Les éléments transposables (ET) sont une source majeure de variation génétique, ce qui leur confère un rôle essentiel dans l’évolution des génomes. Certes présents dans tous les génomes analysés à ce jour, leurs proportions sont fortement variables entre espèces et aussi entre populations, suggérant une relation unique entre génome hôte et ET. Grâce à un système modèle composé de populations naturelles de deux espèces proches (Drosophila melanogaster et D. simulans) avec des quantités différentes en ET, nous avons pu comparer les relations génome hôte/ET. Nous nous sommes particulièrement interessés à l’élément helena qui, chez D. simulans, montre une activité faible, malgré un nombre de copies élevé.Cette activité moindre est associée à de nombreuses délétions internes des copies, suggérant un mécanisme de régulation d’ET par des délétions de l’ADN. Un autre système de régulation de l’activité des ET utilise le contrôle épigénétique, ce qui permet le maintien des copies d’ET dans le génome mais un blocage de leur activité. Le remodelage de la chromatine est un système épigénétique bien décrit chez la drosophile. Les régions chromatiniennes des génomes sont associées à différents types de modifications d’histone. Nous avons mis en évidence, dans des populations de D. melanogaster et D. simulans, une variation conséquente de modifications d’histones de type hétérochromatique, H3K27me3 et H3K9me2, associées àdes copies de différents ET. De plus, nous avons décrit des populations chez D. simulans dites déréprimées, chez lesquelles certains éléments sont surexprimés et présentent des localisations probablement hétéchromatiques. Les ET sont donc contrôlés par le génome hôte par des délétions internes et probablement par un système épigénétique variable. De plus, dans certaines populations, des copies peuvent échapper à ce contrôle et envahir le génome. Les ET sont donc des grands créateurs de variabilité génétique mais permettent aussi une territorialisation chromatinienne du génome car ils portent des modifications épigénétiques précises et sont capables de les étendre à leurs environnements génomiques. Ceci leur confére la fonction "d'épigénétique mobile". / Transposable elements (TEs) are one major force of genome evolution thanks to theirability to create genetic variation. TEs are ubiquitous and their proportion is variable between species and also populations, suggesting that a tight relationship exists between genomes and TEs. The model system composed of the natural populations of the twin sisters Drosophila melanogaster and D. simulans is interesting to compare host/TE relationship, since both species harbour different amounts of TE copies. The helena element is nearly silenced in D.simulans natural populations despite a very high copy number. Such repression is associated to abundant internally deleted copies suggesting a regulatory mechanism of TEs based on DNA deletion. Another pathway of TE regulation is through epigenetics where the host genome is able to keep intact the DNA sequences of TEs and still silence their activities.Chromatin remodelling is well known in drosophila and specific histone modifications can be associated to specific chromatin domains. We observed an important variation on H3K27me3and H3K9me2, two heterochromatic marks, on TE copies in D. melanogaster and D. simulans natural populations. Also, we show that derepressed lines of D. simulans exist for specific elements, have high TE transcription rates and are highly associated to non constitutive heterochromatic marks. TEs are therefore controlled by the host genome through DNA deletion and a possible chromatin remodelling mechanism. Not only genetic variability is enhanced by TEs but also epigenetic variability, allowing the host genome to be partitioned into chromatin domains. TEs are therefore mandatory to gene network regulation through their ability of “jumping epigenetics”.

