[EN] The plasma membrane H+-ATPase (Pma1) is essential for yeast growth and is activated by glucose metabolism by an unknown mechanism involving double phosphorylation of a regulatory site at the C-terminus (Ser911 Thr912). In this thesis we have investigated in Saccharomyces cerevisiae the role of two protein phosphatases, type 1 Glc7 and type 2A Sit4, and of an essential atypical protein kinase, TORC1, in the activation of Pma1 by glucose. The regulatory site of activated Pma1 can be dephosphorylated "in vitro" by recombinant Glc7 and Sit4, but inhibition "in vivo" of these phosphatases does not activate Pma1. Inhibition of Glc7 by regulated expression of a dominant-negative truncated form (the null mutant is not viable) had no effect on Pma1 activity while deletion of SIT4 gene decreased both Pma1 activity and double phosphorylation of the regulatory site. Inhibition of TORC1 protein kinase by treatment of yeast cells with the drug rapamycin or by exposure to non-permissive temperature of a temperature-sensitive mutant (tor1¿ tor2ts) inhibited Pma1 and decreased double phosphorylation of the regulatory site. We conclude that Sit4 and TORC1 are required for full activation of Pma1 by glucose while Glc7 either does not participate or is redundant with other phosphatases. / [ES] La H+-ATPasa de la membrana plasmática (Pma1) es esencial para el crecimiento de la levadura y se activa por metabolismo de glucosa por un mecanismo desconocido que lleva consigo la doble fosforilación de un sitio regulador en el extremo C-terminal (Ser911 Thr912). En la presente tesis hemos investigado en Saccharomyces cerevisiae la participación de dos proteína fosfatasas, Glc7 de tipo 1 y Sit4 de tipo 2A, y de una proteína kinasa atípica esencial, TORC1, en la activación de Pma1 por glucosa. El sitio regulador de Pma1 en su estado activo puede defosforilarse "in vitro" por Glc7 y Sit4 recombinantes pero la inhibición "in vivo" de estas fosfatasas no activa Pma1. La inhibición de Glc7 mediante la expresión regulada de una forma truncada que actúa como dominante-negativa (el mutante nulo no es viable) no tiene efecto en la actividad de Pma1 mientras que la deleción del gen SIT4 disminuye tanto la actividad de Pma1 como la doble fosforilación del sitio regulador. Inhibición de la proteína kinasa TORC1 mediante tratamiento de las células de levadura con el fármaco rapamicina o exponiéndolas a temperatura no permisiva en el caso de un mutante termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en inhibición de Pma1 y disminución de la doble fosforilación del sitio regulador. Estos resultados indican que Sit4 y TORC1 son necesarias para la máxima activación de Pma1 por glucosa mientras que Glc7 podría no participar o hacerlo de forma redundante con otras fosfatasas. / [CAT] L'H+-ATPasa de la membrana plasmàtica (Pma1) és essencial per al creixement dels llevats i s'activa gràcies al metabolisme de glucosa per un mecanisme desconegut que porta associat la doble fosforilació d'una regió reguladora a l'extrem C-terminal (Ser911 Thr912). En aquesta tesi hem investigat en Saccharomyces cerevisiae la participació de dos proteïnes fosfatases, Glc7 de tipus 1 i Sit4 de tipus 2A, i d'una proteïna quinasa essencial atípica, TORC1, en l'activació de Pma1 per glucosa. La regió reguladora de Pma1, en seu estat activat, pot desfosforar-se "in vitro" per Glc7 i Sit4 recombinants, però la inhibició "in vivo" d'aquestes fosfatases no activa Pma1. La inhibició de Glc7 mitjançant l'expressió regulada d'una forma truncada que actua com a dominant-negativa (el mutant nul no és viable) no té cap efecte en l'activitat de Pma1 mentre que la deleció del gen SIT4 disminueix tant l'activitat de Pma1 com la doble fosforilació de la regió reguladora. La inhibició de la proteïna quinasa TORC mitjançant un tractament de cèl·lules de llevat amb el fàrmac rapamicina o la seua exposició a temperatures no permissives en el cas d'un mutant termosensible (tor1¿ tor2ts) resulta en la inhibició de Pma1 i la disminució de la doble fosforilació de la regió reguladora. Aquests resultats indiquen que Sit4 i TORC1 són necessàries per a l'activació màxima de Pma1 per glucosa, mentre que Glc7 podria no participar o fer-ho d'una forma redundant amb altres fosfatases. / Mahmoud Ali Ibrahim Hamouda, S. (2015). Protein kinases and phosphatases regulating the yeast proton pump [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/54131 / TESIS

