Une des premières caractéristiques reconnues dans les cellules cancéreuses fut l’observation d’aberrations chromosomiques au cours de la division cellulaire. Parmi ces aberrations, on retrouve l’aneuploïdie, une mutation génétique définie par un nombre de chromosomes anormal de la cellule. Première cause associée aux fausses couches et au retard mental, l’aneuploïdie participe également à la progression tumorale. Plusieurs mécanismes sont mis en place par la cellule pour parer à ces aberrations chromosomiques. Le « spindle assembly checkpoint » (SAC) fait partie de ces mécanismes qui assurent la ségrégation précise des chromosomes au cours de la mitose. La kinase à double spécificité MPS1 codée par le gène TTK est une composante critique du SAC. La régulation de l’activité et de la localisation de MPS1 reste encore incomprise dans son ensemble. La localisation de MPS1 aux kinétochores (KT, structure des centromères permettant la mise en place du SAC) nécessite une région d’environ 50 acides aminés appelée NTE (N-Terminal Extension) qui ne possède pas de domaine fonctionnel clairement défini. Des données récentes ont montré que la région N-Terminale de MPS1 est impliquée dans la régulation de son activité. L’objectif principal de ces travaux est de comprendre dans quelle mesure la région NTE participe à la régulation de l’activité kinase et à la localisation de MPS1. Mettant en place une approche basée sur l’hypothèse que la conservation de la structure à travers l’évolution peut correspondre à une fonction, nous avons mis en évidence que la région NTE de MPS1 contribue à sa localisation et son activation par 2 modules indépendants. Nous avons démontré que les résidus 19-29 sont absolument requis pour la localisation de MPS1 déterminant ainsi plus précisément une région responsable de sa localisation. Cette région est également nécessaire pour diminuer l’interaction entre MPS1 et sa protéine partenaire ARHGEF17/TEM4 qui participe à son recrutement au KT, régulant de ce fait la localisation de MPS1. Le second module concerne les résidus 40-49 et c’est en particulier la phosphorylation de cette région qui contribue à l’activation de la kinase, vraisemblablement par la relâche d’un mécanisme d’auto-inhibition de la kinase. Ce mécanisme, participant à la régulation de l’activité kinase de MPS1, semble se produire successivement avec la dimérisation, puis la phosphorylation initiale de la région NTE et est enfin suivie de la trans-autophosphorylation de la boucle d’activation du domaine kinase. L’importance de la région NTE dans l’accomplissement des fonctions de MPS1 au cours de la mitose a été démontrée ainsi que la nécessité de ces deux régions particulières de la NTE requises indépendamment pour le fonctionnement optimal et le maintien de la robustesse du SAC. Ainsi, cette thèse apporte des informations supplémentaires et indispensables à la compréhension des mécanismes régulant l’activité kinase et la localisation au kinétochore de MPS1 par l’intermédiaire de sa région NTE. / One of the first recognized characteristics in cancer cells was the observation of chromosomal aberrations during cell division. Among these aberrations, there is aneuploidy, a genetic abnormality defined by having an incorrect number of chromosomes in the cell. As the leading cause of miscarriages and mental retardation, aneuploidy also contributes to tumor progression. Several mechanisms are established by the cell to counter these chromosomal aberrations. The "spindle assembly control point" (SAC) is one of these mechanisms which ensures accurate segregation of chromosomes during mitosis. The dual specificity kinase MPS1 coded by the TTK gene is a critical component of the SAC. The regulation of the activity and the localization of MPS1 is still not wholly understood. The localization of MPS1 to the kinetochores (KT, structure of the centromeres allowing SAC organization) requires a region of approximately 50 amino acids called NTE (N-Terminal Extension) which does not exhibit a known functional domain. Recent data have demonstrated that the N-Terminal region of MPS1 is involved in the regulation of its activity. The main objective of this project is to understand to what extent the NTE region participates in the regulation of the kinase activity and the localization of MPS1. Using a structure-based approach, we have demonstrated that the NTE region of MPS1 contributes to its localization and activation by 2 independent modules. We demonstrated that residues 19-29 are absolutely required for the localization of MPS1, thus defining more accurately the region responsible for its localization. This region is also necessary to decrease the interaction between MPS1 and its partner protein ARHGEF17/TEM4, which participates in its recruitment to the KT thereby regulating the localization of MPS1. The second module concerns the residues 40-49, especially the phosphorylation of this region which contributes to the activation of the kinase, presumably by the release of a mechanism of auto-inhibition of the kinase. This mechanism, which participates in the regulation of the MPS1 kinase activity, appears to occur successively with dimerization then the initial phosphorylation of the NTE region and finally followed by trans-autophosphorylation of the activation loop of the kinase domain. The importance of the NTE region in performing the functions of MPS1 during mitosis has been demonstrated as well as the need for these two particular regions of the NTE which are independently required for optimal functioning and maintaining the robustness of the SAC. Thus, this thesis provides additional and indispensable information for understanding the mechanisms regulating the kinase activity and the kinetochore localization of MPS1 via its NTE region.

