Entendre quin és el cribratge al que estan sotmesos els pèptids abans de poder-se unir a les molècules del complex major d’histocompatibilitat classe II o major histocompatibility complex class II en angles (MHC classe II o HLA classe II en humans) per a més tard ser presentats als limfòcits T és especialment rellevant per les seves implicacions en salut, a l’estar involucrats en diferents processos relacionats amb la defensa de l’organisme, des de la resposta davant d’infeccions a les reaccions autoimmunitàries, passant pel reconeixement de les cèl·lules cancerígenes. L’objectiu d’aquesta tesi ha estat desenvolupar diferents estratègies usant tècniques bioinformàtiques per a identificar els patrons que reconeixen les diferents molècules del HLA alhora de seleccionar els pèptids que més tard presentaran els diferents al·lels i, per extensió, poder arribar a predir si un determinat pèptid tindrà la capacitat d’unir-se a una determinada molècula d’HLA. Un cop desenvolupat l’algoritme de determinació i predicció de patrons es va construir una plataforma web per poder-hi analitzar grans quantitats de pèptids i/o proteïnes mitjançant diferents funcionalitats. Per a poder assolir aquests objectius, el treball es va dividir en tres fases diferents. La primera fase va consistir en construir una base de dades relacional en postgesql per a poder-hi emmagatzemar tant la informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme com les dades resultants de l’anàlisi d’aquesta informació. La informació requerida per al correcte funcionament de l’algoritme està formada per epítops per als quals es coneix si són o no presentats per les diferents molècules d’HLA classe II i diferents proteomes de patògens humans, així com el proteoma humà. A més a més, s’hi ha inclòs una secció privada on els usuaris registrats poden pujar-hi dades d’epítops derivades de les seves pròpies investigacions per poder-los analitzar en combinació amb les dades públiques del sistema per a una mateixa molècula. En la segona fase d’aquest treball es varen desenvolupar dos predictors, el primer usant un sistema basat en matrius de puntuació específiques de posició (position-specific scoring matrices en anglès, també conegudes com a PSSM) i el segon usant màquines d’aprenentatge de vectors de suport (Suport vector machines en anglès o SVM). Les PSSM varen ser desenvolupades usant un protocol iteratiu d’optimització, on es comença usant la informació proporcionada per l’alineament de segments de 9 residus en epítops, identificats com a possibles regions d’interacció amb les molècules d’HLA objectes de estudi, i posteriorment es va afegint informació tant de pèptids que no s’uneixen a la molècula com del grau de conservació dels diferents al·lels. Per a la construcció de la SVM, els segments d’unió dels pèptids a cada una de les molècules d’HLA es van definir a partir les PSSM construïdes per a cada una d’elles i els paràmetres per a la SVM amb una funció de base radial (Radial-basis function o RBF) com a nucli (kernel) varen ser fixades individualment per a cada cas a fi i efecte d’assolir els millors resultats possibles. En la tercera i última fase d’aquest projecte, es van construir dos pàgines web, una per cada predictor. Aquests predictors tenen en comú que els usuaris en general poden introduir-hi llistats de pèptids i/o proteïnes en format FASTA per a ser analitzades. Aquestes anàlisi tornen com a resultat els possibles motius d’unió detectats i la seva localització en els proteomes seleccionats. Una característica particular del predictor basat en PSSM és que els usuaris registrats poden pujar seqüències resultants de la seva pròpia investigació per trobar nous patrons d’unió a molècules d’HLA noves o millorar els existents i fer prediccions amb ells. / Understanding how peptides are selectively bound and presented by major histocompatibility complex class II molecules (MHC class II or HLA class II in humans) is of outmost importance for its broad implications in human health, from infection to autoimmunity or cancer. The aim of this thesis was to develop a computational strategy to identify HLA class II binding patterns for a variety of alleles and use this knowledge to predict their capacity to bind specific peptide sequences. To make an effective use of the prediction algorithm, a web-based platform for the analysis of large peptide or protein sets, including various functionalities, was also devised. In order to accomplish these objectives, the work was divided into three different stages. The first stage consisted in the construction of a postgresql relational database to store all the information required for and generated by the algorithms developed. The required, uploaded information (subject to updates) consisted of known HLA class II epitopes and the translated genomes of a list of pathogenic bacterial species and human. In addition, the database was designed to include a private section for the upload of user-owned epitope information, which the owner may use in combination with the public data. In a second stage two predictors were developed, one using position-specific scoring matrices (PSSMs) and the other one using a support vector machine (SVM). PSSM development was performed using an iterative optimisation protocol, starting from the alignment of known epitopes to identify HLA class II binding cores (9-residue segments) and incorporating additional information such as allele conservation and non-binders at different phases of the refinement. For SVM construction, the epitope core was defined using the corresponding PSSM and the parameters for the SVM with a radial-basis-function (RBF) kernel were set up individually for each molecule to get the best performance. In the third stage, two web pages were constructed, one for each predictor. The servers share a common part in which the user can introduce peptide or protein sequences in Fasta format to perform an analysis that delivers both putative epitopes and their localization in a selected proteome. In addition, the PSSM-based server allows the user to upload his/her own sequences to elucidate new HLA class II binding patterns and perform predictions with them.

