Sen1 est une hélicase ARN/ADN impliquée dans la protection du génome de la levure en résolvant les hybrides ARN/ADN et dans la terminaison de la transcription de courts ARN non codants. Malgré la demande cellulaire généralisée pour l'action Sen1, son abondance cellulaire est très faible, ce qui suggère que des mécanismes régulent les niveaux de protéine Sen1 dans la cellule. Nous avons confirmé que Sen1 est dégradé via une voie dépendante du protéasome. Ce mécanisme dépend de l’activité catalytique de Glc7, une protéine phosphatase dont il a été précédemment démontré qu’elle déphosphoryle Sen1 in vitro et qu’elle interagit avec Sen1 via un motif RVxF selon des expériences à deux hybrides. Notre hypothèse de travail est que Glc7 contrôle les niveaux de protéine Sen1 via la déphosphorylation d'un phospho-dégron. Fait intéressant, un site potentiel dans la région N-terminale de Sen1 (sérine 863) qui peut fonctionner comme un phospho-dégron a été identifié dans une analyse à l'échelle du protéome de la co-occurrence de phosphorylation et d'ubiquitylation. Afin d'identifier les sites de phosphorylation Sen1 qui sont enrichis en l'absence de Glc7, nous avons réalisé une immunoprécipitation de Sen1 suivie d'une spectrométrie de masse. Cette analyse a identifié un site de phosphorylation dans Sen1 à la sérine 1505 qui pourrait agir comme un site de dégron potentiel. A noter que ce site, a également été signalé dans les études antérieures phosphoprotéomiques sur la levure. De plus, l'interaction entre Sen1 et Glc7 et l’importance du motif RVxF (par la mutation du résidu F2003) pour cette interaction ont été confirmée par co-immunoprécipitation. De manière surprenante, la prévention de cette interaction n'affecte pas la stabilité de Sen1 ou la croissance cellulaire. Dans l'ensemble, nous avons identifié un petit groupe de sites de phosphorylation Sen1 avec une pertinence biologique potentielle. Nos résultats confirment également que la mutation du motif RVxF de Sen1 altère l'interaction avec Glc7 in vivo. Ces données approfondissent notre compréhension de la régulation de la protéine Sen1 par Glc7 dans les cellules de levure qui peuvent fournir des indices sur le rôle de la sénataxine, orthologue humaine, dans les troubles neurodégénératifs. / Sen1 is an RNA/DNA helicase involved in protecting the yeast genome by resolving RNA/DNA hybrids and in the transcription termination of short non-coding RNAs. Despite the widespread cellular demand for Sen1 action, its cellular abundance is very low, suggesting that mechanisms regulate Sen1 protein levels in the cell. We have confirmed that Sen1 is degraded via a proteasome-dependent pathway. This mechanism depends on the catalytic activity of Glc7, a protein phosphatase that was previously shown to dephosphorylate Sen1 in vitro, and to interact with Sen1 through an ‘RVxF’ motif. Our working hypothesis is that Glc7 controls Sen1 protein levels via dephosphorylation of a phospho-degron. Interestingly, a potential site in the N-terminal region of Sen1 (serine 863) that may work as a phospho-degron has been identified in a proteome-wide analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk. In order to identify Sen1 phosphorylation sites enriched in the absence of Glc7, we conducted immunoprecipitation of Sen1 followed by mass spectrometry. This analysis identified one phosphorylation site within Sen1 at serine 1505 that could act as a potential degron site. Note that this site has also been reported in previous phosphoproteomic studies on yeast. Furthermore, the interaction between Sen1 and Glc7 and the importance of the RVxF motif (by mutation of residue F2003) for this interaction was confirmed by co-immunoprecipitation. Surprisingly, prevention of this interaction does not affect the stability of Sen1 or cell growth. Overall, we have identified a small group of Sen1 phosphorylation sites with potential biological relevance. Our findings also confirm that mutating the RVxF motif of Sen1 impairs the interaction with Glc7 in vivo. These data further our understanding of Sen1 protein regulation by Glc7 in yeast cells that may provide clues to the role of senataxin, human orthologue, in neurodegenerative disorders.