Le point de contrôle d’assemblage du fuseau mitotique (SAC) est un système de surveillance conservé chez les eucaryotes permettant un attachement précis entre les kinétochores et les microtubules. Le SAC empêche la progression mitotique jusqu'à ce que soit généré un attachement et une tension correcte entre les kinétochores et les microtubules. La dérégulation du SAC a des conséquences graves avec de l'aneuploïdie retrouvé dans la plupart des tumeurs solides. BUB1 est une kinase sérine/thréonine requise pour le fonctionnement du SAC. Elle possède à la fois des rôles dépendants et indépendants de sa fonction kinase. Ce projet définit plusieurs fonctions associées à BUB1 lors de la mitose. L'utilisation d’outils in vivo et in vitro ont permis d’identifier plusieurs sites d'autophosphorylation sur Bub1. Nous avons testé et confirmé le site T589 de BUB1 comme un site d'autophosphorylation. Un mutant de ce site (BUB1-T589A) a été exprimé de manière stable et un anticorps phosphospécifique a été généré pour étudier ce site. Le rôle structural des domaines de BUB1 a été rapporté précédemment. Nous montrons que quand le domaine d'extension du domaine kinase (aa 724-780) située en N-terminal du domaine kinase est nécessaire pour l’autophosphorylation de BUB1-T589 et l'activité de la kinase BUB1, le TPR à l’extrémité N-terminale est localisée normalement kinétochores et n’est pas requis pour l'activité kinase. BUB1-T589A a modifié le taux de renouvellement au kinétochores. Cela conduit à la propagation des signaux de SGO1 et de H2ApT120 au niveau des bras des chromosomes. Enfin, l’autophosphorylation en T589 régule le congression des chromosomes mais pas la fonction de BUB1 pour le SAC. De plus nous montrons que l'inhibition de PLK1, une autre kinase sérine/thréonine, augmente la localisation de BUB1 aux kinétochores après la suppression BUB3 dans les cellules humaines. Ainsi, PLK1 peut réguler la localisation de BUB1 aux kinétochores. Nous montrons également que cette régulation se produit à travers KNL1, une protéine d'échafaudage du SAC. PLK1 pourrait réglementer BUB1 kinétochore localisation pour influencer la progression mitotique. Des futures études se concentreront sur l’élucidation de mécanismes derrière ces interactions. / The Spindle assembly checkpoint (SAC) is a monitoring system conserved in eukaryotes for accurate attachments between kinetochores and microtubules. The SAC precludes mitotic progression until correct attachments and tension between kinetochores and microtubules is generated. Deregulation of the SAC has the severe consequence of aneuploidy found in most solid tumors. BUB1 is a serine/threonine kinase required for the SAC function. It has both kinase-dependent and kinase-independent roles. This project defines several BUB1 associated functions during mitosis. Using in vivo and in vitro tools several autophosphorylation sites on BUB1 were identified. We tested and confirmed BUB1 T589 as an autophosphorylation site. A mutant of this site (BUB1-T589A) was stably expressed in cells and a phosphospecific antibody was generated to study this site. The role of structural domains of BUB1 has been studied earlier. We show that while the kinase extension domain (aa 724-780) located N-terminal to the kinase domain is required for BUB1-T589 autophosphorylation and BUB1 kinase activity, the TPR at the N-terminus localizes normally to kinetochores and is not required for kinase activity. BUB1-T589A has altered turnover at kinetochores. This leads to the spread of SGO1 and H2ApT120 signal to chromosome arms. Finally, autophosphorylation at T589 regulates chromosome congression but not the SAC function of BUB1. We further show that inhibition of PLK1, another serine/threonine kinase, increases BUB1 kinetochore localization after BUB3 depletion in human cells. Thus, PLK1 can regulate BUB1 kinetochore localization. We also show that this regulation occurs through KNL1, a scaffold protein of the SAC. It is possible that PLK1 could regulate BUB1 kinetochore localization to influence mitotic progression. Future studies will focus on elucidation of mechanism behind these interactions.

