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Detention of spores of Bacillus subtilis into spheres of chitosan obtained from chitin from shrimp for use in the biodegradation of hydrocarbons. / ImobilizaÃÃo de esporos de Bacillus subtilis em esferas de quitosana obtida de quitina de camarÃo para uso na biodegradaÃÃo de hidrocarbonetos.Raphaela Vasconcelos Gomes 05 November 2008 (has links)
CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The use of microorganisms or their metabolic products for cleaning polluted areas represents one of the most important challenges of bioremediation. However, in spite of very promising, this technology shows as main limitation the use of free microorganisms in the environment, which could fault the effectiveness from biodegradation. In those circumstances, the microorganisms are exposed to environmental conditions and can be easily dispersed from the application site, and find resistance of the indigenous microorganisms. The cells immobilization in polymers minimizes those problems providing environmental protection, maintaining the microbial population concentrated in the action site and preventing the natural competition. Several polymers have been tested in the attempt of developing supports for cells immobilization. The chitosan, a chitin derived found predominantly in the shell of crustaceans, has been studied due to its intrinsic characteristics such as high positive charges density that can interact with the cellular surfaces of many microorganisms. Besides, the chitin is the second most abundant polymer in the world after cellulose. As the main by-product of the industry of the shrimp, the choice of chitosan as immobilization matrix also represents a form of recycling these residues from shrimp culture. In spite of those advantages, the antimicrobial effects of the chitosan have limited its utilization. To be immobilized in chitosan the microorganism has to be not only resistant to harmful effects of chitosan, but preferentially, it is necessary that it doesn't produce enzymes to degrade the polymer, such as chitosanases. Few microorganisms are known to meet that get to fill out these requirements, what explains the shortage of works dealing on immobilization of cells in chitosan. So, the aim of this work was investigate the immobilization of bacterial spores of a Bacillus strain in chitosan spheres and evaluating, after the germination of the spores, the efficiency of the cells free or immobilized to degrade n-hexadecane and produce surfactants. The results showed that the immobilization of the spores was quite viable because they resisted to the toxic effect of chitosan and to the drastic treatment of spheres production, although it was necessary supplemented the medium growth with 1% glucose in addition to 1% n-hexadecane for the germination to occur. The results of biodegradation assays showed that, in both cases, with free or immobilized cells, the n-hexadecane was consumed after 48 h of cultivation, with 98.74% and 99.51%, respectively. In spite of the biodegradation percentages be statistically similar the use of B. subtilis LAMI007 immobilized was more advantageous since the culture degraded the same n-hexadecane concentration with the biomass ten times smaller. The immobilized cells produced the same amount of surfactants as the free cells (around 50%), but the immobilized cells did not use the surfactants produced as source of carbon. Thus could facilitate the isolation of those substances from the supernatant of the cultures. In conclusion, it was proven to be viable the use of the chitosan in the immobilization of B. subtilis LAMI007 spores, as well as the potential of those cells to degrade hydrocarbons and produce surfactant, both results can be applied for decontamination of polluted areas. / A utilizaÃÃo de microrganismos ou de seus produtos metabÃlicos para limpeza de Ãreas contaminadas por hidrocarbonetos representa uma das vertentes mais estudadas da biorremediaÃÃo. Entretanto, apesar de muito promissora, esta tecnologia apresenta como principal limitaÃÃo o fato de, na maioria dos casos, empregar bactÃrias livres no ambiente, podendo comprometer a eficÃcia da biodegradaÃÃo. Nessas circunstÃncias, os microrganismos ficam expostos Ãs condiÃÃes ambientais, podem ser facilmente dispersos do local de aplicaÃÃo, alÃm de encontrarem resistÃncia da microbiota indÃgena. A imobilizaÃÃo de bactÃrias em polÃmeros minimiza esses problemas por proporcionar um microambiente protegido, alÃm de manter a populaÃÃo microbiana concentrada no local de aÃÃo e impedir a competiÃÃo natural com outros microrganismos. VÃrios polÃmeros tÃm sido pesquisados na tentativa de se desenvolver suportes para imobilizaÃÃo de cÃlulas. A quitosana, um derivado da quitina encontrada predominantemente na carapaÃa dos crustÃceos, tem sido atualmente estudada por possuir alta densidade de cargas positivas que favorecem a interaÃÃo com as superfÃcies celulares de muitos microrganismos. AlÃm disso, pela quitina ser o segundo polÃmero mais abundante no planeta e o principal subproduto da indÃstria do camarÃo, a escolha pelo uso da quitosana tambÃm representa uma forma de reciclagem dos resÃduos da carcinicultura. Apesar dessas vantagens, os efeitos antimicrobianos da quitosana tÃm limitado o seu uso, visto