La betterave sucrière est une plante bisannuelle dont le besoin de vernalisation est absolu. Ce processus correspond à l’acquisition de l’aptitude à la montaison et à la floraison et résulte d’une exposition prolongée à de basses températures. La durée de froid requise pour induire la montaison puis la floraison varie suivant les génotypes et reflète leur tolérance à la montaison, qui constitue donc un caractère agronomique essentiel. Cette thèse visait à (i) mettre en évidence un éventuel contrôle épigénétique (méthylation ADN) de l‘induction de la montaison chez des génotypes de betterave sucrière résistants ou sensibles à la montaison, (ii) identifier les séquences ciblées par des remaniements de méthylation de l’ADN et d’expression associés, et (iii) caractériser certaines séquences candidates en vue de leur utilisation comme marqueurs de la montaison. Nos travaux ont montré que l’amplitude et la cinétique des variations de méthylation de l’ADN observées au cours de la vernalisation semblent être des éléments critiques de l’induction et de la tolérance à la montaison. Par une approche ciblée, des séquences dont la méthylation de l’ADN est remaniée ont été identifiées. L’implication dans la transition florale de deux BvRNMT (RNA METHYLTRANSFERASES) et de la méthylation des ARN, tels que l’ARNm de BvFL1, un répresseur floral, a ainsi été mise en évidence chez la betterave sucrière. Enfin, grâce à une approche génomique, un réseau de gènes intégratif incluant la réponse à l’environnement, la signalisation hormonale et l’induction de la floraison a été identifié. La cinétique d’activation de ces gènes définirait le niveau de tolérance à la montaison des différents génotypes de betterave sucrière. / Sugar beet is a biennial plant with an absolute requirement of vernalization, corresponding to the acquisition of the competence to bolt and flower after a prolonged exposure to low temperatures. The cold duration needed to induce bolting and flowering varies depending on the genotypes, reflecting their bolting tolerance, which is an essential agronomic trait. This work aimed at (i) investigating a possible epigenetic control of bolting induction in bolting sensitive and bolting resistant sugar beet genotypes, (ii) identifying sequences targeted by DNA methylation and expression remodeling, and (iii) characterizing candidate sequences which could be used in marked-assisted selection for plant breeding. Our data suggest that the time course and amplitude of DNA methylation variations are critical points for the induction of sugar beet bolting and represent an epigenetic component of the genotypic bolting tolerance. In addition, we identified differentially methylated sequences exhibiting variations of gene-body DNA methylation and expression during cold exposure and/or between genotypes. Among them, two RNA METHYLCYTOSINE TRANSFERASES, in association with RNA methylation such as BvFL1 mRNA, a floral repressor, were shown to play a role in floral transition. Finally, using microarrays we identified an integrative network of genes including response to environment, phytohormone signalling and flowering induction. The activation kinetics of these genes could define the bolting tolerance level of sugar beet genotypes.

Les voies de signalisation sont des moyens de communication intercellulaires très conservées au cours de l'évolution qui contrôlent tous les aspects du développement des organismes multicellulaires. La signalisation par les récepteurs Notch oriente les destins cellulaires au cours du développement embryonnaire et régule l'homéostasie des tissus. Dans les cellules normales, l'activation de la voie Notch est soumise à une régulation très stricte, ayant pour enjeu de maintenir un équilibre au sein des tissues entre prolifération et différenciation. Cependant des disfonctionnement de la voie Notch sont à l'origine de l'augmentation de la prolifération cellulaire, perturbant ainsi cet équilibre et aboutissant à la transformation maligne des cellules. Le rôle central de NOTCH1 dans l'oncogenèse humaine est soutenu par la présence de mutations activatrices de la voie dans plus de 50% des leucémies aigues lymphoblastiques T (LAL-T), ainsi qu'un large éventail de cancers hématopoïétiques et de tumeurs solides. Au cours des dernières décennies, d'importants progrès ont été réalisés dans la compréhension des mécanismes de transduction du signal Notch et l'identification des processus biologiques qui sont influencés par la voie Notch. Les fonctions physiologiques et pathologiques de NOTCH1 requièrent sa translocation dans le noyau, mais ses partenaires nucléaires et leurs rôles dans la tumorigénèse restent peu connus. De même, les mécanismes moléculaires par lesquelles Notch active la transcription des gènes cibles de la voie restent à élucider.Afin de comprendre les fonctions nucléaires de Notch dans un contexte tumoral, nous avons, par une approche protéomique, caractérisé les complexes protéiques