BubR1 est une protéine importante dans le point de contrôle de la mitose pour la stabilisation des interactions entre kinétochores et microtubules (KT-MT). Ces fonctions protègent de la ségrégation anormale des chromosomes et de l’instabilité du génome. BubR1 possède des sites de phosphorylation mitotique hautement conservés dans le domaine régulant l’attachement des kinétochores (KARD), où S676 et S670 sont phosphorylées respectivement par la kinase polo-like 1 (Plk1) et par la kinase cycline-dépendante 1 (Cdk1). Ces sites de phosphorylation sont essentiels pour le recrutement de la phosphatase PP2A-B56, qui stabilise les interactions KT-MT. Nos résultats montrent que la délétion entière ou des mutations qui déstabilisent le domaine pseudokinase de BubR1, causent la perte de phosphorylation des résidus S676 et S670 en mitose. Notre hypothèse est que le domaine pseudokinase de BubR1 peut jouer un rôle essentiel dans la régulation de la phosphorylation du KARD et donc dans la stabilisation des interactions KT-MT. / The mitotic protein BubR1 functions in the spindle assembly checkpoint (SAC) by stabilizing kinetochore-microtubule (KT-MT) interactions. These functions protect the cell from abnormal chromosome segregation and genome instability. BubR1 has highly conserved mitotic phosphorylation sites in the kinetochore-attachment regulatory domain (KARD); the residue S676 is phosphorylated by polo-like kinase-1 (Plk1) and S670 is phosphorylated by cyclin-dependent kinase-1 (Cdk1). These phosphorylation sites are essential for KARD recruitment of protein phosphatase PP2A-B56, which stabilizes KT-MT interactions. Our results show that mutations that cause pseudokinase domain instability and a highly stable truncation mutant of BubR1 were found to cause loss of mitotic S676 and S670 phosphorylation. We hypothesize that the pseudokinase domain of BubR1 may play an important role in the regulation of KARD phosphorylation and thus the stabilization of KT-MT interactions.

La cytogénétique est une branche de la génétique qui étudie les chromosomes et leur intégrité ainsi que les conséquences de leur transmission et de leur expression. Plusieurs syndromes et maladies ont pu être expliqués par cette discipline. Certaines anomalies chromosomiques de structure ont d'ailleurs contribué à identifier des gènes, des fonctions de gènes ou à caractériser des structures chromosomiques. Dans cet ordre d'idées, nous avons utilisé deux isodicentriques du bras long du chromosome Y (idic(Y)(p11.3)) pour étudier la fonction d'une protéine du kinétochore, CENP-B, dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore. Pour ce faire, nous avons premièrement fait une caractérisation cytogénétique des deux idic(Y)(p11.3) à l'aide des techniques de cytogénétique classique et de cytogénétique moléculaire. Nous avons ainsi déterminé approximativement le point de cassure des deux isodicentriques, soit en Yp11.3. Comme les deux chromosomes avaient une structure très semblable, mais que les patients présentaient un phénotype clinique très différent, nous avons investigué les niveaux de mosaïcisme dans différents tissus chez les deux patients. Il est connu qu'un chromosome possédant deux centromères capables de former le kinétochore peut être très instable lors des divisions cellulaires. Ainsi, la cellule a mis au point un mécanisme permettant d'inactiver un des kinétochores du chromosome dicentrique. Une récente revue a proposé que la protéine CENP-B jouerait un rôle dans ce mécanisme. Cependant, comme le chromosome Y ne possède pas la séquence d'ADN liant cette protéine, il était intéressant de vérifier si une inactivation des kinétochores avait eu lieu dans nos idic(Y)(p11.3). À l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine CENP-C, connue comme un marqueur de kinétochore actif, nous avons montré que plus de 40% des chromosomes dicentriques avaient subi une inactivation d'un de leur kinétochore. Enfin, la présence de la protéine CENP-B dans ces kinétochores a été étudiée. Nous avons montré que la protéine CENP-B était présente à tous les autres centromères, sauf ceux de l'idic(Y)(p11.3). Ainsi, nous proposons que la protéine CENP-B n'est pas impliquée directement dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore du chromosome Y. Par contre, nous ne pouvons pas exclure qu'elle joue un rôle indirect, soit par une interaction protéine/protéine, soit à une étape en amont dans le mécanisme d'inactivation.

