L’etil tert-butil éter (ETBE) és un compost oxigenant de combustibles utilitzat a Europa per tal de reduir la contaminació de l’aire produïda per la combustió dels carburants d’automòbils. L’ús continuat d’ETBE pot contaminar les aigües degut a la seva elevada solubilitat en aigua i també podria ser un potencial agent carcinogènic. L’objectiu d’aquest treball és la identificació i l’estudi de microorganismes biodegradadors potencials d’ETBE i l’anàlisi dels mecanismes moleculars de la biodegradació. Dues mostres d’aigua contaminades amb gasolina s’han enriquit amb ETBE i s’han aïllat dos consorcis anomenats A i B. El consorci A, format per Methylovorus sp. i Xanthomonas sp., degrada l’ETBE i BTX simultàniament i cometabòlicament amb metanol, mentre que el consorci B va ser capaç de créixer amb només ETBE i el va degradar. El consorci B degrada ETBE quasi completament i fins i tot a elevades concentracions del compost, constituint així un consorci amb major capacitat degradadora de l’ETBE. Methylophilus sp., Pseudomonas sp., i Xanthomonas sp. varen ser identificats com els bacteris participants en la degradació de l’ETBE en el consorci B. L’anàlisi proteòmica del consorci B ha revelat que les proteïnes sobreexpressades estan relacionades amb el metabolisme de l’ETBE, síntesi d’aminoàcids, transport, xaperones i metabolisme energètic. Per altra banda, el gen citocrom P450 (CYP), descrit en la primera reacció de la degradació de l’ETBE, ha estat identificat en la soca degradadora de MTBE i ETBE Achromobacter xylosoxidans MCM2/2/1. La seqüència de nucleòtids identificada de CYP ha estat sotmesa a la base de dades del NCBI amb el número d’accés JX454599. Addicionalment, el nou gen CYP identificat ha estat clonat i expressat a E. coli per l’estudi, en un futur, de la seva potencial activitat versus ETBE i altres contaminants comuns. / Ethyl tert-butyl ether (ETBE) is a commonly used fuel oxygenate in Europe, to reduce air pollution in automobile fuels. Continued use of ETBE may render water bodies contaminated as they are fairly soluble in water and also they could be a potential carcinogen. The aim of this study is to identify and study the potential biodegraders of ETBE from microbial source and also to understand the molecular mechanisms behind the degradation. Two bacterial consortia namely A and B were enriched with ETBE from gasoline contaminated water samples. Consortium A consisted of Methylovorus sp., and Xanthomonas sp., was found to degrade ETBE and BTX simultaneously and cometabolically along with methanol, while bacterial consortium B was able to grow alone on ETBE and degrade them. Consortium B degrades ETBE almost completely and even in higher concentrations of ETBE which made them to be better biodegrader of ETBE. Methylophilus sp., Pseudomonas sp., and Xanthomonas sp. were identified as the participating bacteria in ETBE degradation in consortium B. The proteomic analysis done on bacterial consortium B revealed that proteins related to ETBE metabolism, amino acid, transport, chaperons and energy metabolism were found to be up-regulated. On the other hand cytochrome P450 gene which is believed to initiate ETBE degradation, was identified in ETBE and MTBE degrading strain Achromobacter xylosoxidans MCM2/2/1. The identified nucleotide sequence of CYP from A. xylosoxidans MCM2/2/1 was submitted to NCBI under the accession number JX454599. Moreover, the newly identified CYP gene was cloned and heterologoulsy expressed in E.coli in order to study its potential in converting ETBE and other common pollutants in future.

The generaBipolaris, Curvularia, Exserohilium and Pithomyceshave species clinically relevant.However, their identification is not easy. A total of 281 clinical isolates of Bipolaris,Curvularia,ExserohilumandPithomyceshave been studied by morphological and molecular methods. The in vitrosusceptibility studies of these genera were performed against the different antifungal drugs availables. Our studies revealed the presence of many species of Bipolaris, Curvularia and Pithomyces species can be isolated from human specimens; we proposed five new species ofCurvularia such as C. americana, C. chlamydospora, C. hominis, C. muehlenbeckiae and C. pseudolunata.Our phylogenetic analysis revealed that only E. rostratum should be considered as human opportunist. Evaluation of the in vitro antifungal susceptibility profile revealed that most of the antifungal drugs tested presented a good activity against the genera studied. / Bipolaris, Curvularia, Exserohilumand Pithomycesson agentes responsables de infecciones oportunistas.El gran número y lasemejanza morfológicaentre las especies en estos géneros dificultan su identificación. Se han estudiadoun total de 281 cepasde Bipolaris, Curvularia, Exserohilum y Pithomyces por métodos morfológicos y moleculares además dela susceptibilidad in vitro de los mismo frente alos antifúngicos. Los resultados obtenidos demuestran la presencialas siguientes especies:Bipolariscynodontis, B. micropus, B. setariae, Curvulariaaeria, C. borreriae, C. intermedia, C. protuberata, C. pseudorobusta,C. sorghina, Pithomycessacchariy P. maydicus,por primera vez en muestras clínicas, además de las 5 nuevas especies de Curvularia. Nuestro análisis filogenético ha demostrado que del género Exserohilum sólo E. rostratum debe de ser considerada como un patógenooportunista. Laevaluación del patrón de susceptibilidad antifúngicaha evidenciado que la mayoría de antifúngicosensayados presentan una buena actividad frente a las distintas especies estudiadas.