De nombreuses études ont mis en évidence l’importance du contrôle qualité des protéines, c’est à dire des mécanismes de reconformation (chaperons moléculaires) et de dégradation (autophagie, proteasome) des protéines dans différentes pathologies musculaires telles que la dystrophie musculaire d’Ullrich (UCMD), de Duchenne (DMD) ou d’Emery-Dreifuss (EDMD) ; cependant, à l’heure actuelle, aucune n’a été menée sur l’ensemble de ces mécanismes dans un seul et même modèle et sur des cellules musculaires avant leur différenciation en muscles. Nous nous sommes donc intéressés à la fonctionnalité des mécanismes de Contrôle Qualité des Protéines et à leurs interconnexions dans des myoblastes immortalisés de donneurs sains ou de patients atteints de DMD. Nous avons observé une augmentation de l’agrégation protéique dans les cellules DMD. Ce phénomène s’accompagne d’une dérégulation des mécanismes de séquestration par les chaperons moléculaires, conséquence d’une modulation de l’expression des protéines HSPB5 et HSPB8. Les mécanismes de dégradation sont également dérégulés; en effet, nous avons observé d’une part, une diminution de l’activité enzymatique du protéasome ainsi que des molécules d’adressage des protéines multiubiquitinées au protéasome et d’autre part, une augmentation de l’activité du facteur de transcription NF?B, de l’expression de protéines intervenant dans l’autophagie et des complexes BAG3/HspB8 conduisant à une augmentation du flux autophagique. L’ensemble de ces dérégulations reflète l’existence d’un stress d’agrégation protéique dans les myoblastes issus de patients DMD. Dans ce contexte, la modulation pharmacologique du PQC dans ces cellules pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne / Various studies have highlighted the importance of Protein Quality Control (PQC), including protein refolding (molecular chaperones) and degradation (autophagy, proteasome) mechanisms in inherited muscle disorders such as Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD), Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) or Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD); however, to date, no extensive study has been conducted on these mechanisms in a same model, in muscle cells before muscle differentiation. Thus, we were interested in PQC mechanisms functionality and their interconnection in human immortalized myoblasts from healthy donors or patients suffering from DMD. We observed an increase of protein aggregation in DMD cells. This phenomenon is accompanied by a deregulation of sequestration mechanisms by molecular chaperones, reflected by the modulation of HSPB5 and HSPB8 expression. Degradation mechanisms are also deregulated; indeed, we observed on one hand a decrease of proteasome enzymatic activity and multiubiquitinated proteins UPS-adressing molecules and on the other hand, an increase of NF?B transcription factor’s activity, involved in autophagy, and of BAG3/HSPB8 complexes, leading to an increase of the autophagic flux. These PQC defects reflect the existence of a protein aggregation stress in myoblasts coming from DMD patients. In this context, pharmacological modulation of PQC in these cells could represent a new therapeutic strategy for Duchenne Muscular Dystrophy

On estime que 10%-20% de la population mondiale est infectée chaque année par des virus influenza A (IAV) saisonniers, causant 250 à 500 000 morts. De plus ces virus présentent des risques de pandémie, et sont à ce titre un problème de santé publique majeur. Le cycle viral est dépendant de la capacité du virus à manipuler le protéome cellulaire. Par ailleurs, le système ubiquitine-protéasome (SUP) cellulaire est impliqué dans de nombreux processus de régulation cellulaires par l'induction de la dégradation de protéines, ou par la modification de leur activation ou de leur localisation sub-cellulaire. Le SUP est une cible privilégiée des virus lors de l'infection. Des études récentes indiquent qu'un réseau d'interactions entre les protéines virales des IAV et les protéines du SUP pourrait contribuer à la réplication virale et l’échappement du virus face au système immunitaire. Cependant ces interactions restent encore mal connues. Nous avons