Dans la plupart des eucaryotes, il n’existe qu’une seule région centromérique par chromosome et celle-ci est capable d’être liée au fuseau mitotique via le complexe du kinétochore. Dans ce contexte, la présence de deux centromères est un défi pour une séparation normale. Au cours de la mitose, la capture des deux centromères de la même chromatides vers les pôles opposés génère un pont d’anaphase résultant en une rupture entre les centromères. Les extrémités libérées peuvent être fusionnées bout à bout recréant ainsi un dicentrique. Le chromosome entre alors dans un cycle de Rupture Cassure Pont, capable quelques cycles d’entrainer des modifications profondes du nombre de copies de gène qui peuvent contribuer à l'oncogenèse et résistance à la chimiothérapie. Malgré son importance, le mécanisme de rupture reste pour une grande partie inexploré. Ce projet permet l’analyse de la rupture des chromosomes dicentriques en utilisant le modèle de la levure bourgeonnante, Saccharomyces cerevisiae. Nous utilisons des souches dicentriques conditionnelles dans lequelles un chromosome, portant un centromère conditionnel sous le contrôle de deux promoteurs inductibles au galactose, est fusionné à un autre chromosome natif par recombinaison homologue. Nous avons observé que les chromosomes dicentriques ont tendance à casser dans le voisinage des deux centromères. La région de la rupture se répand sur ~ 30 kb vers l'autre centromère. Une insertion d’un fragment d’ADN 1-kb possédant un centromère ectopique dans un chromosome avec un centromère conditionnelle établit un point chaud d’environs 30 kb indiscernables des points chauds à centromères natifs. En outre, la taille de zone de rupture n’est pas corrélée à la distance intercentromerique (des intervalles de 30-600 kb ont été testés). Cela indique que la plus forte propension à rompre est une conséquence de la structure ou de la fonction des centromères et est sans rapport avec les séquences environnantes des chromosomes. Il est encore difficile de savoir si la rupture aux centromères a une fonction physiologique, mais nous pouvons supposer que ce point chaud peut favoriser les réarrangements d'ADN dans ces régions permettant ainsi l’inactivation du centromère et donc le retour à un caryotype stable. Globalement dans la S.cerevisiae, les dicentriques cassent dans les régions péricentromériques ou dans les fusions de télomères quand ils sont présents. Fait intéressant, les séquences télomériques internes, à savoir les répétitions TG₁₋₃, établissent plusieurs points chauds de rupture à une fréquence similaire. En perspective, il serait intéressant d'aborder les questions suivantes : 1) Quelles sont les caractéristiques qui rendent une région plus sujette à la casse ? 2) Quelles sont les positions de rupture au niveau des nucléotides ? 3) Existe-t-il un contrôle de la cassure des chromatides exercé dans la cellule ? 4) Quelle peut être la fonction biologique des points chauds de cassures ? / In most eukaryotes, there is one defined centromeric region per chromosome that links it to the spindle apparatus via the kinetochore complex. In this context, the presence of two centromeres is a challenge for an accurate segregation. During mitosis, the capture of the two centromeres of the same chromatid to opposite poles generates anaphase bridges that results in breakage between the centromeres. The released ends can be fused end-to-end thus recreating dicentric. It enters breakage-fusion-bridge cycles that, in multiple rounds, can result in large gene copy number alterations that can contribute to oncogenesis and chemotherapy resistance. Despite of its significance, the mechanism of breakage remains for a large part unexplored. This project adresses the dicentric breakage using a budding yeast, Saccharomyces cerevisiae. We use conditional dicentric strains, where a chromosome, bearing a conditional centromere under the control of two galactose-inducible promoters, is fused to another native chromosome by homologous recombination. We observed that dicentric chromosomes tend to break in the vicinity of the two centromeres. The breakage region spreads over ~30 kb towards the other centromere. An insertion of a 1-kb ectopic centromere in a chromosome with a conditional centromere establishes a ~30 kb hot spot indistinguishable from the hot spots at native centromeres. Furthermore, the size of breakage region is unrelated to an intercentromeric distance (30-600 kb intervals were tested). This indicates that the higher propensity to break is a consequence of centromere structure or function and is unrelated to the native surrounding sequences. It is yet unclear whether breakage at centromeres has a physiological function but we can speculate that this hot spot may favour local DNA rearrangements that result in centromere inactivation and thus the return to a stable karyotype. Overall in budding yeast, dicentrics break at pericentromeric regions or at the telomere fusions when they are present. Interestingly, internal telomeric sequences, i.e. TG₁₋₃ repeats, establish several breakage hot spots with a similar frequency. In perspective, it would be interesting to address the following questions: 1) What are features that make a region more prone to breakage? 2) What are the positions of breakage at nucleotide level? 3) Is there a coordination of dicentric chromatid breakage? 4) What can be the biological function of dicentric breakage hot spots?

