grecase@um.es,ntma@um.es;jmoraled@um.es / Objetivos: La membrana timpánica (MT) tiene capacidad de repararse fisiológicamente tras traumatismos, infecciones y otras patologías. Es lógico deducir que existe un nicho de células madre con capacidad regenerativa responsable de la reparación tisular a este nivel, pero existe muy poca información contrastada sobre ello. Nuestro objetivo fue confirmar la existencia y localización de células madre de la MT y realizar su aislamiento y caracterización. Metodología: Se utilizo un modelo murino C57BL/6J de 8-10 semanas, procedente del animalario de la Universidad de Murcia, siguiendo normativa vigente. Para extracción de MT se utilizaron varios protocolos quirúrgicos con inclusión o ausencia de martillo y annulus. Se realizaron técnicas de digestión enzimática y explantes para obtención de cultivo primario. Las células se sembraron a 1,25 x106 en frascos de cultivo de 25cm2 con alfa-MEM suplementado según protocolos estandarizados en estufas a 37ºC y 5% de C02. Se realizaron subcultivos, curvas de crecimiento y cuantificación de la proliferación celular con MTT. Se utilizó citómetro FACSCanto y un panel de 8 Ac monoclonales para la tipificación inmunofenotípica y RT-PCR para expresión de Nestina, Nanog y Slug. Se emplearon medios de cultivo específicos para la capacidad de diferenciación multipotente. El estudio del nicho se realizó mediante cortes histológicos en zonas estructuradas de la MT y análisis histológico convencional e inmuno-histoquímico para Ki-67, Nestina, Tuj-1 y Oct-3/4. Resultados: Se extrajeron 333 tímpanos de 207 ratones, de los que se lograron realizar 25 explantes. La digestión enzimática produjo una baja viabilidad y escasa proliferación celular en relación directa con el tiempo de exposición. En contraste las técnicas de explante produjeron una viabilidad >75% alcanzándose confluencia más rápidamente y durante mayor número de pases que con colagenasa. Los mejores explantes para cultivos primarios incluyeron el martillo y el annulus. En los cultivos primarios se observaron células de morfología epitelial y otras células de morfología fibroblástica. Las curvas de crecimiento demostraron un promedio de 3,54x105 en los explantes con martillo y annulus en comparación con 2,9 x105 y 3,1 x105 en los que no incluyeron annulus. El MTT mostró una proliferación exponencial proporcional al tiempo de cultivo y a la densidad de la muestra inicial. Las células de la MT fueron negativas para CD45, CD19 y citoqueratina, y positivas para CD90, CD105, CD73, (marcadores mesenquimales), así como para Ki67 y Nestina (marcadores de proliferación e inmadurez). Fueron parcialmente positivas para CD34. La PCR mostró positividad para Nanog, Slug y Nestina. La diferenciación adipocítica se demostró por la presencia de tinción celular positiva para Oil Red O; la diferenciación osteocítica por los depositos de calcio Alizarin red, tinción positiva de fosfatasa alcalina e inmunofluorescencia para osteopontina, y diferenciación condrocítica con inmunofluorescencia positiva a colágeno II. Los estudios histológicos fueron positivos para Ki67, Nestina y Oct-3/4 no así como para Tuj-I. Los nichos de células con características de células madres se encontraron en las áreas de engrosamiento de la membrana timpánica junto al mango del martillo y al annulus. Conclusiones: Nuestros datos confirman la presencia en la membrana timpánica de células progenitoras inmaduras con características de células madre. Las células madre de la MT se sitúan preferentemente en la zona de inserción del mango del martillo, y con menor frecuencia en el annulus. La técnica optima de explante para la obtención de cultivos primarios eficaces debe incluir el martillo y el annulus. Las células obtenidas del cultivo de la MT identificadas en nuestro estudio, tienen capacidad de diferenciación multipotencial a líneas celulares mesodérmicas y presentan un fenotipo inmunológico, compatibles con la definición de células madre mesenquimales aceptada por la ISCT, por lo que podrían emplearse en ensayos de terapia celular. / Goals: The tympanic membrane (TM) has the ability to repair after trauma, infections and other diseases. It is logical to conclude that there is a niche of stem cells with regenerative capacity responsible for tissue repair at this level, but there is little authoritative information about it. Our aim was to confirm the existence and location of these cells within the TM and to try to isolate and characterize them. Methododology: An 8-10 weeks mouse model C57BL/6J from the animal facility of the University of Murcia was used following current regulations. For the TM extraction, various surgical protocols were used including combinations of hammer or and annulus extractions. Different techniques were performed to obtain primary cultures including explants and enzymatic digestion. Cells were seeded at a concentration of 1.25 x 106 in 25cm2 culture flasks with alpha-MEM supplemented by standardized protocols in a stove at 37C with 5% C02. Subcultures, growth