Les prions sont des protéines qui suite à des changements de conformation acquièrent un caractère infectieux. Ils sont à l’origine de traits dominants, héritables de façon non-Mendélienne, chez les mammifères, les champignons filamenteux et les levures. Le mauvais repliement et l’agrégation des protéines sont à l’origine de plus de 40 maladies, parmi lesquelles on retrouve des maladies neurodégénératives telles que les maladies d’Alzheimer, de Parkinson et de Huntington. Il a été montré que les formes agrégées des protéines supposées responsables de ces maladies (i.e. peptide amyloïde-β, tau, α-synucléine, huntingtine) se propagent de cellule en cellule à la manière des prions. La levure Saccharomyces cerevisiae possède plusieurs prions qui sont autant d’excellents modèles biologiques pour la compréhension des mécanismes de formation et de propagation des prions.[PSI+] et [URE3], issus respectivement de la conversion sous forme prion du terminateur de la traduction Sup35p et d’un régulateur du métabolisme azoté Ure2p, sont à ce jour les deux prions les mieux documentés chez la levure. Les chaperons moléculaires et leurs co-chaperons modulent la formation, la réplication et la propagation des prions chez la levure. Cependant, l’élimination ou la dégradation de ces prions sont encore mal connus. Notre laboratoire a montré que le protéasome 26S est capable de dégrader les formes soluble et fibrillaire de Sup35p. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le rôle du protéasome 26S dans la dégradation des formes soluble et fibrillaire d’Ure2p. Nous avons montré que, comme pour Sup35p, le protéasome 26S dégrade Ure2p soluble en générant des peptides amyloïdes issus du domaine prion N-terminal ainsi qu’un fragment C-terminal résistant à la protéolyse. Nous avons montré que le domaine prion déstructuré est nécessaire pour la reconnaissance et la dégradation par le protéasome. Contrairement à ce qui avait été observé pour Sup35p, Ure2p sous sa forme fibrillaire est totalement résistante à la dégradation protéasomale. Nous suggérons que la variabilité structurale aux seins des particules de prions dans un contexte cellulaire dicte leurs interactions avec les machineries protéolytiques, et plus particulièrement avec le protéasome.Les prions de levure ont principalement été étudiés dans un contexte de cellules en division active. Cependant, dans la nature, la plupart des cellules sont retrouvées dans un état quiescent post-mitotique. Nous n’avons que très peu d’informations sur le devenir des particules de prions lorsque les cellules entrent dans un état quiescent. De même les conséquences physiologiques des prions sur la survie à long terme des levures sont très peu documentées. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons utilisé le prion [PSI+] comme modèle pour répondre à ces questions. Différentes conformations des agrégats de Sup35p conduisent à des souches phénotypiquement distinctes du prion [PSI+]. Nous avons constaté que les agrégats de Sup35p subissent des changements ultra-structuraux et fonctionnels au cours des différentes phases de croissance cellulaire. Ainsi, nous avons observés des changements importants dans la distribution de taille et dans l’infectiosité des polymères de Sup35p résistants au SDS formant les briques élémentaires du prion [PSI+]. Ces changements interviennent sans affecter les informations structurales spécifiques à chaque souche de prion [PSI+]. De façon remarquable, bien que [PSI+] n’affecte pas le taux de croissance des levures, ce prion semble prolonger significativement la durée de vie des levures. Cet effet bénéfique semble pouvoir se fixer de façon efficace et permanente dans les cellules et persister même après élimination de [PSI+]. La fixation génétique de caractéristiques épigénétiques induites par [PSI+] ont été déjà observées et l’ensemble de ces résultats suggère que [PSI+] (et éventuellement d’autres prions) peut jouer le rôle de capaciteurs évolutifs transitoires. / “Proteinaceous infectious particles”, or prions, are self-perpetuating alternate conformations of proteins that are responsible for heritable non-Mendelian traits in mammals, filamentous fungi and yeast. On a more general note, protein misfolding and aggregation is at the origin of over forty protein folding disorders including devastating neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s or Huntington’s diseases. The aggregated proteins responsible for these diseases (i.e. amyloid-β peptide/tau, α-synuclein and huntingtin) were shown to propagate from cell to cell in a prion-like manner. The yeast Saccharomyces cerevisiae hosts many prion or prion-like proteins, unrelated in sequence and function, which proved to be excellent models for understanding the dynamics of