Les centromères contribuent à garantir la distribution égale de l'ADN en mitose. Leur identité n'est pas codifiée par la séquence d'ADN, mais de manière épigénétique par le variant de l'histone H3 CENP-A. Dans des lignées cellulaires humaines transformées, CENP-A est incorporé au centromère par son chaperon HJURP, au début de la phase G1. Pendant ma thèse, j'ai utilisé le modèle murin pour étudier les particularités de la chromatine centromérique et son dysfonctionnement dans le cancer. J'ai montré que CENP-A est maintenu sur le génome paternel au cours de la spermatogenèse, contrairement aux autres histones, et peut constituer une marque transgénérationnelle du centromère. Nous avons généré une souris KO pour HJURP pour l'étudier in vivo, et avons détecté son amplification dans de multiples souches de souris. En parallèle, nous avons étudié l'interaction entre la dynamique des variants d'histone et la structure d'ordre supérieur de la chromatine centromèrique. Nous avons découvert que la réorganisation de l'hétérochromatine péricentrique au cours du cycle cellulaire contrôle les deux modes distinctifs d'incorporation des variants d'H2A et la stoechiométrie de CENP A. Pour explorer le lien entre la tumorigenèse et la surexpression de CENP A/HJURP dans des cancers humains, nous avons utilisé un modèle de transformation de fibroblastes murins embryonnaires. Dans le fond génétique nul pour p53 de ces cellules, la surexpression exogène des deux facteurs n'apportait pas un avantage prolifératif mesurable, mais leur accumulation était une conséquence de la transformation. Actuellement, nous analysons si cette surexpression contribue à augmenter la capacité de transformation. / Centromeres are genomic loci ensuring equal distribution of the two sets of chromosomes in mitosis. Their identity is not encoded in the underlying DNA sequence but specified epigenetically by the histone H3 variant CENP-A. In transformed human cell lines, CENP A is deposited at centromeres by the histone chaperone HJURP in a distinct window of the cell cycle. During my PhD I have taken advantage of the mouse model to address cell cycle and developmental features of centromeric chromatin, as well as its dysfunction in cancer.Using an organism-level approach, I could observe that contrary to most histones, CENP-A is retained on the paternal genome during spermatogenesis, acting as a transgenerational mark of the centromere. To study the role of HJURP in vivo, we generated a knockout mouse and discovered that its genomic locus underwent amplification in several mouse subspecies.In parallel, we addressed the crosstalk between histone variant dynamics and higher-order chromatin structure at the centromere, and revealed that the dynamic reorganization of pericentric heterochromatin during the cell cycle controls the distinct incorporation of H2A variants and CENP-A stoichiometry.Finally, to explore the connection between tumorigenesis and CENP-A/HJURP overexpression, recorded in a number of human cancers, we used a mouse embryonic fibroblast model of transformation. We determined that whereas their overexpression did not confer a measurable proliferative advantage in a p53-deficient background, CENP-A/HJURP upregulation was a consequence of transformation. Whether their accumulation has a functional role to enhance tumorigenesis in this system was further investigated.

