Les cellules souches embryonnaires de souris (ESCs) et les cellules souches de l'épiblaste (EpiSCs) représentent, respectivement, les états naïf et amorcé de la pluripotence et sont maintenues in vitro par des voies de signalisation spécifiques. De plus les ESCs cultivées dans un milieu sans sérum avec deux inhibiteurs (2i) sont décrites comme étant les plus naïves. Plusieurs études ont suggéré que chaque type de cellules pluripotentes est caractérisé par une organisation différente de l'épigénome. Nous présentons ici une étude comparative de l'état épigénétique et transcriptionnel des séquences satellites répétées péricentromériques (PCH) entre les ESCs (2i et sérum) et EpiSCs. Nous montrons que H3K27me3 au PCH est très dynamique et peut discriminer les ESCs en 2i des autres cellules souches pluripotentes. Alors que la transcription des séquences satellites est élevée dans les ESCs en sérum, elle est plus faible dans ESCs en 2i et encore plus réprimée dans les EpiSCs. La suppression de la méthylation de l'ADN ou d'H3K9me3 dans les ESCs conduit à un dépôt important de H3K27me3 au PCH, mais peu de changements transcriptionnels de ces séquences. En revanche, l'absence d'H3K9me3 dans les EpiSCs n'empêche pas la méthylation de l'ADN au PCH, mais induit la transcription de ces séquences. La conversion in vitro des ESCs en EpiSCs est plus longue que le passage des cellules de l'ICM en épiblaste in vivo. Cette inefficacité ne peut pas être expliquée par une mise en place retardée du nouveau réseau transcriptionnel. Pour conclure notre étude a révélé que les EpiSCs ont perdu de la plasticité par rapport au ESCs sur l'hétérochromatine ainsi que l’euchromatine, comme le montre la réduction des niveaux d'H3K9ac et des domaines bivalents, étant ainsi plus proche épigénétiquement de cellules somatiques que de la pluripotence naïve. / Mouse embryonic stem cells (ESCs) and epiblast stem cells (EpiSCs) represent naïve and primed pluripotency states, respectively and are maintained in vitro using specific signaling pathways. Furthermore, ESCs cultured in serum-free medium with two inhibitors (2i) are described as being the most naïve. Several studies have suggested that each pluripotent cell type is characterized by a different epigenome organization. Here we present a comparative study of the epigenetic and transcriptional state of centromeric and pericentromeric (CH/PCH) satellite repeats in ESCs (2i and serum ones) and EpiSCs. We show that the pattern of H3K27me3 at PCH is highly dynamic and discriminate 2i-ESCs from the other pluripotent stem cells. Whereas satellites transcription is high in serum-ESCs, it is lower in 2i-ESCs and even more repressed in EpiSCs. Removal of either DNA methylation or H3K9me3 in ESCs leads to enhanced deposition of H3K27me3 but few changes in satellite transcription. By contrast, in EpiSCs removal of H3K9me3 does not prevent DNA methylation at PCH but de-represses the satellite transcription. In vitro conversion from naive to primed pluripotency showed an important delay compared to the in vivo development of ICM cells into post-implantation epiblast. Such inefficiency cannot be explained by a delayed switch to the new transcriptional network. Altogether our study reveals that EpiSCs have lost the chromatin plasticity of ESCs on heterochromatin as well as euchromatin, as shown by the reduction of H3K9ac levels and bivalent domains, thus being closer to somatic cells in terms of epigenetics than naive pluripotency.