curves and quantification of cell proliferation was performed with MTT. A FACSCanto cytometer with a panel of 8 monoclonal Antibodies was used for immunophenotypic characterization and RT-PCR for expression of Nestin, Nanog and Slug. Specific culture media for multipotential differentiation capacity were used. To localize the stem cell niche structured sections of different TM areas were performed using conventional histological staining and immunohistochemical analysis for Ki-67, Nestin, Tuj-I and Oct-3/4. Results: 333 eardrums of 207 mice were extracted, of which we were able to perform 25 explants. Enzymatic digestion produced a low viability and low cell proliferation in direct relation to the exposure time. In contrast explants techniques produced viability greater than 75% with confluence being reached more quickly and for most passes compared with collagenase. The best explants for primary cultures included the hammer and the annulus. In primary cultures cell with epithelial and fibroblast morphology were observed. The growth curves showed an average 3,54x105 cells in explants of hammer and annulus compared to 3.1x105 and 2.9x105 cells in the two explants that didn’t include annulus. The MTT showed proportional exponential proliferation to the time of cultivation and initial cell density. TM cells were negative for CD45, CD19 and cytokeratin, and positive for CD90, CD105, CD73, (mesenchymal markers) and Nestin and Ki67 (proliferation markers and immaturity). They were partially positive to CD34. The PCR was positive for Nanog, Slug and Nestin. Adipocyte differentiation was demonstrated by the presence of cell staining positive for Oil Red O. The osteocytic differentiation by calcium deposits Alizarin red, positive staining of alkaline phosphatase and immunofluorescence for osteopontin. Chondrocyte differentiation by collagen II was positive in immunofluorescence. Histological studies were positive for Ki-67, Nestin and Oct-3/4 and not to Tuj-I. Cells with characteristics of stem cells were found in the areas of thickening of the tympanic membrane near the handle of malleus and the annulus. Conclusions: Our data confirms the presence in the TM of immature progenitor cells with stem cell characteristics. TM stem cells are preferably located in the insertion of the handle of the malleus, and less frequently in the annulus. The optimum explants technique for obtaining efficient primary cultures should include hammer and annulus. The cells obtained from culture of TM identified in our study, have multipotential differentiation capacity to mesodermal cell lines and express a immunological phenotype compatible with the definition of mesenchymal stem cells accepted by the ISTC, so could be used in for cell therapy.

OBJETIVO. Elaborar e implementar una vía clínica de atención al paciente subsidiario de nutrición enteral domiciliaria en el Sistema Murciano de Salud. Tras su puesta en marcha se evalúan las mejoras en la calidad asistencial y en la contención del consumo de dietoterápicos en el Área Sanitaria I Murcia Oeste, así como el impacto del proyecto sobre el gasto regional en estos productos tras la generalización del procedimiento al resto de áreas. MÉTODO. Inicialmente se diseñó la vía y se llevaron a cabo los pasos necesarios para su aplicación, en fase de pilotaje, en el Área de Salud I Murcia Oeste. Posteriormente se procede a realizar un análisis prospectivo y descriptivo de 1.192 peticiones recibidas en la Unidad de Nutrición del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, mediante una serie de indicadores de calidad definidos en la Guía de Nutrición Enteral Domiciliaria publicada por el Ministerio de Sanidad y otros propios. Este estudio se realiza en un periodo inicial (2010), antes de la puesta en marcha del trabajo y en uno final (2013-2014), tras su completa instauración. Por otra parte se estudia la evolución del gasto en nuestra área y a nivel regional en nutrición enteral domiciliaria, antes y después de la implantación del nuevo protocolo de soporte nutricional. RESULTADOS. Existe un bajo cumplimento de ambos tipos de índices de calidad en el grupo de pacientes portadores de nutrición enteral domiciliaria antes de la implementación de la vía clínica que mejora significativamente cuando el control se lleva a cabo desde la unidad de nutrición. Por otro lado, en los años de aplicación del protocolo (2010-2014) se ha conseguido una importante contención acumulada del consumo de dietoterápicos tanto en nuestra área, donde asciende al 240% en envases y a los siete millones de euros en importe, como a nivel regional, con cifras del 126,58% (-244.096) en envases y más de 23 millones de euros en importe. En los dos últimos años se alcanza una meseta en ambas medidas de gasto. CONCLUSIÓN. El perfil de pacientes con soporte nutricional enteral domiciliario descrito en este estudio es similar a otras experiencias, aunque no totalmente comparables por las diferencias en los registros. Se ha revertido el desequilibrio existente en Murcia respecto