Objetivos: Estudiar in vitro el efecto sobre la viabilidad y la proliferación celular de los compuestos: extracto de semilla de uva (flavan-3-oles polímeros de catequinas), extracto de cacao (flavan-3-oles epicatequinas), extracto de pomelo (glicósidos de flavanonas naringina y neohesperidina), extracto de piel de limón (glicósido de flavanona eriocitrina), naringenina (flavanona), apigenina (flavona) y apigenina potásica. Así mismo estudiar la influencia de estas sustancias sobre el ciclo celular y la apoptosis de las líneas celulares Vero y Ca-Co2. Material y Métodos: Los compuestos fueron ensayados sobre la línea celular no tumoral Vero (túbulo renal de mono verde africano) y la línea celular tumoral CaCo-2. Utilizamos el test de MTT con diferentes concentraciones de los extractos. Todo ello junto con el conocimiento de la composición cromatográfica de cada extracto nos permitió hallar posibles relaciones entre la estructura molecular y su efecto en la proliferación celular. Resultados: En las condiciones de nuestro estudio, no hallamos efecto negativo significativo sobre la proliferación celular en ninguno de los extractos testados a concentraciones inferiores a 10 μM en la línea celular Vero. Podría establecerse como orden de actividad antiproliferativa de las estructuras flavonoides estudiadas: flavan-3-ol > flavanona > flavona. Sobre la línea transformada CaCo-2, todos los extractos estudiados mostraron efecto antiproliferativo y/o citotóxico, sobre todo apigenina potásica. Sobre la línea Vero apigenina potásica y extracto de semilla de uva, provocaron un mayor bloqueo del ciclo celular. Y sobre la línea CaCo-2, extracto de piel de limón y de cacao. El análisis del porcentaje de población celular que se encontraba en apoptosis mostró unos valores en general muy bajos en relación a la población total analizada en la línea celular Vero. Sin embargo, sobre CaCo-2, consideramos especialmente relevantes los resultados obtenidos por la flavona apigenina potásica, que mostró una capacidad apoptótica significativa a partir de las 72 horas de tratamiento. Conclusión: Las estructuras moleculares más complejas y de mayor peso molecular causan mayores efectos antiproliferativos, y parecen influir más sobre el ciclo celular y la apoptosis. / Introduction: Molecular structure is a very important factor in relation of any substances with cells or biological system. Objective: Present study is an in vitro research about the viability and proliferation activity of following products and extracts: grape seed extract (flavan-3-ols catechins polymers), cocoa extract (flavan-3-ol epicatechins), grapefruit extract (flavanones glycosides naringin y neohesperidin), skin lemon extract (flavanone glycoside eriocitrin), naringenin (flavanone), apigenin (flavone). Also study the influence of these extracts on cellular cycle and apoptosis on Vero and CaCo2. Material and Methods: We have study the different extracts and products effects concentrations on Vero cells proliferation and CaCo-2 cells culture, using the MTT assay. It together with the knowledge of the chromatographic composition of every extract of the experiment allows us to find relations between structures or molecular skeletons and his effect on the cellular proliferation. Results: In our study conditions, we have not negative effect on cellular proliferation with all the extracts, on concentrations lower than 10 µMa on Vero. The order in antiproliferative capacity could be: flavan-3-ol > flavanone > flavone. On CaCo-2, all the extracts showed antiproliferative effect or citotoxicity especially apigenine. On Vero apigenine and grape fruit seed, showed the best arrest in cell cycle. On CaCo-2, citrus and cocoa were he most significant. Cellular population percentage analyses, in apoptosis were very low regarding the total population in Vero. But, on CaCo-2, we considered relevant results on Apigenine, which showed an important apoptotic capacity after 72 hours. Conclusion: We have found the more complex molecular structures it provokes antiproliferative activity increase. This fact would interact in relationship between cell and environment.

Objetivos: (i) Esbozar una imagen general del metabolismo central de C. salexigens a partir de la información del genoma, (ii) determinar los principales flujos extracelulares (asimilación de carbono, excreción de subproductos) y de síntesis de sus solutos compatibles, las ectoínas, y analizar el efecto de la salinidad sobre dichos flujos empleando fuentes de carbono marcadas isotópicamente, (iii) estudiar el efecto de la composición del medio (en términos de ratio C/N y tipo de fuente de nitrógeno) sobre los flujos metabólicos, síntesis de ectoínas/biomasa y excreción de subproductos y aplicar esta información en el diseño de una estrategia de cultivo que maximice la producción de biomasa/ectoínas, (v) analizar el efecto del uso de fructosa como fuente de carbono sobre la fisiología de C. salexigens y (vi) identificar las rutas de consumo de fructosa y demostrarlas experimentalmente. Metodología: Se aplicó HPLC para identificación y cuantificación de metabolitos y ectoínas, 13C-RMN para cuantificación de ectoínas y rastreo de marcaje isotópico y 31P-RMN para medida de actividad enzimática en extractos crudos. Se usaron métodos espectrofotométricos para medida de actividades enzimáticas (en extractos crudos y en proteínas purificadas). Se aplicó RT-PCR en determinaciones de expresión génica y técnicas de biología molecular en la clonación y expresión heteróloga de genes de C. salexigens en E. coli. Resultados: Se llevan a cabo cultivos crecidos en glucosa a diferentes salinidades que muestran una menor eficacia metabólica a baja salinidad, en forma de metabolismo overflow (excreción de piruvato y acetato), menor síntesis de biomasa y mayor velocidad de consumo de glucosa. Los estudios con glucosa marcada con 13C indican que i) C. salexigens carece de ruta glucolítica funcional, metabolizando la glucosa casi exclusivamente mediante la ruta de ED, debido a la probable falta de una enzima Pfk funcional, ii) el nivel de anaplerosis es alto en comparación con microorganismos relacionados, iii) algunos flujos relativos clave del metabolismo central no se alteran con la salinidad, lo que implica una rigidez metabólica que podría justificar la presencia de overflow a baja salinidad. En cultivos con distintas ratios C/N, se observa un mayor nivel de overflow en ratios C/N altas (fuente de nitrógeno limitante). La eficacia en síntesis de ectoínas es mayor en medio con menor cantidad de fuente de carbono (glucosa) y de nitrógeno (amonio). Estos resultados se aplican al diseño de una estrategia de cultivo fed-batch en dos fases, con la que se consigue alcanzar alta densidad celular y eliminar el overflow. La ratio C/N no afecta a las ratios de flujos centrales confirmando la rigidez metabólica. En cultivos con fructosa como fuente de carbono se observa la ausencia de overflow y mayor síntesis de biomasa. El empleo de fructosa marcada con 13C confirma la presencia de dos rutas para el catabolismo de la fructosa en C. salexigens: la ruta de ED, mayoritaria, y la ruta de EMP que contribuye en un 15-20% del flujo. Conclusiones: La glucólisis no es funcional debido a la carencia de Pfk, y la glucosa se asimila mediante la ruta de ED, más eficaz en producción de NADPH; existe un alto nivel de anaplerosis. Estos datos apuntan a una adaptación al gran esfuerzo anabólico para síntesis de ectoínas. El metabolismo central del carbono es rígido, sus flujos relativos no varían con la salinidad, ni con la proporción C/N en el medio. Esta rigidez hace el metabolismo menos eficiente en medios pobres en fuente de nitrógeno y con baja salinidad. Esto indica una adaptación a ambientes pobres en nutrientes. Las condiciones en las que el metabolismo es menos eficiente dan lugar a un menor crecimiento, y la aparición de metabolismo overflow. C. salexigens metaboliza la fructosa mediante dos rutas: las rutas de ED y EMP. ED es mayoritaria, debido a las altas necesidades de cofactores reducidos. La disponibilidad adicional de la ruta de EMP hace al metalismo en fructosa más eficiente que en glucosa, lo que se traduce en ausencia de overflow en fructosa, y mayor síntesis de biomasa. / Objectives: (i) Drawing a draft of central metabolism from C. salexigens