El exceso de sales en el medio causa grandes inconvenientes tanto a nivel agrícola debido a las pérdidas que se producen en la calidad y la cantidad de las cosechas, como a nivel médico, siendo responsable de un gran número de enfermedades. El estrés osmótico desencadena mecanismos adaptativos complejos que estudiamos en la presente tesis utilizando como organismo modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae por tratarse de células eucariotas unicelulares metodológicamente accesibles y por la conservación evolutiva de los mecanismos moleculares de la adaptación al estrés entre organismos eucariotas. El principal objetivo de la presente tesis consistió en identificar nuevos procesos moleculares que tienen lugar en las células de levadura cuando éstas sufren un estrés hiperosmótico. Hasta el momento se sabía que la respuesta a estrés osmótico involucraba un gran número de procesos biológicos que tienen lugar a varios niveles como son la regulación de los transportadores de iones, la síntesis de osmolitos para mantener estable la estructura celular, la regulación del ciclo celular y de la traducción y la activación masiva de la expresión génica. Durante la presente tesis hemos identificado a la mitocondria como orgánulo cuya funcionalidad es crucial para la adaptación de las células de levadura al estrés hiperosmótico. Mediante análisis northern mostramos que las células responden al estrés osmótico activando la mitocondria al nivel de expresión génica. Mediante ensayos de actividad enzimática, mostramos que la mitocondria de las células sometidas a estrés es más activa que en condiciones óptimas de crecimiento y mediante ensayos proteómicos, observamos diferencias notables entre los proteomas mitocondriales de aquéllas células que crecen en condiciones hiperosmóticas. Además, hemos demostrado que una de las mayores funciones de la mitocondria en condiciones de estrés osmótico es el control de la generación de estrés oxidativo. / Martínez Pastor, MM. (2011). Análisis de la función y la regulación de la mitocondria de la levadura Saccharomyces cerevisiae en respuesta a estrés osmótico [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10600 / Palancia

En esta Tesis Doctoral se ha abordado el estudio de la respuesta al frío en el flavedo de frutos cítricos, simulando tratamientos cuarentenarios requeridos para evitar la propagación de plagas con la exportación. Desafortunadamente, hay variedades sensibles que desarrollan síntomas de daño por frío durante este tratamiento. En este trabajo se utilizaron frutos de Clementina de Nules (CN), variedad tolerante, y de Clementina Fortune (F), sensible, para analizar a nivel transcriptómico las respuestas de adaptación y de desarrollo de daños durante la exposición al frío. Para ello (1) se generaron dos genotecas de cDNA (una de longitud completa) representativas de flavedo de frutos CN sometidos a estrés por frío; (2) los cDNAs novedosos obtenidos se incluyeron (10,3%) junto con otros (12672 ESTs totales) para generar la primera micromatriz del Proyecto de Genómica de Cítricos; (3) mediante ésta micromatriz se abordó el análisis transcriptómico de CN y F. Los resultados manifestaron que en ambas variedades se produjo una represión de procesos biosintéticos, principalmente de proteínas y también de lípidos, y se activó su catabolismo. Algunas diferencias transcriptómicas podrían ser causantes, al menos en parte, de la tolerancia de CN, al igual que el retraso de la respuesta al frío en F. Por último, también se detectó un programa de expresión tardío exclusivo de F, que podría relacionarse con el desarrollo de daños. / Royo Brun, C. (2010). Respuesta de los frutos cítricos a las bajas temperaturas: estudio mediante micromatrices [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/8642 / Palancia