associés à la forme oncogénique de NOTCH1 à partir d'extraits nucléaires de cellules leucémiques T humaines. Nos travaux, associant des approches biochimiques et fonctionnelles, mettent en évidence le rôle central de plusieurs enzymes et facteurs nucléaires dans le contrôle de l'activité transcriptionnelle et les fonctions oncogéniques de Notch.La perturbation de l'expression de plusieurs facteurs nouvellement identifiées induit un arrêt du cycle cellulaire et altère la prolifération in vitro des cellules cancéreuses portant des mutations de la voie Notch. De façon remarquable, l'inhibition des partenaires de NOTCH1 est capable de supprimer la croissance tumorale de cellules leucémiques humaines dans un modèle de xénogreffe murin. Ces travaux auront un impact important dans le développement des nouvelles stratégies capables d'interférer avec les fonctions oncogéniques de Notch et pourraient s'avérer utile dans le traitement des cancers humains. / Activating mutations in NOTCH1, an essential regulator of T-cell development, are frequently found in human T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). However, the precise mechanisms by which Notch causes T-ALL are not fully understood. While several target genes regulated by Notch have been identified in thymocytes and T-ALLs, little is known about the identity of NOTCH1 interacting partners that are required for its oncogenic activity. Using an improved tandem affinity chromatography method, followed by mass spectrometry, we have purified the intracellular active form of NOTCH1 (ICN1) and its nuclear cofactors in human T-ALL cells. We identified and validated a large set of proteins associated with ICN1, including transcriptional activators, repressors and protein-modifying enzymes. Moreover, we found that NOTCH1 interacts with lineage-specifying transcription factors and components of other signaling pathways that could cooperate to confer a specific program of gene expression. This work represents the first comprehensive analysis of Notch partners in the nucleus and provides a framework to elucidate Notch functions and regulation.We subsequently used Notch nuclear interactome as resource to expand our understanding of how ICN1 orchestrates target gene activation. Biochemical and functional experiments demonstrated that Notch activation in T-ALL cells leads to the assembly of a large multisubunit complex in the nucleus containing ICN-CSL-MAML1 as a core subunit and several classes of transcriptional regulators that act at different steps of the transcriptional activation process. These include the transcriptional activator AF4p12, the histone demethylases LSD1 and PHF8, and the SWI/SNF nucleosome remodeling complex PBAF, all of which are required for expression of Notch-responsive genes. We found that PBAF recruitment to Notch-target enhancers facilitates transcription in a chromatin context, probably through the remodeling of nearby nucleosomal structures, while LSD1 and PHF8 act through their demethylase activity to promote local epigenetic modifications. In the presence of Notch, PHF8 demethylates the repressive dimethyl H3 lysine-27 (H3K27me2) mark and LSD1 removes the repressive H3K9me2 mark from Notch-responsive enhancers to promote gene expression. However, LSD1 is also associated with CSL corepressor complex in the absence of Notch and contributes to CSL-mediated repression of Notch targets by removing the activating H3K4me2 mark, suggesting that LSD1 plays a dual role in Notch signaling regulation. AF4p12 is a poorly-characterized protein that was first identified as one of the MLL translocation partners in leukemias. While its precise role awaits further investigation, our results indicate that AF4p12 is required for RNAPII recruitment at several Notch-target genes, therefore acting as a transcriptional coactivator of ICN1. Importantly, we found that Notch cofactors are recruited to Notch-responsive genes in primary developing T cells and are required for Notch-mediated tumor growth in a xenograft T-ALL model. Thus, this newly characterized Notch-activation complex controls both Notch developmental and oncogenic functions in immature T-cells.In addition, our preliminary data provide insights into regulation of ICN1 stability and identify several protein-modifying enzymes as potential regulators of Notch signaling. Moreover, we propose that non-canonical Notch activities, as well as extensive crosstalk with lineage-specifying transcription factors, might shape the repertoire of Notch regulated genes, therefore contribute to Notch oncogenic functions in T-ALL cells.The identification of Notch-associated proteins in T-ALL uncovered novel aspects of Notch signaling and provided a powerful tool for dissecting mechanisms of Notch function and regulation that could be translated into new therapeutic approaches.

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique. / In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome.