serem inÃmeros os microrganismos sensÃveis a este polÃmero natural. Um microrganismo para ser imobilizado em matriz exclusivamente de quitosana deve nÃo somente ser resistente aos seus efeitos danosos, mas preferencialmente, à necessÃrio que ele nÃo produza enzimas que degradem a matriz, como quitosanases. Poucos sÃo os microrganismos conhecidos que conseguem preencher estes requisitos, o que explica a escassez de trabalhos que relatem a imobilizaÃÃo de cÃlulas em suportes exclusivamente de quitosana. Dessa maneira, a relevÃncia deste trabalho encontra-se em dois pontos. Primeiramente em apresentar, de forma inÃdita, a imobilizaÃÃo de esporos bacterianos de uma linhagem de Bacillus subtilis em esferas fabricadas somente por quitosana. E segundo em avaliar, apÃs a germinaÃÃo dos esporos, a eficiÃncia das cÃlulas livres e imobilizadas dessa linhagem em biodegradar n-hexadecano. Os resultados mostraram que a imobilizaÃÃo dos esporos foi bastante viÃvel e reprodutÃvel, uma vez que eles resistiram à quitosana, ao drÃstico tratamento de fabricaÃÃo das esferas, e germinaram quando na presenÃa de glucose. Os ensaios de biodegradaÃÃo mostraram que, em ambos os casos, o n-hexadecano foi consumido apÃs 48h de cultivo, numa taxa de 98,74% e 99,51% para cÃlulas livres e imobilizadas, respectivamente. Apesar das taxas de biodegradaÃÃo terem sido estatisticamente semelhantes, o uso de B. subtilis LAMI007 imobilizado mostrou-se mais vantajoso pelo fato da cultura conseguir biodegradar a mesma concentraÃÃo de n-hexadecano estando com a biomassa celular dez vezes menor, produzir e liberar a mesma quantidade de biossurfactantes no meio que o observado pelas cÃlulas livres (em torno de 50%), e tambÃm por nÃo utilizar os biossurfactantes produzidos como fonte de carbono, o que facilitou a detecÃÃo e seleÃÃo dessas substÃncias no sobrenadante da cultura. Dessa forma, ficou comprovado ser viÃvel o uso da quitosana na imobilizaÃÃo de esporos da linhagem de B. subitlis LAMI007, assim como o potencial dessas cÃlulas em, uma vez germinadas, serem utilizadas na biorremediaÃÃo de ambientes contaminados por hidrocarbonetos.
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Isolamento e identificação de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em amostras de ambientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - RSCarlesso, Ana Maris January 2006 (has links)
Amebas de vida livre (AVL), tais como Acanthamoeba spp., Naegleria spp. e Balamuthia mandrillaris, são potenciais agentes de infecções humanas podendo ser encontradas no meio ambiente como solo, água fresca e ar atmosférico. No Brasil, de um modo geral, há poucos trabalhos relatando a importância do estudo desses patógenos em ambientes hospitalares. Assim este trabalho visou estudar a presença de Acanthamoeba spp. e Naegleria spp. na poeira e biofilmes de 15 ambientes diferentes (CTI, UTI pediátrica, Centro Cirúrgico, Centro Cirúrgico Ambulatorial, Emergência, Cozinha, Reservatórios de Azulejo e de Concreto, 06 Bebedouros e 01 Torneira) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS (HCPA). Coletas mensais de poeira e biofilmes foram realizadas com suabes passados aleatoriamente nos locais de coleta, de julho de 2004 e março de 2005, totalizando 135 amostras. Após sedimentação do material, o sedimento foi usado como inóculo em placas de Petri com ágar não nutriente 1,5%, previamente inoculadas com E. coli. As amostras foram incubadas durante 10 dias a 30°C. Das 135 amostras coletadas dos 15 ambientes do HCPA, 47 (35%) foram positivas para AVL, segundo critérios morfológicos de Page. Destas, 34% apresentaram características morfológicas próprias do gênero Acanthamoeba, sendo 03 desses isolados confirmados por PCR.
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Isolamento e identificação de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em amostras de ambientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - RSCarlesso, Ana Maris January 2006 (has links)
Amebas de vida livre (AVL), tais como Acanthamoeba spp., Naegleria spp. e Balamuthia mandrillaris, são potenciais agentes de infecções humanas podendo ser encontradas no meio ambiente como solo, água fresca e ar atmosférico. No Brasil, de um modo geral, há poucos trabalhos relatando a importância do estudo desses patógenos em ambientes hospitalares. Assim este trabalho visou estudar a presença de Acanthamoeba spp. e Naegleria spp. na poeira e biofilmes de 15 ambientes diferentes (CTI, UTI pediátrica, Centro Cirúrgico, Centro Cirúrgico Ambulatorial, Emergência, Cozinha, Reservatórios de Azulejo e de Concreto, 06 Bebedouros e 01 Torneira) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS (HCPA). Coletas mensais de poeira e biofilmes foram realizadas com suabes passados aleatoriamente nos locais de coleta, de julho de 2004 e março de 2005, totalizando 135 amostras. Após sedimentação do material, o sedimento foi usado como inóculo em placas de Petri com ágar não nutriente 1,5%, previamente inoculadas com E. coli. As amostras foram incubadas durante 10 dias a 30°C. Das 135 amostras coletadas dos 15 ambientes do HCPA, 47 (35%) foram positivas para AVL, segundo critérios morfológicos de Page. Destas, 34% apresentaram características morfológicas próprias do gênero Acanthamoeba, sendo 03 desses isolados confirmados por PCR.