based on the annotated genome, (ii) assessing the main extracellular fluxes (carbon source uptake, by-products excretion) and the synthesis of the main compatible solutes, ectoines, and analyzing the effect of salinity on such fluxes using isotopically labeled carbon sources, (iii) studying the effects of medium composition (as C/N ratio and nitrogen source) on metabolic fluxes, biomass/ectoines synthesis and by-products excretion and applying this information to devise a culture strategy able to maximize biomass/ectoines production, (v) analyzing the effect of fructose as carbon source on the C. salexigens physiology and (vi) identifying the pathways for fructose uptake and give experimental evidence of them. Methodology: HPLC was applied to identify and quantify metabolites and ectoines, 13C-NMR for ectoines quantification and isotopic label tracing and 31P-NMR for assessing enzyme activities on crude extracts. Spectrophotometric methods were applied for measuring enzyme activities (both in crude extracts and purified proteins). RT-PCR was used in gene expression experiments and molecular biology techniques for cloning and heterologous expression of genes from C. salexigens in E. coli. Results: Glucose grown cultures were performed at different salinities, showing a less efficient metabolism at low salinity as overflow metabolism (pyruvate and acetate excretion), lower biomass synthesis and higher glucose uptake rate. Studies using 13C-labeled glucose show that i) C. salexigens lacks a functional glycolytic pathway, and metabolizes glucose almost exclusively through ED pathway, which is likely due to the lack of Pfk enzyme, ii) high anaplerosis levels, compared to related microorganisms, iii) certain key flux ratios from central metabolism were not affected by salinity, involving a metabolic rigidity which could explain the presence of overflow at low salinity. Higher overflow levels are shown by cultures grown on a higher C/N ratio (limiting nitrogen source). Ectoines synthesis yield is higher when growing in media with low carbon (glucose) and nitrogen (ammonium) sources content. These results are applied to devising a two-step fed-batch culture strategy, which allowed reaching high cell density and overflow removal. C/N ratio did not affect central metabolism flux ratios, further confirming the metabolic rigidness. Lack of overflow and higher biomass yields are shown by fructose grown cultures. Using 13C-labeled fructose confirmed the existence of two alternative pathways for fructose uptake in C. salexigens: ED pathway which contributes to 80-85% of fructose uptake flux, and EMP pathway for the remaining part of carbon flux. Conclusions: Glycolysis is not present due to lack of Pfk enzyme, thus, glucose must be assimilated through ED pathway, which is more efficient in NADPH production; anaplerosis is relatively high. These results suggest C. salexigens has adapted to meet the high biosynthesis needs posed by salinity. Central metabolism is rigid, as central flux ratios were not affected by salinity or C/N ratio in growth medium. Such rigidity makes metabolism less efficient in low nitrogen and low salinity growth media. This could be understood as an adaptation to grow in nutrient-poor environments. Environmental conditions where central metabolism is less efficient lead lower growth yield due to overflow metabolism. C. salexigens can metabolize fructose by means of two different routes: ED and EMP pathways. Most of fructose is assimilated by ED pathway, due to high cofactor synthesis needs. The availability of an additional EMP route makes fructose metabolism more efficient than glucose metabolism, resulting in lack of overflow and higher biomass yields in fructose.

Objectivos: El principal objectivo de este estudio fue conocer la prevalencia de los mecanismos plásmidicos de resistencia a fluoroquinolonas (RPFQs) en aislamientos clínicos de enterobacterias tanto productoras como no productoras de β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) en la región de Murcia. Metodología: Se estudiaron 312 aislamientos clínicos de enterobacterias consecutivos, no duplicados obtenidos en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario Virgen de la Arrixaca de Murcia durante noviembre y diciembre de 2010. Los genes qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qepA y aac (6') Ib-cr fueron amplificados mediante PCR. Las BLEEs fueron caracterizadas mediante PCR y secuenciación del ADN. En todos los aislamientos portadores de genes de RPFQs se estudiaron mutaciones en la QRDR de los genes gyrA, gyrB, parC y parE. La relación clonal entre los aislamientos con genes de RPFQs se evaluó mediante REP-PCR y RFLP-PFGE. Se realizaron experimentos de selección in vitro de mutantes resistentes a fluoroquinolonas de primer y segundo escalón en aislamientos portadores de determinantes de RPFQs pero sin mutaciones en los genes de las topoisomerasas. Resultados: Un 11.2% (35/312) de los aislamientos fueron productores de BLEEs. CTX-M-14 fue el tipo de BLEE más frecuente (14/35 aislamientos, 40%). Los mecanismos de RPFQs se detectaron en 20 aislamientos (6.4%) (9 E.coli, 5 K. pneumoniae, 2 C. freundii, 3 E. cloacae y 1 S. enteritidis), y fueron claramente más prevalentes en aislamientos productores de BLEEs (28.6% vs. 3.6%). Un 65% de los aislamientos fueron portadores de genes qnr como único mecanismo de RPFQs, en 3 aislamientos (15%) se detectó aac(6’)-Ib-cr y 4 aislamientos presentaron genes qnr y aac(6’)-Ib-cr combinados. Las enterobacterias no productoras de BLEEs fueron portadoras siempre de genes qnr, mientras que en los aislamientos productores de BLEEs, se detectó aac(6')-Ib-cr en 7 de 10 aislamientos (70%), sólo o combinado con genes qnr. Las dos cepas de K. pneumoniae portadoras de genes aac(6')-Ib-cr y qnr en ausencia de mutaciones en las topoisomerasas, fueron resistentes a ciprofloxacino. Un 45% (9/20) de los aislamientos con genes de RPFQs mostraron mutaciones en las topoisomerasas y un 55% de ellos acumuló 4 o más mutaciones. El estudio de relación clonal entre los aislamientos portadores de determinantes de RPFQs mostró diferentes patrones de bandas de ADN en la mayoría de ellos, indicando que no estaban relacionados clonalmente. Sin embargo, 3 cepas de E. coli mostraron idénticos patrones de bandas, portaban el mismo perfil de mutaciones en las topoisomeras pero diferente mecanismo de RPFQs y diferentes BLEE. La frecuencia de selección de mutantes a ciprofloxacino fue de 1.4x10-6 a 2.2x10-8. No se detectaron mutaciones en las topoisomerasas en los aislamientos seleccionados portadores de genes de RPFQs pero se observó un incremento significativo en los valores de CMI de ciprofloxacino (de 4 a 128 veces) y de ofloxacino (de 16 a 256 veces). Conclusiones: Los determinantes de RPFQs son mucho más frecuentes en enterobacterias productoras de BLEEs (28.6% vs. 3.6%) pero con diferentes características. Las productoras de BLEEs y portadoras de genes de RPFQs se localizan en la mayoría de casos en las especies de E. coli or K.pneumoniae portando determinantes qnr y/o aac(6’)-Ib-cr, múltiples mutaciones en los genes de las topoisomerasas y elevadas CMIs de ciprofloxacino. Sin embargo, los determinantes de RPFQs en ausencia de BLEEs aparecen en un grupo de especies más heterogéneo, los determinantes qnr son predominantes, las mutaciones en los genes de las topoisomerasas son infrecuentes (aparecen sólo en E. coli) y son normalmente sensibles a ciprofloxacino. Los determinantes de RPFQs no conducen a resistencia a fluoroquinolonas de alto nivel por sí mismos, pero la asociación de dos determinantes de RPFQs diferentes en el mismo aislamientos podría derivar en ella. / Objectives: The main objective of this study was to know the prevalence of plasmid-mediated quinolone-resistance (PMQR) in extended-spectrum β-lactamases (ESBL)–non-producing enterobacteria clinical isolates obtained in Murcia (Spain), and determine the differences with ESBL-producing enterobacteria. Methods: We studied 312 consecutive, non-duplicated enterobacteria clinical isolates, obtained in the Department of Microbiology of University Hospital Virgen de la Arrixaca of Murcia during November and December 2010. qnrA, qnrB, qnrC, qnrS, qepA and aac (6') Ib-cr genes were amplified by PCR. ESBLs were characterized