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Los plásmidos de piscirickettsia salmonis: desarrollo de un modelo alternativo para el estudio comparativo de sus factores de virulencia y la respuesta del hospedero a la infección

Ortiz Severín, Javiera Rocío 08 1900 (has links)
Tesis entregada a la Universidad De Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Microbiología / Piscirickettsia salmonis es una bacteria patógena intracelular facultativa que causa la Septicemia Rickettsial de Salmónidos (SRS). Esta bacteria coloniza diversos tejidos y órganos, lo que culmina con la septicemia y muerte del animal. Es capaz de sobrevivir al interior de macrófagos, y se multiplica en ellos al interior de vacuolas replicativas unidas a la membrana celular. Esta forma de replicación es similar a la observada en bacterias relacionadas filogenéticamente, como las del género Francisella, Coxiella y Legionella. Los patógenos de estos géneros además comparten la presencia de plásmidos que se relacionan con la virulencia de la cepa que los posee, y codifican factores de virulencia (FdeV) como el sistema de secreción Dot/Icm, el cual ha sido descrito en P. salmonis. Mediante secuenciación, se han identificado de plásmidos en P. salmonis, cuya función no ha sido estudiada. En este trabajo se analizaron las secuencias codificantes contenidas en 4 plásmidos de P. salmonis LF-89, se identificaron genes de replicación y mantención, profagos, sistemas toxina-antitoxina, y FdeV. Estos probables FdeV tienen homólogos en todas las cepas secuenciadas de P. salmonis y se expresan en condiciones de infección en cultivos celulares SHK-1 y ASK derivados de Salmo salar y en cultivos primarios de riñón (CPR) de pez cebra (Danio rerio), utilizado como un modelo alternativo de infección. En todos ellos P. salmonis fue capaz de infectar, disminuyó la viabilidad celular y permaneció por al menos 12 días al interior de las líneas celulares, y 5 días en los CPR, según se observó por inmunofluorescencia. En las células de salmón, la bacteria causó un aumento en la expresión de il8, il10 e il12, y una disminución en los transcritos de ifn-γ, generando un ambiente antiinflamatorio. En los CPR infectados, generó un ambiente proinflamatorio producto de un aumento de la expresión de il6, ifn-γ y nos2a, aunque también se observó replicación de P. salmonis en ellos. Esto sugiere que los cultivos celulares responden de forma distinta a la infección por esta bacteria. En P. salmonis aumentó la expresión de genes relacionados sistemas de secreción (Dot/Icm y posiblemente la maquinaria del flagelo), toxinas y proteínas secretadas y genes plasmidiales, lo que indica que los plásmidos cumplen un rol en la infección bacteriana. Destacó la sobreexpresión de 3 copias pipB2, y la expresión diferencial de ficD, que aumentó significativamente sólo en células SHK-1, lo que se correlaciona con la formación de grandes vacuolas citoplasmáticas sólo en este tipo celular. / Piscirickettsia salmonis is a facultative intracellular pathogen, and the etiological agent of Salmonid Rickettsial Septicemia (SRS). This bacterium colonizes fish tissues and organs, causing septicemia and death of the animal. P. salmonis is able to survive inside the macrophages, and replicates in citoplasmic vacuoles attached to the cell membrane. This form of replication is similar to that observed in phylogenetically related bacteria, such as Francisella, Coxiella and Legionella. Pathogens of these genera also contains plasmids that are implicated in the virulence of the strain. These plasmids encode virulence factors (VF) such as the Dot / Icm secretion system, which has been also described in P. salmonis. After long read sequencing of P. salmonis genome, four distinct plasmid sequences were predicted in P. salmonis LF-89 strain, but their function is unknown. In this work, we analyzed the coding sequences of P. salmonis LF-89 plasmids and identified replication and maintenance genes, profagos, toxin-antitoxin systems, and VFs. Homologous genes were identified in all P. salmonis sequenced strains and the putative VFs were expressed in infected salmon cells (SHK-1 and ASK cultures), and in infected primary cell cultures derived from zebrafish kidney (ZFPCC), used as an alternative infection model. In those cultured cell types, P. salmonis was able to infect, decreased cell viability and remained inside the cells for at least 12 days for the cell lines, and 5 days for the ZFPCC, as observed by immunofluorescence assays. In salmon cells, the bacterium caused an increase expression of il8, il10 and il12, and a down-regulation of ifn-γ, generating an anti-inflammatory environment. Although bacterial replication occured in the infected ZFPCC, P. salmonis generated a proinflammatory environment, as a result of the up-regulation of il6, ifn-γ and nos2a. This suggests that cell cultures respond in different ways to P. salmonis infection. During infection, genes related to secretion systems (Dot / Icm and possibly the flagellum structure), toxins and secreted proteins and plasmid genes were overexpressed in the bacteria. These results suggests that P. salmonis plasmids have an important role in bacterial infection. In particular, the overexpression of three pipB2 gene copies, and the differential expression of ficD, which increased significantly only in SHK-1 cells, correlates with the formation of large cytoplasmic vacuoles that took place only in this cell type. / Las fuentes de financiamiento de este trabajo: • Beca de Doctorado Nacional CONICYT año 2013, número 21130717, Becas complementarias Pasantía en el Extranjero, y beneficios adicionales de Gastos Operacionales y Extensión de Beca. • Proyecto Fondecyt 1120209 a cargo del Dr. Francisco P. Chávez. • Proyecto Fondecyt 1160802 a cargo de la Dra. Verónica Cambiazo. • FONDAP 15090007, Centro de Regulación del Genoma (CRG
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Inmunidad específica