La carence en donneurs de méthyle est assez fréquente dans la période périnatale et au cours du vieillissement. Les donneurs de méthyle alimentaires, l'acide folique et la vitamine B12, influencent la teneur cellulaire en S-adénosylméthionine et S-adénosylhomocystéine et en homocystéine. Le lien entre les donneurs de méthyle et le métabolisme énergétique n'est pas connu, en dépit de leur rôle dans les voies liées à l'épigénétique et la synthèse de molécules méthylées. Nous avons évalué les conséquences d'un régime alimentaire déficient donneur de méthyle, dans le myocarde des ratons au moment du sevrage, soumis à une carence durant la gestation et la lactation. Le régime carencé augmente l'homocystéine plasmatique et S-adénosylhomocystéine myocardique. Les résultats mettent en évidence une cardiomyopathie hypertrophique et un déficit global de l'oxydation des acides gras avec acylcarnitines plasmatiques. Les liens entre le métabolisme des mono-carbones, l'oxydation mitochondriale des acides gras et de cardiomyopathie ont été constatées par des corrélations entre l'homocystéine et les acylcarnitines et le peptide natriurétique de type B. La carence en donneurs de méthyl peut être une condition aggravante de la cardiomyopathie en altérant l'oxydation des acides gras à travers une expression modifiée de PPAR[alpha] et ERR[alpha] et un déséquilibre de l'acétylation / méthylation de PGC1[alpha]. Nous avons montré que l'Hcy et Apo A-I ont été deux facteurs métaboliques déterminants de l'ABI dans une population ambulatoire de volontaires âgés d'une région rurale de la Sicile. L'influence négative de l'Hcy sur Apo A-I et sur le métabolisme des HDL ouvre des nouvelles perspectives sur l'implication de l'Hcy dans la physiopathologie de l'athérothrombose / The deficiency in methyl donors is prevalent in the perinatal period of life and in aging. Dietary methyl donors, folate and vitamin B12, influence the cellular content in Sadenosylmethionine and S-adenosylhomocysteine and increases homocysteine. The link between methyl donors and energy metabolism is not known, despite their role in pathways related to epigenetics and synthesis of methylated molecules. We evaluated the consequences of a diet lacking methyl donors, in myocardium of weaning rats from dams subjected to deficiency during gestation and lactation. The deficient diet increased plasma homocysteine and myocardium Sadenosylhomocysteine. The results evidenced a hypertrophic cardiomyopathy with a global deficit in fatty acid oxidation with increased plasma acylcarnitines. The links between one-carbone metabolism, mitochondrial fatty acid oxidation and cardiomyopathy were ascertained by correlations between hyperhomocysteinemia, short-, medium- and long-chain acylcarnitines, and type-B natriuretic peptide. Methyl donor deficiency may be an aggravating condition of cardiomyopathy by impairing fatty acid oxidation through altered expression of PPAR[alpha] and ERR[alpha] and imbalanced acetylation/methylation of PGC1[alpha]. Finally, in a clinical study we sshowed that the Hcy and Apo A-I were two metabolic factors that influence the « anckle brachial index » in an ambulatory aged Sicilian population. The influence of homocysteine on Apo A-I and HDL metabolism provides new insights on its role on vascular diseases, at a cross-point between atherosclerosis and atherothrombosis

Le métabolisme des monocarbones relie le métabolisme cellulaire à la machinerie épigénétique à travers une molécule commune, la S-adénosylméthionine (SAM). Les changements dans le potentiel de méthylation cellulaire (ratio SAM/SAH) sont impliqués dans plusieurs maladies, notamment l'hépatocarcinome et les défauts de fermeture du tube neural (NTD). La perturbation du ratio SAM/SAH peut être liée à des déficits enzymatiques ou à une exposition à un facteur environnemental. La reméthylation de l'homocystéine (HCY) en méthionine est catalysée par la méthionine synthase (MTR) ou la bétaïne homocystéine méthyltransférase (BHMT) dans le foie. En comparant le tissu tumoral au tissu sain environnant dans le foie, les transcrits de BHMT étaient fortement diminués dans les échantillons mais pas les transcrits de MTR. La protéine BHMT n'a pas été détectée dans les cellules HepG2 et dans 5 des 6 échantillons tumoraux analysés. L'absence d'expression de BHMT était due à un variant génétique conduisant un codon stop prématuré. Une déficience pré-natale en donneurs de méthyle aggrave la susceptibilité face à certaines maladies. La fumonisine B1 (FB1) est une mycotoxine qui contamine les céréales et a été identifiée comme étant un facteur de risque de survenue de tumeur et des NTD. Nous avons étudié les récepteurs des folates et 4 marques de l'hétérochromatine dans le foie des foetus de rat issus de mères exposées à un régime déficient en donneurs de méthyle et/ou à la FB1 à une dose deux fois supérieure à la dose journalière admissible. Le régime carencé et la FB1 diminuent le ratio SAM/SAH. La FB1 inverse le mécanisme d'adaptation consistant en une régulation positive de l'expression des récepteurs des folates lors d'une carence seule. Le régime carencé diminue H4K20me3 mais une combinaison carence/FB1 diminue encore d'avantage H4K20me3 et augmente H3K9me3. Cette augmentation de H3K9me3 peut être vu comme un mécanisme de défense incitant la cellule à résister à la désorganisation de l'hétérochromatine. H3R2me2 et H4K16ac varient également selon ce