude de l’association des Dnmt avec l’oncoprotéine bien connue, Myc. La seconde approche est plus large. Grâce à l’utilisation de la technique du double hybride en levure, nous avons identifié de nouveaux partenaires des Dnmt, dont un qui pourrait s’avéré particulièrement intéressant : le protéine Cart1 (cartilage homeoproteine 1) impliquée dans le développement du système nerveux central. En conclusion, notre travail de doctorat devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la méthylation de l’ADN ainsi que son implication dans les divers processus physiologiques mais aussi pathologiques auxquels elle participe.

Dans une première partie du travail, nous nous sommes intéressés à l'effet de l'acrylamide sur la tumorigénèse thyroïdienne. En effet des chercheurs suédois avaient récemment attiré l’attention de la communauté scientifique sur la présence de ce xénobiotique dans des denrées alimentaires couramment utilisées. Des études antérieures avaient montré que l’acrylamide, administré chroniquement à des rats pendant deux ans, induisait des tumeurs parmi lesquelles les tumeurs thyroïdiennes étaient les plus fréquentes. Pour ces raisons l’acrylamide est considéré comme une substance potentiellement cancérigène pour l’homme. Nous avons voulu investiguer les mécanismes d’action possibles de l’acrylamide dans la tumorigénèse thyroïdienne avec un modèle in vitro et ensuite un modèle in vivo. Dans le modèle in vitro, nous avons d’abord testé l’effet de l’acrylamide sur les propriétés caractéristiques de la thyroïde, qui pourraient expliquer la spécificité de cette substance pour ce tissu. Dans un premier temps, nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur l’accumulation d’AMPc (médiateur de la croissance) et sur la génération d’H2O2 potentiellement cancérigène mais nous avons montré qu’aucun de ces deux paramètres n’est modulé suite au traitement des cellules thyroïdiennes. Nous avons ensuite montré que l’acrylamide n’avait pas d’effet sur la prolifération dans les lignées thyroïdienne de rat, un facteur qui aurait pu expliquer l’effet tumorigène de l’acrylamide mais pas sa spécificité thyroïdienne. Nous avons enfin testé en utilisant l’essai comète la capacité de l’acrylamide à générer des cassures au niveau de l’ADN. Ceci nous a permis de montrer que l’acrylamide était capable d’induire des cassures dans l’ADN de lignées thyroïdiennes de rat ainsi que dans des cultures primaires de thyroïde humaines, de chien et de mouton. Afin de déterminer que l’effet observé sur l’ADN était dû à des cassures double brin, nous avons utilisé une technique de détection de l’histone H2AX phosphorylée. En effet, la phosphorylation de cette histone se produit lorsque des cassures d’ADN double brin sont présentes. Les résultats obtenus ne soutiennent pas l’hypothèse que l’acrylamide provoque des cassures double brin. Néanmoins ces dommages à l’ADN sont susceptibles d’induire des mutations qui peuvent jouer un rôle dans le processus de tumorigénèse de l’acrylamide. Nous avons donc testé l’effet de l’acrylamide sur un modèle in vivo. Pour cela nous avons traité des souris avec de l’acrylamide additionné à l’eau de boisson à des doses comparables à celles administrées aux rats pendant 2, 6 ou 8 mois. Ce traitement a également été combiné avec de la thyroxine (T4) afin de mettre la thyroïde au repos ou avec du méthimazole qui inhibe la sécrétion des hormones thyroïdiennes et par conséquent induit la sécrétion de TSH, ce qui a pour effet de stimuler la glande. Ces traitements modérés ont eu les effets attendus au niveau des taux de TSH et de T4 circulants ainsi que sur la morphologie de la glande. L’acrylamide a eu de faibles effets sur le système nerveux périphérique traduit par une paralysie des membres postérieurs. Par contre nous n’avons pas observé d’apparition de tumeurs dans la thyroïde des souris. La cible thyroïdienne de l’acrylamide chez le rat semble donc spécifique de l’espèce et jette un doute sérieux sur un rôle cancérigène potentiel chez l’homme au niveau thyroïdien. Dans une deuxième partie, nous avons investigué la réexpression de certains gènes thyroïdiens dans des lignées cancéreuses humaines. En effet nous avons montré au sein du laboratoire que la plupart des lignées thyroïdiennes les plus utilisées avaient perdu les gènes de différentiation spécifiques de la thyroïde. Pour cela nous avons utilisé des agents capables de modifier soit la méthylation de l’ADN comme la 5-aza-2’-déoxycytidine (5-AzadC) soit la compaction de la chromatine comme la trichostatine A (TSA), ce qui a pour conséquence de moduler le niveau d’expression des gènes. Ces traitements ont été utilisés à différentes concentrations, différents temps, seuls ou en combinaison. La 5-AzadC, utilisée seule a permis de réexprimer fortement les gènes Duox1 et Duox2 et faiblement NIS. En combinaison avec la TSA et la forskoline (un activateur de la voie AMPc), nous avons montré une forte réexpression de NIS mais au stade actuel de notre étude celui-ci n’est pas fonctionnel. Ceci montre que les agents modifiant la chromatine peuvent influencer l’expression des gènes de différenciation, cependant nous devons investiguer de façon plus large les différents agents ainsi que les conditions de culture pouvant mener à la réexpression d’un NIS fonctionnel. Grâce à ce traitement différenciant, qui permettrait un rétablissement du transport de l’iodure, un traitement par l’I131 des cancers indifférenciés de la thyroïde pourrait être réenvisagé.

