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Mecanismos de regulación post-traduccional de transportadores de la membrana plasmática: Papel de las quinasas Hal4 y Hal5 en el tráfico de transportadores de nutrientes e iones en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae

Primo Planta, Cecilia 06 July 2015 (has links)
[EN] The Saccharomyces cerevisiae protein kinases Sat4 (Hal4) and Hal5 are required for the plasma membrane stability of the high affinity K+ transporter Trk1 and some amino acid and glucose permeases. A transcriptomic analysis of the hal4 hal5 strain revealed that the absence of these genes causes general alterations in the metabolism of amino acids and glucose. This data is confirmed by the following approaches: activity of the Gcn2-Gcn4 pathway, uptake of methionine and leucine, activity of succinate dehydrogenase (SDH), glucose consumption and ethanol production of this mutant. In this thesis, we demonstrated that the high affinity permease Mup1 is internalized and degraded in the vacuole in the absence of potassium supplementation, like other plasma membrane permeases such as Hxt1 (glucose), Can1 (arginine), Fur4 (uracil) and Gap1 (amino acids). This destabilization of the Mup1 permease is likely to explain the reduction in the uptake of methionine in the double mutant hal4 hal5 and suggests that Hal4 and Hal5 are involved in a general mechanism of regulation of the stability of permeases in the plasma membrane. This hypothesis was corroborated by studies with inhibitors of endocytosis and mutant isoforms of the E3 ubiquitin ligase Rsp5, which is responsible for the ubiquitination and subsequent vacuolar degradation of the permeases studied. The process of Rsp5-mediated ubiquitination requires, in many cases, specific adapters for recognition of the target protein. So far, 19 Rsp5 adapter proteins have been described, among which there are 9 ARTs proteins (Arrestin-Related Trafficking adaptor). In this study, we investigated whether there is a functional connection between Hal4 and Hal5 kinases and ARTs, since this mechanism could explain the observed phenotypes. We studied whether Art1, a regulator of Mup1 and Can1 endocytosis, is involved in the internalization of these permeases in hal4 hal5 strains. Our data indicates that Art1 is not necessary for internalizing Mup1 in the hal4 hal5 strain in the absence of potassium supplementation, therefore suggesting a new role for the Hal4 and Hal5 kinases. We extended the study to include the transporter of aspartic and glutamic acid, Dip5, whose endocytosis is mainly mediated by Aly2 (Art3). The results were positive, providing support for a more general mechanism of regulation of the permeases of the plasma membrane by these kinases. It has been proposed that Npr1, a kinase that is an effector of the Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1), controls the activity of Art1, Aly1 (Art6) and Aly2 (Art3), leading to the accumulation of some permeases in the plasma membrane. We observe lower expression levels of Npr1 in hal4 hal5 strains. We also observe a state of constitutive hyperphosphorylation, similar to WT cells under limiting potassium. Furthermore, overexpression of the Npr1 kinase partially rescues the growth defects and instability of the permeases in the plasma membrane described in the hal4 hal5 mutant. Therefore, we identify part of the pathway regulated by the Hal4 and Hal5 kinases. In eukaryotes, TOR (Target of Rapamycin) exists in two distinct multiprotein complexes, TOR complex 1 (TORC1) and TOR complex 2 (TORC2). We have analyzed the direct substrates of TORC1 (Sch9) and TORC2 (Ypk1) in hal4 hal5 and trk1 trk2 mutants in potassium limiting conditions, observing alterations in the phosphorylation levels of both effectors. Finally, we observed that hal4 hal5 and trk1 trk2 mutants are highly sensitive to the TORC1 inhibitor, rapamycin, and that this sensitivity is rescued by increased external potassium. We confirmed that cells treated with rapamycin had lower internal potassium levels, an effect which is dependent on TORC1 and independent of Trk1 and Trk2. Therefore, our data indicates that the Hal4 and Hal5 kinases have a more specific effect on Npr1 and that there is a reciprocal regulation between potassium and the TOR signaling pathway. / [ES] Las proteínas quinasa de Saccharomyces cerevisiae Sat4 (Hal4) y Hal5 son necesarias para la estabilidad del transportador de K+ de alta afinidad Trk1 y de algunas permeasas de aminoácidos y de glucosa. El análisis transcriptómico del mutante hal4 hal5 reveló que la ausencia de estos genes origina alteraciones generales en el metabolismo de aminoácidos y de glucosa, datos que confirmamos mediante la medida de la ruta Gcn2-Gcn4, de la toma de metionina y de leucina, de la actividad de la succinato deshidrogenasa (SDH), del consumo de glucosa y de la producción de etanol. En esta tesis, hemos demostrado que la permeasa de alta afinidad de metionina, Mup1 se degrada en la vacuola en ausencia de un suplemento de potasio en el mutante hal4 hal5, igual que otras permeasas de la membrana plasmática como Hxt1, Can1, Fur4 y Gap1. Esta desestabilización de Mup1 podría explicar el defecto en la toma de metionina observado y sugiere que Hal4 y Hal5 están implicadas en un mecanismo general de regulación de la estabilidad de las permeasas en la membrana plasmática. Esta hipótesis fue corroborada mediante estudios con inhibidores de la endocitosis y mutantes en la E3 ubiquitina ligasa Rsp5, responsable de la ubiquitinación y posterior degradación vacuolar de las permeasas estudiadas. El proceso de ubiquitinación, en muchos casos, precisa de adaptadores específicos para reconocer la proteína diana. Se han descrito 19 proteínas adaptadoras de Rsp5, entre las que se encuentran 9 proteínas ARTs (Adaptadores de tráfico relacionados con arrestina). En este trabajo, hemos investigado si existe una conexión funcional entre las quinasas Hal4 y Hal5 y los ARTs; este mecanismo podría explicar los fenotipos observados. Estudiamos si Art1, regulador de la endocitosis de Mup1 y Can1, está implicado en la internalización de estas permeases en la cepa hal4 hal5. Nuestros datos indican que Art1 no es necesario para la internalización de Mup1 y Can1 en una cepa hal4 hal5 en ausencia de un suplemento de potasio, sugiriendo un papel novedoso de las quinasas Hal4 y Hal5. Ampliamos el estudio al transportador de ácido aspártico y glutámico, Dip5, cuya endocitosis viene mediada principalmente por Aly2 (Art3). Los resultados fueron positivos apoyando un mecanismo más general de regulación de las permeasas de la membrana plasmática por parte de estas quinasas. Se ha propuesto que Npr1, una quinasa efectora del Target of Rapamycin Complex 1 (TORC1), controla la actividad de Art1, Aly1 (Art6) y Aly2 (Art3) generando la acumulación de algunas permeasas en la membrana plasmática. Observamos menores niveles de expresión de Npr1 en mutantes hal4 hal5, además de un estado de hiperfosforilación constitutivo similar al de células WT en condiciones de potasio limitante. Además, la sobreexpresión de NPR1 rescata los defectos de crecimiento observados en medios con baja disponibilidad de potasio e inestabilidad de permeasas de la membrana plasmática descritos en el mutante hal4 hal5. Por tanto, identificamos parte de la ruta regulada por las quinasas Hal4 y Hal5. En los organismos eucariotas TOR (Target of Rapamycin) existe en dos complejos multiproteicos distintos, complejo TOR1 (TORC1) y complejo TOR2 (TORC2). Hemos analizado los sustratos directos de TORC1 (Sch9) y TORC2 (Ypk1) en mutantes hal4 hal5 y trk1 trk2 y en condiciones de potasio limitante observando alteraciones en los niveles de fosforilación de ambos efectores. Finalmente, hemos observado que los mutantes hal4 hal5 y trk1 trk2 son altamente sensibles