prion aggregation and distribution upon cell division.Sup35p and Ure2p which cause the [PSI+] and [URE3] heritable traits, respectively, stand out as the most studied and best characterized yeast prions to date. A plethora of cellular factors, mostly belonging to various molecular chaperone families, were shown to affect yeast prion formation and propagation. Clearance of protein aggregates and prion particles is however poorly understood and documented. Our laboratory showed that the 26S proteasome degrades both the soluble and prion-associated fibrillar forms of Sup35p. In the first part of my thesis, we investigated the role of the 26S proteasome in the degradation of the soluble and fibrillar forms of Ure2p. We found that, as with Sup35p, the 26S proteasome is able to degrade the soluble native Ure2p, generating an array of amyloidogenic N-terminal peptides and a C-terminal fragment which is resistant to proteolysis. The N-terminal prion domain was shown to act as a degron required for proteasomal engagement and degradation. In contrast to Sup35p, fibrillar Ure2p resisted proteasomal degradation. We expect the structural variability within prion assemblies in a cellular context to dictate their interaction with proteolytic machineries in general and the proteasome in particular.The biology of yeast prions has been mostly explored in the context of logarithmically dividing cells. In nature however, most cells are generally in a post-mitotic non-dividing quiescent state. Yet little is known about the fate and properties of prion particles upon yeast cells entry into the stationary or quiescent states and the physiological consequences of harboring these prions throughout the lifespan of yeast cells. In the second part of my thesis, we addressed this issue using the [PSI+] prion as a model. Structurally different conformers of Sup35p aggregates can lead to distinct [PSI+] strains with different prion phenotypes. We found that Sup35p prion particles undergo growth phase-dependent ultrastructural and functional changes. Indeed, the size distributions of SDS-resistant core-prion particles significantly change during growth without affecting the structural information specific to each prion strain. The infectious properties of Sup35p prion particles undergo dramatic growth phase-dependent changes. Importantly, we found that while [PSI+] has little to no effects on the growth rates of yeasts, it robustly prolongs their chronological lifespan. Furthermore, this beneficial effect can then be permanently and efficiently fixed in the cells even when [PSI+] is subsequently lost. Similar genetic fixation of [PSI+]-induced epigenetic characteristics were previously observed and suggested [PSI+] (and possibly other prions) can act as transient evolutionary capacitators.

De nombreuses études ont mis en évidence l’importance du contrôle qualité des protéines, c’est à dire des mécanismes de reconformation (chaperons moléculaires) et de dégradation (autophagie, proteasome) des protéines dans différentes pathologies musculaires telles que la dystrophie musculaire d’Ullrich (UCMD), de Duchenne (DMD) ou d’Emery-Dreifuss (EDMD) ; cependant, à l’heure actuelle, aucune n’a été menée sur l’ensemble de ces mécanismes dans un seul et même modèle et sur des cellules musculaires avant leur différenciation en muscles. Nous nous sommes donc intéressés à la fonctionnalité des mécanismes de Contrôle Qualité des Protéines et à leurs interconnexions dans des myoblastes immortalisés de donneurs sains ou de patients atteints de DMD. Nous avons observé une augmentation de l’agrégation protéique dans les cellules DMD. Ce phénomène s’accompagne d’une dérégulation des mécanismes de séquestration par les chaperons moléculaires, conséquence d’une modulation de l’expression des protéines HSPB5 et HSPB8. Les mécanismes de dégradation sont également dérégulés; en effet, nous avons observé d’une part, une diminution de l’activité enzymatique du protéasome ainsi que des molécules d’adressage des protéines multiubiquitinées au protéasome et d’autre part, une augmentation de l’activité du facteur de transcription NF?B, de l’expression de protéines intervenant dans l’autophagie et des complexes BAG3/HspB8 conduisant à une augmentation du flux autophagique. L’ensemble de ces dérégulations reflète l’existence d’un stress d’agrégation protéique dans les myoblastes issus de patients DMD. Dans ce contexte, la modulation pharmacologique du PQC dans ces cellules pourrait représenter une nouvelle stratégie thérapeutique pour la Dystrophie Musculaire de Duchenne / Various studies have highlighted the importance of Protein Quality Control (PQC), including protein refolding (molecular chaperones) and degradation (autophagy, proteasome) mechanisms in