by PCR and DNA sequencing. Mutations in the gyrA, gyrB, parC and parE genes QRDR were studied in PMQR-positive isolates. Clonal proximity among PMQR-positive isolates was evaluated by REP-PCR and RFLP-PFGE. First and second-step in vitro selection of fluoroquinolone-resistant mutants experiments were performed in PMQR-positive isolates with no mutations in topoisomerases genes. Results: Thirty-five isolates (11.2%) were ESBL-producers. CTX-M-14 was the most frequent ESBL (14/35 isolates, 40%). PMQR mechanisms were detected in 20 isolates (6.4%) (9 E.coli, 5 K. pneumoniae, 2 C. freundii, 3 E. cloacae y 1 S. enteritidis), and were clearly more prevalent in ESBL-producing isolates (28.6% vs. 3.6%). Thirteen isolates (65%) harbored qnr genes as the only PMQR mechanism, 3 isolates (15%) harbored aac(6’)-Ib-cr and 4 isolates combined qnr and aac(6’)-Ib-cr genes. ESBL-non producing enterobacteria harbored always qnr genes, while ESBL-producing isolates, harboured aac(6')-Ib-cr in 7 out of 10 isolates (70%), alone or combined to qnr genes. The two K. pneumoniae isolates combining aac(6')-Ib-cr and qnr genes in absence of topoisomerases mutations, were shown ciprofloxacin-resistant. Nine (45%) PMQR-positive isolates showed topoisomerases mutations. 55% of them accumulated 4 or more topoisomerase mutations. Clonal relatedness study among the PMQR-positive isolates showed different DNA patterns in most isolates, indicating that they were not clonally related. However, three E. coli isolates showed identical DNA patterns, harboring the same topoisomerase mutations profile but different PQMR mechanism and ESBLs presence. Ciprofloxacin-mutants selection frequency was from 1.4x10-6 to 2.2x10-8. Topoisomerases mutations were absent after fluoroquinolone selection from PMQR-positive strains but it was observed a significant increase in quinolones MICs (4 to 128-fold for ciprofloxacin and 16 to 256-fold for ofloxacin). Conclusions: PMQR determinants are much more frequent in ESBL-producing enterobacteria (28.6% vs. 3.6%) but with different features. PMQR-, ESBL-harboring enterobacteria are in most cases E. coli or K.pneumoniae harboring qnr and/or aac(6’)-Ib-cr determinants, multiple topoisomerase genes mutations and high MICs of ciprofloxacin. Meanwhile, PMQR determinants in absence of ESBLs appear in a more heterogeneous group of species, qnr determinants are largely predominant, topoisomerases genes mutations are infrequent (appear only in E. coli) and are usually ciprofloxacin-susceptible. PMQR determinants do not lead to fluoroquinolone resistance by themselves, but two different PMQR determinants combined in the same isolate might do it.

Las L-aminoácido oxidasas (LAOs) son enzimas que oxidan aminoácidos generando el cetoácido correspondiente, amonio y peróxido de hidrógeno. Generalmente, estas enzimas tienen una flavina como cofactor. En la bacteria marina Marinomonas mediterranea se han descrito las dos primeras LAOs que poseen un cofactor quinónico. Este tipo de cofactores se generan mediante modificación post-traduccional de aminoácidos. La primera LAO descrita en M. mediterranea, LodA, es una novedosa L-lisina-épsilon-oxidasa (EC 1.4.3.20). De forma paralela a la realización de este trabajo, se ha descrito GoxA, una glicina oxidasa con características distintas a las glicinas oxidasas descritas previamente en otros organismos. Ambas proteínas son codificadas en operones. En el caso del operón lod, inmediatamente después al gen lodA, se encuentra el gen lodB que codifica la flavoproteína LodB. Datos previos indicaban que en M. mediterranea ambas proteínas son necesarias para obtener LodA activa. El objetivo de este trabajo ha sido estudiar el papel de LodB en la generación del cofactor quinónico de LodA. Así mismo, se han abordado por primera vez estudios de relación estructura/función de LodA para determinar residuos implicados en el proceso de generación del cofactor quinónico y en la actividad enzimática. El estudio presentado en esta memoria se ha llevado a cabo principalmente mediante expresión recombinante, solas o en combinación, en Escherichia coli de las distintas proteínas de los operones que codifican las LAOs. Las proteínas recombinantes se analizaron mediante espectrometría de masas para detectar la masa molecular de la proteína completa y de los péptidos generados por digestión enzimática, con el fin de identificar los residuos que son modificados post-traduccionalmente durante la generación del cofactor quinónico. Adicionalmente, el papel de los residuos seleccionados por estar conservados en LodA y proteínas similares o por su localización estructural, se ha estudiado mediante mediante mutagénesis dirigida. Finalmente, se ha realizado un análisis comparativo de las proteínas del operón lod y gox. Se ha determinado que LodA recombinante posee como cofactor cisteína triptofilquinona (CTQ) generado por modificación de los residuos Cys516 y Trp581. La expresión de LodA en ausencia de LodB, genera una forma precursora de LodA, a la que se ha denominado PreLodA, que no muestra actividad enzimática y está monohidroxilada en Trp581. Este resultado indica que la síntesis de la proteína activa requiere la flavoproteína LodB que actuaría sobre PreLodA. Por su parte, los experimentos de mutagénesis han permitido determinar que el residuo conservado Asp512 es esencial en la generación de PreLodA. Otros residuos analizados importantes para la actividad están localizados en la entrada del canal del centro activo de LodA o en la proximidad del cofactor. Las deleciones realizadas en el extremo C-terminal sugieren que esa zona podría participar en la generación de la forma activa de LodA. Mediante análisis bioinformático se ha detectado en genomas microbianos que los operones que codifican proteínas similares a LodA generalmente contienen, además del gen similar a lodA, un segundo gen que codifica una hipotética flavoproteína similar a LodB. El estudio del operón gox ha revelado que, al igual que ocurre con LodA, cuando se expresa GoxA en ausencia de GoxB, se detecta una forma intermedia monohidroxilada sin actividad enzimática que se ha denominado PreGoxA, por su similitud con PreLodA. Por último, se ha demostrado que las flavoproteínas que acompañan a LodA y GoxA no son intercambiables, indicando una alta especificidad de la quinooxidasa que modifica. Este trabajo supone un avance en el estudio de la nueva familia de LAOs con cofactor quinónico. En concreto, se ha puesto de manifiesto un mecanismo novedoso de modificación post-traduccional de proteínas, ya que con anterioridad no se había descrito la participación de flavoproteínas en este tipo de procesos. / L-amino acid oxidases (LAOs) oxidize amino acids releasing ammonium, hydrogen peroxide and the corresponding alpha keto acid. The marine bacterium Marinomonas mediterranea synthesizes two novel LAOs which contain a quinone cofactor, in contrast to other LAOs that contain a flavin cofactor. Quinone cofactors are generated by post-translational modification of amino acid residues. The first LAO described in M. mediterranea, LodA, is a novel L-lysine-epsilon-oxidase (EC 1.4.3.20). During the realization of this work, it has been described GoxA, a glycine oxidase which is different from the glycine oxidases previously described in other organisms. Both proteins are encoded in operons containing two genes. The operon lod contains immediately downstream to the gene coding for LodA, a second gene coding for the flavoprotein LodB. Previous data have demonstrated that both proteins are required for the generation of the active form of LodA in M. mediterranea. The aim of this work has been to study the role of LodB in the generation of the quinone cofactor of LodA. In addition, studies about structure/function relationship of LodA has been carried out for the first time with the aim of determining the residues involved in the biogenesis of the quinone cofactor and the enzymatic activity of LodA. This work has been carried out by heterologous expression in Escherichia coli of the different genes coding for either LodA or GoxA, alone or in combination with the genes encoding LodB or GoxB. In order to identify which residues are post-translationally modified, the recombinant proteins were analyzed by mass spectrometry to determine the molecular mass of the