Los viroides, los agentes infecciosos conocidos más simples, están constituidos por una molécula circular de RNA monocatenario. A pesar de su pequeño tamaño (246-401 nt) y de no codificar proteínas, son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en ciertas plantas. En el presente trabajo hemos profundizado en el estudio de dos metodologías para el control de viroides basadas en ribozimas de cabeza de martillo con motivos de estabilización terciaria, y en RNAs interferentes que inducen en la planta una respuesta defensiva de silenciamiento génico mediado por RNA. Las ribozimas derivadas del viroide latente de la berenjena (Eggplant latent viroid, ELVd), que en su contexto natural median el autocorte de los RNAs multiméricos generados por un mecanismo de replicación de círculo rodante, son particularmente interesantes para adaptarlas a un formato trans. Hemos observado que la secuencia del trinucleótido que precede el sitio de autocorte de la ribozima de polaridad (+) del ELVd afecta a su actividad autocatalítica. Las constantes catalíticas de distintas variantes de este trinucleótido (AUA, AUC, GUA, GUC) determinadas in vitro a baja concentración de magnesio son diferentes en condiciones co- y postranscripcionales. Estos resultados sugieren que la ribozima de polaridad (+) del ELVd, y muy posiblemente otras ribozimas de cabeza de martillo naturales, han sido evolutivamente seleccionadas para actuar durante la transcripción de los RNAs viroidales, y que el trinucleótido AUC que precede al sitio de autocorte no se encuentra en la mayoría de las ribozimas de cabeza de martillo naturales por favorecer la adopción de estructuras metaestables catalíticamente inactivas durante la transcripción. La variante ELVd(+)-GUC, que presenta una constante catalítica alta e induce el corte de una amplia fracción del transcrito primario, fue seleccionada para diseñar variantes en trans frente al viroide del tubérculo fusiforme de la patata (Potat / Carbonell Olivares, A. (2008). Resistencia a viroides inducida por ribozimas de cabeza de martillo y RNAs interferentes [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2005 / Palancia

Las giberelinas (GAs) son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo y crecimiento de las plantas. Los niveles de las GAs activas (GA1 y GA4) están regulados por enzimas de biosíntesis como los GA 20-oxidasas (GA20ox) y GA 3-oxidasas (GA3ox) y por enzimas de catabolismo GA 2-oxidasas (GA2ox). Mediante un abordaje de genética reversa se ha estudiado el papel de algunos genes del metabolismo de GAs en la homeostasis de los contenidos de GAs y en el desarrollo de tabaco (Nicotiana tabacum var. xanthi). Plantas transgénicas que sobreexpresan un gen de GA3ox (35S:PsGA3ox1) presentaron pequeñas variaciones en el fenotipo así como leves incrementos en el contenido de GA1, probablemente debido a que este enzima no es limitante. Adicionalmente se encontró un aumento de expresión de algunos genes GA2ox, NtGA2ox3 y -5, los cuales parecen tener un papel importante en el control de la homeostasis de GAs cuando suceden pequeños incrementos en su contenido endógeno, por lo tanto serían los responsables de evitar la acumulación de GA1 convirtiéndolo en su catabolito, GA8, en estas plantas. Paralelamente, en el estudio del efecto de la sobreexpresión conjunta de una GA3ox con una GA20ox (35S:PsGA3ox1 x 35S:CcGA20ox1) se observaron pocas variaciones en el fenotipo así como en el contenido de GAs activas (GA1 + GA4) en comparación con su parental GA20ox. Estos resultados, corroboran el carácter no limitante de GA3ox en el metabolismo de GAs en tabaco. Por otro lado, se ha estudiado el papel de la familia de genes de GA 2-oxidasas (genes del catabolismo de GAs), mediante la técnica de silenciamiento génico post-transcripcional por RNA de interferencia (RNAi). Los GA2ox de tabaco están codificados por al menos 5 genes con alto grado de redundancia en su expresión. Con el objetivo de obtener plantas transgénicas de tabaco con múltiple silenciamiento génico se elaboró una construccion tipo horquilla portadora de una secuencia altamente conservada en los 5 clones de / Gallego Giraldo, LM. (2008). Efecto de la sobreexpresión y del silenciamiento de genes del metabolismo de giberelinas sobre el desarrollo de tabaco [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2303 / Palancia