inherited muscle disorders such as Ullrich Congenital Muscular Dystrophy (UCMD), Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) or Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy (EDMD); however, to date, no extensive study has been conducted on these mechanisms in a same model, in muscle cells before muscle differentiation. Thus, we were interested in PQC mechanisms functionality and their interconnection in human immortalized myoblasts from healthy donors or patients suffering from DMD. We observed an increase of protein aggregation in DMD cells. This phenomenon is accompanied by a deregulation of sequestration mechanisms by molecular chaperones, reflected by the modulation of HSPB5 and HSPB8 expression. Degradation mechanisms are also deregulated; indeed, we observed on one hand a decrease of proteasome enzymatic activity and multiubiquitinated proteins UPS-adressing molecules and on the other hand, an increase of NF?B transcription factor’s activity, involved in autophagy, and of BAG3/HSPB8 complexes, leading to an increase of the autophagic flux. These PQC defects reflect the existence of a protein aggregation stress in myoblasts coming from DMD patients. In this context, pharmacological modulation of PQC in these cells could represent a new therapeutic strategy for Duchenne Muscular Dystrophy

Les protéines Hsp70 appartiennent à une famille de chaperons moléculaires très conservés qui jouent un rôle essentiel dans le contrôle qualité des protéines et qui protègent les cellules contre diverses agressions de l'environnement. Pour fonctionner comme un chaperon moléculaire, les protéines Hsp70 agissent de concert avec plusieurs co-chaperons et co-facteurs nécessaires au fonctionnement de son cycle ATPasique. Nos travaux montrent que les bactéries du genre Mycobacterium codent pour une nouvelle famille de protéines atypiques apparentées à Hsp70 dont l'architecture s'articule autour d'un domaine ATPase putatif à l'extrémité N-terminale, similaire au domaine de la superfamille Hsp70-actine, d’un segment transmembranaire (TMD) putatif et d'une longue région riche en proline/thréonine (P/T) en sa partie C-terminale. Le but de ce travail de thèse était d’étudier la fonction et la localisation cellulaire des protéines de type Hsp70 chez les mycobactéries. Nous avons d’abord constaté que la protéine Hsp70-Like de M. smegmatis (Msmg_Hsp70-Like) se localisait en foci distincts à la membrane des cellules et que son expression induisait un phénotype d’agrégation cellulaire. Afin d’éclaircir le rôle des domaines putatifs TMD et P/T, nous avons construit un ensemble de mutants dans lesquels ces éléments structurels ont été supprimés. Nous avons constaté que le domaine TMD putatif était important pour la localisation de Hsp70-Like, pour la formation des foci à la membrane et pour le phénotype d'agrégation des cellules. En revanche, le domaine riche en P/T n’a aucun effet sur ces phénotypes. In vitro, le domaine ATPase putatif de Msmg_Hsp70-Like a été purifié et des essais de cristallisation sont en cours. Des expériences supplémentaires restent cependant nécessaires pour évaluer la fonction de cette nouvelle famille de protéines. / Hsp70 belongs to a highly conserved family of molecular chaperone proteins that unambiguously plays essential roles in protein quality control, protecting cells against various environmental insults. To function as a bona fide molecular chaperone, Hsp70 acts in concert with several co-chaperones and nucleotide exchange factors to complete its ATP-dependent chaperone cycle. Our work shows that bacteria from the genus Mycobacterium encode new atypical Hsp70-Like proteins that share a common architecture: a putative ATPase domain at the N-terminus similar to members of the Hsp70-actin superfamily, a single putative transmembrane domain (TMD) in the middle of the protein and a long proline/threonine (P/T) - rich region at the C-terminal. The aim of this thesis work was to shed light on the function and the cellular localization of Hsp70-like proteins in mycobacteria. We first found that Msmg Hsp70-Like protein localizes to discrete foci within cells and that its expression induces a cell aggregation phenotype. To shed light on the role of the putative TMD and P/T- rich domains in Hsp70-Like, we engineered a set of mutants in which these structural elements were deleted. We found that the central putative TMD was important for the cell envelop localization of Hsp70-Like, for the formation of foci and for cell aggregation. In contrast, the P/T-rich had no effect on these phenomena. In vitro the putative ATPase domain of Msmg Hsp70-Like was purified and crystallization trials were performed. Further research is needed to assess the function of this novel family of proteins.