complete protein and that of the peptides generated by enzymatic digestion. In addition, the role of residues conserved in LodA and LodA-like proteins has been studied by site directed mutagenesis. Finally, a comparative analysis of protein encoded by lod and gox operons has been also performed. It has been determined that recombinant LodA contains a cysteine tryptophyl quinone cofactor (CTQ) which is generated by post-translational modification of residues Cys516 and Trp581. When LodA is expressed in absence of LodB, an inactive monohydroxylated intermediate of LodA, named PreLodA is generated. It is. This result indicates that LodB is required to obtain active LodA and that PreLodA would be its substrate. A critical role in the generation of this precursor of a conserved Asp residue has been revealed by site directed mutagenesis. Other important residues to obtain enzymatic activity are located at the entrance of the active site of LodA or in close vicinity to the quinone cofactor. Moreover, deletions in C-terminal region of LodA suggest a role of that region in the generation of the active form of LodA. Using bioinformatic analysis it has detected that operons encoding LodA-like proteins in microbial genomes usually contain a second gene encoding a hypothetical LodB-like flavoprotein. The analysis of the recombinant synthesis of GoxA in absence of GoxB has revealed, similarly to LodA, a soluble inactive precursor with partial post-translational modifications. This precursor has been named PreGoxA because of its similarity to PreLodA. Finally, it has been demonstrated that the roles of LodB and GoxB are not interchangeable and each flavoprotein acts specifically on its partner protein. This study gets insights in a novel family of LAOs with quinone cofactors. The data presented in this work have revealed a new mechanism of post-translational modification of proteins involving a flavoprotein.

La emergencia y diseminación de resistencias a antimicrobianos supone un problema para la salud pública y la sanidad animal puesto que pone en serio peligro la eficacia del principal tratamiento contra las infecciones bacterianas. Por este motivo son especialmente interesantes los estudios centrados no sólo en la identificación de los determinantes de resistencia, sino también de los mecanismos que intervienen en su dispersión. En este contexto, la presente Tesis Doctoral profundiza en la incidencia y caracterización molecular de elementos genéticos implicados en la captura, diseminación y mantenimiento de genes de resistencia a antimicrobianos por cepas de serotipos no tifoideos de Salmonella enterica, un patógeno bacteriano que, por su carácter zoonótico, podría estar ocupando un lugar relevante como donador y receptor de genes de resistencia. Los puntos desarrollados en este trabajo fueron fundamentalmente tres:1.- Se demostró el importante papel que juegan los integrones de clases 1 y 2, constatando su presencia en un gran número de cepas multirresistentes (mayoritariamente clínicas), aisladas en el Principado de Asturias y el resto de España. Dos hechos destacables fueron: a) la nueva descripción de los integrones de clase 1 con las regiones variables: 2300 pb/estX-smr-aadA1 y 2100 pb/dfrA1-597pb-aadA24; y b) la primera identificación de integrones de clase 2 en los serotipos S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama y S. Worthington. Se confirmó la asociación de estas unidades genéticas con elementos transponibles, observando diferentes configuraciones integrón de clase 1-transposón tipo Tn21 o integrón de clase 2-transposón tipo Tn7. Además, en la mayoría de los casos estas estructuras se encontraban localizadas en plásmidos conjugativos de gran tamaño, a veces portadores de resistencias adicionales no asociadas a integrones.2.- Dada la creciente emergencia de las resistencias a cefalosporinas de tercera y cuarta generación, se rastrearon β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) y enzimas plasmídicas tipo AmpC en cepas alemanas procedentes de alimentos y animales. Subrayar que la familia de cefotaximasas CTX-M-1 era la más frecuente, y se encontraba asociada a secuencias de inserción tipo ISEcp1. Tanto los genes de BLEEs como de enzimas AmpC, se localizaban en plásmidos de tamaño variable, la mayoría conjugativos.3.- Otro hecho alarmante, dentro del panorama de la multirresistencia, es la aparición de plásmidos híbridos de virulencia-resistencia. En esta Tesis Doctoral se identificó y caracterizó parcialmente un plásmido, denominado pUO-SeVR1, que se encontró en un aislamiento de S. Enteritidis, el serotipo con mayor incidencia en infecciones humanas. Los resultados obtenidos sugieren que deriva de pSEV (el plásmido de virulencia específico de S. Enteritidis) por haber adquirido genes de resistencia asociados a un integrón y a diversos elementos transponibles. A la vez se desvelan algunos de los mecanismos que controlan la transmisión estable del plásmido dentro de la población bacteriana. Esta Tesis Doctoral ilustra el concepto de "ingeniería evolutiva" que, aplicado en este contexto, refleja la importancia que las secuencias "acompañantes" de un gen y sus propiedades combinatorias tienen en la adaptabilidad bacteriana. / The emergence and dissemination of antimicrobial resistance is a worrisome problem for human and veterinary medicines, threatening the effectiveness of the main treatment against the bacterial infections. For this reason, studies focused not only on the identification of the resistance determinants but also on the mechanisms involved in their spread, are especially interesting. In this context, this Doctoral Thesis analyzed the incidence and molecular characterization of mobile genetic elements related to the capture, maintenance and dissemination of antimicrobial resistance genes. For this purpose, multidrug resistant strains belonging to different non-typhoidal serovars of Salmonella enterica were studied. This bacterial pathogen, because of its zoonotic quality, might perform a relevant function as donor and recipient of resistance genes. The main objectives developed in this work were the following:1.- The important role played by class 1 and class 2 integrons was demonstrated by ascertaining their presence in many multidrug resistant strains (mostly from clinical origin), isolated in the Principality of Asturias and the rest of Spain. Two remarkable facts were: a) the new description of class 1 integrons with the variable regions: 2300 bp/estX-smr-aadA1 and 2100 bp/dfrA1-597bpaadA24; and b) the first identification of class 2 integrons in serovars S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama and S. Worthington. The linkage between these genetic units and transposable elements was also established, finding different class 1 integron-Tn21-like transposon or class 2 integron-Tn7-like transposon configurations. Moreover, in most cases these structures were located on large conjugative plasmids, some of them carrying additional non integron-associated resistances.2.- Due to the increasing emergence of the resistance to the third- and fourth-generation cephalosporins, the presence of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) and plasmidic AmpC enzymes was analyzed in German isolates of animal and food origin. The CTX-M-1 family was the prevalent, and was associated with insertion sequences ISEcp1-like. The ESBL and AmpC encoding genes were in all cases located on plasmids of variable sizes, mainly self-transferable.3.- Another alarming trend in the multidrug resistance background, is the emergence of virulence-resistance hybrid plasmids. In this Doctoral Thesis, the identification and partial characterization of the plasmid pUO-SeVR1 (found in a S. Enteritidis isolate) was carried out. The results obtained suggest that it derived from pSEV (the virulence plasmid specific of S. Enteritidis), through acquisition of resistance genes associated with a class 1 integron and diverse transposable elements. Some mechanisms involved in the stable inheritance of the plasmid were also identified.This Doctoral Thesis illustrates the concept of "evolutionary engineering" which, used in this context, shows the significance that "adjacent" sequences to a particular gene and their combinatorial properties have in the bacterial adaptability.