Los carpelos, organizados en un gineceo, presentan el mayor grado de complejidad anatómica y funcional de entre los órganos florales. El fruto deriva fundamentalmente del gineceo y es un órgano altamente especializado cuya función, una vez se produce la polinización y fertilización, es asegurar la maduración y la posterior dispersión de las semillas. A pesar del gran progreso que ha tenido lugar en los últimos años, aún quedan por resolver numerosos interrogantes acerca de la morfogénesis del gineceo y la fructificación. Una manera obvia de contribuir al esclarecimiento de estas cuestiones es desvelar la participación de nuevos moduladores genéticos, cuyas alteraciones provoquen perturbaciones morfológicas visibles en el desarrollo del gineceo. En esta Tesis Doctoral se ha pretendido profundizar en la comprensión de las vías genéticas implicadas en el desarrollo del gineceo, así como de la coordinación de dichas rutas. Para ello se ha realizado un esfuerzo para caracterizar funcionalmente dos miembros de una familia de factores transcripcionales con dominio B3, TOP1 y TOP2, que parecían estar implicados en la diferenciación del gineceo y ser un factor común a varias de las vías ya descritas. Se ha intentado establecer cuáles son las relaciones genéticas y moleculares de estos genes con otros identificados previamente, y que actúan en distintos aspectos del desarrollo del gineceo y el fruto de Arabidopsis. Para ello, se han caracterizado funcionalmente dichos genes mediante la obtención de líneas de pérdida y de ganancia de función de los mismos, y la caracterización fenotípica de dichos mutantes. Así, se ha comprobado que están implicados redundantemente en el desarrollo de las regiones apicales del gineceo, promoviendo la diferenciación de las células del estilo y el estigma. Se ha determinado que el patrón de expresión espacio-temporal de TOP1 y TOP2 coincide con las regiones afectadas en los mutantes de pérdida de función, es decir, el estilo y el estigma. Tambié / Trigueros González, M. (2008). Análisis funcional de los factores de trascripción Tower-of-Pisa1 y Tower-of-Pisa2 y su implicación en el desarrollo del gineceo de Arabidopsis [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/2669 / Palancia

Estudios realizados en Atalantia citroides, un género afín de los cítricos, mostraron que estaba infectada con un viroide no descrito hasta el momento. Este nuevo viroide tiene un genoma de 293-294 nucleótidos con una alta proporción de bases GC, una región central conservada que es característica de los miembros del género Apscaviroid, y también la región terminal conservada que tienen este y otros géneros de la familia Pospiviroidae. La estructura secundaria de mínima energía libre predicha para este nuevo viroide es una conformación en forma de varilla con un 68.7% de nucleótidos apareados y con una identidad de secuencia respecto a los otros viroides inferior al 90%, que es el límite convenido para separar las diferentes especies de viroides dentro de un mismo género. Los ensayos de infectividad utilizando el cidro Etrog han mostrado que este nuevo viroide produce síntomas característicos suaves. La co-inoculació de este nuevo viroide con Citrus bent leaf viroid o con Citrus dwarfing viroid, que también son miembros del género Apscaviroid, causa interacciones sinérgicas que se manifiestan induciendo síntomas muy pronunciados en las hojas y un enanismo muy marcado. Este aumento en la intensidad de síntomas no está acompañado por variaciones en la acumulación del viroide en la planta ya que su concentración se mantiene inalterada en plantas co-inoculadas. De acuerdo con estas propiedades moleculares y biológicas, así como por su capacidad por replicarse en A. citroides, este nuevo viroide que tentativamente hemos nombrado Citrus viroid V (CVd-V), ha sido propuesto como una nueva especie del género Apscaviroid. El análisis de 64 muestras provenientes de varias zonas citrícolas ha mostrado que CVd-V está presente en los Estados Unidos, España Nepal, y el Sultanato de Oman. Estos resultados indican que este viroide no ha surgido recientemente y está bastante difundido por diferentes partes del mundo. Los ensayos de transmisión a naranjo, mandarino, híb / Serra Alfonso, P. (2009). Estudios de Patogenicidad de Viroides del Género Apscaviroide y Hostuviroide en cítricos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/6028 / Palancia