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Human coronavirus detection in pediatric patients with pneumonia treated at a reference hospital in Fortaleza-CE in the years 2011 and 2012 / DetecÃÃo de coronavÃrus humanos em pacientes pediÃtricos com pneumonia atendidos em um hospital de referÃncia em Fortaleza-CE nos anos de 2011 e 2012Francisco MÃrio Sidney Oliveira 15 July 2016 (has links)
Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Four genotypes of human coronavirus (CoVh-229E, OC43, NL63 and HKU1) are often associated with diseases of the upper respiratory tract as well as in the lower.Despite the diversity of human coronavirus associated with acute respiratory infections, little is known about the impact of infections associated with them in child populations living in tropical regions.The present study had as objective detect CoVh in nasopharyngeal samples from pediatric patients with pneumonia treated at emergency rooms and wards of a referral hospital in the city of Fortaleza - CearÃ, during the years 2011 and 2012.To that end, we collected 522 nasopharyngeal aspirates, where the principle indirect immunofluorescence (IIF) was used for detection of influenza A and B viruses, respiratory syncytial virus, adenovirus and parainfluenza 1, 2 and 3, and 99 (19%) samples positive by this technique. Negative samples by IFA were subjected to polymerase chain reaction in real-time (RT-qPCR) for detection of CoVh. Of the 423 negative samples by IFA, 71 (16.80%) had a positive result for CoVh, where the type 229E was the most frequent (34.11%), followed by genotypes OC43 and NL63 with 28.23% each and with lower detection HKU1 genotype (9.4%).We observed 14 (19.71%) co-detections with at most two genotypes among CoVh.All types of CoVh were observed during the study period.A rate of 67.60% of the infected children was treated by CoVh in emergency, but it is worth mentioning the high detection rate in hospitalized patients (32.40%).HKU1 genotype identified in a child with one month old who died, where the only risk factor was age observed.Our results show the circulation four types of CoVh in our city,being detected in pediatric patients with pneumonia, demonstrating the potential importance of these viruses in severe respiratory syndromes. / Quatro genÃtipos de coronavÃrus humanos (CoVh-229E, OC43, NL63 e HKU1) sÃo frequentemente associados a doenÃas no trato respiratÃrio superior como tambÃm no inferior. Apesar da diversidade de coronavÃrus associados a infecÃÃes respiratÃrias agudas humanas pouco se conhece sobre o impacto das infecÃÃes a eles associadas em populaÃÃes infantis que vivem em regiÃes tropicais. O presente estudo teve como objetivo detectar os CoVh em amostras de nasofaringe provenientes de pacientes pediÃtricos com pneumonia atendidos na emergÃncia e nas enfermarias de um hospital de referÃnciana cidade de Fortaleza â CearÃ, durante os anos de 2011 e 2012. Para tanto, foram coletadas 522 aspirados de nasofaringe, onde a princÃpio foi utilizada a tÃcnica de imunofluorescÃncia indireta (IFI) para detecÃÃo dos vÃrus influenza A e B, sincicial respiratÃrio (VSRh), adenovÃrus (ADVh), e parainfluenza 1, 2 e 3 (VPIh 1, 2 e 3), sendo 99 (19%) amostras positivas por esta tÃcnica. As amostras negativas por IFI foram submetidas à reaÃÃo em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) para detecÃÃo dos CoVh. Das 423 amostras negativas por IFI, 71 (16,80%) tiveram o resultado positivo para os CoVh, onde o tipo 229E foi o mais frequente (34,11%), seguidos pelos tipos OC43 e NL63 com 28,23% cada e como menor detecÃÃo o HKU1 (9,4%). Todos os tipos de CoVh puderam ser observados durante o perÃodo de estudo. Uma taxa de 67,60% das crianÃas infectadas pelos CoVh foram atendidas na emergÃncia, mas vale ressaltar a alta taxa de detecÃÃo em pacientes hospitalizados (32,40%). Quanto aos sinais e sintomas clÃnicos, observamos uma maior frequÃncia de coriza, tosse, febre e dispnÃia nos pacientes positivos para os CoVh. Identificamos o tipo HKU1 em uma crianÃa com um mÃs de idade que foi a Ãbito, onde o Ãnico fator de risco observado foi a idade. Nossos resultados demonstram a circulaÃÃo de quatro tipos de CoVh no Nordeste do Brasil, sendo detectados em pacientes pediÃtricos com pneumonia, mostrando a possÃvel importÃncia desses vÃrus em sÃndromes respiratÃrias mais graves. Este estudo representa a primeira anÃlise sobre a epidemiologia dos CoVh em nosso estado.
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Isolamento e identificação de amebas de vida livre potencialmente patogênicas em amostras de ambientes do Hospital de Clínicas de Porto Alegre - RSCarlesso, Ana Maris January 2006 (has links)
Amebas de vida livre (AVL), tais como Acanthamoeba spp., Naegleria spp. e Balamuthia mandrillaris, são potenciais agentes de infecções humanas podendo ser encontradas no meio ambiente como solo, água fresca e ar atmosférico. No Brasil, de um modo geral, há poucos trabalhos relatando a importância do estudo desses patógenos em ambientes hospitalares. Assim este trabalho visou estudar a presença de Acanthamoeba spp. e Naegleria spp. na poeira e biofilmes de 15 ambientes diferentes (CTI, UTI pediátrica, Centro Cirúrgico, Centro Cirúrgico Ambulatorial, Emergência, Cozinha, Reservatórios de Azulejo e de Concreto, 06 Bebedouros e 01 Torneira) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, RS (HCPA). Coletas mensais de poeira e biofilmes foram realizadas com suabes passados aleatoriamente nos locais de coleta, de julho de 2004 e março de 2005, totalizando 135 amostras. Após sedimentação do material, o sedimento foi usado como inóculo em placas de Petri com ágar não nutriente 1,5%, previamente inoculadas com E. coli. As amostras foram incubadas durante 10 dias a 30°C. Das 135 amostras coletadas dos 15 ambientes do HCPA, 47 (35%) foram positivas para AVL, segundo critérios morfológicos de Page. Destas, 34% apresentaram características morfológicas próprias do gênero Acanthamoeba, sendo 03 desses isolados confirmados por PCR.