Objetivos: (i) caracterizar los mutantes delecionados en las rutas de consumo/producción de acetato y determinar las consecuencias de su deleción a distintos niveles celulares, (ii) estudiar la regulación in vivo del metabolismo de acetato por acetilación de proteínas en E. coli , (iii) describir el contexto genómico de los genes de las enzimas responsables de la acetilación de proteínas en E. coli (cobB y patZ) y estudiar su regulación transcripcional, (iv) discernir el papel de la acetilación de proteínas en las diferencias metabólicas observadas entre las cepas de E. coli K12 y BL21, (v) identificar los patrones de acetilación de proteínas en distintas condiciones y fondos genéticos en E. coli y (vi) caracterizar la funcionalidad de la acetilación de proteínas en el metabolismo del acetato y la regulación transcripcional. Metodología: durante esta Tesis se utilizaron la cepa de Escherichia coli BW25113 y sus mutantes delecionados en algunos genes de interés. Además se utilizaron técnicas para determinar expresión génica (RT-PCR, DNA-microarrays y vectores sonda de promotor), actividades enzimática en extractos crudos y enzimas purificadas, western blot, cuantificación de metabolitos por HPLC y espectrometría de masas de alta resolución para proteómica. Resultados. La deleción de la mayor vía de producción de acetato alteró el metabolismo central a distintos niveles, desde la transcripción a los niveles energéticos celulares, mostrando la conexión de este metabolismo y el central, y también mostrando la importancia de un funcionamiento equilibrado de este metabolismo. La sirtuina CobB y la acetiltransferasa PatZ alteraron la actividad in vivo de la enzima acetil-CoA sintetasa. El gen cobB se expresa constitutivamente mientras que la expresión génica de patZ se activa transcripcionalmente por el factor de transcripción CRP, al igual que el gen de la enzima acetil-CoA sintetasa, teniendo dos sitios de unión en su región aguas arriba de su secuencia. La ausencia de las proteínas CobB y PatZ en la cepa BL21 alteró mas severamente el metabolismo del acetato que en la cepa K12. Esto indicó que probablemente la regulación diferencial de estas enzimas puede ser la clave de porque ambas cepas tienen un metabolismo del acetato distinto. La actividad desacetilasa de CobB es global y contribuye a la desacetilación de numerosos substratos , generando un gran efecto sobre la fisiología. La acetilación de la isocitrato liasa contribuye al ajuste fino del ciclo del glioxilato y la acetilación de la lisina 154 de RcsB previene la unión de este factor de transcripción al ADN. Este último efecto de la acetilación activa la biosíntesis de flagelos y proteínas relacionadas con la motilidad, e incrementa la susceptibilidad a estrés. La deleción de la proteín-acetiltransferasa patZ aumenta la acetilación en cultivos con acetato. Esto sugiere que tal vez el papel de esta proteína sea regular los niveles de agentes acetilantes en la célula. Este hecho esto explicaría la activación transcripcional simultanea de los genes de patZ y su sustrato acs. Conclusiones. Los resultados presentados en esta Tesis ofrecen nuevos aspectos de las funciones del metabolismo del acetato y la acetilación de proteinas en E. coli. El metabolismo de acetato está directamente unido al metabolismo central, regulando los niveles de metabolitos clave como el acetil-CoA y el acetil-fosfato, que son clave para la acetilación enzimática y química de los residuos de lisina de las proteínas. Esta regulación post-traduccional es importante para el control del metabolismo pero también en otras funciones celulares como pueden ser la movilidad y la supervivencia a estrés. La proteín-acetiltransferasa PatZ no es responsable, directamente, de la mayor parte de las acetilaciones en E. coli, pero juega un papel importante en la regulación de la acetilación química en E. coli. Summary Objectives: (i) to characterise knockout mutants of the acetate producing/consuming pathways and to determine the consequences of the deletion at different metabolic levels; (ii) to study the regulation in vivo of the acetate metabolism by protein lysine acetylation in E. coli; (iii) to describe the genomic context of the genes that encode for the enzymes involved in protein lysine acetylation in E. coli (cobB and patZ) and to study their transcriptional regulation; (iv) to decipher the role of lysine acetylation in the different acetate metabolism observed between the BL21 and K12 E.coli strains; (v) to identify protein acetylation patterns in different growing conditions and genomic backgrounds; (iv) and to characterise the function of protein lysine acetylation in acetate metabolism and transcriptional regulation. / Methodology: the strain Escherichia coli BW25113 and its knockout mutants deleted in the pathways of interest were used during this PhD thesis. Several techniques were used in order to achieve the objectives mentioned above, such as RT-PCR, promoter probe plasmids, DNA microarray, enzyme activities in cell crude extracts and purified enzymes, metabolite measurement by HPLC and High resolution MS proteomics. Results and discussion. The deletion of the main acetate-producing pathway altered central metabolism at different levels, from the transcripts to the energetic levels, showing the link between this metabolism and central carbon metabolism, and also the importance of a proper-balance of acetate metabolism. The sirtuin CobB and the acetyltransferase PatZ altered the activity of acetyl-CoA synthetase in vivo. the cobB gene is expressed constitutively while the patZ gene expression is activated transcriptionally by the transcription factor CRP, similarly to what has been described for the acetyl-CoA synthetase gene, having two putative binding sites in its upstream region. The absence of the CobB and PatZ protein in the BL21 strain altered more severely the acetate metabolism than in the K12. This indicates that probably the differential metabolic regulation of these enzymes could be the key for this different acetate production. Further, the deacetylase activity of CobB is global, contributes to the deacetylation of a big number of substrates and has a major impact on bacterial physiology. Acetylation of isocitrate lyase contributes to the fine-tuning regulation of the glyoxylate shunt and the acetylation of lysine 154 of RcsB prevents DNA binding. This last effect activates flagella biosynthesis and motility proteins, and increases susceptibility to acid stress. Besides, deletion of the acetyltransferase patZ increased acetylation especially in acetate cultures. These results suggest that the role of PatZ could be the regulation of the levels of acetylating agents in the cell. In fact this last finding would explain the simultaneous transcriptional activation of the protein acetyltransferase (patZ) and acetyl CoA synthetase (acs). Conclusions. The results presented in this PhD thesis offered new insights into the roles of acetate metabolism and lysine acetylation in E. coli. Acetate metabolism is linked to central metabolism regulating the levels of key metabolites, such as acetyl-CoA and acetyl-phosphate, both having been shown involved in protein lysine acetylation. This post-translational modification mechanism is important in the control of metabolism, but also in other important physiological roles such as motility and stress survival. Also, the protein acetyltransferase, PatZ, is not a major protein-acetyltransferase in E. coli, but rather might play a role in the regulation of chemical acetylation in E. coli.