Analyser les modalités de l'interaction des virus neurotropes avec leurs cellules cibles représente un défi majeur, cela pourrait favoriser notre compréhension de la physiopathologie de certains troubles neurologiques dont l'origine virale est parfois suspectée. Le Bornavirus (BDV), un virus neurotrope, représente un modèle idéal pour analyser les mécanismes moléculaires de la persistance virale dans les neurones et en étudier les conséquences sur l'homéostasie neuronale. Au cours de ma thèse, nous avons découvert une nouvelle forme d'interaction virus/cellule dans laquelle une protéine du BDV perturbe la signalisation épigénétique associée à l'acétylation des histones. Cette perturbation de l'acétylation des histones cellulaires est accompagnée d'une modulation de la réplication virale qui permettrait de favoriser la persistance du BDV dans les neurones tout en limitant les dommages cellulaires associés, démontrant ainsi la parfaite adaptation du BDV à sa cellule hôte. / In response to various environmental stimuli, neurons undertake specific cognitive functions, such as learning and memory. Many studies have shown that epigenetics, notably histone acetylation, is crucial for the regulation of gene expression involved in these processes. Moreover, dysregulation of signaling pathways that regulate epigenetics is clearly recognized as a main actor in the pathogenesis of several neurological disorders. Even if the origin of these disorders is sometimes genetic, their etiology remains elusive and environmental factors are also suspected. In particular, infectious agents are considered as serious candidates, notably for viruses that persist in the central nervous system (CNS). The Bornavirus (BDV) constitutes an interesting model to assess the impact of viral infection on neuronal epigenetics. This non-cytolytic RNA virus infects neurons of the CNS and causes various cognitive disorders in animals. It has the remarkable property to replicate in the nucleus, in close association with chromatin, thus leading to our working hypothesis that it may modify the epigenetics of infected neurons. During my Ph.D., we used primary cultures of cortical neurons to demonstrate that BDV infection decreases H2B and H4 acetylation levels on selected lysine residues, through inhibition of histone acetyltransferase (HAT) activities. We also showed that the viral phosphoprotein was responsible for this perturbation, acting on histone acetylation and HAT activities in a protein kinase C dependent manner. Finally, using pharmacological agents, we observed that histone acetylation levels were correlated with replication of BDV. Thus, BDV action on histone acetylation pathway may represent an original mechanism to control viral replication, thereby favoring long-term persistence in neurons. I am currently examining the consequences of this virus-mediated perturbation on H2B/H4 acetylation at the genome scale, using ChIP-sequencing experiments.

Les protéines du groupe Polycomb (PcG) ont initialement été identifiées chez la drosophile comme répresseurs transcriptionnels des gènes homéotiques. Aujourd’hui, nous savons que ces protéines jouent un rôle bien plus large puisqu’elles régulent des gènes dont les produits sont impliqués dans de nombreux processus biologiques (régulation des gènes HOX, maintien de la plasticité des cellules souches, la différenciation cellulaire, l’inactivation du chromosome X, la régulation des gènes soumis à empreintes). Leur dérégulation est source de nombreux cancers chez l’homme. Hautement conservées, elles forment deux principaux complexes : PRC 1 et 2 (Polycomb repressive complex 1 and 2), dont l’activité est respectivement reflétée par la mono-ubiquitinylation de la lysine 118 l’histone H2A (H2AK118Ub) et la tri-méthylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27me3). Chez la Drosophile, les sites de fixation de ces complexes sont appelés PRE (Polycomb Responsive Elements) où ils sont recrutés via des facteurs de transcription (FT).La complexité du recrutement des complexes du PcG, chez la Drosophile comme chez les mammifères, est visible à différents niveaux : au niveau de la séquence même de leurs sites de fixations, au niveau des facteurs de transcription qui les recrutent, au niveau de l’interface entre les deux complexes PRC1 et PRC2 et enfin au niveau global, part le présence de ces complexes au niveau de sites transcriptionnellement actifs. L’ensemble de ces résultats démontre clairement la nature hétérogène des PRE. Ces derniers diffèrent non seulement par leur séquence, mais également par les FT qui les recrutent et enfin par la manière dont les complexes PcG sont recrutés (PRC2 recrute PRC1 ou le contraire). Mon projet de thèse s’est donc dessiné autour d’une hypothèse : il existe différentes classes de PRE chez la Drosophile. Mon travail a donc consisté à définir ces différentes classes et à les caractériser