mécanisme. Cette étude est pertinente car elle suggère que de faibles doses de FB1 interagissent avec la carence en donneurs de méthyle pour perturber le profil épigénétique / Folate-mediated 1-carbon metabolism is a conduit that links cellular metabolism to the epigenetic machinery through the common molecule, AdoMet. There is strong evidence that changes in the cellular methylation potential (AdoMet/AdoHcy ratio) is involved in several types of disease notably tumor proliferation like hepatocarcinoma and developmental disease like neural tube defects. Perturbation of AdoMet/AdoHcy ratio may be related to a cellular cause like enzyme defect or to exposure to an environmental factor. The remethylation of homocysteine to methionine is catalyzed either by methionine synthase (MTR) or by betaine-homocysteine methyltrnasferase (BHMT) in the liver. By comparing tumor tissue to surrounding healthy tissue in the liver we have found that BHMT transcripts, but not MTR, are strongly decreased in tumor samples. Consistently, BHMT protein was not detected in HepG2 cells and in 5/6 tumors investigated. Abolition of BHMT expression was due to a genetic variant producing a premature termination codon. Prenatal methyl deficient diet (MDD) enhances susceptibility to disease. Fumonisin FB1 is a corn contaminating mycotoxin identified as a risk factor for tumor occurrence and neural tube defects. We have investigated folate receptors and 4 heterochromatin markers in rat foetuses liver derived from dams exposed to MDD and/or FB1 administered at a dose twice higher than the Provisional Maximum Tolerable Daily Intake. We found that MDD and even FB1 by itself decrease the AdoMet/AdoHcy ratio. FB1 reverses the adaptation mechanism consisting in upregulating folate receptors in case of folate depletion. MDD decreased H4K20me3 but combined MDD/FB1 decreased H4K20me3 even more and increased H3K9me3. The elevated H3K9me3 can be viewed as a defence mechanism inciting the cell to resist heterochromatin disorganisation. H3R2me2 and H4K16Ac varied according to this mechanism. This study is relevant because it suggests that low doses of FB1 interact with methyl depletion to disrupt the epigenetic landscape

La dystrophie Facio-Scapulo-Humérale (FSHD) est caractérisée par un affaiblissement asymétrique des muscles de la face, de la ceinture scapulaire et des bras. Dans 95% des cas (FSHD1), elle est liée à la contraction d’un élément macrosatellite en 4q35, D4Z4. Dans les 5% des cas qui ne présentent pas de contraction de D4Z4 (FSHD2), des mutations dans le gène SMCHD1 sont retrouvées. Des mutations dans ce gène sont aussi associées à un syndrome développemental très rare, le syndrome de Bosma (BAMS). Les individus présentent des anomalies cranio-faciales mais aucun signe musculaire.Nous avons développé une méthode pour l’analyse de la méthylation de D4Z4 associant modification de l’ADN au bisulfite de sodium et séquençage à haut débit. Nous observons une hypométhylation marquée chez les patients FSHD2 et BAMS au niveau de la partie proximale de cet élément. L’étude de la méthylation au cours de la reprogrammation de fibroblastes primaires en cellules souches pluripotentes induites montre que D4Z4 est reméthylé de façon spécifique dans les cellules contrôles et FSHD1 mais est peu modulée dans les cellules FSHD2 et BAMS. Cette méthylation élevée est une caractéristique de la pluripotence et implique SMCHD1. La reméthylation ne dépend pas non plus de la mémoire épigénétique héritée des fibroblastes ni du nombre de répétitions D4Z4. Ces résultats suggèrent un mécanisme de régulation dynamique. L’hypométhylation de D4Z4 n’est pas observée lors de l’invalidation somatique du gène indiquant que SMCHD1 est impliqué dans la mise en place de la méthylation et non sa maintenance.SMCHD1 est donc impliqué dans la mise en place de la méthylation de D4Z4 dans les cellules pluripotentes. / Facio-Scapulo-Humeral Dystrophy is characterized by the involvement of specific facial, scapulo-humeral and anterior foreleg muscles. In 95% of cases (FSHD1) the disease is associated with a reduction of a macrosatellite element, D4Z4, at the 4q35 locus. In the 5% remaining cases (FSHD2), there is no D4Z4 contraction and patients carry mutations in the SMCHD1 gene. Mutations in SMCHD1 are also involved in a very rare developmental syndrome called Bosma Arhinia Microphtalmia syndrome (BAMS) characterized by cranio-facial abnormalities but no muscular dystrophy.To analyze D4Z4 methylation we developed an approach based on the Sodium Bisulfite treatment method followed by high-throughput sequencing. We showed a significant hypomethylation in the proximal region of D4Z4 in FSHD and BAMS patients compared to controls. Our methylation analysis in primary fibroblasts and corresponding human induced pluripotent stem cells showed that D4Z4 is specifically remethylated upon reprogramming in FSHD1 cells but not in SMCHD1-mutated cells. The high methylation level is a feature of pluripotency likely dependent on SMCHD1. Strikingly, hypomethylation is not observed in somatic cells invalidated for SMCHD1 suggesting a key role for this factor in de novo the methylation. D4Z4 methylation pattern does not depend on the epigenetic memory inherited form donor cells and on the number of the D4Z4 copies and it is a tightly regulated process.In conclusion, SMCHD1 plays a role in the D4Z4 methyl mark deposition at the pluripotency state.