La proteína CarD es un regulador transcripcional de acción global en la bacteria Myxococcus xanthus, que se requiere para la actividad de varios factores σ-ECF (extracytoplasmatic function). CarD presenta una arquitectura de dominios única, con un dominio C-terminal de unión al DNA similar a las proteínas eucarióticas HMGA (high-mobility group A), y un dominio N-terminal, típicamente bacteriano, que define a la familia de proteínas PF02559. Dicha familia incluye el dominio de interacción con la polimerasa de RNA de los factores TRCF (que acoplan la reparación del DNA con la transcripción), y un grupo de proteínas ampliamente distribuidas y poco estudiadas, cuyo miembro en M. xanthus hemos denominado CdnL (CarD N-terminus Like), para distinguirlo de CarD, ya que ambas proteínas coexisten en esta bacteria. En este trabajo se ha determinado la estructura de CdnL, una proteina esencial para la viabilidad en M. xanthus, así como del dominio N-terminal de la proteína homóloga de Thermus thermophilus y se ha realizado un análisis mutacional exhaustivo para establecer la relación estructura-función. Los resultados indican que CdnL utiliza su dominio N-terminal, que adopta una estructura similar a los dominios Tudor, para interaccionar con la subunidad β de la polimerasa de RNA (βRNAP), y que la superficie de contacto CdnL-βRNAP está conservada en relación con otros miembros de la familia. Asimismo, se ha demostrado que la interacción CdnL-βRNAP es fundamental para la función de CdnL. El dominio C-terminal de CdnL, también necesario para su función, adopta una estructura compacta con cinco hélices α en disposición antiparalela, en la que destaca una superficie de residuos no polares y básicos expuestos al solvente. Varios de dichos residuos básicos juegan un papel clave, pendiente de determinar, en la función de CdnL. Además, CdnL, pero no los mutantes de pérdida de función in vivo, estabiliza in vitro la formación del complejo abierto formado por la RNAP unida al factor σ principal, σA, en un promotor de rRNA. Consistente con estos datos, CdnL se localiza in vivo en los promotores de rRNA. Que CdnL se requiera para la actividad del holoenzima RNAP-σA y CarD para la de factores σ-ECF en M. xanthus ilustra cómo dos miembros de una misma familia han evolucionado para actuar sobre promotores dependientes de distintos factores σ. Como la proteína CdnL de M. xanthus, su homólogo en Mycobacterium tuberculosis, pero no en Bacillus subtilis, es esencial para la viabilidad celular, interacciona con la βRNAP, y se requiere para la activación de la transcripción del rRNA. Para evaluar el grado de conservación evolutiva de la función de CdnL, en este trabajo se ha estudiado también la proteína homóloga (CcCdnL) de Caulobacter crescentus, una alfaproteobacteria modelo de estudio para diversos procesos celulares. Los resultados obtenidos indican que CcCdnL es esencial, interacciona con la βRNAP, y se localiza en los promotores de rRNA activando su transcripción in vivo. Estos resultados sugieren que la función esencial de CdnL y su modo de acción, más allá de alguna posible excepción, están conservados en distintos grupos taxonómicos bacterianos. CcCdnL, cuya expresión es constitutiva, es sustrato de la proteasa ClpXP. Sin embargo, el aumento en los niveles intracelulares de CcCdnL por falta de la degradación mediada por ClpXP no provoca efectos adversos sobre el crecimiento. Una peculiaridad de las mutaciones de falta de función en CcCdnL, en relación con las mutaciones equivalentes en sus homólogos de M. xanthus y M. tuberculosis, es su criosensibilidad, que podría resultar de diferencias intrínsecas entre los distintos homólogos, o de diferencias en la estabilidad intrínseca de los complejos abiertos de transcripción formados por la distintas RNAP. / The CarD protein is a global transcriptional regulator in the bacterium Myxococcus xanthus that is required for the activity of various ECF (extracytoplasmatic function) σ factors. CarD has a unique domain architecture with a C-terminal DNA binding domain similar to eukaryotic HMGA (high- mobility group A) proteins and an N-terminal, typically bacterial, domain that defines the protein family PF02559. This family includes the RNA polymerase interaction domain of TRCF factors (that couple DNA repair with transcription) and a group of widely distributed but poorly studied proteins, whose member in M. xanthus we named CdnL (CarD N-terminus Like) to distinguish it from CarD, since both proteins co-exist in this bacterium. In this work, the structure of CdnL, a protein essential for M. xanthus viability, as well as that of the N-terminal domain of the homologous protein in Thermus thermophilus have been determined, and an extensive mutational analysis has been carried out to establish structure-function relationships. The results indicate that CdnL utilizes its N-terminal domain, which adopts a structure similar to Tudor domains, to interact with the β subunit of RNA polymerase (βRNAP), and that the CdnL-βRNAP contact surface is conserved relative to other members of this family. Furthermore, the CdnL-βRNAP interaction is shown to be critical for CdnL function. The CdnL C-terminal domain, also required for its function, adopts a compact structure composed of five antiparallel  helices, whose striking feature is the presence of a solvent-exposed nonpolar-basic patch. Several of these basic residues play a key role, which remains to be determined, in CdnL function. Moreover, CdnL, but not its loss-of-function mutants, stabilizes in vitro the formation of open complexes at rRNA promoters by RNAP holoenzyme containing σA, the principal σ factor in M. xanthus. Consistent with these data, CdnL localizes to rRNA promoters in vivo. That CdnL is required for activity of the RNAP-σA holoenzyme and CarD for that of ECF-σ factors in M. xanthus illustrates how two members of the same family have evolved to act on promoters dependent on distint σ factors. Like M. xanthus CdnL, its homologue in Mycobacterium tuberculosis, but not in Bacillus subtilis, is essential for cellular viability, interacts with βRNAP, and is required for the activation of rRNA transcription. To assess the degree of evolutionary conservation of CdnL function, we also studied the homologue (CcCdnL) in Caulobacter crescentus, a model alphaproteobacterium for the study of diverse cellular processes. The results show that CcCdnL is essential, interacts with βRNAP, and localizes to rRNA promoters activatng their transcription in vivo. These results suggest that the essential function of CdnL and its mode of action, other than some possible exception, is conserved across distinct taxonomical bacterial groups. CcCdnL, whose expression is constitutive, is a substrate of the ClpXP protease. Nevertheless, the increase in intracellular levels of CcCdnL due to the loss of its degradation by ClpXP does not provoke adverse effects on growth. An unusual feature of CcCdnL lack-of-function mutations, relative to equivalent mutations of its homologues in M. xanthus and M. tuberculosis, is their cold- sensitivity, which may stem from intrinsic differences among the distinct homologues, or from differences in the intrinsic stabilty of the open, transcripion complexes formed by distinct RNAP.