al Sistema Nacional de Salud en consumo de productos dietoterápicos, y se han obtenido unos resultados sin precedentes en contención de gasto farmacéutico. Además, se ha logrado mejorar la calidad asistencial en este proceso en el Área de Salud I Murcia Oeste, estableciendo un circuito de coordinación centrado en las unidades de nutrición hospitalarias. / OBJECTIVE. To develop and implement a clinical pathway for subsidiary patients to home enteral nutrition support in the ‘Región de Murcia’ Health Service (Spain). After its implementation in a western area (Área I Murcia Oeste), improvements in the quality of care and containment consumption are evaluated, as well as the regional spending of these products after the expansion of the procedure to other areas. METHOD. Initially the pilot phase was designed for the western area of Murcia Health Service, in which the way and the bases for its implementation were established. Then, prospective descriptive analysis of 1,192 received petitions in the Nutrition Unit of the `Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca’ (Murcia) are analized following quality indicators defined in the Home Enteral Nutrition Guide published by the Ministry of Health and others defined for us. This study was performed in two periods, first in 2010, were the design was developed, and secondarily between 2013 and 2014, after complete compliance. Moreover, the changes in home enteral nutrition expenditure of our area and the rest of the region, before and after implementation of the new nutritional support protocol, are studied. RESULTS. Before implementation of the clinical pathway, the group of patients with home enteral nutrition sparsely meet both types of quality rates. These indicators improve significantly when control is carried out by the nutrition unit. In addition, during the application of the protocol (2010-2014) a significant accumulated restriction of containment consumption, both in our area, which reaches 240% in packaging and seven million Euros, as well as regional level, up to 126.58% in containers and tweinty-three million Euros. In the last two years of the study, a plateau is reached in both spending measures. CONCLUSION. The profile of patients with home enteral nutritional support described in this study is similar to other experiences, albeit not entirely comparable because of the differences in the records. The Imbalance of products consumption has been reversed in Murcia compared to the National Health Service, and we have obtained unprecedented results in containment of pharmaceutical expenditure. In addition, quality of care has been improved in the western area of `Región de Murcia’ Health Service, establishing a circuit coordinated by the Hospital Nutrition units.

La otitis media crónica en humanos es una afectación del oído medio que se presenta de distintas formas clínicas, siendo la más frecuente la perforación timpánica. Esta entidad es una solución de continuidad del tímpano y su tratamiento consiste en una intervención denominada miringoplastia. Otro tipo de otitis media crónica es la otitis seromucosa, descrita como la acumulación de contenido mucoso en oído medio. Su tratamiento consiste en el drenaje del moco y la colocación de una prótesis transtimpánica para mantener abierta la perforación (miringotomía) realizada. La gran variedad de materiales utilizados en la miringoplastia es evidencia de que los resultados no son satisfactorios y por ello se mantiene abierta la investigación sobre nuevas alternativas de andamiajes biológicos que pudieran facilitar la cicatrización, como la membrana amniótica. Para ello necesitamos un modelo animal con cronificación de perforación timpánica. En nuestra revisión de la literatura encontramos estudios que conseguían la cronificación de las perforaciones timpánicas mediante la realización de miringotomías con láser y la aplicación de hidrocortisona o mitomicina C, siendo esta última un citostático que se ha utilizado para retrasar la cicatrización en diversas patologías de oftalmología y otorrinolaringología. Debido a que el láser no está disponible habitualmente en los laboratorios de investigación, se decidió desarrollar un modelo de cronicidad de perforación timpánica mediante miringotomías incisionales con mitomicina C. Se ha realizado un ensayo prospectivo analítico con 34 ratas machos Sprague Dawley, con un peso medio de 331.4 gramos, distribuídas en tres grupos: A, B y C. El grupo A formado por 10 ratas a las que se les ha realizado una miringotomía con amputación del mango del martillo y aplicación posterior de mitomicina C (0.4 mg/ml) a los oídos izquierdos (brazo A1) y solución salina (0.9%) a los oídos derechos (brazo A2). El grupo B lo constituían 12 ratas divididas en 4 brazos, dos brazos (B1 y B2) formados por 10 oídos cada uno, a los que se les aplicó mitomicina C antes de las miringotomías sin amputación de los mangos de los martillos (B1) y con amputación (B2). Los 4 oídos restantes de este grupo fueron tratados con solución salina