Interés del estudio: el desarrollo vascular de las plantas, y más concretamente del xilema es un proceso determinante en el correcto desarrollo de las plantas, y vital para la formación de los recursos madereros de los mismos. Objetivos: los dos objetivos principales de esta tesis son: a) establecer los mecanismos moleculares por los cuales la termoespermina controla la correcta formación del xilema. b) encontrar las diferencias estructurales entre las diversas aminopropil transferasas, que les confieren a cada una de ellas su actividad específica. Elementos de la metodología a destacar: Para esta tesis se han empleado técnicas generales de biología molecular como PCR, digestiones, transformación de bacterias, expresión y purificación de proteínas; y otras técnicas más específicas de la biología molecular de plantas como son la generación de plantas transgénicas y el cartografiado de plantas mutantes generadas por tratamiento químico. Además se han empleado técnicas de cromatografía para el manejo de HPLC y GC-MS. Resultados logrados: las dos principales conclusiones de esta tesis son: a) el papel de ACL5 y/o de la termoespermina es impedir la muerte prematura durante la diferenciación del xilema. El mecanismo más probable es la promoción de la traducción de los genes AJAX, que codifican factores de transcripción bHLH. b) la discriminación de sustratos por parte de las aminopropil transferasas y putrescina-N-metil transferasas no se explica únicamente por diferencias en los centros activos. / Vera Sirera, FJ. (2011). Bases moleculares de la síntesis de termoespermina y sus implicaciones en el desarrollo vascular de Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/10689 / Palancia

Para que los microorganismos probióticos ejerzan su efecto beneficioso sobre el huésped, han de encontrarse en proporciones elevadas en el producto y ser capaces de sobrevivir en suficiente cantidad al tránsito gastrointestinal. Se ha producido una cierta discrepancia entre diferentes líneas de investigación a la hora de afirmar los efectos beneficiosos del yogur tradicional. Algunas de ellas aseguran que sus bacterias no son capaces de sobrevivir al tracto gastrointestinal mientras que otras afirman lo contrario. En este trabajo se planteó desarrollar métodos rápidos alternativos a los tradicionales de cultivo para estudiar las propiedades probióticas de las bacterias contenidas en yogures naturales. Se procedió al aislamiento, identificación y caracterización molecular de las bacterias lácticas presentes en yogures naturales. Se realizó la puesta a punto de las técnicas de PCR y FISH para la detección de ambos microorganismos. Se desarrolló la técnica DVC-FISH para la detección de células viables de Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus y Streptococcus thermophilus que permitió determinar su resistencia in vitro a los jugos gastrointestinales. Finalmente, se hizo un estudio in vivo de la supervivencia al tracto gastrointestinal de estas cepas y se estudió la evolución de la microbiota intestinal a lo largo del ensayo. Este ensayo permitió demostrar la presencia de Streptococcus thermophilus viables en las heces humanas tras la ingesta de producto. La técnica DVC-FISH se mostró como el método más rápido y eficaz para la determinación de la viabilidad de LAB en matrices complejas. Se observó que el consumo de yogur durante un periodo determinado produce un aumento de la microbiota endógena de lactobacilos así como una disminución de la población de enterobacterias. / García Hernández, J. (2010). Técnicas moleculares aplicadas a la caracterización y estudio de la supervivencia de bacterias lácticas del yogur [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/14010 / Palancia