Actualmente, existe un interés por la demanda de alimentos saludables que puedan tener un efecto beneficioso para la salud de los consumidores. La evidencia científica avala que el consumo de determinados compuestos presentes en los alimentos de forma natural, tiene una relación inversa con la disminución del riesgo de padecer enfermedades, como enfermedades cardiovasculares, cáncer y otras enfermedades degenerativas. Entre estos componentes presentes en los alimentos de origen vegetal, los (poli)fenoles son considerados potentes antioxidantes con numerosos efectos beneficiosos. El grano de cacao y sus productos derivados, destacan por tener una alto contenido en (poli)fenoles. Sin embargo, numerosos trabajos científicos han demostrado que desde la recogida del grano hasta el producto final, se producen pérdidas de estos compuestos en todas las etapas del proceso. Por ello, es importante reducir las pérdidas de estos compuestos antioxidantes en el producto final. El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido desarrollar y obtener un ingrediente natural de cacao con un alto contenido en (poli)fenoles y con una alta capacidad antioxidante, y que pueda ser apto como ingrediente para su aplicación en productos alimenticios. En las primeras etapas se realizó un estudio del grano de cacao para seleccionar la materia prima con un elevado contenido de (poli)fenoles. Asimismo, se evaluaron los efectos de diferentes procesos tecnológicos sobre los contenidos en (poli)fenoles totales y flavanoles, con la finalidad de introducir nuevas etapas en el procesado y conseguir un polvo de cacao desgrasado con un perfil fenólico mejorado. De este modo, se consiguió el desarrollo industrial de un ingrediente de cacao rico en (poli)fenoles totales y flavanoles que fue utilizado en la formulación de un chocolate negro. Los resultados obtenidos muestran que el proceso de fermentación y tostado del grano producen una disminución significativa del contenido de (poli)fenoles totales, observando el mayor contenido de estos compuestos en el “nib”. El genotipo de cacao, clon CCN51, producido en Ecuador, es el cacao con el contenido más alto de (poli)fenoles. La inactivación de la enzima polifenol oxidasa mediante un escaldado con agua a 95 ºC y 5 minutos, redujo las pérdidas de (-)-epicatequina, (+)-catequina y procianidina B2, así como el contenido de (poli)fenoles totales. Por ello, el empleo de “nib” de cacao procedente de semillas no fermentadas con la enzima polifenol oxidasa inactivada, es una buena alternativa como materia prima para obtener un ingrediente con un mayor contenido en flavanoles. El prototipo de cacao desgrasado por Soxhlet a partir de semillas con la enzima polifenol oxidasa inactivada, representó a un cacao no afectado por variables postcosecha. El prototipo óptimo fue escalado a nivel piloto mediante un desgrasado con CO2 supercrítico, resultando un cacao con un mayor contenido de (poli)fenoles totales y de flavanoles, así como una capacidad antioxidante superior respecto a los valores encontrados en un polvo de cacao convencional. La aplicación de un tratamiento térmico con calor húmedo a 121 ºC y 1 minuto, no afectó al contenido de (poli)fenoles, obteniendo un ingrediente de cacao con un elevado contenido de procianidinas. La formulación de un chocolate negro empleando un 15% de este ingrediente, ha dado lugar a un enriquecimiento notable de las fracciones de procianidinas oligoméricas y de (-)-epicatequina, (+)-catequina y los dímeros B1 y B2, cuando se compararon los valores con los de un chocolate negro no enriquecido. Aunque la actividad biológica de este ingrediente no ha sido objeto de este estudio, la caracterización del mismo, en cuanto a su perfil (poli)fenólico, abre nuevas líneas de investigación, dirigidas al estudio de la funcionalidad de dicho ingrediente evaluando tanto in vitro como in vivo sus efectos beneficiosos relacionados con los mecanismos de estrés oxidativo. / ABSTRACT Currently, there is an interest in the demand for healthy foods that can have a beneficial effect on the health of consumers. The scientific evidence supports that the intake of certain compounds present naturally in foods has an inverse relationship with reduced risk of some diseases, such as cardiovascular disease, cancer and other degenerative diseases. Among the components present in food of plant origin, (poly)phenols are considered powerful antioxidants with numerous beneficial effects. Cocoa beans and their derived products are characterized by having a high content of (poly)phenols. However, numerous scientific studies have shown that from the collection of the bean to the final product, part of these bioactive compounds are lost at the different processing stages. Therefore, it is important to reduce losses of these antioxidant compounds in the final product. The overall objective of this PhD thesis has been to develop and obtain a natural cocoa ingredient with a high content of (poly)phenols and with high antioxidant capacity, which may be also suitable as an ingredient for use in food products. In the first part of the thesis, a study of the cocoa bean was performed to select the raw material with a high content of (poly)phenols. Also, the effects of various processes on the contents of (poly)phenols and flavanols were evaluated, in order to introduce new steps in the processing for the production of a defatted cocoa powder with an improved phenolic profile. This way, the industrial development of a cocoa ingredient rich in (poly)phenols and flavanols was achieved, which was then used in the formulation of a dark chocolate. The results show that the fermentation and roasting of the bean produce a significant decrease in the total content of (poly)phenols, the highest content of these compounds being observed in the “nib”. The genotype CCN51 clone, produced in Ecuador, is the type of cocoa with the highest content of (poly)phenols. Inactivating the polyphenol oxidase by blanching with water at 95 °C and 5 minutes, reduced losses of (-)-epicatechin, (+)-catechin, and procyanidin B2, as well as the total content of (poly)phenols. Therefore, the use of cocoa “nib” from unfermented beans with the polyphenol oxidase inactivated seems to be a good alternative as a raw material to obtain a cocoa ingredient with an increased content of flavanols. The prototype of cocoa defatted by Soxhlet from beans with the polyphenol oxidase inactivated, represented a cocoa powder unaffected by postharvest variables. The optimum prototype was taken to pilot scale level by defatting with supercritical CO2, this resulting in a higher content of total (poly)phenols and flavanols, as well as an antioxidant capacity higher than that found in a conventional cocoa powder. The subsequent application of a heat treatment with moist heat at 121 °C during 1 minute did not affect the (poly)phenols content, obtaining a defatted cocoa ingredient with a high content of oligomeric procyanidins. Formulating a dark chocolate using 15% of this ingredient resulted in a significant enrichment of the fractions of oligomeric procyanidins, and of (-)-epicatechin, (+)-catechin and B1 and B2 dimers, when the values were compared with a not enriched dark chocolate Although the biological activity of this ingredient has not been the subject of this study, its characterization regarding its (poly)phenolic profile, open new research lines aimed at the study of the functionality of this ingredient, evaluating both in vitro and in vivo its beneficial effects related to oxidative stress mechanisms.