previamente a la miringotomía, dos sin amputación de los mangos de los martillos (B3) y otros dos con amputación (B4). El grupo C formado por 12 ratas estaba estructurado igual que el grupo B, pero se les añadió dexametasona (4mg/ml) en las cuatro primeras revisiones de los brazos C1 y C2 y se aplicó solución salina en las mismas revisiones de los brazos C3 y C4. Los resultados muestran una duración media de las perforaciones en los oídos tratados con solución salina de 8.3 días. Los oídos tratados con mitomicina C tuvieron una duración media de las perforaciones de 18.6 días el grupo A, 15.1 días el grupo B y 112.7 días el grupo C. No obtuvimos diferencia entre realizar miringotomía con amputación del mango del martillo o sin amputación, como tampoco la hubo entre aplicar la mitomicina C antes o después de la miringotomía. Sí hubo diferencia significativa entre las perforaciones tratadas con mitomicina C y las tratadas con solución salina y también entre las tratadas con mitomicina C sola y con mitomicina C asociada a dexametasona. Como la cronicidad de las perforaciones timpánicas en animales se establece a partir de 8 semanas, podemos considerar como modelo murino de perforaciones timpánicas crónicas cuando aplicamos mitomicina C previamente a la miringotomía incisional y asociamos dexametasona. La duración de las perforaciones timpánicas en nuestro modelo, mayor de 3 meses, justificaría promover ensayos para estudiar este método como tratamiento de las otitis seromucosas, sin utilizar drenajes transtimpánicos. / Chronic otitis media in humans is an affectation of the middle ear that occurs in different clinical forms, the most frequent of them is eardrum perforations. This entity is an integral part of the tympanic membrane and its treatment is a procedure called myringoplasty. Another type of chronic otitis media is otitis media with effusion which is described as the accumulation of mucus in the middle ear. Treatment consists on draining the mucus and placing a transtympanic prosthesis to hold the previously made drilling (myringotomy) open. The great variety of materials used in the myringoplasty is evidence that the results are unsatisfactory and therefore research into new alternatives for biological scaffolds that may promote healing, such as amniotic membrane remains open. For this, we need an animal model with chronicity of perforated eardrum. In our review of the previous research, we have found studies that could get the chronicity of the tympanic perforations by conducting laser myringotomy and applying hydrocortisone or mitomycin C, the latter being a cytostatic that has been used to delay healing various diseases in ophthalmology and otolaryngology. Due to the fact that a laser is not routinely available in research laboratories, it was decided to develop a model of chronic tympanic perforation by incisional myringotomy with mitomycin C. We performed a prospective analytical trial with 34 male Sprague Dawley rats with an average weight of 331.4 grams, divided into three groups: A, B and C. Group A consisted of 10 rats which have undergone a myringotomy with amputation of the handle of the hammer and subsequent application of mitomycin C (0.4 mg / ml) to the left ears (subgroup A1) and saline solution (0.9%) to the right ears (subgroup A2). The B group were 12 rats divided into 4 subgroups, two of them (B1 and B2) formed for 10 ears each, which were applied mitomycin C before myringotomies without amputation of the handles of the hammers (B1) and with amputation (B2). The remaining 4 ears of this group were treated with saline prior to myringotomy , two of them without amputation of the handles of the hammers (B3) and the other two with amputation (B4). The C group of 12 rats was structured like the B group, but dexamethasone (4 mg / ml) was added in the four first reviews of the C1 and C2 subgroups and saline in the same revisions of the C3 and C4 subgroups. The results show an average duration of the drillings in the ears treated with saline of 8.3 days. Ears treated with mitomycin C had an average duration drillings of 18.6 days in group A, group B 15.1 days and 112.7 days group C. There was no significant difference between performing myringotomy obtained with or without amputation of the hammer handle, nor was there when appliying mitomycin C before or after myringotomy. But there was a significant difference between those drillings treated with mitomycin C and those treated with saline and also between the drillings treated exclusively with mitomycin C and those treated with mitomycin C together with dexamethasone. As the chronicity of the tympanic perforations in animals is set from 8 weeks, we can consider murine model of chronic tympanic perforations when applying mitomycin C prior to incisional myringotomy and associate dexamethasone. The duration of the tympanic perforations in our model, greater than 3 months, would justify to increase trials to study this method for the treatment of otitis media with effusion without using ear tubes.