al inhibidor de TORC1, rapamicina y que esta sensibilidad se rescata con un exceso de potasio en el medio. Comprobamos que células tratadas con rapamicina presentan una disminución del potasio interno dependiente de TORC1 e independiente de Trk1 y Trk2. Por tanto, nuestros datos indican que las quinasas Hal4 y Hal5 tienen un efecto más específico sobre Npr1 y que hay una regulación reciproca entre el potasio y la r / [CAT] Les proteïnes quinasa de Saccharomyces cerevisiae Sat4 (Hal4) i Hal5 són necessàries per a l'estabilitat del transportador de K+ d'alta afinitat Trk1 i d'algunes permeases d'aminoàcids i de glucosa. L'anàlisi transcriptòmic d'una soca mutant hal4 hal5 revela que l'absència d'aquests gens origina alteracions generals en el metabolisme d'aminoàcids i de glucosa, dades que confirmem mitjançant la mesura de la ruta Gcn2-Gcn4, de la presa de metionina i leucina, de l'activitat de succinat deshidrogenasa (SDH), del consum de glucosa i de la producció d'etanol d'aquest mutant. En aquesta tesi, hem demostrat que la permeasa d'alta afinitat de metionina, Mup1 es degrada en el vacúol en absència d'un suplement de potassi en el mutant hal4 hal5, igual que altres permeases de la membrana plasmàtica com Hxt1, Can1, Fur4 i Gap1. Aquesta desestabilització de Mup1 podria explicar el defecte en la presa de metionina observat i suggereix que Hal4 i Hal5 estan implicades en un mecanisme general de regulació de l'estabilitat de les permeases a la membrana plasmàtica. Aquesta hipòtesi va ser corroborada mitjançant estudis amb inhibidors de l'endocitosi i mutants en l'E3 ubiquitina ligasa Rsp5, responsable de la ubiquitinació i posterior degradació vacuolar de les permeases estudiades. El procés d'ubiquitinació, en molts casos, precisa d'adaptadors específics per reconèixer la proteïna diana. Fins al moment s'han descrit 19 proteïnes adaptadores de Rsp5, entre les quals es troben 9 proteïnes ART (Adaptadors de trànsit relacionats amb arrestina). En aquest treball hem investigat si existeix una connexió funcional entre les quinases Hal4 i Hal5 i els ARTs; aquest mecanisme podria explicar els fenotips observats. Estudiem si Art1, regulador de l'endocitosi de Mup1 i Can1, està implicat en la internalització d'aquestes permeases a la soca hal4 hal5. Les nostres dades indiquen que Art1 no és necessari per a la internalització de Mup1 i Can1 en una soca hal4 hal5 en absència d'un suplement de potassi, suggerint un paper nou de les quinases Hal4 i Hal5. Ampliem l'estudi per incloure el transportador d'àcid aspàrtic i glutàmic, Dip5, en l'endocitosi del qual intervé principalment Aly2 (Art3). Els resultats van ser positius recolzant un mecanisme més general de regulació de les permeases de la membrana plasmàtica per part d'aquestes quinases. S'ha proposat que Npr1, una quinasa que és un efector del Target of rapamycin Complex 1 (TORC1), controla l'activitat de Art1, Aly1 (Art6) i Aly2 (Art3) i genera l'acumulació d'algunes permeases a la membrana plasmàtica. Observem nivells menors d'expressió de Npr1 en mutants hal4 hal5, a més d'un estat d'hiperfosforilació constitutiu semblant al de cèl·lules WT en condicions de potassi limitant. A més, la sobreexpressió de la quinasa Npr1 rescata parcialment els defectes de creixement observats en medis amb baixa disponibilitat de potassi i la inestabilitat de permeases de la membrana plasmàtica descrits en el mutant hal4 hal5. Per tant, identifiquem part de la ruta regulada per les quinases Hal4 i Hal5. En els organismes eucariotes, TOR (Target of rapamycin) existeix en dos complexos multiproteics diferents, complex TOR1 (TORC1) i complex TOR2 (TORC2). Hem analitzat els substrats directes de TORC1 (Sch9) i TORC2 (Ypk1) en mutants hal4 hal5 i trk1 trk2 i en condicions de potassi limitant observant alteracions en els nivells de fosforilació dels dos efectors. Finalment, hem observat que els mutants hal4 hal5 i trk1 trk2 són altament sensibles a l'inhibidor de TORC1, rapamicina, i que aquesta sensibilitat es rescatada amb un excés de potassi en el medi. Vam comprovar que cèl·lules tractades amb rapamicina presenten una disminució del potassi intern dependent de TORC1 e independent de Trk1 i Trk2. Per tant, les nostres dades indiquen que les quinases Hal4 i Hal5 tenen un efecte més específic sobre Npr1 i que hi ha una regulació recíproca entre el potassi i / Primo Planta, C. (2015). Mecanismos de regulación post-traduccional de transportadores de la membrana plasmática: Papel de las quinasas Hal4 y Hal5 en el tráfico de transportadores de nutrientes e iones en el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/52697 / TESIS
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Aplicación de compuestos fototóxicos a la esterilización fotoquímica de la mosca de los frutos (Ceratitis Capitata Wield)

Planes Ferrer, Mª Dolores 11 March 2009 (has links)
Son conocidos los graves daños que produce la C. Capitata en los frutales de la Comunidad Valenciana, los cultivos de citricos y melocotones son especialmente dañados, sobre todo por la estraordinaria, fecundidad de las hembras. Los tratamientos usados con insecticidas fosforados, en pulverizaciones aéreas, no consiguen erradicar la plaga, son caros y dan lugar a protestas de grupos ecologistas y habitantes de las zonas tratadas. Es importante encontrar metodos efectivos y no contaminantes. Un metodo usado con éxito, en zonas limitadas y aisladas, ha sido la suelta de machos esterilizados, con cobalto-Go, en insectarios; los machos esterilizados copulan en el campo y las hembras copuladas ponen huevos inviables. Este método es caro y no aplicable a grandes extensiones, pero, si se lograra la autoesterilización quimica en el propio campo, se conseguiría un metodo eficaz. Recientemente, se han aislado, de plantas desérticas, compuestos que son tóxicos para los insectos cuando son iluminados (entomo-foto-tóxicos). Estos compuestos se activan por la luz, produciendo cadenas de radicales peróxido u oxígeno singlete que interfieren los mecanismos hormonales de los insectos, pero no son tóxicos para animales superiores. En algunos ensayos preliminares, hemos visto que, con dosis infratóxicas, uno de ellos, el tertienilo disminuye la puesta de huevos, de las hembras de C. Capitata. El objeto del trabajo de la Tesis Doctoral es estudiar la posibilidad de esterilizar hembras y machos de C. Capitata, con dosis adecuadas de compuestos fotoactivos incorporados a un cebo alimentario; teniendo en cuenta que un macho esterilizados, anula las puestas de muchas hembras por lo que es más efectivo, a efectos de la anulación de las plagas, que un macho muerto. Los ensayos se harán en cajas de laboratorio, con dispositivo para el recuento diario de huevos, incubación de estos en placas petri, recuento de huevos eclosionados, de pupas formadas y de adultos normales y anormales....... / Planes Ferrer, MD. (2000). Aplicación de compuestos fototóxicos a la esterilización fotoquímica de la mosca de los frutos (Ceratitis Capitata Wield) [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/4266 / Palancia
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Síntesis de productos naturales y análogos biológicamente activos, derivados de Penicillium brevicompactum Dierckx

Cantin Sanz, Angel 04 June 2009 (has links)
En la presente tesis se han desarrollado unas secuencias sintéticas que han permitido la confirmación de las estructuras de los metabolitos aislados previamente de Penicillium brevicompactum, bien sea por síntesis total de los mismos o por preparación de sustancias análogas que hacen inequívoca la asignación realizada en un principio. Por otro lado, se han utilizado las rutas sintéticas abiertas para la consecución de diferentes análogos con el fin de establecer relaciones estructura-actividad que permitan la optimización de las actividades observadas para los productos naturales aislados. Todo ello ha concluido con la confirmación de las importantes actividades presentadas por los productos naturales aislados, así como la optimización de las actividades fungicidas e insecticidas por obtención de análogos sintéticos. / Cantin Sanz, A. (1998). Síntesis de productos naturales y análogos biológicamente activos, derivados de Penicillium brevicompactum Dierckx [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/5022 / Palancia