Les qualités intrinsèques spermatiques (état de condensation de la chromatine, intégrité de l’ADN, contenu chromosomique, capacités fécondantes..) sont très variables d’un spermatozoïde à l’autre. Le pari aujourd’hui en assistance médicale à la procréation est de relier un aspect morphologique spermatique à ces qualités intrinsèques dans le but de mieux choisir le spermatozoïde vivant à injecter et d’améliorer les taux de grossesse. Depuis 2002, le MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination) permet d’observer les spermatozoïdes à fort grossissement, en contraste interférentiel de Nomarski et d’observer des structures qu’on appelle les « vacuoles ». L’injection intra-ovocytaire de spermatozoïdes sélectionnés en MSOME (IMSI) comme non porteurs de vacuoles céphaliques permettrait d’améliorer les taux de grossesses évolutives. Ici, nous avons montré que les vacuoles spermatiques correspondaient à des cratères nucléaires en lien avec une non-condensation chromatinienne (non remplacement des histones au cours de la spermiogenèse). Certaines atypies morphologiques spermatiques sont aussi en lien avec une non-condensation de la chromatine. De plus, spermatozoïdes vacuolés présentent parfois des taux de fragmentation élevés. Aucun lien n’a cependant été retrouvé entre un aspect morphologique spermatique d’une part et un contenu chromosomique ou des capacités fécondantes particulières d’autre part. De ces liens, nous avons pu dégager de nouvelles indications d’IMSI. Ainsi, nous avons avancé dans la description des critères de sélection du spermatozoïde humain vivant donnant le moins de risque d’échec d’implantation embryonnaire et/ou d’anomalies pour la descendance / Intrinsic sperm quality criteria (chromatin condensation, DNA fragmentation, chromosome content, fecundity, etc.) vary from one spermatozoon to another. It is critical to be able to link morphological aspects to these quality criteria, in order to improve the selection of high-quality, live spermatozoa and thus improve pregnancy and delivery rates. Since 2002, motile sperm organelle morphology examination has been used to screen for defects under high magnification and thus select vacuole-free spermatozoa (which are known to be associated with higher pregnancy rates in intracytoplasmic morphologically selected sperm injection (IMSI) programmes). Here, we demonstrate that sperm vacuoles are nuclear concavities associated with chromatin condensation failure (due to a lack of histone replacement during spermiogenesis). A number of other morphological abnormalities were found to be linked to chromatin condensation failure. In some cases, vacuolated spermatozoa were seen to be more DNA-fragmented than vacuole-free ones. In contrast, sperm morphology was not related to chromosomal content or fecundity characteristics. Our observations enabled us to identify new indications for IMSI and refine the criteria for selecting the best spermatozoon: the spermatozoon with the lowest risk of implantation failure or abnormalities in the offspring

Le génome humain est constamment la cible d'agents qui endommagent l'ADN. Ces dommages sont multiples et variés tels que les cassures simple et double brin (DSB). Les DSBs sont des lésions très toxiques dont l'origine peut être multiple. Les cellules de mammifères réparent les DSBs en utilisant deux mécanismes principaux, la recombinaison homologue (RH) qui est dépendante du cycle cellulaire et utilise la chromatide sœur comme matrice de réparation et la jonction des extrémités non homologues (NHEJ) qui est indépendante du cycle cellulaire et consiste en la ligation des extrémités d'ADN endommagées. Cette réparation a lieu dans un contexte chromatinien qui nécessite un dynamisme pour rendre accessible