La Deficiencia Familiar de CD8 está causada por una mutación puntual (Gly111Ser) en la glicoproteína CD8a que conduce a una ausencia total de la proteína en los linfocitos T y en las células NKs, por lo que proporciona un modelo único para estudiar la función del correceptor CD8 en humanos. Los resultados indican que el correceptor CD8 no sería imprescindible ni para el desarrollo ni para la función efectora de los linfocitos T del linaje citotóxico, aunque el proceso de selección positiva de los linfocitos T restringidos para HLA-I se ve severamente afectado. Puesto que todos los pacientes con Deficiencia Familiar de CD8 pertenecen a la etnia gitana, se investigó la incidencia de la mutación en esta población y en población control (no gitana). La mutación se encuentra restringida a individuos gitanos de la península ibérica, y presenta una frecuencia cromosómica de 1/300. Por otra parte, se analizó el mecanismo por el cual el cambio Gly>Ser conduce a una ausencia total de CD8 en los linfocitos T y en las células NKs de los pacientes. Se diseñaron moléculas quiméricas de las variantes de CD8a nativa (CD8aGly) y mutante (CD8aSer) unidas a un péptido marcador para analizar la expresión de CD8aSer en la membrana de células transfectadas y para estudiar las características bioquímicas de la molécula mutante. Se demostró que la mutación altera la estructura del dominio inmunoglobulina y la biogénesis de CD8aSer (específicamente la capacidad de dimerización, y los procesos de N- y O-glicosilación). La eliminación de la Nglicosilación no conlleva la recuperación de la estructura del dominio IgV-like de CD8aSer ni un aumento de la forma O-glicosilada de la molécula. Sin embargo, la N-glicosilación tiene un papel fundamental en el mecanismo de control de calidad del retículo endoplásmico, puesto que tras el tratamiento con inhibidores de glicosidasas (bloqueo del mecanismo de control de calidad dependiente de N-carbohidratos) la expresión de CD8aSer en su forma madura Oglicosilada aumenta sustancialmente. Con el fin de profundizar en las diferentes enfermedades genéticas que afectan a las células citotóxicas se analizaron diversas inmunodeficiencias primarias relacionadas. Se estudió un caso de deficiencia de HLA-I, otra inmunodeficiencia primaria que afecta a la etapa de reconocimiento antigénico por parte de los linfocitos T CD8+. Se detectó una mutación en TAP2 no descrita anteriormente en una paciente con una clínica muy similar a la que presentan los pacientes con deficiencia de CD8 (infecciones de repetición del tracto respiratorio). La paciente también presenta úlceras en una pierna, y desarrolla un carcinoma epidermoide sobre dichas lesiones. También se estudiaron inmunodeficiencias que afectan a los principales mecanismos efectores de los linfocitos T CD8+ y las células NKs: la secreción de gránulos citotóxicos (Síndrome de Griscelli tipo II-SG- y Síndrome de Chediak-Higashi), y la apoptosis mediada por Fas (Síndrome Linfoproliferativo Autoinmune-ALPS). Se analizó la respuesta inmune en estos pacientes y se realizaron estudios moleculares. Se determinaron los extremos de la deleción en el gen RAB27A, causante de Síndrome de Griscelli tipo II, y se describieron tres nuevas mutaciones en FAS, causantes de ALPS. / Familiar CD8 deficiency is caused by a point mutation (Gly111Ser) at the CD8α glycoprotein leading to total lack of the protein in both T lymphocytes and NK cells, and is a perfect model to investigate CD8 coreceptor role in humans. The results indicate that the CD8 coreceptor would not be necessary either for development or for the effector function of cytotoxic T lymphocyte lineage, although the process of positive selection of T cells restricted for HLA-I was severely affected. Since all patients with Familial CD8 belong to the gypsy population, the incidence of the mutation was investigated in gypsy and non-gypsy (control) individuals. It was found that the mutation is restricted to Gypsy populace in the Iberian Peninsula with a chromosome frequency of 1/300. Furthermore, we examined the mechanism by which the change Gly>Ser leads to a complete absence of CD8 on T cells and in NKs cells of patients. Chimeric molecules of native CD8α (CD8αGly) and mutant (CD8αSer) variants linked to a peptide marker were assembled to analyze the expression of membrane CD8αSer in transfected cells and to study the biochemical characteristics of the mutant molecule. It was shows that the mutation alters the structure of the immunoglobulin domain and the biogenesis CD8αSer (specifically the ability of dimerization, and the processes of N-and O-glycosylation). The elimination of N-glycosylation does not lead to the recovery of the structure of the IgV-like domain of CD8αSer or to the rise of O- glycosylated form of the molecule. However, the N-glycosylation has a key role in quality control mechanism of the endoplasmic reticulum, since after treatment with glycosidases inhibitors (blockade of quality control mechanism dependent on N-carbohydrate) CD8αSer expression in its O-glycosylated mature form is significantly increased. To delve into