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Biogènesi de centres Fe-S, dany al DNA i mecanismes de resposta en Saccharomyces cerevisiaePijuan Marquilles, Jordi 05 October 2015 (has links)
La biogènesi de centres Fe-S és necessària per múltiples processos cel·lulars. En l’estudi present s’ha demostrat que defectes en diferents etapes de la biosíntesi mitocondrial i citosòlica de centres Fe-S causen un increment en la mutagènesi espontània i hipersensibilitat a agents genotòxics, acompanyat d’un increment en la formació de foci associats a Rad52 i un augment en la fosforilació de la histona γ–H2A, tots aquests fets indicatius de la presència de lesions constitutives al DNA i d’inestabilitat genòmica. A més, d’un retard en la progressió a través de la fase S del cicle cel·lular i l’activació constitutiva del checkpoint de dany al DNA. Aquest darrer estimula l’augment en l’activitat de la ribonucleòtid reductasa mitjançant la disminució dels nivells de l’inhibidor Sml1 i la redistribució citosòlica de les subunitats enzimàtiques Rnr2/4.
En paral·lel a la inestabilitat del genoma nuclear observada quan hi ha defectes en les diferents etapes de la maquinària ISC, s’ha demostrat també en aquest estudi una pèrdua constitutiva del DNA mitocondrial, i conseqüentment, defectes en la respiració i altres disfuncions mitocondrials. / La biogénesis de centros Fe-S es necesaria en múltiples procesos celulares. En el presente estudio se ha demostrado que defectos en diferentes etapas de la biosíntesis mitocondrial y citosólica de centros Fe-S causan un incremento en la mutagénesis espontanea e hipersensibilidad a agentes genotóxicos, acompañado de un incremento en la formación de foci asociados a Rad52 y un aumento en la fosforilación de la histona γ-H2A, todos estos hechos indicativos de la presencia de lesiones constitutivas en el DNA y de inestabilidad genómica. Además, un retraso en la progresión a través de la fase S del ciclo celular y la activación constitutiva del checkpoint de daño al DNA. Este último estimula el aumento de la actividad ribonucleótido reductasa mediante la disminución de los niveles del inhibidor Sml1 y la redistribución citosólica de las subunidades enzimáticas Rnr2/4.
En paralelo a la inestabilidad genómica nuclear observada cuando hay defectos en las diferentes etapas de la maquinaria ISC, en este estudio se ha demostrado también una perdida constitutiva del DNA mitocondrial, y consecuentemente, defectos en la respiración y otras disfunciones mitocondriales. / The Fe-S clusters biogenesis is required for multiple cellular processes. In this work we demonstrate that defects at different stages of mitochondrial and cytosolic Fe-S clusters biosynthesis cause an increase of spontaneous mutagenesis and hypersensitivity to genotoxic agents, accompanied by an increment in Rad52-associated DNA repair foci and a hyperphosphorylated state of γ–H2A histone, altogether supporting the presence of constitutive DNA lesions and genomic instability. Furthermore, a delay in the progression of S phase in the cell cycle and constitutive activation of the DNA damage checkpoint. This last one stimulates the upregulation of the ribonucleotide reductase activity by promoting reduction of the levels of Sml1 inhibitor, as well as the cytosolic redistribution of the Rnr2/4 enzyme subunits.
In parallel to the nuclear genome instability displayed when different ISC machinery stages are impaired, we also demonstrate in this work constitutive loss of mitochondrial DNA, and consequently, respiration defects and other mitochondrial dysfunctions.
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Mecanismes implicats en la senyalització i la defensa front l'estrès per selenit en Saccharomyces cerevisiaePérez Sampietro, Maria 24 January 2014 (has links)
El seleni és un element essencial en la dieta humana present en selenoproteïnes, que té propietats
anticancerígenes a concentracions baixes tot i que és tòxic a dosis elevades. Contràriament als
microorganismes multicel•lulars, el Se no és essencial pel creixement de Saccharomyces
cerevisiae, ja que manca de selenoproteïnes. La proteïna quinasa Snf1/AMPK juga un paper
central en la regulació de l’homeòstasi del metabolisme del carboni en S. cerevisiae. En aquest
treball s’ha demostrat que l’activitat d’aquesta quinasa és necessària per protegir les cèl•lules
front la toxicitat per selenit. A més, Snf1 juga un paper protector quan l’homeòstasi redox del
metabolisme del glutatió es troba alterada cap a un ambient intracel•lular més oxidant. D’altra
banda, aquest treball demostra que el selenit provoca la inducció del reguló Aft1 de forma
específica i diferent del que s’observa en condicions de dèficit de ferro. Mentre que Aft1
protegeix les cèl•lules front la toxicitat per selenit depenent dels nivells de ferro intracel•lulars,
Aft2, factor transcripcional paràleg d’Aft1, juga una funció independent front aquesta protecció.