CARACTERIZACIÓN DE CEPAS TOXIGÉNICAS DEL GÉNERO Fusarium MEDIANTE TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR. Las micotoxinas son metabolitos producidos por un amplio grupo de hongos, entre los que se encuentran los pertenecientes al género Fusarium. Se han detectado como contaminantes naturales en mayor o en menor grado en un gran número de productos agrícolas y manufacturados y, si llegan a ser consumidas, pueden causar una gran variedad de efectos tóxicos en humanos y animales. Dentro de los cereales, el maíz es uno de los más vulnerables a la colonización por especies del género Fusarium y, por consiguiente, a la contaminación por las micotoxinas que produce dicho género. Es por ello que en este trabajo se aislaron estos hongos a partir de granos de maíz destinados al consumo humano y animal. Estos análisis, además de aportarnos los aislados necesarios para la identificación y detección de la producción de micotoxinas, sirvieron para el estudio comparativo entre los medios de cultivo Patata Dextrosa Agar (PDA) y Agar Verde Malaquita, destacándose este último por su selectividad para el aislamiento de hongos del género Fusarium frente otros géneros. Una vez obtenidos los aislados, nos centramos en la identificación por PCR de especies del género Fusarium procedentes de grano de maíz y la detección de especies productoras de tricotecenos (deoxinivalenol (DON) y nivalenol (NIV)). Como controles se utilizaron cepas de referencia: suministradas por la Colección Española de Cultivos Tipo. De los hongos obtenidos en la primera parte de este trabajo se seleccionaron 377 pertenecientes al género Fusarium. Estos aislados fueron analizados mediante PCR utilizando diferentes iniciadores específicos. Con este método se obtuvo la identificación de las especies F. graminearum, F. proliferatum, F. oxysporum y F. verticillioides. La técnica PCR también permitió la detección de cepas productoras de tricotecenos, así como la de aislados productores de DON. Para comprobar la especificidad / Gómez López, ED. (2008). Caracterización de cepas toxigénicas del género fusarium mediante técnicas de biología molecular [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3346 / Palancia

La ?-oxidación es un proceso metabólico esencial en las células eucarióticas. Tradicionalmente, esta ruta catabólica ha sido considerada en plantas como la vía principal de degradación de ácidos grasos en las células. Sin embargo, en los últimos años, la ?-oxidación de plantas está siendo objeto de un gran interés científico por su implicación en funciones relacionadas con el desarrollo y la defensa. En este contexto, aunque en estudios bioquímicos previos se había propuesto la participación de reacciones de -oxidación en la biosíntesis de ácido salicílico (SA) y ácido jasmónico (JA), moléculas señalizadoras clave en las respuestas de defensa de plantas frente a patógenos y herida, no se había descrito la implicación de ningún enzima de ?-oxidación hasta la realización de este trabajo. De todos los pasos enzimáticos implicados en esta ruta, la familia de las 3-cetoacil-CoA tiolasas (KAT) son las enzimas y genes menos estudiados. Este trabajo se ha centrado en la caracterización molecular y funcional de los distintos genes que codifican proteínas KAT de Arabidopsis, principalmente del gen KAT2 que codifica la proteína con la función KAT mayoritaria en ?-oxidación en Arabidopsis. Para determinar las posibles funciones del gen KAT2 en procesos relacionados con el desarrollo y con la defensa de las plantas, se generaron plantas transgénicas con pérdida o ganancia de función del gen y otras donde la secuencia promotora de KAT2 se fusionó a genes delatores, las cuales permitieron caracterizar en mayor profundidad el patrón de expresión de este gen en Arabidopsis. Los análisis de expresión realizados demostraron que la herida activa transcripcionalmente genes de -oxidación con un patrón de inducción específico. Concretamente, el gen KAT2 aumentó su expresión a través de una vía de señalización independiente de la señalización mediada por JA y posiblemente dependiente de ácido abcísico. Además, plantas transgénicas con una expresión reducida del gen KAT2 mostrar / Castillo López Del Toro, MC. (2008). Función del gen 3-cetoacil-CoA tiolasa 2 (KAT2) en defensa y desarrollo. Participación de los peroxisomas en las respuestas a herida en Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/3783 / Palancia