Flórez, Martha 22 September 2006 (has links)
Inmunidad adquirida. Componentes y tipos de inmunidad.
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Enfermedades causadas por bacterias grampositivas

Flórez, Martha 27 September 2006 (has links)
Bacterias grampositivas, características morfológicas, factor de virulencia, vía de transmisión,y enfermedades.
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Enfermedades causadas por bacterias gramnegativas

Flórez, Martha 29 September 2006 (has links)
Morfología, vías de transmisión y enfermedades producidas por bacterias gramnegativas.
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Mecanismo de inmunidad inespecífico

Flórez, Martha 22 September 2006 (has links)
Inmunidad natural. Componentes de la inmunidad natural o inespecífica.
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Patogenicidad

Flórez, Martha 22 September 2006 (has links)
Concepto de patogenicidad y virulencia. Mecanismos de proceso infeccioso.
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Bacteriología

Flórez, Martha 22 September 2006 (has links)
Bacterias. Estructura bacteriana. Clasificación. Reproducción.
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Estudio de mecanismos de resistencia a fluoroquinolonas de localización plasmídica en aislamientos clínicos de enterobacterias en la Región de Murcia.

Albert Hernández, Míriam 18 September 2013 (has links)
Objectivos: El principal objectivo de este estudio fue conocer la prevalencia de los mecanismos plásmidicos de resistencia a fluoroquinolonas (RPFQs) en aislamientos clínicos de enterobacterias tanto productoras como no productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) en la región de Murcia. Metodología: Se estudiaron 312 aislamientos clínicos de enterobacterias consecutivos, no duplicados obtenidos en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia durante noviembre y diciembre de 2010. Los genes qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qepA y aac (6') Ib-cr fueron amplificados mediante PCR. Las BLEEs fueron caracterizadas mediante PCR y secuenciación del ADN. En todos los aislamientos portadores de genes de RPFQs se estudiaron mutaciones en la QRDR de los genes gyrA, gyrB, parC y parE. La relación clonal entre los aislamientos con genes de RPFQs se evaluó mediante REP-PCR y RFLP-PFGE. Se realizaron experimentos de selección in vitro de mutantes resistentes a fluoroquinolonas de primer y segundo escalón en aislamientos portadores de determinantes de RPFQs pero sin mutaciones en los genes de las topoisomerasas. Resultados: Un 11.2% (35/312) de los aislamientos fueron productores de BLEEs. CTX-M-14 fue el tipo de BLEE más frecuente (14/35 aislamientos, 40%). Los mecanismos de RPFQs se detectaron en 20 aislamientos (6.4%) (9 E.coli, 5 K. pneumoniae, 2 C. freundii, 3 E. cloacae y 1 S. enteritidis), y fueron claramente más prevalentes en aislamientos productores de BLEEs (28.6% vs. 3.6%). Un 65% de los aislamientos fueron portadores de genes qnr como único mecanismo de RPFQs, en 3 aislamientos (15%) se detectó aac(6’)-Ib-cr y 4 aislamientos presentaron genes qnr y aac(6’)-Ib-cr combinados. Las enterobacterias no productoras de BLEEs fueron portadoras siempre de genes qnr, mientras que en los aislamientos productores de BLEEs, se detectó aac(6')-Ib-cr en 7 de 10 aislamientos (70%), sólo o combinado con genes qnr. Las dos cepas de K. pneumoniae portadoras de genes aac(6')-Ib-cr y qnr en ausencia de mutaciones en las topoisomerasas, fueron resistentes a ciprofloxacino. Un 45% (9/20) de los aislamientos con genes de RPFQs mostraron mutaciones en las topoisomerasas y un 55% de ellos acumuló 4 o más mutaciones. El estudio de relación clonal entre los aislamientos portadores de determinantes de RPFQs mostró diferentes patrones de bandas de ADN en la mayoría de ellos, indicando que no estaban relacionados clonalmente. Sin embargo, 3 cepas de E. coli mostraron idénticos patrones de bandas, portaban el mismo perfil de mutaciones en las topoisomeras pero diferente mecanismo de RPFQs y diferentes BLEE. La frecuencia de selección de mutantes a ciprofloxacino fue de 1.4x10-6 a 2.2x10-8. No se detectaron mutaciones en las topoisomerasas en los aislamientos seleccionados portadores de genes de RPFQs pero se observó un incremento significativo en los valores de CMI de ciprofloxacino (de 4 a 128 veces) y de ofloxacino (de 16 a 256 veces). Conclusiones: Los determinantes de RPFQs son mucho más frecuentes en enterobacterias productoras de BLEEs (28.6% vs. 3.6%) pero