La maladie d'Alzheimer est la démence la plus répandue dans le monde. Le nombre de cas augmente de manière exponentielle et il est donc important de comprendre les mécanismes moléculaires donnant lieu à cette terrible maladie. Une des hypothèses les plus supportées est celle suggérant que la production et dégradation déséquilibrées de l'amyloïde-beta (Aß), un peptide de 42 acides aminés trouvé dans tous les individus sains, est un événement clé dans le déroulement de la maladie d'Alzheimer. En effet, une production accrue ou une dégradation faible du peptide ont pour conséquence son agrégation et accumulation dans des plaques de fibres entre les neurones des régions spécifiques du cerveau. C'est pourquoi la modulation de l'agrégation du peptide Aß est une des approches envisageables pour modifier l'évolution de la maladie d'Alzheimer. Les protéines chaperons dont une des fonctions est d'assister d'autres protéines dans leur repliement, sont parmi les molécules les plus étudiées pour leur capacité modulatrice de l'agrégation des protéines (inclus le peptide Aß). Plusieurs chaperons ont montré la capacité d'inhiber la formation des fibres par l'Aß. Cependant, du fait que les chaperons sont des molécules conservées et peu spécifiques, leur surexpression ou administration directe peut avoir des conséquences négatives si les chaperons interagissent avec des protéines autres que la protéine cible. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à une protéine chaperon bactérienne possédant une forte activité " holdase " (i.e., elle empêche le repliement précoce des protéines) comme possible modulateur de l'agrégation du peptide Aß. Le chaperon sauvage a une très faible capacité d'inhibition de la formation de fibres par le peptide Aß. Cependant, nous avons démontré qu'en modifiant légèrement la surface de liaison du chaperon, la protéine devient un puissant inhibiteur de l'agrégation d'Aß. En parallèle, nous nous sommes intéressés à l'influence des ions métalliques sur l'agrégation du peptide Aß. [...] / Alzheimer's disease is the most frequent type of dementia. With an exponentially growing number of cases, understanding the underlying molecular events leading to this devastating condition is of crucial importance. Much evidence points to a disequilibrium in the production and degradation of amyloid beta (Aß), a normally physiological 42 amino acid peptide, as an early key event in Alzheimer's etiology. Whether Aß is overproduced or poorly degraded, the overall result is an abnormally large pool of peptide that gradually aggregates forming extracellular deposits of fibrils, called amyloid plaques, in specific brain regions. Hence, modulation of Aß aggregation process is one of the suggested approaches to control the evolution of Alzheimer's disease. Universally conserved molecular chaperones have been intensively studied for their capacity to prevent aggregation of disease-related proteins, and many of them have proven to efficiently modulate Alzheimer's Aß aggregation. In a scenario where chaperones are overexpressed or directly administered into the affected tissue, the universal conservation and the relatively poor client-specificity of generic chaperones can become a downside because of the risk of interaction with proteins other than the targeted one is not dismissible, and thus the consequences unpredictable. In the first part of this work, we looked upon a bacterial chaperone call SecB with an unusually robust holdase activity (i.e. it prevents early protein folding) as a promising modulator of Alzheimer's Aß peptide aggregation. [...]