L'endoribonucléase RNase L est essentiellement connu comme étant un acteur critique de l'immunité innée pour enrayer la progression d'une infection virale en clivant les ARN cellulaires. Son activité est régulée par de nombreux facteurs tels que la 2-5A et son inhibiteur, la RLI. Au cours de cette étude, nous avons démontré une implication de l'activité de la RNase L dans la régulation de la structure du domaine centromérique. Nous présentons dans ce manuscrit, les perturbations majeures engendrées par une augmentation ou une inhibition de l'activité de la RNase L représentées par une délocalisation de HP1-alpha et de CENP-C causant une déstructuration générale des chromosomes. Ces délocalisations de protéines centrales de la structure chromatinienne seraient causées par un défaut de la maturation des transcrits majeures péricentromériques lors d'une modulation de l'activité de la RNase L. Pour terminer, nous avons également identifié un potentiel trafic cyto-nucléaire empreinté par la RNase L. Nous proposons ainsi une fonction nucléaire inattendue de la RNase L par son implication dans la régulation des transcrits péricentromériques assurant l'intégrité structurale de la chromatine. / The endoribonuclease Latente (RNase L) is mostly known as a critical factor in the innate immunity during the cell's defence against a viral infection. The antiviral activity of RNase L which is characterize by it capacity of cleavage of viral RNA, is regulated by several factors like it activator the oligoadénylates 2-5A and his inhibitor RLI. In this manuscript, we have studied the role of the activity of RNase L in the regulation of the structure of centromeric domains. Our results show a general destructuration of chromosomes observed in cells over-expressing RNase L or RLI. These major aberrations are demonstrated by a delocalization of essentials proteins for the structure of chromatin: HP1-alpha and CENP-C. The mislocalization of these proteins could be provoked by a default in the maturation of major transcripts due to a modulation of the activity of RNase L. moreover, in this study, we have identified a mechanism regulating the cyto-nuclear shuttling of RNase L. therefore, we propose that a new nuclear function of RNase L: it's implication in the regulation of pericentromeric transcripts needed to stabilize the integrity of the structure of chromatin.

Pour assurer une ségrégation correcte des chromosomes, la cohésion entre les deux chromatides sœurs doit être protégée au centromère contre la vague de phosphorylation du "prophase pathway", depuis la prophase jusqu'à la transition métaphase-anaphase. Cette protection est sous contrôle de la shugoshine (Sgo1), une protéine recrutée au centromère par la thréonine 120 de l'histone H2A phosphorylée par la kinase Bub1. Mon équipe d'accueil a montré que la déplétion de la désacétylase HDAC3 conduit à l'acétylation et la perte de la di-méthylation de la lysine 4 de l'histone 3 au centromère. Cette acétylation forcée de H3K4 est corrélée avec un défaut de la protection de la cohésion et une perte de la localisation des acteurs majeurs de cette protection. L'objectif général de ma thèse est de déterminer le rôle de la protéine kinase CDK11p58 dans la protection de la cohésion. Nous avons pu confirmer que CDK11p58 est nécessaire à la protection de la cohésion centromérique. Des analyses de déplétion de CDK11 montrent une séparation précoce des chromatides sœurs. Cette séparation est corrélée à une perte de la localisation de Bub1, de la phosphorylation de H2A-T120 et de Sgo1 au centromère, mais la diméthylation de H3K4 reste intacte. Grâce à des expériences de FISH en utilisant des sondes qui ciblent la région centromérique du chromosome 11, nous avons démontré que CDK11 protège la cohésion des chromatides sœurs à partir de la mitose mais pas en interphase. En utilisant des lignées exprimant la forme sauvage ou mutée sur le domaine kinase de CDK11p58, nous avons démontré que l'activité kinase de cette protéine est nécessaire pour ce processus de protection. Les résultats de ma thèse documentent le rôle de l'activité kinase de CDK11p58 dans la protection de la cohésion des chromatides sœurs. Ces résultats montrent l'existence d'un substrat de CDK11p58 impliqué dans le recrutement au centromère des facteurs de cohésion qui assurent la protection des cohésines centromériques contre le "prophase pathway". / Sister chromatid cohesion during the early stages of mitosis is essential to ensure faithful chromosome segregation. Sister chromatid cohesion is established in S phase and is maintained at centromeres until the metaphase to anaphase transition. Protection of cohesion at centromeres is under the control of the Bub1 kinase which phosphorylates histone H2A on threonine 120. Phosphorylated H2AT120 recruits the cohesion protection factor shugoshin (Sgo1) at centromeres. We had previously reported that depletion of the HDAC3 deacetylase induces acetylation of histone H3 lysine 4 at the centromere and loss of dimethylation at the same position. Forced acetylation of H3K4 at centromeres correlates with impaired Sgo1 recruitment and loss of sister chromatid separation. Cdk11p58, a member of the p34cdc2 related protein kinase family, is a G2/M specific protein, involved in different cell cycle events such as centrosome maturation, spindle formation or centriole duplication. It has also been reported as being involved in sister chromatid cohesion. Here we report that, upon cdk11p58 depletion, sister chromatids do not prematurely separate until the early stages of mitosis. We confirm that Cdk11p58 depletion induces a loss of Bub1 and Sgo1 from the centromeres and we show that H3K4 dimethylation is not affected by Cdk11p58 depletion. We report that depletion of endogenous Cdk11p58 in a cell line expressing a kinase-dead version of Cdk11p58 do not rescue the premature sister chromatid separation phenotype. Thus, phosphorylation of an unknown susbtrate by Cdk11p58 is necessary to maintain Bub1 at centromeres and our efforts are now directed towards its identification.