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Comportamiento de herbicidas residuales en suelo posible contaminación de acuiferos

Gómez De Barreda Ferraz, Diego 23 June 2009 (has links)
Se ha estudiado el comportamiento ambiental en los herbicidas terbutilazina, terbacil, molinato y tiobencarb. Los resultados obtenidos indican que la terbutilazina y el terbacil se absorben fuertemente en los primeros centímetros de perfil del suelo, sin que se aprecie una lixiviación significativa pese a su alta persistencia. La mejor forma de incorporar el herbicida terbutilazina fue mediante herbigación o sobre suelo previamente humedecido, habiendose observado una lata disipación de este producto en el momento de la aplicación. Los herbicidas molinato, debido a su alta presión de vapor, se volatiliza facilmente y el tiobencarb es fuertemente fijado al suelo. Se ha utilizado dos modelos matemáticos de simulación del comportamiento y distribución de los plaguicidas en el suelo. VARLEACH y LEACHP, con el fin de evaluar su validez en la predicción del comportamiento y distribución en el suelo de la terbiutilazina y el terbacil. Ambos modelos se comportaron de forma similar, dando aceptables predicciones de la cantidad de residuos en el perfil, al compararlos con datos observados en el campo, sobre todo en el caso de terbacil. Pero esto solo ocurrió cuando los herbicidas presentaban altos coeficientes de absorción, ya que con bajos coeficientes, la distinta forma que tiene ambos modelos de simular el flujo de agua a través del suelo influye en el transporte y distribución de solutos en el perfil del suelo. Tanto por su sencillez como por las características del manejo del agua y climáticas de la Comunidad Valenciana se recomienda el uso del modelo VARLEACH. / Gómez De Barreda Ferraz, D. (1999). Comportamiento de herbicidas residuales en suelo posible contaminación de acuiferos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/5647 / Palancia
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Design and development of modular DNA assembly tools for Multigene Engineering and Synthetic Biology in Plants

Sarrión Perdigones, Manuel Alejandro 07 February 2014 (has links)
The post-genomics era has put at the disposal of modern plant breeders an endless list of genetic building blocks for the design of new biotechnological crops. After a first wave of single-gene transgenic with controversial public acceptance, genomic information and technology is paving the way for increasingly complex designs based in multiple gene engineering. Those designs aiming at the production of inexpensive health-promoting compounds are most likely to be welcomed by consumers. In this project we plan to develop new multigene assembling tools. During this PhD, a standardized collection of interchangeable genetic parts (including promoters, CDS, P-DNAs, etc) and vectors will be developed. The collection, inspired in Synthetic Biology standards, will be made easy-to-assemble in an interchangeable, semi-idempotent and seamless fashion by the addition of flanking recognition sites of type IIS Restriction endonucleases. The construction of the collection will facilitate multigene engineering and will constitute a first step towards enabling Synthetic Biology in plants. / Sarrión Perdigones, MA. (2014). Design and development of modular DNA assembly tools for Multigene Engineering and Synthetic Biology in Plants [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/35399 / Alfresco
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Caracterización de mecanismos implicados en la regulación de la respuesta a estrés por frío en plantas

Bustamante González, Antonio Javier 01 April 2019 (has links)
[ES] En un contexto de calentamiento global, el estrés abiótico se ha convertido en una de las mayores amenazas para la productividad agrícola. El estrés por frío es uno de estos factores limitantes. Por lo tanto, estudiar a nivel molecular la respuesta de la planta a este tipo de estrés e identificar los genes o los microRNAs cuya función es determinante en la resistencia a este tipo de estrés puede aportar información fundamental para desarrollar plantas tolerantes a frío y así poder aumentar la producción de alimentos en condiciones ambientales adversas. En esta tesis pretendemos dar un enfoque transversal para poder identificar genes implicados en la respuesta a estrés. Por un lado utilizamos un enfoque de biología molecular clásica, y por otro una visión basada en la biología de sistemas y en la secuenciación a gran escala. Mediante esta estrategia hemos sido capaces de identificar y caracterizar el gen BvCOLD1 de Beta vulgaris que codifica una aquaporina localizada en el retículo endoplásmico y que al ser sobrexpresado en plantas de Arabidopsis thaliana confiere tolerancia a frío y a condiciones limitantes de Boro (B). Por lo que demostramos que es un gen fundamental para el transporte de este oligoelemento esencial. En paralelo desarrollamos un abordaje de biología de sistemas a partir de plantas de melón (Cucumis melo) sometidas a estrés por frío. Lo que nos permitió identificar 20 familias de miRNA implicadas en la respuesta en condiciones de frío. En el tercer capítulo profundizamos en la regulación de uno de estos miRNA (miR319) y descubrimos que el frío induce el procesamiento de una forma alternativa de esta molécula. / [CAT] En un context d'escalfament global, l'estrès abiòtic s'ha convertit en una de les majors amenaces per a la productivitat agrícola global. L'estrès per fred és un d'aquests factors limitants. Per tant, Estudiar a nivell molecular la resposta de la planta a fred i identificar els gens o els microRNA la funció dels quals és determinant en aquestes condicions pot aportar informació fonamental per desenvolupar plantes tolerants a aquest estrès i així poder augmentar la producció d'aliments en condicions adverses. En aquesta tesi hem utilitzat un enfocament transversal per poder identificar gens implicats en la resposta a estrès. D'una banda hem fet servir mètodes de biologia molecular clàssica, que ens ha permès identificar i caracteritzar el gen BvCOLD1 de Beta vulgaris que codifica una aquaporina localitzada en el reticle endoplasmàtic i que en ser sobrexpresada en plantes d'Arabidopsis thaliana conferia tolerància a fred i a condicions limitants de bor. Pel que hem demostrat que és un gen fonamental per al transport d'aquest oligoelement essencial. En paral·lel hem desenvolupat un abordatge de biologia de sistemes a partir de plantes de meló (Cucumis melo) sotmeses a estrès per fred. El que ens va permetre identificar 20 famílies de miRNA implicades en la resposta en condicions de fred. Hem aprofundit en la regulació d'un d'aquests miRNA (el mi319) i hem descobert que el fred indueix la formació d'una forma alternativa d'aquesta molècula. / [EN] In a context of global warming, abiotic stress has become one of the greatest threats to global agricultural productivity. Cold stress is one of these limiting factors. Therefore, Studying the plant response at the molecular level and identifying the genes or microRNAs whose function is determinant in these conditions can provide fundamental information to develop plants tolerant to this stress and thus be able to increase the production of food under adverse conditions. In this Ph.D. Thesis we have used a transversal approach to identify genes involved in stress response. We have used two different approaches. First we used classical molecular biology methods, which has allowed us to identify and characterize the BvCOLD1 gene of Beta vulgaris that encodes an aquaporin located in the endoplasmic reticulum and which upon overexpression in Arabidopsis thaliana conferred tolerance to cold and limiting conditions of Boron. So we showed that it is a fundamental gene for the transport of this essential trace element. In parallel, we undertook a systems biology approach based on melon plants (Cucumis melo) subjected to cold stress. This allowed us to identify 20 families of miRNA involved in the response to cold conditions. We have further studied the regulation of one of these miRNAs (miR319) and discovered that cold induces the alternative processing of its precursor. / Bustamante González, AJ. (2019). Caracterización de mecanismos implicados en la regulación de la respuesta a estrés por frío en plantas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/118800 / TESIS