El laberinto circular elevado es un modelo animal de ansiedad basado en el paradigma de aproximación/evitación. Dicho modelo forma parte de la metodología utilizada en toxicología de la conducta. Esta tesis parte de un estudio prototípico de la toxicología de la conducta e intenta resolver algunos problemas metodológicos. En el primer experimento se hallaron alteraciones en ansiedad y memoria espacial debidas a la exposición a deca-BDE, un compuesto de la familia de los éteres difenílicos polibromados. El segundo estudio mostró la capacidad del amansamiento y el aislamiento social para modificar la línea basal de ansiedad. Además se desarrolló un nuevo parámetro para distinguir entre alteraciones en ansiedad y actividad. El tercer experimento cuestiona la idoneidad del uso de la cepa C57BL/6J en estudios relacionados con la ansiedad debido a la dificultad para interpretar los resultados. Los resultados obtenidos muestran algunas de las dificultades que implica el uso de este modelo animal de ansiedad. / The zero maze test is an animal model of anxiety based on the approach/avoidance paradigm. This model is part of the methodology used in behavioral toxicology. This thesis begins with a prototypical study in the field of behavioral toxicology and it tries to solve some methodological issues. The first study showed differences in anxiety and spatial memory due to deca-BDE intoxication, the most brominated congener of the polybrominated difenil ethers. The second study showed the capability of the handling and social isolation procedures to modify the anxiety baseline of the animals. Moreover, a new parameter to distinguish between anxiety or activity alterations was proposed. The third study discusses about the use of C57BL/6J strain of mice in anxiety studies due to the difficulty in the interpretation of results. Globally, the results obtained in these experiments showed some of the difficulties that imply the use of this animal model of anxiety.

La emergencia y diseminación de resistencias a antimicrobianos supone un problema para la salud pública y la sanidad animal puesto que pone en serio peligro la eficacia del principal tratamiento contra las infecciones bacterianas. Por este motivo son especialmente interesantes los estudios centrados no sólo en la identificación de los determinantes de resistencia, sino también de los mecanismos que intervienen en su dispersión. En este contexto, la presente Tesis Doctoral profundiza en la incidencia y caracterización molecular de elementos genéticos implicados en la captura, diseminación y mantenimiento de genes de resistencia a antimicrobianos por cepas de serotipos no tifoideos de Salmonella enterica, un patógeno bacteriano que, por su carácter zoonótico, podría estar ocupando un lugar relevante como donador y receptor de genes de resistencia. Los puntos desarrollados en este trabajo fueron fundamentalmente tres:1.- Se demostró el importante papel que juegan los integrones de clases 1 y 2, constatando su presencia en un gran número de cepas multirresistentes (mayoritariamente clínicas), aisladas en el Principado de Asturias y el resto de España. Dos hechos destacables fueron: a) la nueva descripción de los integrones de clase 1 con las regiones variables: 2300 pb/estX-smr-aadA1 y 2100 pb/dfrA1-597pb-aadA24; y b) la primera identificación de integrones de clase 2 en los serotipos S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama y S. Worthington. Se confirmó la asociación de estas unidades genéticas con elementos transponibles, observando diferentes configuraciones integrón de clase 1-transposón tipo Tn21 o integrón de clase 2-transposón tipo Tn7. Además, en la mayoría de los casos estas estructuras se encontraban localizadas en plásmidos conjugativos de gran tamaño, a veces portadores de resistencias adicionales no asociadas a integrones.2.- Dada la creciente emergencia de las resistencias a cefalosporinas de tercera y cuarta generación, se rastrearon β-lactamasas de espectro extendido (BLEEs) y enzimas plasmídicas tipo AmpC en cepas alemanas procedentes de alimentos y animales. Subrayar que la familia de cefotaximasas CTX-M-1 era la más frecuente, y se encontraba asociada a secuencias de inserción tipo ISEcp1. Tanto los genes de BLEEs como de enzimas AmpC, se localizaban en plásmidos de tamaño variable, la mayoría conjugativos.3.- Otro hecho alarmante, dentro del panorama de la multirresistencia, es la aparición de plásmidos híbridos de virulencia-resistencia. En esta Tesis Doctoral se identificó y caracterizó parcialmente un plásmido, denominado pUO-SeVR1, que se encontró en un aislamiento de S. Enteritidis, el serotipo con mayor incidencia en infecciones humanas. Los resultados obtenidos sugieren que deriva de pSEV (el plásmido de virulencia específico de S. Enteritidis) por haber adquirido genes de resistencia asociados a un integrón y a diversos elementos transponibles. A la vez se desvelan algunos de los mecanismos que controlan la transmisión estable del plásmido dentro de la población bacteriana. Esta Tesis Doctoral ilustra el concepto de "ingeniería evolutiva" que, aplicado en este contexto, refleja la importancia que las secuencias "acompañantes" de un gen y sus propiedades combinatorias tienen en la adaptabilidad bacteriana. / The emergence and dissemination of antimicrobial resistance is a worrisome problem for human and veterinary medicines, threatening the effectiveness of the main treatment against the bacterial infections. For this reason, studies focused not only on the identification of the resistance determinants but also on the mechanisms involved in their spread, are especially interesting. In this context, this Doctoral Thesis analyzed the incidence and molecular characterization of mobile genetic elements related to the capture, maintenance and dissemination of antimicrobial resistance genes. For this purpose, multidrug resistant strains belonging to different non-typhoidal serovars of Salmonella enterica were studied. This bacterial pathogen, because of its zoonotic quality, might perform a relevant function as donor and recipient of resistance genes. The main objectives developed in this work were the following:1.