the different genetic diseases that affect the cytotoxic cells, other related primary immunodeficiencies were analyzed. We studied a case of HLA-I deficiency, another primary immunodeficiency that affects the stage of antigen recognition by CD8 + T cells. A new TAP2 mutation was detected in a patient with clinical manifestations very similar to that shown by patients with CD8 deficiency (recurrent infections of the respiratory tract). The patient had also leg ulcers and developed a squamous cell carcinoma at the previous lesion. Other immunodeficiencies affecting the main effector mechanisms of CD8 + T cells and cells NKS were also studied: the secretion of cytotoxic granules (Griscelli Syndrome Type II-SG-and Chediak-Higashi), and Fas-mediated apoptosis (Autoimmune lymphoproliferative syndrome, ALPS). We analyzed the immune response in these patients and performed molecular studies. A deletion in the RAB27A gene, causing Griscelli syndrome type II, was detected and three new mutations in FAS, causing ALPS, were described.

Tesis por compendio de publicaciones / En la presente tesis doctoral abordamos el estudio de diversos factores tanto extrínsecos como intrínsecos que afectan al proceso de criopreservación espermática. Entre los factores extrínsecos evaluados observamos que un protocolo de descongelación alternativo provoca mejoras en la funcionalidad de los espermatozoides. De igual modo la adición del antioxidante genisteína al medio de descongelación ocasiona una ligera mejoría en la motilidad así como una menor fragmentación de ADN, a la vez que modula el proceso de capacitación espermática. Por otra parte encontramos que la composición de ácidos grasos tanto en espermatozoides como en plasma seminal está estrechamente relacionada con la calidad seminal, antes y después del proceso de congelación-descongelación. La composición en ácidos grasos de la muestra junto con la capacidad antioxidante del plasma seminal pueden ser factores pronósticos del éxito de la criopreservación espermática / In the current study we analyzed several factors related to the success in the freeze-thawing sperm procedure. Extrinsic factors as thawing methodology and addition of the antioxidants substance as genistein to the media had a positive effect on the sperm functionality. Some improvement were detected in motility parameters and decrease the membrane lipid disorder and DNA damage in sperm after freeze thawing process. Finally, we analyzed the relationships between the fatty acid composition of human spermatozoa or seminal fluid and total antioxidant capacity in seminal plasma before freezing with sperm quality before and after freezing-thawing. These factors could be used as predictors of the capacity of sperm cryopreservation.

Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo de esta Tesis Doctoral, titulada “Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius” es caracterizar el envejecimiento de dos especies del género Nothobranchius (N. korthausae y N. rachovii), considerando aspectos hasta ahora no estudiados en este género: las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, concretamente de las distintas especies fosfolipídicas y los ácidos grasos que las integran, y los cambios en el sistema circadiano (CS) con la edad, considerando el ritmo de actividad locomotora como marcador de su funcionamiento. En primer lugar, se estableció una colonia permanente de estas especies en el Laboratorio de Cronobiología de la Universidad de Murcia. De este modo, se pudo disponer de individuos de cada una de las etapas del ciclo vital. Con el objetivo de determinar las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, se procedió en primer lugar a la separación de las mitocondrias del resto de componentes celulares en muestras de individuos de diferentes edades, usando para ello centrifugaciones seriadas en un gradiente de sacarosa, para después proceder a la extracción del lípido total de acuerdo con el método de Folch. A partir del lípido total mitocondrial, se separaron y cuantificaron las distintas fracciones fosfolipídicas mediante cromatografía de capa fina y se obtuvieron los perfiles de ácidos grasos de cada una de ellas mediante transmetilación catalizada por ácido y cromatografía gas-líquido. El funcionamiento del CS de los peces se midió a través del estudio del ritmo de actividad locomotora. Para ello, se situaron individuos de diferentes edades en cámaras específicamente diseñadas. Estas cámaras estaban dotadas de fotocélulas que registraban constantemente la actividad de los peces y enviaban la información a una placa de registro en un sistema informático. De este modo, se obtenían series temporales de datos que eran analizadas mediante un software específico para ritmos circadianos así como métodos analíticos desarrollados para esta Tesis Doctoral. Las dos especies de Nothobranchius estudiadas mostraron cambios morfológicos fácilmente identificables a simple vista, como una pérdida patente de coloración, pérdida de peso y curvatura de la espina dorsal. A nivel bioquímico, los peces mostraron membranas mitocondriales