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Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura

Rienzo, Alessandro 05 April 2016 (has links)
[EN] Cells respond to environmental stimuli by fine tuned regulation of gene expression. In this thesis we investigate the dose dependent modulation of the genetic response upon nutrient and stress signals in yeast. A destabilized version of firefly luciferase was used in living yeast cells as a real-time reporter for gene expression. This highly sensitive and non-invasive system can be simultaneously used upon many different experimental conditions in small culture aliquots. This allows the dose-response behaviour of gene expression driven by any yeast promoter to be reported and can be used to quantify important parameters, such as the threshold, sensitivity, response time, maximal activity and synthesis rate for a given stimulus. We applied the luciferase assay to the nutrient-regulated GAL1 promoter and the stress-responsive GRE2 promoter. We find that luciferase expression driven by the GAL1 promoter responds dynamically to growing galactose concentrations, with increasing synthesis rates determined by the light increment in the initial linear phase of activation. The GAL1 gene is activated with continuously increasing synthesis rates in a well defined range of galactose concentrations, correlating with a dynamic increase of histone remodeling and subsequent association of the RNAPII complex. Dose dependent chromatin remodeling appears to be the basis for the dynamic GAL1 expression since mutants with impaired histone dynamics show severely truncated dose response profiles. In the case of the GRE2 promoter, we demonstrate that the very short-lived version of luciferase used here is an excellent tool to quantitatively describe transient transcriptional activation. The luciferase expression controlled by the GRE2 promoter responds dynamically to a gradual increase of osmotic or oxidative stress stimuli, which is mainly based on the progressive increase of the time the promoter remains active. In contrast, the GRE2 promoter operates like an off/on switch in response to increasing osmotic stress with almost constant synthesis rates and exclusively temporal regulation of histone remodeling and RNAPII occupancy. The Gal3 inducer and the Hog1 MAP kinase seem to determine the different dose response strategies at the two promoters. Our analysis reveals important differences in the way dynamic signals create dose sensitive gene expression outputs. Taken together, the luciferase assay described here is an attractive tool to rapidly and precisely determine and compare kinetic parameters of gene expression. Additionally, the function of the specific transcriptor factor Smp1 involved in the yeast osmostress response was investigated. Location analyses upon osmotic stress reveal that Smp1 associates preferentially with the whole transcribed regions (ORFs) upon stress as opposed to other transcriptional activators involved in the osmostress response. However, Smp1 seems to be important for stress-activated gene expression only in the presence of the natural induced gene and not of artificial promoter fusions. This highlights the possible role of Smp1 in regulating gene expression from ORF sequences rather than promoter regions. / [ES] Las células responden a los estímulos ambientales a través de una regulación precisa de la expresión génica. En este trabajo se investigó la modulación dosis dependiente de la expresión de genes activados en respuesta a estrés y por nutrientes. Se utilizó una versión desestabilizada de luciferasa de luciérnaga en células vivas de levadura como reportero para la detección de la expresión génica en tiempo real. Este sistema altamente sensible y no invasivo puede ser utilizado simultáneamente en diferentes condiciones experimentales a través de pequeñas alícuotas de cultivo. Esto permite la caracterización dosis-respuesta de la regulación de los promotores de levadura y puede ser utilizado para cuantificar parámetros importantes como el umbral, la sensibilidad, el tiempo de respuesta, la actividad máxima y el ratio de síntesis provocado por un determinado estímulo. Se aplicó el ensayo luciferasa al promotor GAL1 regulado por nutrientes y al promotor GRE2 activado en respuesta a estrés. Se observó que la expresión de la luciferasa activada por el promotor GAL1 responde de forma dinámica a las crecientes concentraciones de galactosa, con un incremento del ratio de síntesis determinado por el aumento de luz en la fase lineal inicial de la activación, en función de una gama de concentraciones de galactosa bien definidas. Este mecanismo de regulación depende de un aumento en la remodelación de las histonas y la consecuente asociación del complejo ARN pol II. La remodelación de la cromatina dosis dependiente parece ser la base de la expresión dinámica de GAL1, pues los mutantes relacionados con la dinámica de las histonas muestran perfiles dosis respuesta severamente afectados. En el caso del promotor GRE2, se demostró que una versión de una luciferasa desestabilizada es una herramienta excelente para describir de forma cuantitativa la activación transcipcional transitoria. La expresión de la luciferasa controlada por el promotor GRE2 responde de forma dinámica al aumento gradual de estímulo de estrés osmótico u oxidativo. La activación se observa principalmente en el incremento progresivo del tiempo en que el promotor permanece activo. Diferentemente de GAL1, el promotor GRE2 opera a través de un cambio apagado/encendido en respuesta a un aumento de estrés osmótico a través de ratios de síntesis prácticamente constantes y cuya regulación solamente depende de la remodelación de la cromatina y de la permanencia de la ARN pol II. Finalmente, se puede especular que el inductor Gal3 y la MAPK Hog1 son las moléculas determinantes para las diferentes estrategias de respuesta dinámica para los dos promotores. En este trabajo se identifican importantes diferencias en la señalización dinámica determinada por la dosis de estímulo en la expresión génica. En conjunto, el ensayo de luciferasa presentado en este trabajo puede ser una herramienta interesante para determinar y comparar de forma rápida y precisa los parámetros de la expresión génica. Adicionalmente se investigó la función del factor de transcripción Smp1 involucrado en la respuesta a osmoestrés en levadura. Un análisis de la asociación a la cromatina in vivo bajo estrés osmótico demostró que Smp1 se une preferentemente a regiones transcritas (ORFs) lo que refleja un comportamiento diferente comparando con otros activadores transcripcionales de la respuesta a estrés osmótico. Sin embargo, Smp1 parece ser importante para la expresión génica