- The important role played by class 1 and class 2 integrons was demonstrated by ascertaining their presence in many multidrug resistant strains (mostly from clinical origin), isolated in the Principality of Asturias and the rest of Spain. Two remarkable facts were: a) the new description of class 1 integrons with the variable regions: 2300 bp/estX-smr-aadA1 and 2100 bp/dfrA1-597bpaadA24; and b) the first identification of class 2 integrons in serovars S. Virchow, S. Grumpensis, S. Panama and S. Worthington. The linkage between these genetic units and transposable elements was also established, finding different class 1 integron-Tn21-like transposon or class 2 integron-Tn7-like transposon configurations. Moreover, in most cases these structures were located on large conjugative plasmids, some of them carrying additional non integron-associated resistances.2.- Due to the increasing emergence of the resistance to the third- and fourth-generation cephalosporins, the presence of extended spectrum β-lactamases (ESBLs) and plasmidic AmpC enzymes was analyzed in German isolates of animal and food origin. The CTX-M-1 family was the prevalent, and was associated with insertion sequences ISEcp1-like. The ESBL and AmpC encoding genes were in all cases located on plasmids of variable sizes, mainly self-transferable.3.- Another alarming trend in the multidrug resistance background, is the emergence of virulence-resistance hybrid plasmids. In this Doctoral Thesis, the identification and partial characterization of the plasmid pUO-SeVR1 (found in a S. Enteritidis isolate) was carried out. The results obtained suggest that it derived from pSEV (the virulence plasmid specific of S. Enteritidis), through acquisition of resistance genes associated with a class 1 integron and diverse transposable elements. Some mechanisms involved in the stable inheritance of the plasmid were also identified.This Doctoral Thesis illustrates the concept of "evolutionary engineering" which, used in this context, shows the significance that "adjacent" sequences to a particular gene and their combinatorial properties have in the bacterial adaptability.

Objetivos: (i) caracterizar los mutantes delecionados en las rutas de consumo/producción de acetato y determinar las consecuencias de su deleción a distintos niveles celulares, (ii) estudiar la regulación in vivo del metabolismo de acetato por acetilación de proteínas en E. coli , (iii) describir el contexto genómico de los genes de las enzimas responsables de la acetilación de proteínas en E. coli (cobB y patZ) y estudiar su regulación transcripcional, (iv) discernir el papel de la acetilación de proteínas en las diferencias metabólicas observadas entre las cepas de E. coli K12 y BL21, (v) identificar los patrones de acetilación de proteínas en distintas condiciones y fondos genéticos en E. coli y (vi) caracterizar la funcionalidad de la acetilación de proteínas en el metabolismo del acetato y la regulación transcripcional. Metodología: durante esta Tesis se utilizaron la cepa de Escherichia coli BW25113 y sus mutantes delecionados en algunos genes de interés. Además se utilizaron técnicas para determinar expresión génica (RT-PCR, DNA-microarrays y vectores sonda de promotor), actividades enzimática en extractos crudos y enzimas purificadas, western blot, cuantificación de metabolitos por HPLC y espectrometría de masas de alta resolución para proteómica. Resultados. La deleción de la mayor vía de producción de acetato alteró el metabolismo central a distintos niveles, desde la transcripción a los niveles energéticos celulares, mostrando la conexión de este metabolismo y el central, y también mostrando la importancia de un funcionamiento equilibrado de este metabolismo. La sirtuina CobB y la acetiltransferasa PatZ alteraron la actividad in vivo de la enzima acetil-CoA sintetasa. El gen cobB se expresa constitutivamente mientras que la expresión génica de patZ se activa transcripcionalmente por el factor de transcripción CRP, al igual que el gen de la enzima acetil-CoA sintetasa, teniendo dos sitios de unión en su región aguas arriba de su secuencia. La ausencia de las proteínas CobB y PatZ en la cepa BL21 alteró mas severamente el metabolismo del acetato que en la cepa K12. Esto indicó que probablemente la regulación diferencial de estas enzimas puede ser la clave de porque ambas cepas tienen un metabolismo del acetato distinto. La actividad desacetilasa de CobB es global y contribuye a la desacetilación de numerosos substratos , generando un gran efecto sobre la fisiología. La acetilación de la isocitrato liasa contribuye al ajuste fino del ciclo del glioxilato y la acetilación de la lisina 154 de RcsB previene la unión de este factor de transcripción al ADN. Este último efecto de la acetilación activa la biosíntesis de flagelos y proteínas relacionadas con la motilidad, e incrementa la susceptibilidad a estrés. La deleción de la proteín-acetiltransferasa patZ aumenta la acetilación en cultivos con acetato. Esto sugiere que tal vez el papel de esta proteína sea regular los niveles de agentes acetilantes en la célula. Este hecho esto explicaría la activación transcripcional simultanea de los genes de patZ y su sustrato acs. Conclusiones. Los resultados presentados en esta Tesis ofrecen nuevos aspectos de las funciones del metabolismo del acetato y la acetilación de proteinas en E. coli. El metabolismo de acetato está directamente unido al metabolismo central, regulando los niveles de metabolitos clave como el acetil-CoA y el acetil-fosfato, que son clave para la acetilación enzimática y química de los residuos de lisina de las proteínas. Esta regulación post-traduccional es importante para el control del metabolismo pero también