construit une banque contenant 570 facteurs du SUP, ce qui représente environ 60% des facteurs SUP humains connus. Puis nous avons mis au point une méthodologie permettant de réaliser un crible comparatif des interactions entre cette banque SUP et cinq PB2 provenant de souches de virus influenza A de virulence différentes chez l’homme : deux souches saisonnières circulant actuellement dans la population humaine (H1N1pdm09 et H3N2), deux souches hautement pathogènes chez l’homme (H7N9 et H1N1-1918) et une souche de laboratoire (H1N1-WSN). Cette première phase de cartographie a permis de sélectionner 42 facteurs du SUP interagissant avec au moins une des protéines PB2 étudiées. Par ailleurs, l’analyse des similarités de profils d’interaction PB2/UPS des souches étudiées a permis de mettre en évidence une corrélation avec le temps de circulation de chaque souche dans la population humaine. Nous avons ensuite caractérisé le rôle fonctionnel des partenaires de PB2 dans le cycle viral par des expériences de déplétion transitoire de l’expression des facteurs cellulaires par siARN, et validé 36 des 42 facteurs testés. La très grande quantité de facteurs identifiés impliqués dans le cycle viral démontre la qualité de la méthodologie développée pour l’identification de ces interacteurs. Parmi ces facteurs, nous avons étudié plus en détail le rôle de trois deubiquitinases (DUBs) dans l’infection. Nous avons montré que les DUBs sont impliquées dans les phases précoces et tardives du cycle viral. De plus, avec des collègues de Hong Kong nous avons mis en évidence que la DUB OTUB1 est impliquée dans la réponse cellulaire à l’infection produisant des cytokines, et probablement dans l’assemblage des nouveaux virions. Nous avons identifié que la DUB OTUD6A est également impliquée dans les phases tardives du cycle viral. A l’inverse PAN2 qui fait partie des complexes de poly-d’adénylation est impliqué dans les phases précoces. Nous poursuivons nos études afin d’élucider le rôle de ces DUBs dans l’infection par IAV. / An estimated 10%-20% of the world's population is affected each year by seasonal epidemic influenza, causing about 250,000 to 500,000 fatal cases. The pandemic risk reinforces the trait of influenza A virus (IAV) infection as a public health issue. The virus life cycle critically relies on its ability to manipulate the host proteome. Besides, the ubiquitin-proteasome system (UPS) is involved in many regulatory processes in mammalian cells by inducing protein degradation, mediating protein activation or shaping their sub-cellular localisation. Therefore, UPS is a prime target hijacked by viruses. Recent evidence indicates that an intricate regulatory network involving viral proteins and the cellular UPS is likely to contribute to viral replication and immune evasion of influenza A viruses. However, usurpation of the host UPS by IAV is far from being comprehensively deciphered. To gain better understanding, we assessed the interplay between the human UPS and the PB2 subunit of the influenza A virus polymerase through a global proteomic profiling approach. For that purpose, an UPS-dedicated library of 590 human cDNAs, comprising 63% of the whole human UPS, was constituted and characterised. In an initial screen, UPS factors were challenged using a high-throughput split luciferase assay for interaction with the PB2 protein from 5 influenza A strains of different pathogenicity in human. A total of 80 UPS factors emerged as potential PB2 partners, of which 42 were validated as high-confidence PB2 partners for at least one of the strains. Further comparison of interaction profiles of the 5 PB2 with the UPS by hierarchical clustering revealed an interaction dendrogram fitting with the circulation time in the human population.Functional importance of interactors was tested by siRNA-mediated knock down experiments using luciferase tagged recombinant IAV viruses. Depletion of 36 out of the 42 tested UPS factors showed an effect on the infection with all or a subset of IAV strains, underlying the strong functional output of the developed methodology. Among these factors three deubiquitinases (DUBs) were further studied to decipher their involvement in IAV viral cycle. We