activada por estrés osmótico sólo en la presencia del gen natural inducido y no de fusiones artificiales del promotor. Esto evidencia el posible papel de Smp1 en la regulación de la expresión génica desde secuencias ORF y no en las regiones promotoras. / [CAT] Les cèl¿lules responen als estímuls ambientals a través d'una regulació precisa de l'expressió gènica. A aquest treball es va investigar la modulació dosi dependent de l'expressió de gens activats en resposta a estrès i per nutrients. Es va utilitzar una versió desestabilitzada de luciferasa de cuca de llum en cèl¿lules vives de llevat com a reporter per a la detecció de l'expressió gènica a temps real. Aquest sistema altament sensible i no invasiu pot ser utilitzat simultàniament en diferents condicions experimentals a través de xicotetes alíquotes de cultiu. Això permet la caracterització dosi-resposta de la regulació dels promotors de llevat i pot ser utilitzat per a quantificar paràmetres importants com el llindar, la sensibilitat, el temps de resposta, l'activitat màxima i el rati de síntesi provocat per un determinat estímul. L'assaig luciferasa es va aplicar al promotor GAL1 regulat per nutrients i al promotor GRE2 activat en resposta a estrès. Es va observar que l'expressió de la luciferasa activada pel promotor GAL1 respon de forma dinàmica a les creixents concentracions de galactosa, amb un increment del rati de síntesi determinat per l'augment de llum en la fase lineal inicial de l'activació, en funció d'una gama de concentracions de galactosa ben definides. Aquest mecanisme de regulació depèn d'un augment en la remodelació de les histones i la conseqüent associació del complex ARN pol II. La remodelació de la cromatina dosi dependent sembla ser la base de l'expressió dinàmica de GAL1, ja què els mutants relacionats amb la dinàmica de les histones mostren perfils dosi-resposta severament afectats. En el cas del promotor GRE2, es va demostrar que una versió d'una luciferasa desestabilitzada és una eina excel¿lent per a descriure de forma quantitativa l'activació transcripcional transitòria. L'expressió de la luciferasa controlada pel promotor GRE2 respon de forma dinàmica a l'augment gradual d'estímul d'estrès osmòtic o oxidatiu. L'activació s'observa principalment a l'increment progressiu del temps al qual el promotor roman actiu. De forma diferent de GAL1, el promotor GRE2 opera a través d'un canvi apagat/encès en resposta a un augment d'estrès osmòtic a través de ratis de síntesi pràcticament constants i als quals la seua regulació només depèn de la remodelació de la cromatina i de la permanència de l'ARN pol II. Finalment, es pot especular que l'inductor Gal3 i la MAPK Hog1 són les molècules determinants per a les diferents estratègies de resposta dinàmica per als dos promotors. A aquest treball s'identifiquen importants diferències a la senyalització dinàmica determinada per la dosi d'estímul a l'expressió gènica. En conjunt, l'assaig luciferasa presentat a aquest treball pot ser una eina interesant per a determinar i comparar de forma ràpida i precisa els paràmetres de l'expressió gènica. Addicionalment, es va investigar la funció del factor de transcripció Smp1 involucrat en la resposta a osmoestrès en llevat. Una anàlisi de l'associació a la cromatina in vivo sota l'estrès osmòtic va demostrar que Smp1 s'uneix preferentment a regions transcrites (ORFs), el qual reflecteix un comportament diferent comparant amb altres activadors transcripcionals de la resposta a estrès osmòtic. Tot i així, Smp1 sembla ser important per a l'expressió gènica activada per estrès osmòtic només en la presència del gen natural induït i no de fusions artificials del promotor. Això evidencia el possible paper de Smp1 en la regulació de l'expressió gènica des de seqüències ORF i no a les regions promotores. / Rienzo, A. (2016). Estudio de la regulación dinámica de la expresión génica en respuesta a estrés osmótico en levadura [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/62160. / TESIS
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MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS

Timón Gómez, Alba 30 May 2016 (has links)
[EN] Eukaryotic cells adapt to environmental changes ("stress") through signal transduction pathways which coordinate complex adaptive responses. Mitochondria are able to respond to different external stimuli in a dynamic manner. In previous studies, mitochondria were shown to play an important role in adaptation to hyperosmotic stress and defects in many mitochondrial functions cause sensitivity to this stress. In the present work, we investigate novel mechanisms of mitochondrial adaptation in response to stress. First of all, the role of the mitochondrial pyruvate carrier complex (MPC) in this adaptation was analyzed. This carrier is composed by three proteins in yeast: Mpc1, Mpc2 and Mpc3. MPC3 is upregulated upon salt stress and during a diauxic shift, which leads to an increase in Mpc3 protein abundance. HOG pathway, implicated in osmostress response, is needed for the efficient induction of MPC3 transcription. Our analysis suggests that amino acid biosynthesis, respiration rate and oxidative stress tolerance are regulated by changes in the Mpc protein composition of the mitochondria. In this way, Mpc2 is most abundant under fermentative non stress conditions and important for amino acid biosynthesis, while Mpc3 is the most abundant family member upon salt stress or when high respiration rates are required. In addition, Mpc3 stimulates respiration and enhances tolerance to oxidative stress. Therefore, our results identify that the regulated mitochondrial pyruvate uptake via different Mpc proteins might be an important determinant of respiration rate and stress resistance. Secondly, since pyruvate flux to mitochondria is modified according to environmental conditions, here we study also possible changes in electron transport chain complex subunits. We found that a switch to partially or completely respiratory energy sources causes selective degradation of respiratory complex I and III subunits. Moreover, this degradation was also observed when there was a specific organelle damage caused by valinomycin, to maintain cell homeostasis. Interestingly, the loss of Atg32 function only partially affected the respiratory complex specific degradation, while the Atg11 protein was absolutely required in this process. Fission and fusion machinery proteins (Fzo1 and Fis1) and some mitochondrial proteases (Yme1, Pim1 and Afg3) also have a role in the valinomycin-mediated mitophagy. This process might start by Atg11 accumulation in foci close to the mitochondria shortly after valinomycin treatment. In this work, we describe for the first time a specific mechanism of mitophagy mediated by damage in yeast, which opposes to the concept of a generalized degradation of the organelle. / [ES] Las células eucariotas responden a cambios en su entorno ("estrés") a través de rutas de transmisión de señales que coordinan respuestas adaptativas muy complejas. Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos capaces de responder a diversos estímulos externos. En estudios anteriores, se demostró que la mitocondria tiene un papel en la adaptación a estrés hiperosmótico, ya que los mutantes con defectos en diversos componentes mitocondriales muestran mayor sensibilidad a este estrés. En este trabajo, se ha investigado nuevos mecanismos de adaptación de la actividad mitocondrial en respuesta a estrés. Por una parte, se ha estudiado el papel del complejo transportador de piruvato mitocondrial (MPC) en esta adaptación. Este transportador está conformado por tres proteínas en levadura: Mpc1, Mpc2 y Mpc3. El gen MPC3 sufre una fuerte inducción transcripcional en condiciones de estrés osmótico y cambio diáuxico, que se traduce en un aumento de la cantidad de proteína Mpc3. Esta regulación se vio que dependía de la ruta HOG, implicada en la respuesta a estrés osmótico, y no ocurría en Mpc1 y Mpc2. Se comprobó, además, que los cambios en la composición de MPC en la mitocondria regulaban la biosíntesis de aminoácidos, la capacidad respiratoria y la tolerancia a estrés oxidativo de la célula. De esta forma, Mpc2 es la proteína más abundante en condiciones fermentativas sin estrés y es necesaria para la biosíntesis de aminoácidos; mientras que Mpc3 es el miembro más abundante ante estrés salino o cuando se requiere una elevada tasa respiratoria. Además, Mpc3 estimula la respiración y aumenta la tolerancia a estrés oxidativo. Por tanto, nuestros resultados identifican que la entrada de piruvato en la mitocondria y su posterior uso están regulados por la composición específica de las subunidades del transportador y determina la tasa respiratoria y la resistencia a estrés. Por otra parte, dado que el flujo de piruvato a la mitocondria se modificaba en función de las condiciones ambientales, se quiso estudiar qué ocurría en los complejos de la cadena de transporte de electrones en estas condiciones. Se observó que los complejos I y III se degradaban ante elevadas tasas respiratorias, al parecer como un mecanismo de reciclaje. Además, ante un daño mitocondrial específico utilizando valinomicina, también existía una degradación específica de los complejos respiratorios I y III, para mantener la homeostasis celular. Este proceso es dependiente de Atg11, e independiente de Atg32. También parecen implicadas proteínas de la maquinaria de dinámica mitocondrial (Fzo1 y Fis1) y algunas proteasas mitocondriales (Yme1, Pim1 y Afg3). El inicio de este proceso parece producirse ante la aparición de foci de Atg11 cercanos a la mitocondria. Se describe por primera vez en levadura un mecanismo específico de mitofagia inducida por daño, que contrasta con el concepto de degradación generalizada del orgánulo. / [CAT] Les cèl·lules eucariotes responen a canvis al seu entorn ("estrès") a través de rutes de transmissió de senyals que coordinen respostes adaptatives molt complexes. Les mitocòndries són orgànuls molt dinàmics capaços de respondre a diversos estímuls externs. A estudis previs, es va demostrar que la mitocòndria té un paper en l'adaptació a estrès hiperosmòtic, ja què els mutants amb defectes en diversos components mitocondrials mostren major sensibilitat a aquest estrès. A aquest treball, s'ha analitzat nous mecanismes d'adaptació de l'activitat mitocondrial en resposta a estrès. Per una banda, s'ha estudiat el paper del complex transportador de piruvat mitocondrial (MPC) a aquesta adaptació. Aquest transportador està conformat per tres proteïnes en llevat: Mpc1, Mpc2 i Mpc3. El gen MPC3 pateix una forta inducció transcripcional en condicions d'estrès osmòtic i canvi diàuxic, que es tradueix en un augment de la quantitat de proteïna Mpc3. Aquesta regulació depèn de la ruta HOG, implicada en la resposta a estrès osmòtic, i no tenia lloc en Mpc1 i Mpc2. A més, es va comprovar que els canvis en la composició de MPC a la mitocòndria regulaven la biosíntesi de aminoàcids, la capacitat respiratòria i la tolerància a estrès oxidatiu de la cèl·lula. D'aquesta manera, Mpc2 és la proteïna més abundant en condicions fermentatives en absència d'estrès, mentre que Mpc3 és el membre més abundant davant d'estrès salí o quan és necessària una elevada taxa respiratòria. A més, Mpc3 estimula la respiració i augmenta la resistència a estrès oxidatiu. Per tant, els nostres resultats identifiquen que l'entrada de piruvat a la mitocòndria i el seu posterior ús estan regulats per la composició específica de les subunitats del transportador i determina la taxa respiratòria i la resistència a estrès. Per altra banda, com el flux de piruvat a la mitocòndria es modifica en funció de les condicions ambientals, es va voler estudiar què succeïa als complexes de la cadena de transport electrònic a aquestes condicions. Es va observar que els complexes I i III es degradaven davant d'elevades taxes respiratòries, com a mecanisme de reciclatge. A més, davant d'un dany mitocondrial específic utilitzant valinomicina, també existia una degradació específica dels complexes respiratoris I i III, per a mantenir l'homeòstasi cel·lular. Aquest procés és depenent d'Atg11, però independent d'Atg32. També semblen implicades proteïnes de la maquinària de dinàmica mitocondrial (Fzo1 i Fis1) i algunes proteases mitocondrials (Yme1, Afg3 i Pim1). L'inici d'aquest procés sembla produir-se per l'aparició de foci d'Atg11 propers a la mitocòndria. Per primera volta, es descriu en llevat un mecanisme específic de mitofagia induïda per dany, que contrasta amb el concepte de degradació generalitzada de l'orgànul. / Timón Gómez, A. (2016). MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE LA ACTIVIDAD MITOCONDRIAL EN RESPUESTA A ESTRÉS [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/64873. / TESIS
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DESIGN OF GENETIC ELEMENTS AND SOFTWARE TOOLS FOR PLANT SYNTHETIC BIOLOGY

Vázquez Vilar, Marta 01 September 2016 (has links)
[EN] Synthetic Biology is an emerging interdisciplinary field that aims to apply the engineering principles of modularity, abstraction and standardization to genetic engineering. The nascent branch of Synthetic Biology devoted to plants, Plant Synthetic Biology (PSB), offers new breeding possibilities for crops, potentially leading to enhanced resistance, higher yield, or increased nutritional quality. To this end, the molecular tools in the PSB toolbox need to be adapted accordingly, to become modular, standardized and more precise. Thus, the overall objective of this Thesis was to adapt, expand and refine DNA assembly tools for PSB to enable the incorporation of functional specifications to the description of standard genetic elements (phytobricks) and to facilitate the construction of increasingly complex and precise multigenic devices, including genome editing tools. The starting point of this Thesis was the modular DNA assembly method known as GoldenBraid (GB), based on type IIS restriction enzymes. To further optimize the GB construct-making process and to better catalog the phytobricks collection, a database and a set of software-tools were developed as described in Chapter 1. The final webbased software package, released as GB2.0, was made publicly available at www.gbcloning.upv.es. A detailed description of the functioning of GB2.0, exemplified with the building of a multigene construct for anthocyanin overproduction was also provided in Chapter 1. As the number and complexity of GB constructs increased, the next step forward consisted in the refinement of the standards with the incorporation of experimental information associated to each genetic element (described in Chapter 2). To this end, the GB package was reshaped into an improved version (GB3.0), which is a self-contained, fully traceable assembly system where the experimental data describing the functionality of each DNA element is displayed in the form of a standard datasheet. The utility of the technical specifications to anticipate the behavior of composite devices was exemplified with the combination of a chemical switch with a prototype of an anthocyanin overproduction module equivalent to the one described in Chapter 1, resulting in a dexamethasone-responsive anthocyanin device. Furthermore, Chapter 3 describes the adaptation and functional characterization of CRISPR/Cas9 genome engineering tools to the GB technology. The performance of the adapted tools for gene editing, transcriptional activation and repression was successfully validated by transient expression in N. benthamiana. Finally, Chapter 4 presents a practical implementation of GB technology for precision plant