con diferentes características. Las productoras de BLEEs y portadoras de genes de RPFQs se localizan en la mayoría de casos en las especies de E. coli or K.pneumoniae portando determinantes qnr y/o aac(6’)-Ib-cr, múltiples mutaciones en los genes de las topoisomerasas y elevadas CMIs de ciprofloxacino. Sin embargo, los determinantes de RPFQs en ausencia de BLEEs aparecen en un grupo de especies más heterogéneo, los determinantes qnr son predominantes, las mutaciones en los genes de las topoisomerasas son infrecuentes (aparecen sólo en E. coli) y son normalmente sensibles a ciprofloxacino. Los determinantes de RPFQs no conducen a resistencia a fluoroquinolonas de alto nivel por sí mismos, pero la asociación de dos determinantes de RPFQs diferentes en el mismo aislamientos podría derivar en ella. / Objectives: The main objective of this study was to know the prevalence of plasmid-mediated quinolone-resistance (PMQR) in extended-spectrum β-lactamases (ESBL)–non-producing enterobacteria clinical isolates obtained in Murcia (Spain), and determine the differences with ESBL-producing enterobacteria. Methods: We studied 312 consecutive, non-duplicated enterobacteria clinical isolates, obtained in the Department of Microbiology of University Hospital Virgen de la Arrixaca of Murcia during November and December 2010. qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qepA and aac (6') Ib-cr genes were amplified by PCR. ESBLs were characterized by PCR and DNA sequencing. Mutations in the gyrA, gyrB, parC and parE genes QRDR were studied in PMQR-positive isolates. Clonal proximity among PMQR-positive isolates was evaluated by REP-PCR and RFLP-PFGE. First and second-step in vitro selection of fluoroquinolone-resistant mutants experiments were performed in PMQR-positive isolates with no mutations in topoisomerases genes. Results: Thirty-five isolates (11.2%) were ESBL-producers. CTX-M-14 was the most frequent ESBL (14/35 isolates, 40%). PMQR mechanisms were detected in 20 isolates (6.4%) (9 E.coli, 5 K. pneumoniae, 2 C. freundii, 3 E. cloacae y 1 S. enteritidis), and were clearly more prevalent in ESBL-producing isolates (28.6% vs. 3.6%). Thirteen isolates (65%) harbored qnr genes as the only PMQR mechanism, 3 isolates (15%) harbored aac(6’)-Ib-cr and 4 isolates combined qnr and aac(6’)-Ib-cr genes. ESBL-non producing enterobacteria harbored always qnr genes, while ESBL-producing isolates, harboured aac(6')-Ib-cr in 7 out of 10 isolates (70%), alone or combined to qnr genes. The two K. pneumoniae isolates combining aac(6')-Ib-cr and qnr genes in absence of topoisomerases mutations, were shown ciprofloxacin-resistant. Nine (45%) PMQR-positive isolates showed topoisomerases mutations. 55% of them accumulated 4 or more topoisomerase mutations. Clonal relatedness study among the PMQR-positive isolates showed different DNA patterns in most isolates, indicating that they were not clonally related. However, three E. coli isolates showed identical DNA patterns, harboring the same topoisomerase mutations profile but different PQMR mechanism and ESBLs presence. Ciprofloxacin-mutants selection frequency was from 1.4x10-6 to 2.2x10-8. Topoisomerases mutations were absent after fluoroquinolone selection from PMQR-positive strains but it was observed a significant increase in quinolones MICs (4 to 128-fold for ciprofloxacin and 16 to 256-fold for ofloxacin). Conclusions: PMQR determinants are much more frequent in ESBL-producing enterobacteria (28.6% vs. 3.6%) but with different features. PMQR-, ESBL-harboring enterobacteria are in most cases E. coli or K.pneumoniae harboring qnr and/or aac(6’)-Ib-cr determinants, multiple topoisomerase genes mutations and high MICs of ciprofloxacin. Meanwhile, PMQR determinants in absence of ESBLs appear in a more heterogeneous group of species, qnr determinants are largely predominant, topoisomerases genes mutations are infrequent (appear only in E. coli) and are usually ciprofloxacin-susceptible. PMQR determinants do not lead to fluoroquinolone resistance by themselves, but two different PMQR determinants combined in the same isolate might do it.
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Metabolismo bacteriano

Flórez, Martha 27 September 2006 (has links)
Metabolismo, crecimiento y nutrición bacteriana.
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Estudio de los mecanismos de diversificación intraespecífica de Salinibacter ruber

González-Torres, Pedro 01 February 2016 (has links)
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