pour en déduire des rôles spécifiques à l’échelle génomique. En effet, l’implication des complexes du PcG dans l’apparition de cancer chez l’Homme requière que l’on comprenne comment ces protéines sont recrutées à la chromatine.Mes travaux de thèse ont permis d’identifier six classes différentes de sites de fixation aux protéines du PcG. Nous avons retrouvé une classe correspondant aux sites de fixations canoniques fixés par les protéines du PcG et présents au sein de larges domaines répressifs marqués par H3K27me3. Une seconde classe correspond à des éléments de régulation marqués par un état de pause transcriptionnelle. De façon surprenante, nous avons démontré qu’une grande partie des sites de fixation des complexes du PcG était localisée au niveau de régions transcriptionnellement actives. Ces classes de PRE diffèrent en particulier en éléments génomiques qui les composent. Deux classes correspondent à des enhancers développementaux. Une classe correspond à des promoteurs actifs pouvant réguler des gènes de ménage. Enfin, une dernière classe correspond à des bordures de TAD. Les sites actifs et réprimés fixés par le PcG fixent également des combinaisons différentes de FT. Des analyses in vivo associées à un transcriptome réalisé à partir de cellules mutantes pour une protéine du PcG révèlent que les complexes du PcG jouent également un rôle de répresseur transcriptionnel au niveau des sites actifs. L’ensemble de ces résultats suggère une hétérogénéité inattendue des sites de fixation des complexes du PcG et permettra de mieux comprendre les caractéristiques liées à ces protéines dont la dérégulation mène à l’apparition de cancers chez l’Homme marqués par leur agressivité. / Polycomb group (PcG) complexes were initially discovered in Drosophila as transcriptionnal repressors of homeotic genes. To date, we know that they are involves in a large pleithora of biological processes including the maintenance of stem cells plasticity, differentiation, X chromosome inactivation and imprinting. PcG complexes are highly conserved from Drosophila to Humans and can be divided into two main complexes: PRC1 and PRC2 (Polycomb repressive complex 1 and 2). Both complexes have a histone modifying activity: PRC1 catalyses the mono-ubiquitination of the lysine 118 on histone H2A (H2AK118Ub) and PRC2 catalyses the tri-methylation of the lysine 27 on histone H3 (H3K27me3).In Drosophila, these complexes are recruited to cis regulatory elements named Polycomb Responsive Elements (PREs) that drive the epigenetic inheritance of silent chromatin states throughout development. Importantly, PcG complexes do not contain DNA-binding activity but are recruited to PREs via their interaction with Transcription Factors (TF) recognizing DNA motifs clustered at PREs. However the mechanism how PREs target PcG complexes is still not well understood due to the complexity of PcG recruitment, which is reflected at different levels: The DNA signature between PREs can differ significantly and several TF are implicated in PcG recruitment, but none of them is sufficient to recruit PcG complexes to PREs. Moreover PcG complexes can cooperate in different ways to stabilize each other’s binding. Finally, another layer of complexity is found at a more global level since PcG complexes do not only bind repressed sites, but they are also found at active regions.Therefore, our working hypothesis is that different classes of PREs exist in Drosophila. My PhD work was thus to define these different classes of PREs on a genome-wide scale and to functionally characterize them in order to get a complete molecular description of PRE function. Understanding how PcG complexes are recruited is of high importance, since deregulation of both, PcG complexes and their recruiting factors can led to cancer and diseases. My work led to the identification of six different classes of PREs that are characterized by different chromatin and genomic features. Interestingly the majority of PREs are associated with active genes that can be divided into housekeeping regulatory regions and developmental enhancers. In addition another class comprises bona fide chromatin domain boundaries. On the other hand PREs associated with repressed chromatin states shows features of previously described PREs and associate with repressed genes and PcG-associated histone marks. Finally another class comprises PREs that are likely in a poised chromatin state. We further demonstrated that PREs located at repressed and active regions differ in their combination of TF. In vivo analyses along with a transcriptomic analysis performed in cell lines mutated for a member of PcG complexes revealed that PcG complexes play a repressive role at both, active and repressed PREs.Taken together, our result suggest an unexpected heterogeneity of PREs and contributes to the better understanding of their characteristics and function.