en otras funciones celulares como pueden ser la movilidad y la supervivencia a estrés. La proteín-acetiltransferasa PatZ no es responsable, directamente, de la mayor parte de las acetilaciones en E. coli, pero juega un papel importante en la regulación de la acetilación química en E. coli. Summary Objectives: (i) to characterise knockout mutants of the acetate producing/consuming pathways and to determine the consequences of the deletion at different metabolic levels; (ii) to study the regulation in vivo of the acetate metabolism by protein lysine acetylation in E. coli; (iii) to describe the genomic context of the genes that encode for the enzymes involved in protein lysine acetylation in E. coli (cobB and patZ) and to study their transcriptional regulation; (iv) to decipher the role of lysine acetylation in the different acetate metabolism observed between the BL21 and K12 E.coli strains; (v) to identify protein acetylation patterns in different growing conditions and genomic backgrounds; (iv) and to characterise the function of protein lysine acetylation in acetate metabolism and transcriptional regulation. / Methodology: the strain Escherichia coli BW25113 and its knockout mutants deleted in the pathways of interest were used during this PhD thesis. Several techniques were used in order to achieve the objectives mentioned above, such as RT-PCR, promoter probe plasmids, DNA microarray, enzyme activities in cell crude extracts and purified enzymes, metabolite measurement by HPLC and High resolution MS proteomics. Results and discussion. The deletion of the main acetate-producing pathway altered central metabolism at different levels, from the transcripts to the energetic levels, showing the link between this metabolism and central carbon metabolism, and also the importance of a proper-balance of acetate metabolism. The sirtuin CobB and the acetyltransferase PatZ altered the activity of acetyl-CoA synthetase in vivo. the cobB gene is expressed constitutively while the patZ gene expression is activated transcriptionally by the transcription factor CRP, similarly to what has been described for the acetyl-CoA synthetase gene, having two putative binding sites in its upstream region. The absence of the CobB and PatZ protein in the BL21 strain altered more severely the acetate metabolism than in the K12. This indicates that probably the differential metabolic regulation of these enzymes could be the key for this different acetate production. Further, the deacetylase activity of CobB is global, contributes to the deacetylation of a big number of substrates and has a major impact on bacterial physiology. Acetylation of isocitrate lyase contributes to the fine-tuning regulation of the glyoxylate shunt and the acetylation of lysine 154 of RcsB prevents DNA binding. This last effect activates flagella biosynthesis and motility proteins, and increases susceptibility to acid stress. Besides, deletion of the acetyltransferase patZ increased acetylation especially in acetate cultures. These results suggest that the role of PatZ could be the regulation of the levels of acetylating agents in the cell. In fact this last finding would explain the simultaneous transcriptional activation of the protein acetyltransferase (patZ) and acetyl CoA synthetase (acs). Conclusions. The results presented in this PhD thesis offered new insights into the roles of acetate metabolism and lysine acetylation in E. coli. Acetate metabolism is linked to central metabolism regulating the levels of key metabolites, such as acetyl-CoA and acetyl-phosphate, both having been shown involved in protein lysine acetylation. This post-translational modification mechanism is important in the control of metabolism, but also in other important physiological roles such as motility and stress survival. Also, the protein acetyltransferase, PatZ, is not a major protein-acetyltransferase in E. coli, but rather might play a role in the regulation of chemical acetylation in E. coli.

Se ha estudiado variabilidad genética en el musgo Funaria hygrometrica y su relación con los procesos de adaptación al cambio climático en la alta montaña Mediterránea de Sierra Nevada (España). Para ello se han secuenciado cuatro regiones del ADN (espaciadores nuclear ITS1 e ITS2, la región cloroplastidial rps3-rpl16 y la mitocondrial rpl5-rpl16). Asimismo se han usado dos técnicas de fingerprinting (microsatélites y AFLP). Se ha aplicado el método de exploración del genoma sobre los datos AFLP para detectar loci sometidos a selección. Se han desarrollado con éxito nuevos cebadores y/o se han modificado otros para mejorar la amplificación PCR en las regiones rps3-rpl16 e ITS. Los resultados obtenidos han mostrado una alta variabilidad genética y han revelado la existencia de dos linajes divergentes en Funaria hygrometrica. Asimismo, los niveles significativos de la prueba de Mantel han sugerido que Funaria hygrometrica posee una variación adaptativa a lo largo de Sierra Nevada. / The genetic variability in the common cord moss Funaria hygrometrica and its relation to climate change adaptation processes in Mediterranean high mountain of Sierra Nevada (Spain) were studied. Four DNA regions were sequenced (ITS1 and ITS2 nuclear spacers, rps3-rpl16 chloroplast DNA region, and rpl5-rpl16 mitochondrial intergenic spacer). Two fingerprinting techniques (microsatellites and AFLP) were used to complement the sequence data. A genome scan method was applied on the AFLP data in order to find loci under selection. New and/or modified primers were developed to improve the PCR amplification for the nuclear ITS spacer and the chloroplast rps3-rpl16 region. The results obtained showed a high genetic variability and revealed the existence of two divergent lineages of Funaria hygrometrica. Based on the statistical Mantel test, the significant levels of correlation suggested that Funaria hygrometrica possesses an adaptive variation along Sierra Nevada Mountains.