Sen1 est une hélicase ARN/ADN impliquée dans la protection du génome de la levure en résolvant les hybrides ARN/ADN et dans la terminaison de la transcription de courts ARN non codants. Malgré la demande cellulaire généralisée pour l'action Sen1, son abondance cellulaire est très faible, ce qui suggère que des mécanismes régulent les niveaux de protéine Sen1 dans la cellule. Nous avons confirmé que Sen1 est dégradé via une voie dépendante du protéasome. Ce mécanisme dépend de l’activité catalytique de Glc7, une protéine phosphatase dont il a été précédemment démontré qu’elle déphosphoryle Sen1 in vitro et qu’elle interagit avec Sen1 via un motif RVxF selon des expériences à deux hybrides. Notre hypothèse de travail est que Glc7 contrôle les niveaux de protéine Sen1 via la déphosphorylation d'un phospho-dégron. Fait intéressant, un site potentiel dans la région N-terminale de Sen1 (sérine 863) qui peut fonctionner comme un phospho-dégron a été identifié dans une analyse à l'échelle du protéome de la co-occurrence de phosphorylation et d'ubiquitylation. Afin d'identifier les sites de phosphorylation Sen1 qui sont enrichis en l'absence de Glc7, nous avons réalisé une immunoprécipitation de Sen1 suivie d'une spectrométrie de masse. Cette analyse a identifié un site de phosphorylation dans Sen1 à la sérine 1505 qui pourrait agir comme un site de dégron potentiel. A noter que ce site, a également été signalé dans les études antérieures phosphoprotéomiques sur la levure. De plus, l'interaction entre Sen1 et Glc7 et l’importance du motif RVxF (par la mutation du résidu F2003) pour cette interaction ont été confirmée par co-immunoprécipitation. De manière surprenante, la prévention de cette interaction n'affecte pas la stabilité de Sen1 ou la croissance cellulaire. Dans l'ensemble, nous avons identifié un petit groupe de sites de phosphorylation Sen1 avec une pertinence biologique potentielle. Nos résultats confirment également que la mutation du motif RVxF de Sen1 altère l'interaction avec Glc7 in vivo. Ces données approfondissent notre compréhension de la régulation de la protéine Sen1 par Glc7 dans les cellules de levure qui peuvent fournir des indices sur le rôle de la sénataxine, orthologue humaine, dans les troubles neurodégénératifs. / Sen1 is an RNA/DNA helicase involved in protecting the yeast genome by resolving RNA/DNA hybrids and in the transcription termination of short non-coding RNAs. Despite the widespread cellular demand for Sen1 action, its cellular abundance is very low, suggesting that mechanisms regulate Sen1 protein levels in the cell. We have confirmed that Sen1 is degraded via a proteasome-dependent pathway. This mechanism depends on the catalytic activity of Glc7, a protein phosphatase that was previously shown to dephosphorylate Sen1 in vitro, and to interact with Sen1 through an ‘RVxF’ motif. Our working hypothesis is that Glc7 controls Sen1 protein levels via dephosphorylation of a phospho-degron. Interestingly, a potential site in the N-terminal region of Sen1 (serine 863) that may work as a phospho-degron has been identified in a proteome-wide analysis of phosphorylation and ubiquitylation cross-talk. In order to identify Sen1 phosphorylation sites enriched in the absence of Glc7, we conducted immunoprecipitation of Sen1 followed by mass spectrometry. This analysis identified one phosphorylation site within Sen1 at serine 1505 that could act as a potential degron site. Note that this site has also been reported in previous phosphoproteomic studies on yeast. Furthermore, the interaction between Sen1 and Glc7 and the importance of the RVxF motif (by mutation of residue F2003) for this interaction was confirmed by co-immunoprecipitation. Surprisingly, prevention of this interaction does not affect the stability of Sen1 or cell growth. Overall, we have identified a small group of Sen1 phosphorylation sites with potential biological relevance. Our findings also confirm that mutating the RVxF motif of Sen1 impairs the interaction with Glc7 in vivo. These data further our understanding of Sen1 protein regulation by Glc7 in yeast cells that may provide clues to the role of senataxin, human orthologue, in neurodegenerative disorders.

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