Cette thèse est axée en deux parties :une première partie explorant la dérégulation d’une modification épigénétique localisée sur l’ADN tandis que la seconde porte sur une modification des ARN messagers. Ces deux modifications sont étudiées dans le cadre du cancer du sein. La première partie concernant l’hydroxymethylation de l’ADN décrit l’influence de l’infiltration immune sur l’expression de l’enzyme TET1, responsable de l’ajout de cette modification. En effet, notre étude met en évidence une anti-corrélation entre l’expression de TET1 et l’infiltration immune (via IHC et analyses in silico). De plus, nous démontrons que l’activation de la voie de signalisation NF-B dans le cancer du sein « basal-like » réduit l’expression de TET1. Finalement, nous avons pu mettre en évidence, grâce à plusieurs expériences dont de l’immunoprécipitation que cette régulation se déroulait (au moins en partie) via liaison d’NF-B au promoteur de TET1. Dans le but d’élargir notre model à d’autres cancers, nous avons pu également observer cette anti-corrélation et l’effet de NF-B dans les cancers de la thyroïde, du poumon et de la peau. Avec le développement récent de l’immunothérapie, ce lien entre modification épigénétique et immunité pourrait s’avérer intéressant à exploiter. La seconde partie décrit quant à elle la dérégulation de la modification m6A dans le cancer du sein en général et non plus dans un sous-type particulier. Nous avons non seulement été en mesure de décrire une accumulation de la marque dans les tissus cancéreux mais également de proposer une cause et une conséquence à cette dérégulation. En effet, cette augmentation de la présence d’m6A (observée par spectrométrie de masse) serait causée par la baisse d’expression d’une enzyme responsable de sa suppression (l’enzyme FTO). Cette dérégulation, en agissant directement sur les ARNm de la voie de signalisation WNT comme le montre notre m6A-seq, active d’avantage la voie. Cette suractivation des WNT entraine alors une transition épithélio-mésenchymateuse des cellules, étape importante dans le développement de métastases. Ainsi, les patientes présentant une tumeur à basse expression de FTO pourraient être plus sujettes à des récurrences tumorales. Nous avons également observé cette même régulation dans d’autres cancers comme celui de la prostate, à la fois in vitro, in vivo et in silico. De plus, notre recherche met également en évidence une plus grande sensitivité de ces tumeurs à un inhibiteur des WNT. En effet, nos expériences de xénogreffes soulignent que des tumeurs avec peu de FTO, traitées avec l’inhibiteur des WNT ICRT-3, sont bien moins actives et grandes que les tumeurs contrôle et développent moins de métastases. Mesurer la quantité d’FTO tumorale pourrait donc en théorie permettre une meilleure discrimination des patientes pour de tels traitements. Ces deux projets ont pour but d’améliorer notre compréhension de l’épigénétique dans le cancer du sein et ainsi proposer de potentielles implications thérapeutiques.This thesis is divided in two parts: the first part explores the dysregulation of an epigenetic modification localized on DNA and the second part is centred on a mRNA modification. These two marks are being studied in the context of breast cancer (BC). The first part describes the influence of immune cell infiltration on the expression of the TET1 enzyme, which is responsible for the addition of hydroxymethylation to DNA. Our study indeed first describes an anti-correlation between TET1 expression and immune infiltration (through both IHC and in silico analysis). In addition, we show that NF-B pathway activation in « basal-like » breast cancer cells downregulates TET1 expression. Finally, we highlighted through several experiments including immunoprecipitation, a TET1 promoter binding of NF-B. In an effort to generalize our data to other cancers, we also investigated this anticorrelation and the NF-B regulation in several cancers. Our results indicate that this immune related regulation also occurs in lung, thyroid and skin cancers. With the increasing use of immunotherapy as anti-cancer treatment, this link between an epigenetic modification and immunity might be interesting to explore. The second part focuses on the dysregulation of the m6A modification in breast cancer in general. We describe an accumulation of m6A in cancerous tissues and we further unravel cause and consequence of this dysregulation. Indeed, we show that this increase of m6A observed by mass spectrometry correlates with the downregulation of an enzyme (FTO), which is responsible for the removal of this mark. In addition, we observed with TCGA data that this downregulation occurs in multiple cancers such as prostate or lung cancers. Our results indicate that this dysregulation activates the WNT pathway through interaction with WNT related mRNAs (identified by our m6A-seq). This overactivation (observed with TOP FOP, IHC and western blot assays) promotes epithelialmesenchymal transition (EMT) which is essential in the development of metastasis. Consistent with this, we observed that patients with low FTO expressing breast tumors are more prone to tumor progression and recurrence. Moreover, we were able to generalize our data to other cancers including prostate cancer both through in vitro, in vivo and in silico data. Finally, our research also shows a greater sensitivity of FTO-low tumors to WNT inhibition. Indeed, our mice xenografts experiments showed that FTO-low tumors treated with the WNT inhibitor ICRT-3 are less metabolically active, smaller than controls and develop less metastasis. Measuring the amount of FTO in tumors could therefore allow for the stratification better of breast cancer patients for WNT inhibition therapy. Both projects aim to improve our understanding of the role of epigenetics in breast cancer and thus propose potential therapeutic implications. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques (Médecine) / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’étude du contrôle de l’expression des gènes a été, au cours de ces dernières années, révolutionnée par la découverte des régulations épigénétiques. Parmi les différents acteurs participant à ces régulations se trouvent les protéines du groupe Polycomb (PcG). Ces protéines, initialement découvertes chez la drosophile, sont responsables de la mise en place et du maintien de "marques épigénétiques" au niveau de gènes cibles, qui sont alors réprimés. Les protéines PcG agissent sous forment de trois complexes dinstincts chez les animaux nommés PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) et PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex); le PRC2 possédant une activité histone méthyltransférase de type H3 K9/27. Chez les plantes, seules trois classes de protéines PcG sont retrouvées: la classe des Enhancer of zeste E(z), des Extra Sex Combs (ESC) et des Supressor of zeste 12 (Su(z)12), formant le complexe PRC2. Leur rôle dans le développement des plantes a été mis en évidence chez Arabidopsis, au niveau du gamétophyte femelle et de la graine, du maintien de l’état végétatif, de l’identité florale et de la vernalisation. Cependant leur implication dans le développement du fruit reste inconnue. Mon travail a permis d'identifier et de caractériser deux gènes PcG de la classe des E(z) de tomate exprimés dans le fruit, nommés SlEZ1 et SlEZ2. Les proteines SlEZ1 et SlEZ2 présentent l’ensemble des domaines caractéristiques des protéines de cette classe et sont localisées dans les noyaux. Les expériences de double hybride révèlent que les protéines SlEZ1 et SlEZ2 sont capables de former des complexes de type PRC2 avec certaines autres protéines PcG de tomate (de type ESC et Su(z)12). Ceci suggère que SlEZ1 et SlEZ2 sont effectivement des protéines fonctionnelles. L’analyse de des profils d’expression des gènes SlEZ1 et SlEZ2 révèle une expression ubiquitaire dans la plante au niveau de l’appareil végétatif, de la fleur et dans le fruit. Cependant, dans la fleur, seul SlEZ1 présente une expression dans les étamines tandis que les ARNm de SlEZ2 sont présent de façon spécifique dans le tissu de transmission du style. Dans le fruit, SlEZ1 est exprimé de façon constante, tandis que SlEZ2 semble faiblement exprimé dans les fruits en cours de mûrissement. Afin d’identifier la fonction de SlEZ1 dans le développement du fruit, des plantes transgéniques sous-exprimant SlEZ1 de façon constitutive ont été générées. Elles présentent une morphologie altérée de la fleur: les étamines sont torsadées et ne forment pas de cône staminal fermé. De plus, une augmentation du nombre moyen de carpelles par fruit est observée. / The control of gene expression has been challenged by the discovery of epigenetic regulation. Among the different factors involved in epigenetic regulations, the Polycomb (PcG) proteins are known to repress gene expression by setting epigenetic marks. The PcG protein, initially discovered in drosophila, act together in three distinct complexes named PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) and PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex). PRC2 complexes methylate histone H3 on lysines K9/27. In plants, only three classes of PcG protein has been found: the Enhancer of zeste (E(z)) class, the Extra Sex Combs (ESC) class and the Supressor of zeste 12 (Su(z)12) class, which belong to the PRC2. Their function in plant development has been brought to light in Arabidopsis thaliana. They control female gametophyte and seed development, maintain the vegetative development, and are involved in floral identity and vernalization. However, their function in fruit development is still unknown. My work was aimed to identify and characterize two PcG genes, named SlEZ1 and SlEZ2, encoding tomato E(z) class proteins. SlEZ1 and SlEZ2 proteins contain all the five E(z) characteristic domains and are both localized in the nucleus. Furthermore, as double-hybrid experiments reveal that both SlEZ1 and SlEZ2 proteins are able to form PRC2 complexes and interact with PcG proteins of other classes (ESC and Su(z)12 classes), it seems that these proteins are functional. Their expression profiles reveal ubiquitous expression during vegetative development (leaves, buds, stems) and reproductive development (flowers and fruits). However SlEZ1 is specifically expressed in the stamens whereas SlEZ2 shows specific expression in the transmitting tissue of the style. Moreover, their expression during fruit development shows some differences: if SlEZ1 expression is almost constant, SlEZ2 expression decreases during fruit development. In order to indentify SlEZ1 functions in fruit development, transgenic plants underexpressing constitutively SlEZ1 have been generated. These plants present altered flower morphology with twisted stamens and increased carpel number fruits.