A més, Rim101 (qui regula la via de resposta a pH alcalí) també protegeix front al selenit, tot i
que el seu rol protector no està relacionat ni amb Aft1 ni amb Aft2. Addicionalment, Rim101
regula l’expressió de gens d’algunes subunitats de l’ATPasa V-H+ al llarg d’un tractament amb
selenit. / El selenio es un elemento esencial en la dieta humana presente en forma en selenoproteínas, que
tiene propiedades anticancerígenas a concentraciones bajas aunque es tóxico a dosis elevadas.
Contrariamente a los microorganismos multicelulares, el Se no es esencial para el crecimiento de
Saccharomyces cerevisiae, ya que carece de selenoproteínas. La proteína quinasa Snf1/AMPK
juega un papel central en la regulación de la homeostasis del metabolismo del carbono en S.
cerevisiae. En este trabajo se ha demostrado que la actividad de esta quinasa es necesaria para
proteger las células frente a la toxicidad por selenito. Además, Snf1 juega un papel protector
cuando la homeostasis redox del metabolismo del glutatión se encuentra alterada hacia un
ambiente intracelular más oxidante.Por otra parte, este trabajo demuestra que el selenito provoca
la inducción del regulón Aft1 de forma específica y diferente de lo que se observa en condiciones
de déficit de hierro. Mientras que Aft1 protege las células frente a la toxicidad por selenito
dependiendo de los niveles de hierro intracelulares, Aft2, factor transcripcional parálogo de Aft1,
juega una función independiente frente a esta protección. Además, Rim101 (quien regula la vía
de respuesta a pH alcalino) también protege frente al selenito, aunque su rol protector no está
relacionado ni con Aft1 ni con Aft2. Adicionalmente, Rim101 regula la expresión de genes de
algunas subunidades de la ATPasa V-H+ a lo largo de un tratamiento con selenito. / Selenium is an essential element in human diet present in a number of selenoproteins, which has
anticarcinogenic properties at low concentrations although it is toxic at high dosis. In contrast to
multicellular organisms, Se is not essential for growth of Saccharomyces cerevisiae, which lacks
selenoproteins. The AMPK/Snf1 protein kinase has a central role in carbon metabolism in S.
cerevisiae. In this study it has been demonstrated that Snf1 activity is needed for protection
against selenite toxicity. Moreover, Snf1 plays a role in protecting yeast cells when glutathionedependent
redox homeostasis is altered to a more oxidant intracellular environment.On the other
hand, this study demonstrates that selenite provokes the induction of the Aft1 regulon in a
specific manner, and different from that observed in iron limitation conditions. While Aft1
protects cells against selenite in an iron-dependent manner, Aft2, Aft1 paralog transcription
factor, has independent roles in such protection. Moreover, Rim101 (which mediates the alkaline
pH response pathway) also protects against selenite, although its role is not related neither to Aft1
nor to Aft2. Additionally, Rim101 regulates the expression of some genes encoding ATPase VH+
vacuolar subunits during selenite treatment.
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Genomic instability associated to impairment of Fe-S clusters synthesis in Saccharomyces cerevisiae yeast cellsMaria, José Carlos Aires 18 July 2014 (has links)
Les glutaredoxines (GRXs) són tiol oxidoreductases àmpliament repartides entre organismes procariotes i eucariotes. La Grx5 de llevat Saccharomyces cerevisiae es troba a la matriu mitocondrial i participa en la síntesi dels centres ferro-sofre (ISCs), que són co-factors necessaris per a diversos processos cel•lulars essencials des la respiració, la regulació de l'expressió gènica i el metabolisme de l'ADN-ARN. Algunes proteïnes amb ISCs estan involucrades en el metabolisme de l'ADN, més precisament en la replicació de l'ADN o en els processos de reparació del mateix. Treballs recents van demostrar que els defectes en el metabolisme de ISCs comprometen l'estabilitat del genoma cel•lular, i aquesta inestabilitat està associada a la predisposició a múltiples càncers humans. Mitjançant l'ús d'un mutant Δgrx5 de S. cerevisiae com a model d'estudi vam intentar entendre millor la relació entre la inestabilitat genòmica i els defectes en la biosíntesi de ISCs. L'absència de la proteïna mitocondrial Grx5 condueix a un augment de la inestabilitat genètica. Aquesta inestabilitat del genoma no depèn de l'acumulació de ferro que es produeix en les cèl • lules que no tenen Grx5. Les cèl • lules que no expressen Grx5 tenen majors nivells de dany constitutiu a l'ADN, que s'associa específicament a la formació de "focis" associats a Rad52. Les cèl • lules que no tenen Grx5 i Ssq1 són hipersensibles a agents que danyen l'ADN de forma additiva. Aquesta sensibilitat és independent de l'estat d'estrès oxidatiu constitutiu que es produeix en les cèl • lules que no tenen Grx5. L'absència de les proteïnes Grx5 i Ssq1 provoca un retard en la progressió del cicle cel • lular a través de la fase S. La via de reparació de l'ADN, recombinació homòloga podria