les sites lésés aux différentes machineries de réparation. Lors de mes travaux, j'ai étudié le remodeleur de la chromatine p400 ainsi que le variant d'histone H2A.Z qui sont deux protéines impliquées dans la dynamique de la chromatine, afin de comprendre leur rôle dans les mécanismes de réparation des DSBs et la stabilité du génome. p400, une ATPase de la famille SWI2/SNF2 participe à l'incorporation du variant d'histone H2A.Z dans la chromatine. Au cours de ma thèse, j'ai montré que la déplétion par siRNA du variant d'histone H2A.Z, dans la lignée d'ostéosarcome humain (U2OS) et dans des fibroblastes humains immortalisées, n'a pas d'effets sur la réparation des DSBs. Ces résultats sont corrélés avec une absence de recrutement de H2A.Z au niveau des cassures après étude par micro irradiation laser ou par immunoprécipitation de chromatine. Cependant, la déplétion de H2A.Z affecte la prolifération cellulaire en influençant l'efficacité de clonage et le cycle cellulaire. L'autre partie de mes travaux a mis en évidence que l'ATPase p400 est un frein à l'utilisation de la voie alternative de jonction des extrémités (alt-EJ) qui est un processus de réparation des DSBs très mutagène. L'augmentation des événements du NHEJ-Alternatif et la génération d'instabilité génétique observés lors de la déplétion de p400 par siRNA semblent tributaires de la résection des DSBs par CtIP. Ces résultats indiquent que p400 joue un rôle post-résection dans les étapes plus tardives de la RH. De plus, la déplétion de p400 conduit au recrutement de la polyADP ribose polymérase (PARP) et de l'ADN ligase 3 à la DSB, ce qui provoque la mort sélective de ces cellules lors d'un traitement par des inhibiteurs de PARP. Ces résultats montrent que P400 agit comme un frein pour empêcher l'utilisation du NHEJ-Alternatif et donc l'instabilité génétique. / The human genome is constantly targeted by DNA damaging agents. These damages are many and varied, such as single and double strand breaks (DSBs). The DSB are highly toxic lesions whose origin can be multiple. Mammalian cells mainly use two DNA repair pathways to repair DSB, homologous recombination (RH), which is dependent on the presence of the intact homologous copy (the sister chromatid) and on the cell cycle stage and the non-homologous end joining (NHEJ) pathway, which is cell cycle independent and performs direct ligation of the two DNA ends. The repair of DNA damage takes place in a chromatin context that needs to be remodeled to give access to damaged sites. During my work, I studied the chromatin remodeler p400 and the histone variant H2A.Z both involved in chromatin remodeling, to understand their role in DSB repair and genome stability. p400, an ATPase of the SWI2/SNF2 family is involved in the incorporation of H2A.Z in chromatin. I have shown that H2A.Z depletion in the osteosarcoma cell line U2OS and in immortalized human fibroblasts did not alter DSB repair. These results are correlated with the lack of H2A.Z recruitment at DSB observed after local laser irradiation or Chromatin Immunoprecipitation. However, H2A.Z depletion affects cell proliferation and the cell cycle distribution. In addition, I have shown that the chromatin remodeler p400 is a brake to the use of alternative End Joining (alt-EJ) which is a highly mutagenic repair process. The increase in alt-EJ events observed in p400-depleted cells is dependent on CtIP- mediated resection of DNA ends. Moreover, p400 depletion leads to the recruitment of poly(ADP) ribose polymerase (PARP) and DNA ligase 3 at DSB, leading to selective cell killing by PARP inhibitors. Altogether these results show that p400 acts as a brake to prevent alt-EJ dependent genetic instability and underline its potential value as a clinical marker.