Objetivo: El objetivo general de la presente Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento del sistema circadiano de teleósteos. Para ello se han utilizado cuatro especies, una especie de interés en investigación básica, el pez cebra, y tres especies de interés en acuicultura, la lubina, la dorada y la trucha arcoíris. Metodología: A lo largo de diferentes experimentos, se estudió la influencia de las condiciones de iluminación y de disponibilidad de alimento sobre los distintos ritmos circadianos de teleósteos y sobre la expresión de los principales genes que forman parte de los relojes moleculares. Asimismo, se analizó a nivel molecular la maduración de los relojes moleculares de teleósteos durante las primeras etapas del desarrollo y la influencia de las condiciones lumínicas sobre la funcionalidad de dichas estructuras. Resultados y conclusiones: Los principales resultados y conclusiones obtenidas fueron: - El gen per1 de lubina ha sido clonado y secuenciado. La expresion de este gen mostró un patrón de expresión circadiano, con una acrofase o pico de expresión cercana al final de la noche. - En larvas del lubina, la expresión del gen reloj per1, comienza en etapas tempranas del desarrollo, adquiriendo un patrón circadiano robusto a partir del día 16 post-eclosión bajo un ciclo LD. - El inicio de un patrón rítmico en la expresión de per1 en larvas de lubina requiere de la presencia un ciclo luz/oscuridad durante el desarrollo, permaneciendo arrítmico bajo condiciones constantes de luz u oscuridad. La composición del espectral de la luz utilizada en el ciclo LD, también afecta al comienzo de la expresión rítmica de este gen. - El fotoperiodo afecta a la expresión de los genes reloj durante el desarrollo embrionario de la trucha arcoíris. Bajo un fotoperiodo 12L:12D, se detectó un patrón rítmico de expresión en los genes reloj (per1 y clock) a partir del día 8 post-fertilización, mientras que la expresión rítmica de aanat2 es detectable a partir del día 21. Por el contrario, bajo condiciones constantes de luz, la expresión de los genes reloj es alterada. - Los ritmos de expresión de genes reloj en trucha arcoíris, podrían iniciarse por fotorreceptores aún no identificados, ya que aparecen antes del desarrollo de los fotorreceptores clásicos (pineal y retina), y no se observan bajo condiciones constantes. - Los peces cebra sometidos a alimentación periódica muestran una actividad anticipatoria al alimento, que se manifiesta como un aumento de la actividad locomotora en las horas previas a la hora de alimentación. - En pez cebra, el oscilador sincronizado por el alimento parece localizarse fuera del cerebro. - La alimentación aleatoria afecta a los ritmos de comportamiento en dorada provocando un aumento de los niveles diarios de actividad locomotora, mientras que la alimentación periódica provoca un incremento de la actividad locomotora en la las horas previas a la hora de la alimentación (FAA), mostrando un nivel de actividad diaria total menor. - En Dorada, la alimentación periódica mejora el bienestar animal y el crecimiento. Cuando los animales no pueden predecir la llegada del alimento aumentan los niveles de indicadores de estrés, como el cortisol y glucosa plasmáticos. Además, esta situación afecta al crecimiento, al menos a corto plazo. Estos resultados contribuyen al avance del conocimiento sobre sistema circadiano de teleósteos y ponen de manifiesto la importancia de las condiciones ambientales para el correcto desarrollo y funcionamiento del sistema circadiano, así como la influencia de este sistema sobre la fisiología global del todo el organismo. / Aims: The aim of this Doctoral Thesis is to improve our knowledge on the circadian system in teleosts. To this end, four species have been used: one species of interest in basic research, the zebrafish, and three species of interest in aquaculture, the bass, the sea bream and the rainbow trout. Methods: Throughout the different experiments, the influence of lighting conditions and food availability on the different circadian rhythms in teleosts, and on the expression of the principal genes which form part of the molecular clock, was studied. The maturation of the molecular clock in teleosts during the initial stages of development and the influence of lighting conditions on the functionality of said structures were also analysed. Results and conclusions: - The clock gene, per1, was cloned in sea bass. This gene showed a circadian pattern of expression, with an acrophase or peak expression near the end of the dark phase. - In European sea bass larvae, per1 expression starts in the early stages of development, showing a circadian pattern of expression from day 16 post— - In sea bass lavae, the photoperiod induces the start of a rhythmic pattern in per1 expression during development, remained arrhythmic under constant conditions of light and dark. The spectral composition of light used in the LD cycle, also affect the onset of rhythmic expression of this gene. - The photoperiod affects the expression of clock genes during the embryonic development of rainbow trout. Under a 12L: 12D photoperiod, the rhythmic expression of the clock genes (Per1 and clock) are detectable from day 8 post-fertilization (dpf), while aanat2 rhythmic expression is detectable from day 21dpf. By contrast, under LL, the expression of clock genes is altered, - In rainbow trout embryos, the rhythmic expression of per1 starts before the development of the classical photoreceptors (pineal and retina), and is not observed under LL, suggesting that this cycle could be initiated by other as yet unidentified photoreceptors. - Zebrafish subjected to periodic feeding showed Food Anticipatory Activity, which is manifested by an increase in the locomotor activity in the previous hours prior to meal time. - In zebrafish, the oscillator synchronized by food could be located outside the brain. - In sea bream, random feeding affects behavioural rhythms, increasing the locomotor activity levels. In contrast, periodic feeding induced an increase in locomotor activity in the hours prior to meal time (FAA). - In sea bream, scheduled feeding improves animal welfare. When the animals cannot predict the arrival of the food, the levels of stress indicators, such as cortisol and plasma glucose, are increased. ). In addition, periodic feeding improves growth in sea bream, at least in the short term. The results contribute to the advancement of scientific knowledge on the circadian system in teleosts and highlight the importance of environmental conditions for proper development and functioning of the circadian system, as well as the influence of this system on the overall physiology of the whole organism.