tenir un paper important en la reparació dels danys en l'ADN en les cèl • lules del mutant Δgrx5. / Las glutaredoxinas (GRXs) son tiol oxidoreductasas ampliamente distribuídas entre organismos procariotas y eucariotas. La proteína Grx5 de levadura Saccharomyces cerevisiae se encuentra en la matriz mitocondrial y participa en la síntesis de los centros hierro-azufre (ISCs), que son co-factores necesarios para varios procesos celulares esenciales, tales como la respiración hasta la regulación de la expresión génica y el metabolismo del ADN-ARN. Algunas proteínas asociadas a ISCs están involucradas en el metabolismo del ADN, más precisamente en su replicación o en procesos de reparación del mismo. Trabajos recientes demostraron que los defectos en el metabolismo de ISCs comprometen la estabilidad del genoma celular, y esta inestabilidad está asociada a la predisposición a múltiples cánceres humanos. Mediante el uso de un mutante Δgrx5 de S. cerevisiae como modelo de estudio quisimos abordar la comprensión de la relación entre la inestabilidad genómica y los defectos en la biosíntesis de ISCs. La ausencia de la proteína mitocondrial Grx5 conduce a un aumento de la inestabilidad genética. Esta inestabilidad del genoma no depende de la acumulación de hierro que se produce en las células que carecen Grx5. Las células que no expresan Grx5 tienen mayores niveles de daño constitutivo al ADN, que se asocia específicamente a la formación de “focis” asociados a Rad52. Las células que carecen Grx5 y Ssq1 son hipersensibles a agentes que dañan el ADN de forma aditiva. Esta sensibilidad es independiente del estado de estrés oxidativo constitutivo que se produce en las células que carecen de Grx5. La ausencia de las proteínas Grx5 y Ssq1 provoca un retraso en la progresión del ciclo celular a través de la fase S. La vía de reparación del ADN, recombinación homóloga podría desempeñar un papel importante en la reparación de los daños en el ADN en las células del mutante Δgrx5. / Glutaredoxins (GRXs) are thiol oxidoreductases widely spread among prokaryotic and eukaryotic organisms. Saccharomyces cerevisiae Grx5 is located at the mitochondrial matrix and participates in the synthesis of iron-sulphur clusters (ISCs), which are co-factors required for several essential cellular processes, such as respiration, regulation of gene expression and DNA-RNA metabolism. Some ISC proteins are involved in DNA metabolism, more precisely in DNA replication and/or repair processes. Recent works reported that defects in ISC metabolism compromise the stability of the cellular genome, and this instability is associated to human predisposition towards multiple types of cancers. Using the yeast grx5 mutant as a model we wanted to gain further insight in the relationship between genomic instability and defects in ISC biosynthesis.The absence of mitochondrial protein Grx5 leads to an increase in genetic instability. This genomic instability is not dependent on the iron accumulation produced in cells lacking Grx5. The cells that do not express Grx5 have higher levels of constitutive DNA damage, specifically associated with the formation of "focis" related with Rad52. Cells lacking Ssq1 and Grx5 are hypersensitive to DNA-damaging agents in an additively way. This sensitivity is independent of the constitutive oxidative stress state that occurs in the cells depleted of Grx5. The absence of proteins Ssq1 and Grx5 causes a delay in cell cycle progression through S phase. The DNA repair pathway homologous recombination could play an important role in the repair of DNA damage in cells Δgrx5 mutant.
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Glutaredoxines de reticle endoplasmàtic/Golgi de Saccharomyces cerevisiae: relació amb l'homeòstasi del calci i la maquinària de secreció proteicaPuigpinós Roig, Judit 03 July 2014 (has links)
Grx6 i Grx7 són dues glutaredoxines (GRXs) de la via secretora responsables de la reducció dels
ponts disulfur mixtes entre el glutatió i les proteïnes. D’una banda, el mutant Δgrx6 mostra una
inducció constitutiva de la via Crz1-calcineurina. L’absència de Grx6 afecta l’homeòstasi del
Ca2+, provocant un increment dels nivells de Ca2+ citosòlic, que es reflecteix en alteracions en la
sensibilitat del mutant als quelants de Ca2+ i a altes concentracions de Ca2+ extracel·lular.
Donada l’estreta relació entre l’homeòstasi de diversos ions a la cèl·lula, el mutant Δgrx6 també
acumula un excés de fosfat, potassi i sodi. D’altra banda, es mostra una relació entre l’estrès de
RE i ambdues GRXs, ja que en condicions d’estrès de RE, tant la falta de GRX6 com de GRX7
provoquen canvis en la inducció de la resposta degut a les proteïnes mal plegades. Aquestes
GRXs estan relacionades funcionalment amb la maquinària de plegament proteic, ja que
l’absència de GRX6 o GRX7 contraresta els defectes de creixement d’un mutant amb baixos
nivells d’Ero1, de manera similar al que succeeix en presència de l’oxidant diamida,
probablement creant unes condicions oxidants al RE que compensen l’absència d’Ero1.