have shown that they are involved in early and late stage of the infection and began to draw their function in viral cycle. We demonstrated with our colleagues in Hong-Kong that OTUB1 is involved in the host cytokine response and most probably in virus assembly. OTUD6A was also shown to be implicated in late stages of the infection but we still don't know its exact role. Contrariwise, the inactive DUB PAN2, which is part of poly-deadenylation complexes, is implicated in early phase of IAV infection, but surprisingly apparently not through viral mRNA regulation. More work is on-going to precise by which mechanisms these DUBs are implicated in IAV infection.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

Le maintien de la masse musculaire est étroitement lié à la balance entre la synthèse et la dégradation des protéines. L'exercice physique est un puissant régulateur de la balance protéique et plus particulièrement l'exercice en résistance. S'intéresser à la balance protéique après un exercice s'inscrit dans une compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant aux phénomènes d'hypertrophie et/ou d'atrophie musculaire. Nos travaux mettent en évidence que l'hypertrophie obtenue dans le muscle FDP après 10 semaines d'un entraînement en résistance chez le rat, est en lien avec l'activation chronique de la voie IL-6/STAT3 après chaque exercice aigu, en partie au sein du pool de cellules satellites activées. En phase proliférative, les cellules dont la voie de signalisation STAT1/STAT3 est activée, répriment l'expression des facteurs myogéniques comme MyoD et retournent ainsi à l'état quiescent, concourant à augmenter le pool de réserve. Ces mécanismes participent à la synthèse protéique par l'apport de nouveau matériel génétique au sein des fibres musculaires conduisant à une augmentation de leur surface de section ainsi qu'à leur conversion phénotypique avec l'entraînement. L'exercice en résistance favorisant la protéolyse, nos travaux ont cherché à caractériser les systèmes protéolytiques (autophagique-lysosomal, ubiquitine-protéasome) impliqués dans la balance protéique post-exercice. Les marqueurs moléculaires étudiés (activités enzymatiques du protéasome et de la cathepsine L, expression protéique et génique de LC3B, des E3 ligases…) ne permettent pas d'expliquer clairement les +30% de protéolyse obtenus une heure après des contractions excentriques sur muscle EDL isolé de rat en condition à jeun. Des perspectives d'étude des systèmes des calpaines, des caspases et/ou des métalloprotéases matricielles sont alors à envisager. / The maintain of muscle mass is closely controlled by protein synthesis and degradation balance. Physical activity and mainly resistance exercise is a powerful stimulus to positive muscle protein balance. To understand how protein balance is regulated after exercise, cellular and molecular mechanisms leading to muscular hypertrophy and/or atrophy have to be elucidated. Our works point out that FDP muscular hypertrophy after 10 weeks of resistance training in rat is partly due to the chronically activation of IL-6/STAT3 signaling pathway, occurring in the activated satellite cell pool, after each single exercise bout. Once activated and engaged in the myogenic program, cells in which STAT1/STAT3 signaling pathway is activated, could downregulate MyoD and return to a quiescent state, leading to increase satellite cell reserve's pool. These events participate to enhance protein synthesis by the incorporation of new genetic material into muscle fiber leading to increase their cross sectional area and phenotypic shift after training. As resistance exercise increases proteolysis, our works attempt to characterize the proteolysis systems (lysosomal-autophagic, ubiquitin-proteasome) involved in protein balance after exercise. The molecular markers measured ( chymotrypsin-like and cathepsin L activities, protein and gene expressions of LC3B, E3 ligases…) could not explain the +30% of proteolysis obtained one hour after resistance eccentric contractions on EDL muscle of starved rats. Further studies based on calpains, caspases and metalloproteinase activities and/or expressions should bring us valuable information.

Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.<br />Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.<br />Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.<br />Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

Le protéasome (CP) contrôle la majorité des fonctions cellulaires par la dégradation des protéines intracellulaires. En plus d’exprimer le CP, les vertébrés expriment également l’immunoprotéasome (IP), caractérisé par des préférences de dégradation distinctes. Le rôle le mieux caractérisé pour l’IP est la génération d’antigènes adaptés pour la liaison au complexe majeur d’histocomptabilité de classe I (CMH-I). Cependant, les nombreux phénotypes observés au niveau de cellules déficientes en IP ou avec une mutation révèlent que l’IP influence des fonctions immunitaires indépendamment de la génération d’antigènes et peut atténuer le stress présent au niveau de cellules non-immunitaires. L’objectif de cette thèse était de caractériser les rôles de l’IP qui ne sont pas reliés à la génération d’antigènes associés au CMH-I. L’analyse du transcriptome de cellules dendritiques IP-déficientes en cours de maturation révèle que l’IP affecte l’expression de plus de 8 000 transcrits. L’IP affecte l’expression génique principalement au niveau transcriptionnel en contrôlant l’abondance de régulateurs de transcriptions tels que NF-κB et les membres des familles IRF et STAT. Les cellules dendritiques IP-déficientes sont également moins efficaces pour activer des lymphocytes T CD8+, même chargées artificiellement avec des quantités optimales d’antigènes associés au CMH-I. En outre, nos études montrent que l’IP est fortement exprimé au niveau de cellules de patients atteints de leucémie myéloïde aigue. L’expression de l’IP est intrinsèque aux leucémies, puisque qu’elle n’est pas corrélée à la présence de lymphocytes sécréteurs d’IFN-γ. De plus, l’expression d’IP est particulièrement élevée au niveau de leucémies monocytaires et/ou possédant un réarrangement MLL. Notamment, des analyses de corrélation montrent que l’IP est connecté à des gènes impliqués dans le métabolisme, l’activité mitochondriale et la réponse au stress. En effet l’inhibition de la sous-unité PSMB8 de l’IP mène à l’accumulation de protéines ubiquitinées et la mort de cellules leucémiques monocytaires. Globalement, nos travaux montrent que le rôle de l’IP n’est pas limité à la génération d’antigènes, mais qu’il peut contrôler l’expression génique et la survie des leucémies. / By regulating protein degradation, constitutive proteasomes (CP) control practically all cellular functions. In addition to CP, vertebrates express immunoproteasomes (IP), which display distinct substrate preferences. The first non-redundant role ascribed to IP is its enhanced ability to generate MHC I-associated antigens. However, deletion or inhibition of IP subunits can affect several immune cell functions independently of MHC-I antigen generation. Moreover, recent work has shown that IP can be expressed in non-immune cells to deal with cell stress. Thus, we wished to investigate the roles of IP that are not related to antigen generation and that are not redundant with the CP. Based on profiling of WT and IP-deficient maturing mouse dendritic cells (DCs), we report that IP regulate the expression of more than 8,000 transcripts. The broad impact of IP on gene expression is cell-autonomous, mediated mainly at the transcriptional level, and involves major signaling pathways including IRFs, NF-kB and STATs. Moreover, even when engineered to present optimal amounts of antigenic peptides, IP-deficient DCs are inefficient for in vivo T-cell priming. In addition, consistent with the fact that cancer cells endure proteotoxic stress, we report that acute myeloid leukemia (AML) cells from patients express high levels of IP genes. Expression of IP genes in AML is a cell-autonomous and IFN-independent feature that correlates with the methylation status of IP genes, and is particularly high in AML with a monocytic phenotype and/or MLL rearrangement. Notably, IP inhibition leads to accumulation of polyubiquitinated proteins and cell death in IPhigh but not IPlow AML cells. Co-clustering analysis reveals that genes correlated with IP subunits in monocytic AMLs are primarily implicated in cell metabolism and proliferation, mitochondrial activity and stress responses. Overall, our studies show that the role of IP is not limited to antigen processing and reveals major non-redundant roles for IP in transcription regulation and resistance to cell stress in AML.

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.