Los ambientes estuarinos, transicionales entre el medio acuático y terrestre, presentan unas características propias e irrepetibles además de cumplir un elevado número de funciones ecológicas y ambientales. Entre estas se puede destacar la de sus suelos y sedimentos como sumideros de carbono atmosférico. La elevada productividad de sus comunidades vegetales, en conjunción con condiciones geoquímicas que favorecen la lenta descomposición de la materia orgánica, hace que estos suelos y sedimentos sean considerados importantes sumideros de carbono a escala planetaria. Sin embargo, la estabilidad del carbono retenido, así como los distintos papeles que la materia orgánica desempeña en el ecosistema, están condicionados no sólo por la cantidad, sino por la composición de dicha materia orgánica.La presente memoria doctoral valora la materia orgánica de suelos y sedimentos en ámbitos estuarinos de la costa cantabro-atlántica española mediante su caracterización por diversas técnicas de química analítica: espectroscopía de infrarrojo, espectroscopia de luz ultravioleta y visible, espectroscopía de fluorescencia, resonancia magnética nuclear en estado sólido de 13C, pirólisis analítica y espectrometría de masas de isótopos estables. Además, se prestará especial atención al estudio de los posibles orígenes de dicha materia orgánica, a la influencia del ambiente geoquímico en su composición así como a la influencia de procesos antrópicos de reclamado y procesos de regeneración natural en estos ámbitos estuarinos.

Objetivos: - Analizar las variaciones en la composición lipídica y el contenido de carbohidratos del músculo y de la glándula digestiva de O. vulgaris durante un periodo corto de ayuno, como aproximación a sus requerimientos nutricionales. - Conocer la aceptabilidad y crecimiento de O. vulgaris alimentado con dietas formuladas con diferentes ingredientes de origen vegetal y animal. - Elaborar piensos formulados en base a los resultados previos de aceptabilidad y comprobar su rendimiento en O. vulgaris mediante ensayos de engorde y digestibilidad. - Estimar los requerimientos lipídicos de O. vulgaris después de suministrar dietas con distinto contenido en aceite de pescado, comprobando los cambios que se producen en el crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta. - Determinar la composición nutricional de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas con distinto contenido en aceite de pescado. - Estudiar los cambios que se producen en el crecimiento, composición nutricional, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad de la dieta de O. vulgaris después de suministrar dietas formuladas que incluyen carbohidratos simples o complejos. Metodología: -Ensayos de ayuno: Se configuraron 5 grupos experimentales (n = 4). Cuatro grupos se sacrificaron a los días 1, 2, 4 y 8 después de suministrar la última comida y un grupo control fue alimentado durante los 8 días de duración del experimento. El día del sacrificio los animales se diseccionaron separando el tejido muscular y la glándula digestiva. Se determino el contenido de carbohidratos, los lípidos totales, y las clases lipídicas mediante HPTLC. -Aceptabilidad de ingredientes: Se prepararon diferentes dietas formuladas con un ingrediente a testar (30%), gelatina como aglomerante (20%), y agua (50%). Los ingredientes de la dieta se mezclaron al Baño María a 45ºC y se dejaron enfriar a 4ºC. Se utilizaron grupos experimentales de entre 6 y 8 individuos (887,0 ± 274,2 g) y se le suministró la dieta entre 3 y 15 días. Se calcularon las tasas de alimentación y crecimiento y el índice de eficacia alimentaria de cada dieta. -Ensayos de engorde: Se probaron 8 piensos diferentes elaborados con ingredientes secos o liofilizados. La duración de los ensayos fue de 42 a 56 días con ejemplares subadultos (700-800 g) mantenidos a 18ºC en recirculación con control de la temperatura. Se realizaron análisis de composición corporal (humedad, proteína, grasa, cenizas y MELN) de los animales, las heces y en las dietas suministradas. Con los datos obtenidos se calcularon las tasas de alimentación, crecimiento y digestibilidad. Resultados y Conclusiones En los animales sometidos a un periodo de ayuno se detectó un aumento en los monoglicéridos y el colesterol en el músculo y se movilizó un promedio de 0,23 g de lípidos por día de ayuno, principalmente ácidos grasos libres, ésteres de esterol y triglicéridos procedentes de la glándula digestiva. Los lípidos contribuyeron con un 26% y los carbohidratos con un 9,9% al gasto energético diario durante el ayuno en el pulpo de roca. Los piensos elaborados con liofilizados de pescado y la yema de huevo en polvo ofrecieron los mejores resultados, con tasas de alimentación y crecimiento similares a las obtenidas para dietas naturales a base de pescado. Las dietas artificiales semihúmedas basadas en una mezcla de ingredientes secos o liofilizados, que emplearon pota (T. sagittatus) como ingrediente principal, mostraron buenas tasas de alimentación, crecimiento, aprovechamiento nutritivo y digestibilidad, igualando o superando las dietas naturales a base de pescado. Se sugieren tasas óptimas de ingesta de lípidos para el pulpo en torno a 1 g al día, con porcentajes apropiados de grasa para dietas formuladas entre el 13-14% en sustancia seca, aunque estos porcentajes pueden variar en futuros estudios según las proporciones de lípidos polares y neutros de la dieta. La dieta mejor aceptada incluía almidón al 5%, aunque los mejores índices de aprovechamiento nutritivo se observaron en la dieta con glucosa al 5%, destacando un PPV del 72% e índices