Similarment, els anàlisis per pols i caça mostren que l’absència de GRX6 o GRX7 contraresta els
defectes de secreció de la proteïna carboxipeptidasa Y (CPY) d’un mutant amb baixos nivells
d’Ero1. Finalment, es demostra que l’acumulació de Ca2+ en el mutant Δgrx6 es produeix
independentment de l’afectació en la secreció de CPY. / Grx6 i Grx7 son dos glutaredoxinas (GRXs) de la vía secretora responsables de la reducción de
los puentes disulfuro mixtos entre el glutatión y las proteínas. Por una parte, el mutante Δgrx6
muestra una inducción constitutiva de la vía Crz1-calcineurina. La ausencia de Grx6 afecta la
homeostasis del Ca2+, provocando un incremento de los niveles de Ca2+ citoplasmático, que se
refleja en alteraciones en la sensibilidad del mutante a los quelantes de Ca2+ i a elevadas
concentraciones de Ca2+ extracelular. Debido a la estrecha relación entre la homeostasis de
varios iones en la célula, el mutante Δgrx6 también acumula un exceso de fosfato, potasio y
sodio. Por otra parte, se muestra una relación entre el estrés de RE y esas GRXs, ya que en
condiciones de estrés de RE, tanto la falta de GRX6 como de GRX7 provocan cambios en la
inducción de la respuesta debido a las proteínas mal plegadas. Estas GRXs están relacionadas
funcionalment con la maquinaria de plegamiento proteico, ya que la ausencia de GRX6 o GRX7
contrarresta los defectos de crecimiento de un mutante con bajos niveles de Ero1, de manera
similar a lo que sucede en presencia del oxidante diamida, probablemente creando unas
condiciones en el RE que compensan la ausencia de Ero1. Similarmente, los análisis por pulso y
caza muestran que la ausencia de GRX6 o GRX7 contrarresta los defectos de secreción de la
proteína carboxipeptidasa Y (CPY) en un mutante con bajos niveles de Ero1. Finalmente, se
demuestra que la acumulación de Ca2+ en el mutante Δgrx6 se produce independientemente de la
afectación en la secreción de CPY. / Grx6 and Grx7 are two glutaredoxins (GRXs) of the secretory pathway responsible for the
reduction of mixed disulphide bridges between glutathione and proteins. On the one hand, the
Δgrx6 mutant shows a constitutive induction of the Crz1-calcineurin pathway. The absence of
Grx6 affects Ca2+ homeostasis, causing an increase in cytosolic Ca2+ levels, which is reflected
in changes in the sensitivity of the Δgrx6 mutant to Ca2+ chelators and to elevated Ca2+
concentrations. Given the close relationship between homeostasis of various ions in the cell, the
Δgrx6 mutant also accumulates an excess of phosphate, potassium and sodium. On the other
hand, it shows a link between ER stress and Grx6/Grx7, since under ER stress conditions, both
the absence of GRX6 or GRX7 leads to changes in the unfolded protein response induction.
These GRXs are functionally related with the protein folding machinery, since the absence of
GRX6 or GRX7 counteracts the growth defects of a mutant with ERO1-downregulated
expression, similar to what happens in the presence of the oxidant diamide, probably creating
oxidizing conditions that compensate for the absence of Ero1. Similarly, pulse and chase analyses
show that the absence of GRX6 or GRX7 counteracts carboxypeptidase Y (CPY) secretion
defects of a mutant with ERO1-downregulated expression. Finally, it is shown that the
accumulation of Ca2+ in the Δgrx6 mutant occurs independently of the effect on CPY secretion.
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A contribution of budding yeast to unravel aging. Entry into quiescence relies on the transceptor Mtl1 by sensing nutrients and regulation of signaling pathwaysSundaram, Venkatraghavan 10 January 2015 (has links)
Saccharomyces cerevisiae is a premier model system to study ageing in post mitotic cells.
In this study, we show that Mtl1, member of the Cell Wall Integrity pathway (CWI), plays
a positive role in Chronological Life Span (CLS). The absence of Mtl1 shortens CLS
whereas its overexpression extends it. In mtl1 cells, we observe mitochondrial dysfunction
during diauxic shift that is reflected in i) increase in uncoupled respiration associated to
low oxygen consumption; ii) significant increase in mitochondrial membrane potential; iii)
ROS (Reactive Oxygen Species) accumulation and as well as iv) a descent in aconitase
activity. We demonstrate that this mitochondrial dysfunction observed in mtl1 mutant is a
consequence of improper regulation of key signaling pathwaysrequired for entry in
quiescence. TOR1/SCH9 deletion and less effectively PKA (Protein Kinase A) inactivation
in mtl1 not only suppressed the mitochondrial defects but also increased the CLS. Mtl1
links mitochondrial dysfunction with TOR (Target of Rapamycin) and PKA pathways in
quiescence.
In the absence of Mtl1, the stability of the inhibitory subunit of PKA, Bcy1 is severely
reduced, mainly as a consequence of a high PKA activity. Mtl1 regulates PKA inactivation
through Bcy1 phosphorylation, both in diauxic conditions and mainly in response to
glucose depletion. In these conditions, Mtl1 negatively regulates Tor1/Sch9 function to
phosphorylate Bcy1 and thus to inhibit PKA through phosphorylation of Bcy1 by Slt2
MAPK, although additional kinases might be also involved in this signal. We also show
that Mtl1 function in CLS does not totally depend on CWI pathway since mtl1slt2 double
mutant presents synthetic lethality. Mtl1 acts as a glucose sensor thereby it regulates both
NCR (Nitrogen Catabolite Repression) and RTG (Retrograde Response Mitochondrial-
Nucleus) pathways through Snf1 kinase upon glucose depletion, although independent of
TORC1 and PKA functions. Again, additional targets are not completely ruled out.