Les protéines du groupe Polybomb (PcG) sont conservées de la drosophile jusqu’à l’homme et assurent la « mémoire cellulaire » d’un état transcriptionnel réprimé au cours du développement. Un modèle a été proposé pour expliquer leur fonctionnement, qui propose que les deux principaux complexes, PRC1 et PRC2 (Polycomb Repressive Complexes 1 & 2), sont recrutés ensemble au niveau de séquences spécifiques appelés PREs (Polycomb Responsive Elements) où ils collaborent pour maintenir la chromatine dans un été réprimé.Au cours de ma thèse, j’ai voulu tester ce modèle en utilisant les disques imaginaux d’œil-antenne de drosophile, qui sont des structures larvaires préfigurant l’œil adulte. Étonnamment, alors que les mutants PRC1 et PRC2 présentent des phénotypes similaires dans l’embryon, seuls les clones mutants PRC1 présentent une transformation néoplasique et une surcroissance dans l’œil. Pour comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent ce découplage fonctionnel, nous avons réalisé des ChIP-Seq contre plusieurs marques d’histones actives et répressives, ainsi que contre des protéines du PcG. La comparaison de ces ChIP-Seq avec les profils embryonnaires a d’abord révélé un redéploiement majeur du PRC1 au stade larvaire, sur environ 1000 promoteurs actifs. Cette nouvelle classe de cibles, que nous avons appelée « Neo-PRC1 », se trouve au niveau de gènes actifs où la marque H3K27me3 normalement déposée par le PRC2 est remplacée par la marque active H3K27Ac. Ces gènes sont impliqués dans la régulation de la polarité, la prolifération ou encore la signalisation cellulaires, et un nombre substantiel d’entre eux est surexprimé dans les mutants PRC1, mais pas PRC2. Ces résultats suggèrent que l’activité suppresseur de tumeurs du PRC1 au stade larvaire découle de la régulation précise de gènes classiquement dérégulés dans les cancers, et ce en l’absence du PRC2En plus des sites situés sur des promoteurs actifs, nous avons détecté des sites PRC1 sans PRC2 au niveau de régions enrichies pour des marques de séquences amplificatrices (« Enhancers » en anglais) actives. Ces sites correspondent à des séquences amplificatrices spécifiquement actives au stade larvaire, et sont localisés à proximité de gènes codant pour des facteurs de transcription cruciaux pour le développement de l’œil, tels que les gènes du réseau de détermination de la rétine (RDGN). Pour mieux comprendre l’action du PRC1 sur ces cibles, j’ai réalisé des expériences de Hi-C (High-throughput Chromosome Conformation Capture) dans l’œil et l’embryon, révélant ainsi que ces séquences amplificatrices contactent les promoteurs proches spécifiquement au stade larvaire. De plus, la fréquence des contacts est positivement corrélée au niveau de PRC1 fixé. Étonnamment, ces gènes cibles sont sous-exprimés dans les mutants PRC1 mais pas dans les mutants PRC2, ce qui suggère que les contacts PRC1-dépendants entre ces séquences amplificatrices et leurs promoteurs cibles promeuvent la transcription. Pour vérifier cette hypothèse, j’ai étudié l’impact de la délétion via CRISPR de deux sites PRC1 impliqués dans une boucle régulatrice ; l’un situé au promoteur d’un gène du RDGN appelé dac et l’autre sur une séquence amplificatrice putative située en aval du gène. Des expériences de 3D-FISH révèlent que leur délétion entraîne la diminution des contacts entre la séquence amplificatrice et le promoteur, avec pour effet la sous-expression de dac. Ces résultats suggèrent que le PRC1 est impliqué dans la formation de boucles entre les séquences amplificatrices et leurs promoteurs cibles, et que cette topologie est nécessaire pour l’activation de ces gènes au cours du développement.Ma thèse a donc contribué à la découverte de nouvelles fonctions pour le PRC1, qui acquiert de nouvelles cibles au cours du développement et régule la transcription de gènes impliqués dans le cancer ou le développement indépendamment du PRC2, via des mécanismes dédiés. / Polycomb Group (PcG) are a set of highly conserved proteins implicated in cellular memory of transcriptional gene silencing throughout development. A classical model of PcG mode of action proposes that the two main Polycomb Repressive Complexes (PRC), PRC1 and PRC2, are co-recruited at specific DNA sequences called PREs (Polycomb Responsive Elements) where they collaborate to stably maintain a repressed chromatin state.My PhD work has challenged this collaborative model, by using as an experimental system the Drosophila larval Eye-Antennal imaginal Disc (EAD) that prefigures the adult eye. Surprisingly, while PRC1 and PRC2 mutants exhibit similar phenotypes in embryos, only PRC1 mutant clones show neoplastic transformation and massive overgrowth in EAD, while PRC2 mutant clones do not. To understand the molecular basis of this functional uncoupling, we generated ChIP-Seq directed against a large set of repressive and active Histone Marks (HTMs) as well as against core PcG proteins in EAD. A comparative analysis with Chip-Seq embryonic profiles firstly identified a massive de novo redeployment of PRC1 proteins at mostly 1000 active promoters that occurs only at larval stage. This new class of transcriptionally active PcG target genes, that we named “Neo-PRC1”, is devoid of the H3K27me3 epigenetic mark normally deposited by PRC2 and carry instead the active H3K27Ac mark. Moreover, this Neo-PRC1 