de conversión inferiores a 1 / Aims: - To analyse the variations in lipid composition and carbohydrates content of muscle and digestive gland of O. vulgaris during short-term starvation as approximation to its nutritional requirements. - To determine the acceptability and growth of O. vulgaris fed formulated diets with different ingredients of vegetal and animal origin. - To prepare formulated diets based on the previous results of acceptability and check its efficiencies on O. vulgaris by means of ongrowing and digestibility experiments. - To estimate the lipid requirements of O. vulgaris after supplying diets with different content in fish oil, comparing the changes that take place in the growth, feed efficiency and digestibility of diet. - To determine the proximate and lipid classes composition of O. vulgaris after supplying formulated diets with different content in fish oil. - To study the changes that produce in the growth, nutritional composition, feed efficiency and digestibility of diet in O. vulgaris after supplying formulated diets including simple or complexes carbohydrates. Methodology: -Experiment of starvation: We configured 5 experimental groups (N = 4). Four groups were sacrificed 1, 2, 4 and 8 days after the last meal and a group control was fed throughout the 8 day experimental period. The day of the sacrifice the animals were dissected separating the muscular and the digestive gland. We determined the content of carbohydrates, total lipids, and lipid classes by means of HPTLC. -Acceptability of ingredients: We prepared different formulated diets with an ingredient to test (30%), gelatine as binder (20%) and water (50%). The ingredients of the diet were mixed at 45ºC and cool to 4 ºC. Each diet was tested in experimental groups of between 6 and 8 individuals (887.0 ± 274. g) during a period between 3 and 15 days. The feeding and growth rates and feed efficiency indices of each diet were calculated. -Ongrowing experiments: Eight different formulated diets including dry or freeze-dried ingredients were tested. The length of the experiments was of 42 to 56 days with subadults (700-800 g) kept to 18ºC in a recirculation seawater system with control of the temperature. The proximate composition (moisture, protein, lipid, ash and MELN) of the animals, the faeces and the diets supplied were analysed. The feeding and growth rates and digestibility were calculated with the data obtained. Results and Conclusions In the animals subjected to a starvation period detected an increase in the monoacylglycerols and the cholesterol in the muscle and 0.23 g of lipids by day of starvation, mainly free fatty acids, steryl esters and triacylglycerols were mobilized from the digestive gland. The lipids contributed with 26% and the carbohydrates with a 9.9 % of the energy costs of the animals during starvation in octopus. The elaborated diet based on freeze-dried fish and egg yolk powder offered the best results, with feeding and growth rates similar to the obtained for natural diets based on fish. The semi-moist formulated diets based on a mixture of dried or freeze-dried ingredients, composed of squid (T. sagittatus) as the main ingredient, showed good feeding and growth rates, feed efficiency and digestibility, similar or surpassing the natural diets based on fish. We propose optimal lipid feeding rates of around 1 g day-1, with appropriate percentages of lipid for formulated diets between the 13-14% dry matter, although these percentages can vary in future studies according to the proportions of polar and neutral lipids of the diet. The best acceptability was detected in the diet formulated with 5% of starch, although the best feed efficiency was observed in the diet with 5% of glucose, highlighting a productive protein value of 72% and a food conversion ratio lower than

En esta tesis se han prentendido ampliar los conocimientos sobre los mecanismos que permiten la adaptación de los cultivos celulares de Nicotiana tabacum BY-2 al estrés abiótico, concretamente estrés salino. En dichas condiciones, la adaptación a nivel subcelular implica modificaciones ultrastructurales que permiten a las celulas crecer. Para la identificación de los factores que influyen en la adaptación celular al estrés salino y las modificaciones que se producen en la célula, se han utilizado técnicas de microcopía electrónica y óptica. Por otra parte, se han estudiado nuevos mecanismos de captación y acumulación subcelular de sodio mediante el análisis del tráfico de membranas (endocitosis). Para este estudio se han utilizado técnicas in vivo mediante microscopía de laser confocal. Estos estudios han sido completados con la utilización de técnicas de transcriptómica, proteómica e ionómica, que nos permiten identificar qué factores moleculares son los que pueden estar regulando la adaptación a altas concentraciones salinas. Así mismo, debido a que las giberelinas están implicadas en el proceso de elongación y crecimiento celular, y estudios recientes han relacionado el papel de las mismas con la tolerancia de plantas a salinidad, hemos estudiado la influencia de estas hormonas en la adaptación de las células vegetales a dicho estrés. Con este fin, se ha realizado un estudio sobre la alteración en el metabolismo de las GAs en condiciones salinas y cómo afecta esta alteración a la adaptación de dichas células a estas condiciones de estrés. Por otra parte, hemos fijado nuestra atención en los cambios producidos en la estructura de la pared celular en el proceso de adaptación a salinidad. En este estudio se han analizado principalmente las extensinas y proteínas ricas