Chez le cilié Paramecium tetraurelia, la différentiation du génome somatique à partir du génome germinal est caractérisée par la délétion massive et reproductible d'éléments transposables et de 45 000 courtes séquences en copie unique dispersées sur l'ensemble du génome. Des petits ARN non codants produits par la lignée germinale, les scanARN, sont impliqués dans la régulation épigénétique des délétions d'ADN mais les mécanismes sous-jacents sont peu compris. Nous avons montré que la triméthylation de H3 (H3K27me3 et H3K9me3) présente une localisation dynamique pendant le développement du noyau somatique qui est altérée si l'endonucléase requise pour les événements d'élimination d'ADN est déplétée. Nous avons identifié une histone méthyltransférase, Ezl1p, nécessaire à la méthylation de H3 et requise pour les réarrangements du génome. Des analyses à l'échelle du génome entier ont montré que Ezl1p et les scanARN sont nécessaires à l'élimination des longues séquences germinales répétées tandis que les courtes séquences uniques présentent des sensibilités différentes à la déplétion de ces facteurs. Des déterminants cis tels que la longueur de l'ADN à éliminer peuvent contribuer à définir les séquences délétées. Dans une seconde étude, nous avons montré que chez Paramecium, la fonction centromérique est restreinte aux chromosomes germinaux. Un processus d'inactivation des centromères se produit pendant le développement du noyau somatique. L'endonucléase requise pour la délétion des séquences germinales est nécessaire pour l'inactivation des centromères suggérant fortement que l'inactivation des centromères germinaux repose sur l'élimination physique de l'ADN centromérique. / In the ciliate Paramecium tetraurelia, differentiation of the somatic genome from the germline genome is characterized by massive and reproducible deletion of transposable elements and of 45,000 short, dispersed, single-copy sequences. A specific class of small RNAs produced by the germline during meiosis, the scnRNAs, are involved in the epigenetic regulation of DNA deletion but the underlying mechanisms are poorly understood. We showed that trimethylation of histone H3 (H3K27me3 and H3K9me3) displays a dynamic nuclear localization that is altered when the endonuclease required for DNA elimination is depleted. We identified the histone methyltransferase Ezl1p responsible for H3 methylations establishment and showed that it is required for correct genome rearrangements. Genome-wide analyses showed that scnRNA-mediated H3 methylation is necessary for the elimination of long, repeated germline DNA, while single copy sequences display differential sensitivity to depletion of the scnRNA pathway or Ezl1p. Our study reveals cis acting determinants such as DNA length that may contribute to define the deleted germline sequences. In a second study, we showed that in Paramecium cells, the centromeric function is restricted to the germline chromosomes. A process of centromere inactivation occurs during the development of the somatic lineage, concomitantly with the events of DNA elimination. Our genetic analyses show that the endonuclease required for DNA elimination and Ezl1p but not the scnRNA are necessary for centromere inactivation. Our data strongly suggest that centromere inactivation relies on the physical elimination of the centromeric sequences from the somatic genome.