altamente insaturadas, lo cual está relacionado con una alta tasa metabólica y alto estrés oxidativo y es característico de especies que, como las dos estudiadas, presentan fases de crecimiento explosivo. Unas membranas mitocondriales altamente insaturadas están también relacionadas con un ciclo vital corto, debido a la alta tasa de oxidación de las moléculas mitocondriales, principalmente los lípidos de membrana, que desemboca en disfunción y apoptosis. Las membranas mitocondriales podrían ser los marcapasos de toda una serie de procesos que llevan al deterioro progresivo e irreversible que caracteriza al envejecimiento. Estos procesos afectarían a la funcionalidad de los sistemas fisiológicos del animal y aumentaría la fragilidad del individuo, que se mostraría incapaz de responder a estreses inesperados del ambiente. Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto que el CS de Nothobranchius es severamente afectado con la edad y su deterioro podría ser uno de los factores desencadenantes de las últimas etapas del proceso de envejecimiento. Esta Tesis Doctoral pone de manifiesto la idoneidad de la utilización de especies del género Nothobranchius como modelos para estudios de envejecimiento dadas sus características como un reducido ciclo vital, el bajo costo para su cría y mantenimiento en el laboratorio y por presentar un envejecimiento gradual fácil de caracterizar y extrapolable a humanos. Estas especies se han mostrado además útiles para testar el uso de agentes cronobióticos como la melatonina, abriendo todo un abanico de posibilidades para estudiar en el futuro cercano posibles tratamientos frente al envejecimiento. / The purpose of this Doctoral Thesis, entitled “Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius”, is to characterise the ageing process of two different species of the genus Nothobranchius (N. korthausae and N. rachovii) considering novel aspects never studied before in this genus: age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, particularly in the different phospholipid classes and fatty acids which compose them, and the age-related changes in the circadian system, using the locomotor activity rhythm as a circadian system status indicator. Firstly, a permanent colony of these species was established in the Chronobiology Laboratory of the University of Murcia. Thereby it was possible to have individuals of each stage of the life cycle. In order to determine the age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, the first step was to separate the mitochondria from other cellular components in samples obtained from fish of different ages, using serial centrifugations in a sucrose gradient. And the second step was proceeding with the total lipid extraction according to the Folch method. The different phospholipidic fractions were separated from the mitochondrial total lipid and quantified by thin-layer chromatography, and the fatty acid profile was obtained of each one by acid-catalysed transmethylation and gas-liquid chromatography. Fish CS functioning was measured by the study of locomotor activity rhythm. For that, individuals of different ages were placed in specifically designed chambers. These chambers were equipped by photoelectric cells which constantly register the fish activity and send the information to an informatics system. Temporal series data were obtained and analysed by a specific software for circadian rhythms as well as by analytic methods developed for this Doctoral Thesis. The two Nothobranchius species studied showed easily recognizable morphological changes, as colouration and body mass loss and spine curvature with age. At a biochemical level, fish showed highly unsaturated mitochondrial membranes, which is associated with high metabolic rate and oxidative stress, being characteristic of species that show explosive growth stages, like both species used. Highly unsaturated mitochondrial membranes are also related to a short lifespan, due to the high oxidation rate of mitochondrial molecules, mainly membrane lipids, which results in dysfunction and apoptosis. The mitochondrial membranes could be the pacemaker of a number of processes leading to a progressive and irreversible impairment which characterise the aging process. These processes affect animal physiological systems functionality and increase the individual fragility, showing the individual unable to respond to unexpected environmental stresses. Results from the present work show that Nothobranchius CS is strongly affected by age and its impairment could be one of the trigger factors of the last stages in the ageing process. This Doctoral Thesis shows the suitability of using Nothobranchius species as ageing models because of their characteristics as short lifespan, low-cost breeding and maintenance in the laboratory and by showing a progressive ageing easy to characterise and to extrapolate to humans. Also, these species have shown their potential to test the use of chronobiotic agents as melatonin, bringing us new possibilities to study, in the near future, possible treatments against ageing.