In conclusion, Mtl1 is an efficient transceptor involved in sensing and signaling nutrient
availability in quiescence, mainly glucose, and in regulating multiple pathways involved in
life extension. / Saccharomycescerevisiae es un sistema modelo muy adecuado para el estudio de los
procesos de envejecimiento en células posmitóticas. En el presente estudio se muestra que
Mtl1, un miembro de la ruta de integridad celular (CWI), tiene una función positiva en el
proceso de extensión cronológica de la vida (CLS). La ausencia de Mtl1 provoca un
acortamiento de la CLS mientras que su superexpresión la prolonga. En el mutante mtl1 se
observa una disfunción mitocondrial durante el shiftdiauxico, lo que se evidencia tras la
observación de los siguientes parámetros: i) incremento de la respiración desacoplada
ligado a un bajo consumo de oxígeno; ii) aumento significativo del potencial de
membrana; iii) acumulación de ROS (Especies Reactivas de Oxígeno); así como iv) un
descenso en la actividad de la aconitasa.Nosotros demostramos que la disfunción
mitocondrial observada en el mutante mtl1ocurre como consecuencia de ladesregulación
de las rutas de señalización que se necesitan para la correcta entrada en la fase de
quiescencia. La delección de los genes TOR1 y SCH9 y con menor eficiencia la
inactivación de PKA (Protein Quinasa A),suprimen los defectos mitocondriales de mtl1 y
provocan un aumento sustancial de su CLS. Mtl1 es el nexo de unión entre la disfunción
mitocondrial y las vías TOR (Target of Rapamycin) y PKA en la quiescencia. La
estabilidad de Bcy1, una subunidad inhibitoria de PKA, está muy reducida en ausencia de
Mtl1. Esta proteína regula la inactivación de la función PKA a través de la fosforilación de
Bcy1 durante el shiftdiauxico y principalmente en respuesta a la depleción de glucosa. En
ambas condiciones, Mtl1 regula negativamente a la función Tor1/Sch9, lo que activa a la
MAP quinasa Slt2, la cual fosforila a Bcy1, hecho que inhibe la función PKA. Sin
embargo, no se descarta la posibilidad de que otras quinasas estén también involucradas en
este proceso. También se muestra que la función de Mtl1 en la CLS no depende totalmente
de la ruta CWI puesto que los genes MTL1 y SLT2 presentan letalidad sintética en estas
condiciones.Mtl1 actúa como un sensor de glucosa y como tal también regula la función
de Snf1 en respuesta a la depleción de glucosa, y como consecuencia a los genes regulados
por los sistemas NCR (Represión Catabólica Nitrogenada) y RTG (Respuesta Retrógrada
Núcleo-Citoplasma), además, este proceso es independiente de TORC1 y PKA. En
conclusión, Mtl1 es un transceptor que detecta y señaliza la disponibilidad de nutrientes
(principalmente glucosa) en quiescencia para regular la función de múltiples vías de
señalización relevantes para la extensión de la vida. / Saccharomyces cerevisiae és un sistema model molt adecuat pels procesos d’envelliment
en cèl.lules postmitòtiques. En aquest estudi es demostra que Mtl1, un membre de la vía
d’integritat cel.lular (CWI), té una funció positiva en el procés d’extensió cronológica de
la vida (CLS). L’absència de Mtl1 redueix la CLS mentre que la seva sobre expressió
l’allarga. En el mutant mtl1 s’observa una disfunció mitocondrial durant el shift diàuxic,
que es fa evident al observar els següents paràmetres: i) increment de la respiració
desacoplada unit a un baix consum d’oxígen; ii) augment significatiu del potencial de
membrana; iii) acumulació de ROS (Espècies Reactives d’Oxígen); així com iv) un
descens en l’activitat de l’aconitasa. Nosaltres demostrem que la disfunció mitocondrial
observada en el mutant mtl1 succeeix com a conseqüència de la desregulació de les vies de
senyalització necessaries per a la correcta entrada a la fase de quiescencia. La delecció
dels gens TOR y SCH9 i amb menor eficàcia, la inactivació de PKA (Protein Kinasa A),
suprimeixen els defectes mitocondrials de mtl1 i indueixen una augment significatiu de la
seva CLS. Mtl1 es el nexe d’unió entre la disfunció mitocondrial i les vies TOR (Target of
Rapamycin) y PKA en quiescència. L’estabilitat de Bcy1, una subunitat inhibitoria de
PKA, està molt reduïda en absència de Mtl1. Aquesta proteïna regula la inactivació de la
funció de PKA mitjançant la fosforilació de Bcy1 durant el shift diàuxic i principalment
en resposta a la depleció de glucosa. En ambdues condicions, Mtl1 regula negativament la
funció Tor1/Sch9, fet que indueix l’activació de la MAP quinasa Slt2, la qual fosforila a
Bcy1, procés que inhibeix la funció PKA. No obstant, no es descarta la possibilitat de que
altres quinases estiguin participant en aquest procés. També es mostra que la funció de
Mtl1 en la CLS no depen totalment de la vía CWI, donat que els gens MTL1 y SLT2
presenten sintètica letalitat en aquestes condicions. Mtl1 actua con un sensor de glucosa i
com a tal, també regula la funció de Snf1 en resposta a la depleció de glucosa, i en
conseqüència als gens regulats pels sistemes NCR (Repressió Catabòlica Nitrogenada) y
RTG (Resposta Retrògrada Nucli-Citoplasma), a més a més, aquest procés es independent
de TORC1 y PKA. Concluïnt, Mtl1 es un transreceptor que detecta i senyalitza la
disponibilitat de nutrients (principalment glucosa) en quiescència per a regular la funció de
múltiples vies de senyalització rellevants per l’extenció de la vida.
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