Le syndrome de Bloom (BS) est une maladie génétique rare caractérisée par une forte augmentation du taux d’échanges entre chromatides soeurs, des anomalies de ségrégation des chromosomes et une prédisposition au développement de tous types de cancers. Ce syndrome est la conséquence de mutations dans les deux copies du gène BLM, codant pour une 3’-5’ ADN hélicase de type RecQ. La ou les fonctions de la protéine BLM sont encore mal définies mais les données de la littérature convergent vers un rôle de BLM dans des mécanismes de surveillance et/ou maintien de l’intégrité du génome. La protéine BLM serait impliquée dans le redémarrage de fourches de réplication bloquées pendant la phase S et serait nécessaire à la résolution de ponts anaphasiques en mitose, notamment de ponts particuliers appelées « UltraFine anaphase Bridges » (UFBs). Ces UFBs, qui relient les chromatides soeurs entre elles, ne sont pas détectables par les colorants classiques et leur présence ne peut-être révélée que par la détection des protéines PICH (Plk1-Interacting Checkpoint Helicase) ou BLM. A l’état basal, ces UFBs sont essentiellement d’origine centromérique (cUFBs).Tout l’enjeu de mon projet était de déterminer si BLM était également impliquée dans la prévention de la formation de ces cUFBs et donc si BLM jouait un rôle avant l’anaphase. Nous avons montré que BLM est recrutée aux centromères de la phase G2 jusqu’en mitose. BLM, en coopération avec la protéine PICH, est nécessaire (1) à l’organisation structurale de l’ADN centromérique, (2) à la disjonction complète des centromères, indépendamment de la voie des cohésines, suggérant une implication de ces protéines dans le processus de décaténation des centromères et (3) au recrutement de la topoisomérase IIa (Topo IIa) active aux centromères.Nos résultats révèlent ainsi une nouvelle localisation et une nouvelle fonction de la protéine BLM aux centromères et montrent pour la première fois l’implication des protéines BLM et PICH dans la décaténation centromérique avant l’anaphase. Nous proposons que BLM et PICH, par leurs activités respectives hélicase et de remodelage de la chromatine, modifient la structure des centromères pendant la pré-métaphase, rendant ainsi certaines caténations accessibles à la Topo IIa avant l’anaphase. La défaillance de ce mécanisme entraînerait la persistance de caténations centromériques non résolues avant l’anaphase. Ainsi, dans les cellules BS, la fréquence élevée de cUFBs aurait deux origines différentes : une partie correspondrait à des cUFBs formés du fait d’une décaténation défaillante des centromères avant l’anaphase, et l’autre partie correspondrait à des cUFBs « physiologiques » non résolus en anaphase. Afin de distinguer l’origine des cUFBs, nous avons appelé ceux issus de caténations non résolues avant l’anaphase les UFBs centromériques surnuméraires (SC-UFBs pour Supernumerary Centromeric UFBs). / Bloom syndrome (BS) is a rare genetic disease characterized by a sharp increase in the rate of sister chromatid exchanges, chromosome segregation abnormailities and a predisposition to the development of all types of cancers. This syndrome is caused by mutations in both copies of the BLM gene, which encodes BLM, a RecQ 3'-5 DNA helicase. The specific function(s) of BLM remain unclear, but the data from the literature converge towards a role for BLM in mechanisms monitoring and / or maintaining genome integrity. The BLM protein may be involved in restarting stalled replication forks during S phase and necessary to resolve anaphase bridges in mitosis, including particular bridges called "Ultrafine Anaphase Bridges" (UFBs). These UFBs, which link sister chromatids together, are not detectable by conventional stains and their presence can only be revealed by the detection of the proteins PICH (PLK1-interacting checkpoint helicase) or BLM. In untreated cells, UFBs originate mostly from centromeres (cUFBs).The challenge of my project was to determine whether BLM was also involved in preventing the formation of cUFBs and so, if it played a role before anaphase.We showed that BLM is recruited at centromeres from G2 phase to mitosis. BLM, in cooperation with PICH, is required for (1) structural organization of centromeric DNA, (2) completion of centromere disjunction, independently of the cohesin pathway, suggesting an involvement of these proteins in centromere decatenation process, and (3) recruitment of active topoisomerase IIα (Topo IIα) to centromeres. Thus, we report a new localization and a new function of BLM at centromeres, revealing for the first time a new role for BLM and PICH in a previously unknown centromeric decatenation mechanism, crucial for complete centromere disjunction.We propose that the combined action of BLM and PICH promotes, through their helicase and chromatin remodelling activities, respectively, the organization of centromeric chromatin, thereby rendering some centromeric catenates accessible to Topo IIa before the onset of anaphase. The failure of this mechanism may lead to the persistence of some centromeric catenations not resolved before anaphase. Thus, the increase in the frequency of centromeric UFBs in BLMdeficient cells has two different origins: cUFBs arising from catenations not resolved before anaphase and physiological cUFBs not processed at anaphase onset. Two distinguish the two cUFB origins, we defined the former as supernumerary centromeric UFBs (SC-UFBs).