breeding. An intragenic construct comprising an intragenic selectable marker and a master regulator of the flavonoid biosynthesis was stably transformed in tomato resulting in fruits enhanced in flavonol content. All together, this Thesis shows the implementation of increasingly complex and precise genetic designs in plants using standard elements and modular tools following the principles of Synthetic Biology. / [ES] La Biología Sintética es un campo emergente de carácter interdisciplinar que se fundamenta en la aplicación de los principios ingenieriles de modularidad, abstracción y estandarización a la ingeniería genética. Una nueva vertiente de la Biología Sintética aplicada a las plantas, la Biología Sintética Vegetal (BSV), ofrece nuevas posibilidades de mejora de cultivos que podrían llevar a una mejora de la resistencia, a una mayor productividad, o a un aumento de la calidad nutricional. Sin embargo, para alcanzar este fin las herramientas moleculares disponibles en estos momentos para BSV deben ser adaptadas para convertirse en modulares, estándares y más precisas. Por ello se planteó como objetivo general de esta Tesis adaptar, expandir y refinar las herramientas de ensamblaje de DNA de la BSV para permitir la incorporación de especificaciones funcionales en la descripción de elementos genéticos estándar (fitobricks) y facilitar la construcción de estructuras multigénicas cada vez más complejas y precisas, incluyendo herramientas de editado genético. El punto de partida de esta Tesis fue el método de ensamblaje modular de ADN GoldenBraid (GB) basado en enzimas de restricción tipo IIS. Para optimizar el proceso de ensamblaje y catalogar la colección de fitobricks generados se desarrollaron una base de datos y un conjunto de herramientas software, tal y como se describe en el Capítulo 1. El paquete final de software se presentó en formato web como GB2.0, haciéndolo accesible al público a través de www.gbcloning.upv.es. El Capítulo 1 también proporciona una descripción detallada del funcionamiento de GB2.0 ejemplificando su uso con el ensamblaje de una construcción multigénica para la producción de antocianinas. Con el aumento en número y complejidad de las construcciones GB, el siguiente paso necesario fue el refinamiento de los estándar con la incorporación de la información experimental asociada a cada elemento genético (se describe en el Capítulo 2). Para este fin, el paquete de software de GB se reformuló en una nueva versión (GB3.0), un sistema de ensamblaje auto-contenido y completamente trazable en el que los datos experimentales que describen la funcionalidad de cada elemento genético se muestran en forma de una hoja de datos estándar. La utilidad de las especificaciones técnicas para anticipar el comportamiento de dispositivos biológicos compuestos se ejemplificó con la combinación de un interruptor químico y un prototipo de un módulo de sobreproducción de antocianinas equivalente al descrito en el Capítulo 1, resultando en un dispositivo de producción de antocianinas con respuesta a dexametasona. Además, en el Capítulo 3 se describe la adaptación a la tecnología GB de las herramientas de ingeniería genética CRISPR/Cas9, así como su caracterización funcional. La funcionalidad de estas herramientas para editado génico y activación y represión transcripcional se validó con el sistema de expresión transitoria en N.benthamiana. Finalmente, el Capítulo 4 presenta una implementación práctica del uso de la tecnología GB para hacer mejora vegetal de manera precisa. La transformación estable en tomate de una construcción intragénica que comprendía un marcador de selección intragénico y un regulador de la biosíntesis de flavonoides resultó en frutos con un mayor contenido de flavonoles. En conjunto, esta Tesis muestra la implementación de diseños genéticos cada vez más complejos y precisos en plantas utilizando elementos estándar y herramientas modulares siguiendo los principios de la Biología Sintética. / [CAT] La Biologia Sintètica és un camp emergent de caràcter interdisciplinar que es fonamenta amb l'aplicació a la enginyeria genètica dels principis de modularitat, abstracció i estandarització. Una nova vessant de la Biologia Sintètica aplicada a les plantes, la Biologia Sintètica Vegetal (BSV), ofereix noves possibilitats de millora de cultius que podrien portar a una millora de la resistència, a una major productivitat, o a un augment de la qualitat nutricional. Tanmateix, per poder arribar a este fi les eines moleculars disponibles en estos moments per a la BSV han d'adaptar-se per convertir-se en modulars, estàndards i més precises. Per això es plantejà com objectiu general d'aquesta Tesi adaptar, expandir i refinar les eines d'ensamblatge d'ADN de la BSV per permetre la incorporació d'especificacions funcionals en la descripció d'elements genètics estàndards (fitobricks) i facilitar la construcció d'estructures multigèniques cada vegada més complexes i precises, incloent eines d'edidat genètic. El punt de partida d'aquesta Tesi fou el mètode d'ensamblatge d'ADN modular GoldenBraid (GB) basat en enzims de restricció tipo IIS. Per optimitzar el proces d'ensamblatge i catalogar la col.lecció de fitobricks generats es desenvolupà una base de dades i un conjunt d'eines software, tal i com es descriu al Capítol 1. El paquet final de software es presentà en format web com GB2.0, fent-se accessible al públic mitjançant la pàgina web www.gbcloning.upv.es. El Capítol 1 també proporciona una descripció detallada del funcionament de GB2.0, exemplificant el seu ús amb l'ensamblatge d'una construcció multigènica per a la producció d'antocians. Amb l'augment en nombre i complexitat de les construccions GB, el següent pas fou el refinament dels estàndards amb la incorporació de la informació experimental associada a cada element genètic (es descriu en el Capítol 2). Per a aquest fi, el paquet de software de GB es reformulà amb una nova versió anomenada GB3.0. Aquesta versió consisteix en un sistema d'ensamblatge auto-contingut i complemtament traçable on les dades experimentals que descriuen la funcionalitat de cada element genètic es mostren en forma de fulla de dades estàndard. La utilitat de les especificacions tècniques per anticipar el comportament de dispositius biològics compostos s'exemplificà amb la combinació de un interruptor químic i un prototip d'un mòdul de sobreproducció d'antocians equivalent al descrit al Capítol 1. Aquesta combinació va tindre com a resultat un dispositiu de producció d'antocians que respón a dexametasona. A més a més, al Capítol 3 es descriu l'adaptació a la tecnologia GB de les eines d'enginyeria genètica CRISPR/Cas9, així com la seua caracterització funcional. La funcionalitat d'aquestes eines per a l'editat gènic i activació i repressió transcripcional es validà amb el sistema d'expressió transitòria en N. benthamiana. Finalment, al Capítol 4 es presenta una implementació pràctica de l'ús de la tecnologia GB per fer millora vegetal de mode precís. La transformació estable en tomaca d'una construcció intragènica que comprén un marcador de selecció intragènic i un regulador de la biosíntesi de flavonoïdes resultà en plantes de tomaca amb un major contingut de flavonols en llur fruits. En conjunt, esta Tesi mostra la implementació de dissenys genètics cada vegada més complexos i precisos en plantes utilitzant elements estàndards i eines modulars seguint els principis de la Biologia Sintètica. / Vázquez Vilar, M. (2016). DESIGN OF GENETIC ELEMENTS AND SOFTWARE TOOLS FOR PLANT SYNTHETIC BIOLOGY [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/68483. / TESIS / SI
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Fundamental and applied research in ABA signaling: Regulation by ABA of the chromatin remodeling ATPase BRAHMA and biotechnological use of the PP2CA promoter.