La chaperonine CCT/TriC tient un rôle central dans le maintien de la protéostase cellulaire. Elle compte parmi ses clientes un grand nombre de protéines impliquées de près ou de loin dans la régulation du cycle comme l’actine, la tubuline et la cycline E. afin de mieux comprendre l’implication de la CCT/TriC dans la cancérogenèse, nous avons quantifié, dans 18 lignées cellulaires tumorales, une lignée issue d’un tissu sain et un tissu sain, ses taux d’expression et son activité. Nos résultats indiquent que l’expression de la CCT/TriC n’est pas toujours corrélée à son activité. Nous avons dans un second temps, documenté l’expression de ces partenaires/modulateurs d’activité, préfoldine, PhLP3, Hop/p60, Hsp/c70 et leur influence sur son activité. Nos résultats montrent que l’activité de la CCT/TriC pourrait être régulée à travers les variations des niveaux d’expression de la préfoldine et/ ou Hsp/c 70. Enfin, nous avons montré que dans les cellules qui se divisent le plus lentement, l’activité de la CCT/TRiC est la plus faible. Ces observations montrent que les variations de l’activité de la CCT/TriC pourraient constituer un point de contrôle dans la prolifération cellulaire maligne. / The molecular chaperone CCT/TRiC plays a central role in maintaining cellular proteostasis. It mediates the folding of lot of proteins involved in cell cycle regulation as the major cytoskeletal proteins tubulins and actins and the oncoprotein cyclin E. To assess the involvement of CCT/TRiC in tumor genesis, we quantified its expression levels and activity in 18 cancer, one non-cancer human cell lines and a non-cancer human liver. We show that the expression levels of CCT/TRiC in cancer cell lines are higher than that in normal cells. However, CCT/TRiC activity does not always correlate with its expression levels. We therefore documented the expression levels of CCT/TRiC modulators and partners PhLP3, Hop/P60, prefoldin and Hsp/Hsc70. Our analysis reveals a functional interplay between molecular chaperones that might account for a precise modulation of CCT/TRiC activity in cell proliferation through changes in the cellular levels of prefoldin and/or Hsc/p70 and CCT/TRiC client protein availability. Finally, our study reveals that cells with the longest doubling time host the smallest CCT/TRiC activity suggesting that CCT/TRiC-mediated client protein folding constitutes a bottle-neck in cancer cell proliferation. Our observation and approaches bring novel insights in the role of CCT/TRiC-mediated protein folding machinery in cancer cell development.

L'α-Synuclein (αSyn) fibrillaire, impliqué dans la maladie de Parkinson et d’autres synucleinopathies, peut se propager entre cellules de manière « prion-like » et cette propagation est liée à la progression de la maladie. Durant cette étude, nous nous sommes tournés vers les chaperons moléculaires impliqués dans l’agrégation de l’αSyn ou bien dans sa toxicité afin de trouver des candidats capables d’interférer avec la propagation. Nous avons ensuite testé l’effet des chaperons capables de se lier aux fibres d’αSyn sur l’internalisation des fibres d’αSyn par les cellules Neuro-2a. Nous démontrons que l’interaction avec l’αSyn agrégeant avec αB-crystallin (αBc) ou Carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP) a mené à la formation de fibres qui sont moins internalisées par les cellules. Enfin, en passant par une stratégie de pontage chimique optimisé couplé à la spectrométrie de masse, nous avons identifié les zones d’interaction entre l’αSyn fibrillaire et soit αBc, soit CHIP. Ces résidus issus des chaperons, se trouvant à proximité des fibres d’αSyn dans les complexes, pourraient être développés dans des mini-chaperons peptidiques, capables d’enrober la surface des fibres et ainsi de bloquer la liaison à la membrane et l’internalisation des fibres. De surcroît, des polypeptides issus des partenaires précédemment identifiés d’αSyn ont été testé pour leur liaison aux fibres et leur effet sur la propagation des fibres. / Fibrillar α-Synuclein (αSyn) is the molecular hallmark of Parkinson’s Disease and other synucleinopathies. Its prion-like propagation between cells is linked to disease progression. In this study, we looked to molecular chaperones previously implicated in αSyn fibrillation and/or toxicity to identify proteins capable of binding αSyn fibrillar aggregates in order to target their propagation. We further assessed the effect of the fibril-binding chaperones on internalization of αSyn fibrils by Neuro-2a cells. We demonstrate that the interaction of aggregating αSyn with αB-crystallin (αBc) or Carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP) led to the formation of fibrils that are less internalized by cells. Finally, using an optimized chemical cross-linking and mass spectrometry strategy, we identified the interaction areas between fibrillar αSyn and either αBc or CHIP. These chaperone residues, located proximally to αSyn fibrils, could be subsequently developed into peptidic mini chaperones, capable of coating the fibril surface and thereby blocking fibrillar cell binding and internalization. Furthermore, polypeptides derived from previously identified αSyn binding partners were tested for their binding to αSyn fibrils and subsequent effect on fibril propagation.