category of PcG targets is enriched in ontologies linked to cell polarity, proliferation or signalling. A substantial subset of neo-PRC1 targets is up-regulated in PRC1 but not in PRC2 mutants, suggesting that the tumour-suppressor activity of PRC1 during Drosophila development might be exerted by fine-tuning the expression of cancer-related genes independently of PRC2.In addition to neo-PRC1 sites located at promoters, we next detected an enrichment of PRC1, but not PRC2, at regions enriched for active enhancer marks. These neo-sites which correspond to larval stage-specific enhancers are found in the vicinity of genes encoding for transcription factors playing a key role in EAD development, like genes implicated in the Retinal Determination Gene Network (RDGN). To understand the function of PRC1 at these enhancers, we performed comparative Hi-C (High-throughput Chromosome Conformation Capture) experiments between embryos and EADs, and discovered differential chromatin contacts occurring between the stage-specific neo-PRC1 enhancers and their closest promoters. The intensity of these 3D contacts is positively correlated with the PRC1-binding levels. Unexpectedly, in PRC1, but not in PRC2 mutants, these genes are down-regulated, suggesting that PRC1-dependent enhancer-promoter loops promote transcription. To study if larval 3D chromatin loops are PcG-dependent and functionally relevant, we analyzed the topological and transcriptional impact of two CRISPR-generated deletions affecting two PRC1 binding sites known to form a regulatory loop. These two PREs are respectively located close to the promoter and a putative 3’ enhancer of the dac locus encoding for a crucial member of the RDGN. 3D FISH experiments demonstrate that the removal of the dac endogenous PRC1 binding sites is sufficient to significantly decrease dac enhancer-promoter contacts as well as to trigger down-regulation of dac expression. Altogether, these results suggest that PRC1 might contribute to enhancer-promoter contacts at crucial developmental genes in EAD and that these PRC1-dependent long-range interactions could be necessary to allow a proper transcriptional induction during development.To summarize, my PhD project contributed in opening a new perspective, namely that in addition to conveying cellular memory, a main function of PcG correlates with a second wave of PRC1 recruitment during larval stage to subtly regulate and coordinate the expression of cancer-related and developmental genes through non-canonical molecular mechanisms.

Les Papillomavirus Humains (HPV) à haut risque carcinogène, dont HPV16, sont les agents étiologiques du cancer du col de l'utérus. Le génom d'HPV est composé d'un ADN double brin comprenant deux régions codantes : précoce« E » et tardive« L » et une région régulatrice non codante, la LCR. La protéine E2 se fixe au niveau des E2BS, situés dans la LCR et réprime l'expression d'E6 et d'E7. La perte d'expression d'E2 suite à l'intégration du génome virale induit une surexpression d'E6 et d'E7 qui favorisent la dégradation de p53 et de pRb. Des dinucléotides CpG étant présents au niveau des E2BS d'HPV16, nous avons détenniné si l'expression d'E6 était soumise à une régulation épigénétique. Nous avons développé une PCR HRM pour étudier le niveau de méthylation des E2BS dans les lésions précancéreuses et cancéreuses et nous avons noté la présence de CpG méthylés uniquement dans les cancers. Par ailleurs, nous avons montré que la méthylation des E2BS limite la fixation d'E2 et pern1et probablement la surexpression d'E6 et d'E7. Enfin, nous avons montré que le traitement des cellules HPV16 dérivées de cancer du col utérin pi le 5azadC, induit une diminution de l'expression d'E6. Ce mécanisme est indépendant d'E2 et nous avons prouvé que la ré-expression du miR-375, qu cible les transcrits E6/E7, est responsable de la répression d'E6 après traitement par SazadC. L'ensemble de nos résultats ont montré que l'expression des oncoprotéines d'HPV16 est régulée épigénétiquement par des facteurs viraux et cellulaires / High risk Human Papillomaviruses (HPV) are responsible for cervical cancer. HPV genome consists in a double-strand circular DNA harboring early "E" and late "L" genes and a Long Control Region (LCR). The E2 protcin binds to E2 Binding Sites (E2BS) present on the LCR and represses E6 and E7 transcription. The loss of E2 expression after HPV DNA integration induces an overexpression of E6 and E7 that thus favor p53 and pRb degradation. Since CpG dinucleotides are present in HPVl6 E2BS, we investigated whether E6 HPV16 expression was also submitted to epigenetic regulation. We developed a HRM PCR to study the methylation status of E2BS in precanccrous and canccrous lesions. We observed methylated CpG only in cancer samples. Otherwise, we proved that E2BS methylation prevented E2 binding and probably permitted E6 and E7 overexpression. Finally, we showed that the treatment ofHPV16 cervical cancer cell lines with a demethylating agent (SazadC) decreased the E6 expression. This regulation was independent of E2 and we proved that the up-regulation of miR-375, which targets E6/E7 transcripts, was involved in E6 repression after SazadC treatment. Taken as a whole, our data demonstrate that HPV 16 oncoprotein expression is regulated in an epigenetic manncr via viral and cellular factors.