Les méthyltransférases de l'ADN (DNMT) catalysent la méthylation de l'ADN, l'une des marques épigénétiques les plus étudiées. Dans les cancers, on observe une hyperméthylation spécifique de promoteurs de gènes suppresseurs de tumeurs (GST) conduisant à leur extinction génique, ce qui participe au maintien et à la progression de tumeurs. A ce jour, les mécanismes responsables de cette hyperméthylation spécifique des promoteurs de GST dans les cancers sont indéterminés. Ces travaux de thèse sont consacrés à l'inhibition des DNMT dans les cancers afin de restaurer l'expression des GST mais également à l'utilisation d'une approche innovante de chemobiologie pour l'identification de partenaires des DNMT potentiellement responsables de leur adressage vers les régions promotrices des GST. Les partenaires ainsi identifiés peuvent constituer de nouvelles cibles épigénétiques pour le ciblage indirect de la méthylation de l'ADN dans les cancers. Deux séries d'inhibiteurs de DNMT ont été étudiées. La première est la famille des chloronitro-flavanones, précédemment identifiée par criblage, pour laquelle de nouveaux dérivés de type bromonitro-flavanones ont été synthétisés afin d'améliorer la stabilité en conditions physiologiques. J'ai réalisé l'étude des effets pharmacologiques de cette famille de molécules. J'ai également entrepris la synthèse et la caractérisation pharmacologique de nouveaux inhibiteurs de type bi-substrats, analogues de l'adénosine et de la désoxycytidine, conçus par une approche rationnelle. Ces deux études ont permis respectivement d'identifier un dérivé flavanone plus stable et plus actif que le composé de référence et deux dérivés quinazoline-quinoléine très prometteurs, actifs sur les DNMT et dans les lignées cellulaires, à la fois pour la réexpression d'un gène rapporteur mais surtout dans l'induction de la déméthylation du GST CDKN2A et de sa réexpression. Pour identifier les partenaires de DNMT, nous avons employé une approche de chemobiologie (" Activity-Based Protein Profiling - ABPP ") basée sur la conception de sondes chimiques comportant un inhibiteur de DNMT. Ces sondes, utilisées sur des cellules vivantes, permettent, grâce à une étape de fonctionnalisation par chimie bioorthogonale, de purifier les protéines partenaires des DNMT. Vingt sondes ont été synthétisées et leurs activités ont été évaluées sur des modèles enzymatiques et cellulaires. Les sondes sélectionnées ont été utilisées dans des lignées cellulaires cancéreuses pour purifier les protéines partenaires qui ont ensuite été identifiées par analyse protéomique. Suite à leur validation, ces protéines pourront constituer de nouvelles cibles de la méthylation aberrante de l'ADN dans les cancers. / DNA methyltransferases (DNMTs) catalyse DNA methylation, one of the most studied epigenetic marks. In cancers, a specific hypermethylation of the promoters of the tumour suppressor genes (TSGs) is observed, which leads to their silencing. This abnormal DNA methylation pattern participates to the maintenance and the progression of the tumour. Today, the mechanisms that direct this specific hypermethylation of TSG promoters and their transcriptional repression in cancers are still unknown. The aim of my PhD is to identify DNMT inhibitors that are able to reactivated TSGs in cancer cells but also to identify the DNMT partners that address specifically these enzymes to TSG promoter regions. Such partners can constitute new anticancer "epitargets" to indirectly target DNA methylation specifically in cancer cells. Two families of DNMT inhibitors were studied. The first one starts from the chloronitro-flavanones previously identified by screening. New derivatives including bromonitro-flavanones were synthesised aiming at improving compound stability. I pharmacologically characterised these compounds and show for one of them an increased stability and activities compared to reference compound. In parallel, I synthesised and pharmacologically characterised new bi-substrate analogue inhibitors, mimicking the adenosine and the deoxycytidine. Two very promising quinazoline-quinoline derivatives were identified. They are active against DNMT and in cell lines, both for reexpression of a reporter gene but mostly in CDKN2A TSG demethylation inducing its reexpression. To identify DNMT partners we adopted a chemical biology approach (Activity-Based Protein Profiling (ABPP)) based on the use of chemical probes including in-house non- nucleoside DNMT inhibitors as bait to trap the DNMT partners. We designed and synthesised twenty chemical probes and evaluate them using enzymatic and cellular-based assays. Selected probes were used to carry out ABPP directly in living cells. After functionalization by bioorthogonal chemistry, DNMT protein partners were purified and identified by proteomic analysis. Target validation would enable to determine new targets for the aberran