Nectine-4 est une molécule d'adhérence membre de la superfamille des immunoglobulines. Elle est localisée au niveau des jonction adhérentes. Exprimée durant l'embryogenèse, nectine-4 n'est pas retrouvée dans les tissus adultes excepté la peau. Des mutations survenant au niveau du gène de la nectine-4 cause le syndrome EDSS affectant le développement de la peau. Nous avons participer à la démonstration que l'expression de nectine-4 est marqueur des carcinomes mammaires,pulmonaires et ovariens. Ainsi, nous avons étudier le role fonctionnel de l'expression de nectine-4 sur la progression tumorale. Les résultats obtenus suggèrent que nectine-4 représente une cible intéressante dans le cadre d'une stratégie d’immunothérapie anti-tumorale.Par l'utilisation d'une méthode multiplex combinant des essais biochimiques, cellulaires et algorithmiques, 5 peptides potentiellement antigéniques ont été identifiés. Toutefois,après génération de lymphocytes cytotoxiques HLA-A*0201 spécifique à partir de PBMC de donneurs sains et la mise en place" de tests de cytotoxicité dirigée; nous avons identifié un nouveau peptide antigénique produit et présenté de façon naturelle à la surface de cellules tumorales. Ce dernier est le peptide nectine-4 N°145 (VLVPPLPSL). En plus de l'identification d'un peptide antigénique, nous avons développé un anticorps monoclonal anti-nectine-4 qui a la capacité de réduire de façon spécifique et significative les capacités métastatiques des cellules tumorales nectine-4 positive.Ainsi, dans cette étude nous avons démontré que nectine-4 qui est un nouveau antigène associé aux tumeurs, affecte la progression tumorale, mais aussi il est possible de cibler cette molécule par des stratégies d'immunothérapie car nous avons pu identifiés un peptide antigénique et un anticorps monoclonal. L'efficacité d'une stratégie d'immunothérapie est en cours de réalisation actuellement. / Nectin-4 is a cell surface adhesion molecule, member of the Ig-superfamily, and is localized at adherens junctions. Nectin4 is expressed during embryogenesis but not in adult tissues, except in the skin. Mutations in nectin-4 gene in humans cause the EDSS syndrome that affects skin development (EctoDermal and Syndactly Syndrome). We and others have recently demonstrated that nectin-4 expression was a tumoral marker of breast, lung and ovarian carcinoma. We thus started to investigate the functional role of nectin-4 overexpression in breast cancer. Using in vitro and in vivo assays, the preliminary results demonstrate that nectin-4 increased the tumorigenicity of malignant cells.Altogether, these results suggest that nectin-4 might be a candidate target forimmunotherapy (vaccination and antibody based therapy). Using a multiplex approachbased on biochemical, cellular and algorithmic assays, five relevant nectin-4 epitopes were identified. Specific cytotoxic T lymphocyte (CTL) populations from healthy donors that recognized and lyzed peptide-pulsed HLA-A*0201 tumor cells were identified. HLAA*0201-restricted CTL that recognized the N4-145 (VLVPPLPSL) nectin-4 epitope was characterized extensively. This CTL kills breast tumor cells that express nectin4, strongly demonstrating that this peptide could be naturally processed and recognized by specific CTL. In parallel, we also tested a blocking monoclonal antibody against the extracellular region of nectin-4. We next demonstrated that this antibody reduced the metastatic capacity of tumors expressing nectin4. To summarize, in this study, we identified nectin-4 as a newcell surface Tumor Associated Antigen and demonstrated its likely implication in cancertumorigenesis. In parallel, we have developed the specific tools required to conduct an effective immunotherapy targeting nectin4 over-expressing cells, which are currently under investigation.

ERK3 est une protéine de la famille des MAP kinase (MAPK) classifiée comme atypique car elle présente des différences notables comparées aux propriétés redondantes des MAPK dites classiques. ERK3 est notamment une protéine très instable dégradée constitutivement par le système ubiquitine protéasome. Par conséquence, son activité biologique est principalement contrôlée par la régulation de sa dégradation. Pourtant, les facteurs impliqués dans la régulation de la stabilité de ERK3 restent mal compris. Ce travail de thèse vise ainsi à affiner notre compréhension des mécanismes de régulation de la stabilité de ERK3. De manière intéressante, nous avons montré dans une première étude qu’un pH acide stabilise fortement ERK3 alors qu’à l’inverse, un pH basique induit sa rapide dégradation par le protéasome. De plus, la déplétion génétique de NBCn1, un transporteur de bicarbonate impliqué dans la régulation du pH intracellulaire, augmente également la stabilité de ERK3. Ainsi, des variations de pH intracellulaire régulent finement la dégradation de ERK3. Nous avons également montré dans une deuxième étude l’importance de ERK3 dans la progression tumorale dans le cancer du sein. La surexpression de ERK3 au niveau transcriptionnel ou protéique est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein, que ce soit au niveau de la survie globale ou de la survie sans métastase. Ainsi, la déplétion de ERK3 entraîne une diminution drastique du nombre de métastases au foie et aux poumons. ERK3 est également impliquée dans la migration cellulaire in vitro. Nous avons montré pour la première fois que la stabilité d’une kinase peut être modulée par le pH. Or, le pH est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme, entre autres, la prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et la mort cellulaire. Les résultats obtenus pendant ce doctorat ouvrent donc de nouveaux champs d’exploration pour étudier l’activité biologique de ERK3 dans des contextes dépendants du pH. / ERK3 is an atypical member of the MAP kinase (MAPK) family because its regulation differs from the canonical module of classical MAPK. ERK3 is also an unstable protein constitutively degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore, ERK3 stability regulation is an essential element in the control of its biological activity. However, the components implied in the regulation of its stability by the UPS are mainly unknown. This thesis aims to understand the regulation mechanisms controlling ERK3 degradation to better explore its biological function. In a first study, we showed that an acidic extracellular pH strongly stabilizes ERK3. At the opposite, a basic pH triggers its rapid degradation by the proteasome. Moreover, genetic depletion of NBCn1, a bicarbonate transporter involved in the regulation of the intracellular pH (pHi), also impacts ERK3 stability. We demonstrated that pHi variation finely regulates ERK3 degradation. We also explored the role of ERK3 in breast cancer progression in a second study. In breast cancer, high ERK3 expression correlates with a poor overall survival as well as a higher risk to develop metastases. ERK3 depletion triggers a severe decrease in the number of liver and lungs metastasis in a in vivo metastasis model. We also demonstrated that ERK3 is involved in cell migration in vitro. We showed for the first time that a kinase stability is modulated by pH variation. pH homeostasis is finely regulated in cells to assure important cellular functions such as proliferation, invasion, and survival. Therefore, ERK3 protein levels regulation by the pH raises new potential functions to explore for this kinase in a context pH dependent.