Le génome des cellules eucaryotes est empaqueté dans la chromatine, dont l’établissement et la maintenance nécessitent des processus d’assemblage et de remodelage. Ce travail de thèse a été consacré à la caractérisation de deux facteurs de la machinerie d’assemblage de la chromatine. Le premier facteur étudié dans ce travail était HIRIP3, un homologue mammifère de la levure H2A.Z chaperon Chz1. Nous voulions vérifier si HIRIP3 est une chaperon d'histone par elle-même. Pour commencer, nous avons décrit l'interaction de HIRIP3 avec les histones in vivo. Ensuite, nous avons étudié la spécificité structurale de cette interaction in vitro. Nous avons caractérisé HIRIP3 comme une nouvelle chaperon d'histone H2A qui utilise le motif CHZ pour sa fonction. La deuxième partie de ce travail a été axée sur le complexe de remodelage de la chromatine SRCAP. Nous avons cherché à décoder son réseau d'interaction et à décrire ses sous-complexes. Nous avons reconstitué le complexe de base YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B et H2A.Z / H2B en utilisant le système d'expression chez baculovirus. Notre protocole nous a permis de purifier un complexe de base adapté aux futures études structurelles par microscopie cryo-électronique. / The genome of eukaryotic cells is packaged into chromatin, which establishment and maintenance require mechanisms of assembly and remodelling. This thesis work was dedicated to the characterization of two factors of chromatin assembly machinery. The first factor studied in this work was HIRIP3, a mammalian homologue of yeast H2A.Z chaperone Chz1. We aimed to test whether HIRIP3 is a histone chaperone by itself. At first, we established HIRIP3 interaction with histones in vivo. After then, we studied the structural specificity of this interaction in vitro. We have characterized HIRIP3 as a novel H2A histone chaperone that utilizes the CHZ motif for its function. The second part of this work was focused on SRCAP chromatin remodelling complex. We aimed to decipher its interaction network and to describe its sub-complexes. We have reconstituted YL1, SRCAP, TIP49A, TIP49B and H2A.Z/H2B core complex using baculovirus expression system. Our protocol allowed us to purify core complex suitable for future structural studies by cryo-electron microscopy.

Les cellules souches embryonnaires de souris (ESCs) et les cellules souches de l'épiblaste (EpiSCs) représentent, respectivement, les états naïf et amorcé de la pluripotence et sont maintenues in vitro par des voies de signalisation spécifiques. De plus les ESCs cultivées dans un milieu sans sérum avec deux inhibiteurs (2i) sont décrites comme étant les plus naïves. Plusieurs études ont suggéré que chaque type de cellules pluripotentes est caractérisé par une organisation différente de l'épigénome. Nous présentons ici une étude comparative de l'état épigénétique et transcriptionnel des séquences satellites répétées péricentromériques (PCH) entre les ESCs (2i et sérum) et EpiSCs. Nous montrons que H3K27me3 au PCH est très dynamique et peut discriminer les ESCs en 2i des autres cellules souches pluripotentes. Alors que la transcription des séquences satellites est élevée dans les ESCs en sérum, elle est plus faible dans ESCs en 2i et encore plus réprimée dans les EpiSCs. La suppression de la méthylation de l'ADN ou d'H3K9me3 dans les ESCs conduit à un dépôt important de H3K27me3 au PCH, mais peu de changements transcriptionnels de ces séquences. En revanche, l'absence d'H3K9me3 dans les EpiSCs n'empêche pas la méthylation de l'ADN au PCH, mais induit la transcription de ces séquences. La conversion in vitro des ESCs en EpiSCs est plus longue que le passage des cellules de l'ICM en épiblaste in vivo. Cette inefficacité ne peut pas être expliquée par une mise en place retardée du nouveau réseau transcriptionnel. Pour conclure notre étude a révélé que les EpiSCs ont perdu de la plasticité par rapport au ESCs sur l'hétérochromatine ainsi que l’euchromatine, comme le montre la réduction des niveaux d'H3K9ac et des domaines bivalents, étant ainsi plus proche épigénétiquement de cellules somatiques que de la pluripotence naïve. / Mouse embryonic stem cells (ESCs) and epiblast stem cells (EpiSCs) represent naïve and primed pluripotency states, respectively and are maintained in vitro using specific signaling pathways. Furthermore, ESCs cultured in serum-free medium with two inhibitors (2i) are described as being the most naïve. Several studies have suggested that each pluripotent cell type is characterized by a different epigenome organization. Here we present a comparative study of the epigenetic and transcriptional state of centromeric and pericentromeric (CH/PCH) satellite repeats in ESCs (2i and serum ones) and EpiSCs. We show that the pattern of H3K27me3 at PCH is highly dynamic and discriminate 2i-ESCs from the other pluripotent stem cells. Whereas satellites transcription is high in serum-ESCs, it is lower in 2i-ESCs and even more repressed in EpiSCs. Removal of either DNA methylation or H3K9me3 in ESCs leads to enhanced deposition of H3K27me3 but few changes in satellite transcription. By contrast, in EpiSCs removal of H3K9me3 does not prevent DNA methylation at PCH but de-represses the satellite transcription. In vitro conversion from naive to primed pluripotency showed an important delay compared to the in vivo development of ICM cells into post-implantation epiblast. Such inefficiency cannot be explained by a delayed switch to the new transcriptional network. Altogether our study reveals that EpiSCs have lost the chromatin plasticity of ESCs on heterochromatin as well as euchromatin, as shown by the reduction of H3K9ac levels and bivalent domains, thus being closer to somatic cells in terms of epigenetics than naive pluripotency.