Peirats Llobet, Marta 13 June 2017 (has links)
Optimal response to drought is critical for plant survival and will affect biodiversity and crop performance during climate change. Mitotically heritable epigenetic and dynamic chromatin state changes have been implicated in the plant response to the drought stress hormone abscisic acid (ABA). The Arabidopsis SWI/SNF chromatin-remodeling ATPase BRAHMA (BRM) modulates response to ABA by preventing premature activation of stress response pathways during germination. Here, we show that the core ABA signalosome formed by ABA receptors, PP2Cs and SnRK2s physically interact with BRM to regulate BRM activity and post-translationally modify BRM by phosphorylation/dephosphorylation. Genetic evidence suggests that BRM acts downstream of SnRK2.2/2.3 kinases and biochemical studies identified evolutionary conserved SnRK2 phosphorylation sites in the C-terminal region of BRM. Our data suggest that SnRK2-dependent phosphorylation of BRM leads to its inhibition, and PP2CA-mediated dephosphorylation of BRM restores the ability of BRM to repress ABA response. ABA plays a key role to regulate germination and post-germination growth and the AP2-type ABI4 and bZIP-type ABI5 transcription factors (TFs) are required for ABA-mediated inhibition of post-germination growth when the embryo encounters water stress. The growth arrest induced by ABI4 and ABI5 involves ABA signaling and in the case of ABI5, it has been demonstrated that ABA inhibits the activity of BRM to induce ABI5 transcription. Loss of BRM activity leads to destabilization of a nucleosome involved in repression of ABI5 transcription. Therefore reduction of BRM activity in the brm-3 allele leads to enhanced expression of ABI5 in 2-d-old seedlings and enhanced sensitivity to ABA. Novel genetic evidence obtained in this work indicates that ABI4 is one of the redundant TFs regulated by BRM that mediate ABA response during germination and early seedling growth. Thus, the association of BRM with the ABI4 locus together with the observed derepression of ABI4 expression in brm-3 suggests that BRM directly regulates ABI4 expression. Finally, this work provides a direct link between the ABA signalosome and the chromatin-remodeling ATPase BRM, which enables ABA-dependent modulation of BRM activity as a possible mechanism to enhance plant drought tolerance. Additionally, we identified and characterized the promoter of PP2CA as a stress-inducible promoter and we have used it to drive the expression of ABA receptors from Arabidopsis and Solanum lycopersicum. This technology appears to be promising for the expression of ABA receptors in an inducible manner and to generate drought tolerant plants. / La respuesta óptima a la sequía es crítica para la supervivencia de las plantas y afectará a la biodiversidad y al rendimiento de los cultivos durante el cambio climático. Las modificaciones epigenéticas y los cambios dinámicos del estado de la cromatina han sido implicados en la respuesta de la planta al ácido abscísico (ABA), la conocida como la hormona del estrés hídrico. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipo SWI/SNF de Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la respuesta al ABA mediante la prevención de la activación prematura de las vías de respuesta al estrés durante la germinación. Aquí, mostramos que el núcleo del señalosoma de ABA formado por los receptores de ABA, las PP2Cs y las SnRK2s interaccionan físicamente con BRM para regular su actividad y modificarla post-traduccionalmente por mecanismos de fosforilación/desfosforilación. La evidencia genética sugiere que BRM actúa aguas abajo de las quinasas SnRK2.2/2.3 y los estudios bioquímicos identificaron la presencia en la región C-terminal de BRM de sitios de fosforilación de las SnRK2 que estaban conservados evolutivamente. Nuestros datos sugieren que la fosforilación de BRM que depende de las SnRK2 conduce a su inhibición, y que la desfosforilación de BRM mediada por PP2CA restaura la capacidad de BRM para reprimir la respuesta a ABA. El ABA juega un papel clave en la regulación de la germinación y el crecimiento post germinativo y los factores de transcripción de tipo AP2 como ABI4 y de tipo bZIP como ABI5, son necesarios para la inhibición del crecimiento post germinativo mediado por ABA cuando los embriones encuentran estrés hídrico. La detención del crecimiento inducida por ABI4 y ABI5 implica la señalización de ABA y en el caso de ABI5, se ha demostrado que el ABA inhibe la actividad de BRM para inducir la transcripción de ABI5. La pérdida de actividad de BRM conduce a la desestabilización de un nucleosoma implicado en la represión de la transcripción de ABI5. Por lo tanto, la reducción de la actividad de BRM en el alelo brm-3 conduce a una mayor expresión de ABI5 en plántulas de 2 días y una mayor sensibilidad a ABA. La nueva evidencia genética obtenida en este trabajo indica que ABI4 es uno de los factores de transcripción redundantes regulados por BRM que median la respuesta a ABA durante los estadios de germinación y crecimiento temprano de las plántulas. La asociación de BRM con el locus ABI4, junto con la desrepresión de la expresión de ABI4 observada en el mutante brm-3 sugiere que BRM regula directamente la expresión de ABI4. Por último, este trabajo proporciona una relación directa entre el señalosoma de ABA y la ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permite la modulación de la actividad de BRM de modo dependiente de ABA como un posible mecanismo para mejorar la tolerancia a sequía de las plantas. Además, hemos identificado y caracterizado el promotor de PP2CA como un promotor inducible por estrés y lo hemos utilizado para dirigir la expresión de los receptores de ABA de Arabidopsis y Solanum lycopersicum. Esta tecnología parece ser prometedora para la expresión de receptores de ABA de modo inducible y para generar plantas tolerantes a la sequía. / La resposta òptima a la sequera és crítica per a la supervivència de les plantes i afectarà la biodiversitat i al rendiment dels cultius durant el canvi climàtic. Les modificacions epigenètiques i els canvis dinàmics de l'estat de la cromatina han estat implicats en la resposta de la planta a l'àcid abscísic (ABA), la coneguda com hormona de l'estrès hídric. La ATPasa remodeladora de cromatina de tipus SWI/SNF d'Arabidopsis, BRAHMA (BRM), modula la resposta al ABA mitjançant la prevenció de l'activació prematura de les vies de resposta a l'estrès durant la germinació. Ací, mostrem que el nucli del senyalosoma d'ABA format pels receptors d'ABA, les PP2Cs i les SnRK2s interaccionen físicament amb BRM per regular la seva activitat i modificar-la post-traduccionalment per mecanismes de fosforilació/desfosforilació. L'evidència genètica suggereix que BRM actua aigües avall de les quinases SnRK2.2/2.3 i els estudis bioquímics van identificar la presència, a la regió C-terminal de BRM, de llocs de fosforilació de les SnRK2 que estaven conservats evolutivament. Les nostres dades suggereixen que la fosforilació de BRM que depèn de les SnRK2, condueix a la inhibició de BRM, i que la defosforilació de BRM mediada per PP2CA restaura la capacitat de BRM per reprimir la resposta a ABA. El ABA juga un paper clau en la regulació de la germinació i el creixement post-germinació i els factors de transcripció de tipus AP2 com ABI4 i de tipus bZIP com ABI5, són necessaris per a la inhibició del creixement post-germinació mediat per ABA quan els embrions pateixen estrès hídric. La detenció del creixement induïda per ABI4 i ABI5 implica la senyalització d'ABA i en el cas d'ABI5, s'ha demostrat que l'ABA inhibeix l'activitat de BRM per induir la transcripció d'ABI5. La pèrdua d'activitat de BRM condueix a la desestabilització d'un nucleosoma implicat en la repressió de la transcripció d'ABI5. Per tant, la reducció de l'activitat de BRM a l'al·lel brm-3 condueix a una major expressió d'ABI5 en plàntules de 2 dies i una major sensibilitat a l'ABA. La nova evidència genètica obtinguda en aquest treball indica que ABI4 és un dels factors de transcripció redundants que són regulats per BRM que medien la resposta a l'ABA durant els estadis de germinació i creixement primerenc de les plàntules. Per tant, l'associació de BRM amb el locus ABI4, juntament amb la desrepressió de l'expressió de ABI4 observada al mutant brm-3 suggereix que BRM regula directament l'expressió d'ABI4. Finalment, aquest treball proporciona una relació directa entre el senyalosoma d'ABA i l'ATPasa remodeladora de cromatina BRM, que permet la modulació de l'activitat de BRM de manera dependent d'ABA com un possible mecanisme per millorar la tolerància a sequera de les plantes. A més, hem identificat i caracteritzat el promotor de PP2CA com un promotor induïble per estrès i l'hem utilitzat per dirigir l'expressió dels receptors d'ABA d'Arabidopsis i Solanum lycopersicum. Aquesta tecnologia sembla ser prometedora per a l'expressió de receptors d'ABA de manera induïble i per generar plantes tolerants a la sequera. / Peirats Llobet, M. (2017). Fundamental and applied research in ABA signaling: Regulation by ABA of the chromatin remodeling ATPase BRAHMA and biotechnological use of the PP2CA promoter [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. doi:10.4995/Thesis/10251/82694. / TESIS / SI

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