La protéine tyrosine kinase c-Src est surexprimée et activée dans de nombreux cancers. De manière remarquable, Src est activé dans plus de 80% des adénocarcinomes coliques où il joue un rôle dans la carcinogenèse et la progression vers un phénotype métastatique. c-Src et son homologue viral v-Src activent un grand nombre de voies cellulaires permettant à la tumeur de proliférer, de résister à la mort cellulaire et d’acquérir des capacités accrues de migration et d’angiogenèse. Au cours de ma thèse nous avons mis en évidence un mécanisme inattendu d’échappement à l’apoptose de fibroblastes murins surexprimant de manière stable v-Src et de plusieurs lignées tumorales humaines (coliques en particulier) présentant une activité c-Src dérégulée. Nous avons montré que Src stimule la dégradation protéasomedépendantede la protéine Bik, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, connu pour être un suppresseur de tumeurs. Cette régulation post-traductionnelle du niveau d’expression de Bik est à l’origine d’une forte résistance de la voie mitochondriale de l’apoptose. L’inhibition de l’activité kinase de Src ou le blocage de la dégradation de Bik par le protéasome permettent de restaurer des concentrations normales de la protéine Bik dans les cellules transformées et de les restaurer efficacement l’apoptose. En revanche, l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 par l’ABT-737 semble moins efficace. Par ailleurs, nous avons également contribué à mettre en évidence le rôle anti-migratoire et anti-invasif du lithium sur des cellules transformées par Src. Le mécanisme moléculaire mis en jeu implique l’activation redox des protéines tyrosine phosphatases cellulaires. Enfin, nous avons participé à l’étude de peptides mimant les hélices centrales d’insertion de Bax, Bcl-xL et Bid, représentant les trois sous-groupes de protéines de la famille Bcl-2. Nous avons comparé leur comportement vis-à-vis d’une monocouche lipidique mimant la membrane mitochondriale externe ainsi que leur capacité à perméabiliser des mitochondries isolées. Nos résultats nous ont permis de proposer que les fragments centraux d’insertion membranaire des protéines Bcl-2 seraient directement impliqués dans la divergence fonctionnelle des différents sous groupes qui composent la famille / C-Src tyrosine kinase is overexpressed and activated in a number of cancers. Remarkably, Src is deregulated in more than 80% of colorectal adenocarcinoma, playing a role in carcinogenesis and progression toward a metastatic phenotype. c-Src and v-Src activate a large number of intracellular pathways which allow the tumor to proliferate, to evade the cell death machinery and to acquired enhanced migratory and angiogenic abilities. During my PhD, we discovered an unknown mechanism to evade apoptosis developed by murine fibroblasts stably overexpressing v-Src and by some human tumor cell lines with c-Srcb deregulation. We have shown that Src stimulate the proteasomal degradation of the Bik protein, a proapoptotic member of the Bcl-2 family proteins known to act as a tumor suppressor. This post-translationnal regulation of the Bik protein expression level leads to a strong resistance of the mitochondrial pathway of apoptosis. Inhibition of the Src kinase activity or of the Bik proteasome-dependent degradation restore normal levels of the Bik protein and efficiently resensitize these cells to apoptosis. Inhibition of the antiapoptotic Bcl-2 proteins by ABT737 seems to be less efficient in these cells. We also contribute to show that lithium suppresses motility and invasivity of v-Src transformed cells. The molecular mechanism involve a redox activation of the protein tyrosine phosphatases. Finally, we compared the membrane behavior and the ability to permeabilize mitochondria of synthetic peptides derived from the central helical hairpin of Bax,Bcl-xL and Bid. We showed that these structurally analogous domains have distinct membrane behavior which could account for the functional divergence between the Bcl-2 family members