en arabinogalactanos (AGPs) mediante su identificación y distribución a nivel subcelular, utilizando anticuerpos específicos contra epítopos de estos compuestos. El desarrollo de estos objetivos se ha llevado a cabo mediante técnicas bioquímicas, celulares y de biología molecular que nos han permitido obtener una visión más integrada de los mecanismos implicados en la adaptación de las células al estrés salino mediante la regulación hormonal de los cambios en la estructura y composición de la pared celular. / The aim of this thesis is to enhance our knowledge about the mechanisms of the cell line Nicotiana tabacum BY-2 to the stress conditions, in particular, to high salinity stress. Under these conditions, the adaptation at the subcellular level implies ultrastructural modifications that allow the cells to grow. To identify the factors that may affect this adaptation process to the salinity stress and the possible modifications that may take place in the cell, electronic and light microscopy has been implemented. Additionally, potential new mechanims for subcellular uptake and accumulation of sodium have been investigated by analysing membranes vesicle trafficking (endocytosis). In this work, laser confocal in vivo techniques have been applied. Transcriptomic, proteomic and ionomic tools have been successfully used to complement these studies. Since gibberellins (GAs) are involved in the growth and elongation of plant cells, and recent studies show evidence of the association between GAs and plant tolerance to salinity conditions, the influence of GAs on the plant cells adaptation to salinity stress has also been investigated. This study has also examined, the putative changes in the GAs metabolism under the salinity stress conditions and how these changes may affect the plant cells adaptation. We are also look at the structural changes that may occur in the cell wall during the adaptation process to the salinity conditions, since this may play a major role in the control of the cell size. For this purpose, we have analyzed extensins and arabinogalactan-proteins (AGPs) by identifying their presence and distribution at the subcellular level using specific antibodies raised against epitopes of these molecules. To carry out all these objectives, several biochemical, cellular and molecular tools have been implemented to obtain an integrated view of the possible mechanisms that underlie the structural and compositional changes that occur during the adaptation process of plant cells to salinity stress and, of the regulation and effects of hormones on those changes.

La presente tesis trata del diseño y fabricación de un nuevo dispositivo para registrar la actividad eléctrica neuronal espontánea y estimulada farmacológicamente, en redes neuronales in vitro. La forma de operar esta herramienta es simple, su producción es de bajo coste y además, ofrece una interfaz neurona-electrodo estable a largo plazo más allá de lo posible con tecnologías electrofisiológicas basadas en micropipeta. El dispositivo es una pieza polimérica (polidimetilsiloxano) con dos compartimientos (zona de sembrado de los cultivos neuronales) comunicados entre sí a través de un microcanal de dimensiones comparables a las dimensiones de los axones y dendritas. La actividad eléctrica neuronal es registrable tras el crecimiento espontáneo de las neuritas dentro del microcanal (10 a 14 días de sembradas las neuronas). Un par de electrodos, ubicados de extremo a extremo del microcanal, aprovechan las propiedades conductoras del medio extracelular para registrar los potenciales eléctricos. La tecnología para microfabricar el dispositivo es una combinación de la técnica de fotolitografía (para crear los másteres) y de la técnica de elastomer casting (para fabricar las piezas poliméricas). El procesamiento de datos de las señales es un algoritmo matemático diseñado para analizar la información registrada por el dispositivo; este algoritmo es ejecutado con el software de “Matlab”. El procesamiento de datos asigna y contabiliza como potenciales de acción a las señales que sobrepasen el umbral predeterminado (170 μV) de los registros y presenta los resultados en gráficas de barras de número de potenciales de acción por unidad de tiempo (minuto) / The thesis describes the design and manufacturing of a new tool to support electrophysiological investigation of both individual neuronal electrical activity and neuronal networks electrical activity in vitro. The operation mode is simple, easy to learn and the device can be produced at low cost. Neuron-electrode interface stability is better than electrophysiology micropipette interface. The device is a two compartments polymeric (polydimetilsiloxane) structure (neurons are placed) interconnected by a microchannel. The microchannel aperture is comparable to axon and dendrites diameter. The neuronal electrical activity is recorded after spontaneous neurites grew inside the microchannel (10 to 14 days of neurons be culturated). Each compartment has an electrode and the conductivity electrical propriety of the extracellular medium supports to record electrical potentials end-to-end of the microchannel. The device microfabrication process is a combination of photolithography technique (to create masters) and elastomer casting technique (to manufacture the polymeric parts). Spike frequency analysis is a mathematical algorithm designed. The algorithm runs at Matlab software. Spike frequency analysis counts electrical activity higher than 170 μV as action potential. Results frequency are presented as graphic bars of spike amount per time (minute).