La difficulté et la nécessité d'étudier l'organisation dynamique du génome ont poussé ces dernières années les expérimentateurs et les théoriciens à collaborer au développement de modèles théoriques de l'architecture chromosomique. Notre travail s’inscrit dans cet effort. En collaboration avec David Holcman et Assaf Amitaï (ENS Paris), nous avons développé une nouvelle méthode d'analyse de la mobilité de sites chromosomiques marqués avec des protéines fluorescentes. Notre analyse a permis de comparer la mobilité des différents sites du génome afin de comprendre comment l’organisation du noyau influe sur la mobilité de la chromatine, puis dans un second temps nos résultats ont permis d’établir un lien entre les mécanismes de réparation de l’ADN et la mobilité. Il a déjà été prouvé récemment (K. Bloom, 2013) que la mobilité des chromosomes est limitée par leur ancrage au SPB via leur centromère, mais l’étude de l'impact de l’ancrage télomérique sur la mobilité des chromosomes méritait d’être approfondi. Contrairement à ce qui est communément admis, nos résultats ont montré que les télomères ne sont pas fortement ancrés à la membrane nucléaire, de plus il existe une grande variabilité de leur mobilité cellule à cellule. Dans la plupart des cellules, l'interaction télomérique avec la membrane nucléaire est en effet suffisamment forte pour modifier la localisation des locus sub-télomériques mais trop faible pour impacter sa mobilité. Nos résultats ont également montré que les loci sub-télomériques ont une mobilité supérieure à celle des locus situés au milieu du bras chromosomique. Dans les cellules mutantes, la perte de l'intégrité du chromosome lors de l'induction d'une CDB entraîne l'apparition d’extrémités libres sur la chromatine. De manière similaire aux locus sub-télomériques, les extrémités libres des CDB présentent une mobilité plus élevée que les CDB du chromosome dont l'intégrité est préservée, ceci qui pouvant s'expliquer par un degré de liberté de mouvement supérieur des extrémités de la chromatine. Les cassures double-brin de l’ADN sont parmi les lésions les plus toxiques. La non- réparation ou une mauvaise réparation de ces cassures conduit à la mort cellulaire ou à des réarrangements chromosomiques qui sont à l’origine du développement de cancers chez l’homme. Lorsque que la cassure de l’ADN se produit la molécule d’ADN porteuse de l’information génétique est rompue sur les deux brins mais les deux extrémités de la cassure sont maintenues ensemble ce qui préserve l’intégrité du chromosome. En effet l’observation des extrémités de la cassure par microscopie grâce à des tags fluorescents situés de chaque côté de la cassure montre que celles-ci sont maintenues à proximité l’une de l’autre. Il existe donc un ou plusieurs mécanismes permettant à la cellule de préserver l’intégrité du chromosome. Des travaux précédents ont identifié le complexe MRX comme étant l’un des acteurs essentiels de ce mécanisme. Nos travaux ont permis d’identifier une seconde voie, complémentaire de MRX permettant d’assurer le maintien de l’intégrité chromosomique. Nous avons aussi pu observer que nos observations statiques concernant la proportion de cellules présentant des extrémités séparées était en réalité à l’échelle de la cellule le résultat d'un processus dynamique, les extrémités des chromosomes pouvant au cours du temps plusieurs fois se retrouver puis se séparer à nouveau. Afin de mieux comprendre les mécanismes de cohésion entre extrémités, nous avons pensé qu'il était essentiel de comprendre l'impact du recrutement des cohésines sur l'organisation 3D de la chromatine autour de la cassure. En effet, le recrutement de cohésines sur des dizaines de kilobases autour de la rupture est susceptible de générer l'assemblage d'une grande structure capable de modifier l'organisation 3D du chromosome à grande échelle. / The difficulty and the need to study the dynamic organization of the genome have pushed in recent years, experimenters and theorists to collaborate in the development of theoretical models of chromosomal architecture. Our work is a part of this effort. In collaboration with David Holcman and Assaf Amitaï (ENS Paris), we developped a new method of data analysis for the study of chromosomal sites tagged with fluorescent proteins. This new method allows us to extract from miscroscopy analysis a parameter named Kc characterizing constraints that restrict the mobility of the chromosomal locus. This new analysis was used to compare the mobility of different sites in the genome in order to understand how organization of the nucleus impacts chromatin mobility with the final aim of understanding the impact of this mobility on the regulation of DNA repair mechanisms. It was already proven recently (K. Bloom, 2013) that mobility of chromosomes is constrained by their anchoring to SPB by their centromeres, but little was known about the impact of telomeric sequences to nuclear membrane on chromosome mobility. Contrary to what is commonly accepted, our results showed that telomeres are not strongly anchored to the nuclear membrane. Within a cell population, it exists a high variability in telomere mobility, indeed most of the cells the telomeric interaction with the nuclear membrane is indeed strong enough to change the location of sub-telomeric loci but too weak to impact its mobility. Our results also showed that sub-telomeric loci have a higher mobility than loci located in the middle of the same chromosome arm. In mutant cells the loss of chromosom integrity upon the induction of a double-strand break leads to the apparition chromatin free extremities. Similarly to sub-telomerics loci, DSBs free extremities exhibit a higher mobility than DSBs in chromosome with a preserved integrity. In summary our study has shown that free ends of a chromatin fiber have a higher mobility than other monomers in the chain. This higher mobility is due to the higher level of freedom that chromatin extremities have. When DNA double strand break (DSB) is generated, the chromosome ends should become physically totally dissociated from one to another, making ensuing repair difficult. To overcome this dramatic event, the DNA damage response (DDR) takes in charge the implementation of a protein bridge that holds the two chromosome ends together and so preserve its integrity. In S. cerevisiae the MRX complex was already known for playing critical functions in early DSB extremities tethering. Several studies showed that a single DSB induces the formation of a ≈100 kb cohesin domain around the lesion. Our study suggests the late role played by cohesins in the emergence of an intra-chromosomal cohesive structure capable to maintain chromosomal integrity. The way of DSB extremities cohesion is established, is consistent with what is published on the recruitment of cohesins at DSBs. Our study also highlight the dynamical behavior of DSB extremities at the cell scale. Indeed once DSB extremities are separated, they alternate during several hours between a tethered and a separated state. We also analysed the impact of cohesins recruitment at DSBs at the chromosome scale. Our results establish a positive correlation between the level of cohesins loaded on the chromosome and the level of folding of the chromatin fiber. The analysis of the chronology of events leading to the preservation of chromosomal integrity upon DSB suggests that chromatin has an intrinsic property (not related to DNA damage response) preserving its integrity despite the apparition of DSBs. This property could potentially be due to short-range inter-nucleosomal interactions or to the presence of secondary structures formed by cohesines in the interphase genome. All these hypothesis should be further tested experimentally.

Le noyau cellulaire est le siège de réactions chimiques dont le but est l’expression de gènes, la duplication du génome et du maintien et l’intégrité de l’information génétique. Ces réactions sont régulées au cours du cycle cellulaire ou en réponse à un stress. Parmi elles, la transcription permet qu’une séquence d’ADN soit reproduite sous forme d’ARN messager. La transcription est un exemple frappant de processus fondamental pour la cellule impliquant parfois un nombre très faible de molécules. En effet, il n’y a souvent dans un même génome que quelques copies d’un même gène. Le but de cette thèse est d’imager les processus nucléaires dans des cellules humaines à l’échelle de la molécule unique et d’en extraire les grandeurs caractéristiques. Depuis les années 90, des inventeurs de génie ont développé des méthodes simples à partir de microscopes inversés ordinaires pour observer des molécules individuelles jusque dans le noyau des cellules. Nous avons utilisé ces méthodes pour suivre des facteurs de transcription qui régulent la transcription d’un gène. Nos mesures montrent que, bien que hiératique, l’exploration du noyau par les facteurs de transcriptions est régulée par leurs propriétés chimiques. L’agencement des composants du noyau guide les facteurs de transcription dans la recherche d’un gène. Comme exemple de cet agencement, nous nous sommes ensuite intéressés à l’organisation de l’ADN dans le noyau pour montrer qu’elle présentait les caractéristiques d’une structure auto-organisée, une structure fractale. Cette structure change en réponse aux aléas de la vie de la cellule. Dans une dernière étude, nous avons suivi un locus dans le noyau d’une levure. La structure du noyau, qui est révélée par notre méthode, contraint la diffusion du locus à un régime de reptation. Tous ces résultats montrent combien la structure du noyau et les réactions chimiques qui y ont lieu sont interdépendantes. Cette thèse a également permis le développement de méthodes de quantification précises des réactions cellulaires à l’échelle de la molécule unique. / The cell nucleus is a chemical reactor. Nuclear components interact with each other to express genes, duplicate the chromosomes for cell division, and protect DNA from alteration. These reactions are regulated along the cell cycle and in response to stress. One of the fundamental nuclear processes, transcription, enables the production of a messenger RNA from a template DNA sequence. While mandatory for the cell, transcription nevertheless may involve a very small number of molecules. Indeed, a single gene would have only few copies in the genome. During my PhD, I studied nuclear processes in human cells nuclei at the single molecule level with novel imaging techniques. I developed new statistical tools to quantify nuclear components movement that revealed a dynamic nuclear architecture. Since the 90s, simple methods have been developed for the observation of single molecules in the cell. These experiments can be conducted in an ordinary inverted microscope. We used these methods to monitor nuclear molecules called transcription factors (TF) that regulate transcription. From TF dynamics, we concluded that nuclear exploration by transcription factors is regulated by their chemical interactions with partners. The organization of the components of the nucleus guide transcription factors in their search of a gene. As an example of this organization, we then studied chromatin, the de-condensed form of nuclear DNA, proving that it displays the characteristics of a self-organized fractal structure. This structure changes in response to cellular fate and stress. In yeast, we showed that the interminglement of chromatin constrained DNA locus movement in a reptation regime. All these results show the interdependence of the structure of the nucleus and of its chemical reactions. With combination of realistic modeling and high resolution microscopy, we have enlightened the specificity of the nucleus as a chemical reactor. This thesis has also enabled the development of accurate methods for the statistical analysis of single molecule data.