Tesis por compendio de publicaciones / Los opiáceos, como la morfina, son unos potentes analgésicos que se usan para tratar diversas formas de dolor agudo y crónico. Sin embargo, el uso crónico de opiáceos produce cambios neuroadaptativos a nivel cerebral que conllevan efectos indeseables, como la adicción. La creciente evidencia implica a varios mecanismos de regulación génica (incluyendo epigenéticos, moleculares, celulares y a nivel de circuitos neuronales) en los cambios que las drogas de abuso provocan en el cerebro, siendo el conocimiento de éstos una posible estrategia terapéutica para el tratamiento de la adicción. Hemos centrado el presente estudio en varios neurocircuitos implicados en la adicción a opiáceos: i) el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HPA) y el sistema extrahipotalámico del estrés, ii) el sistema dopaminérgico de recompensa, y iii) circuitos relacionados con las memorias aversivas. 1. El primer objetivo consistió en examinar el papel de los glucocorticoides (GCs) en la expresión de ΔFosB en poblaciones neuronales específicas del sistema cerebral del estrés durante la dependencia de morfina. Para ello, la expresión de ΔFosB se cuantificó en ratas control (sham) y adrenalectomizadas (ADX) que desarrollaron dependencia de morfina. 2. Segundo objetivo: Dada la importante implicación de la transmisión dopaminérgica en los desórdenes adictivos, hemos centrado esta parte de nuestro estudio en identificar los marcadores dopaminérgicos que resultan alterados con la administración aguda y crónica de morfina, así como durante el síndrome de abstinencia inducido por naloxona, tanto en el área tegmental ventral (VTA) como el núcleo accumbens (NAc). Para ello, hemos determinado: i) la expresión del miR-133b y Agonauta 2 (Ago2) en el VTA; ii) el contenido de tirosina hidroxilasa (TH) y su actividad; iii) la actividad dopaminérgica (recambio de DA y activación de TH) en el sistema mesolímbico de ratas tratadas con morfina. 3. El tercer objetivo fue estudiar: i) posibles cambios en los niveles de mRNA y proteína de Nurr1 y Pitx3, así como la expresión de Ago2 y de TH en regiones específicas del sistema mesolímbico; ii) actividad dopaminérgica en el NAc; iii) co-localización cuantitativa de Nurr1 y Pitx3 en el VTA en las neuronas que expresan TH, iv) cambios en la plasticidad de subpoblaciones neuronales dopaminérgicas del VTA en respuesta a morfina aguda, crónica o durante el síndrome de abstinencia. 4. Cuarto objetivo: Los efectos del síndrome de abstinencia a morfina sobre la expresión de Nurr1 y Pitx3 nos llevó a investigar la expresión de otros genes y proteínas que están implicadas en la regulación de la función dopaminérgica, algunos de los cuáles son dianas de Nurr1 y Pitx3. Para ello, las ratas recibieron morfina de forma aguda o crónica. Otro grupo fue sometido a un síndrome de abstinencia a morfina. Se estudió: i) la expresión del transportador de dopamina (Dat)-DAT, transportador vesicular de monoaminas 2 (Vmat2)-VMAT2, receptor de DA tipo 2 (Drd2)-DRD2 y DRD1 en VTA/NAc; ii) la co-localización de Nurr1 y/o Pitx3 con neuronas que expresan TH en el VTA, así como el porcentaje de neuronas dopaminérgicas que expresan Nurr1 y Pitx3; iii) la posible correlación entre la expresión de Nurr1/Pitx3 y los niveles de los diferentes marcadores dopaminérgicos. 5. Quinto objetivo: Por otra parte, cada día es más evidente que las drogas de abuso producen alteraciones en el sistema inmune del CNS. Por ello, se ha propuesto que los astrocitos contribuirían a la plasticidad sináptica que se produce durante el desarrollo de la adicción mediante la síntesis y liberación de sustancias, como las citoquinas. Dado que pleiotrofina (PTN) y midkina (MK) tienen los mismos efectos que las neurotrofinas y que los astrocitos pueden liberar MK y PTN después de diversos estímulos, nuestro siguiente objetivo fue: i) estudiar posibles cambios en la expresión de PTN, MK, su receptor, así como alteraciones en sus vías de señalización intracelular en respuesta a morfina aguda, crónica o durante el síndrome de abstinencia en el VTA y NAc; ii) la posible activación de los astrocitos durante los tratamientos descritos; iii) identificar las subpoblaciones celulares que producen y secretan PTN y/o MK. Las conclusiones de nuestro trabajo son: 1. El presente trabajo demuestra que los GCs están críticamente involucrados en la acumulación de FosB/ΔFosB en el sistema cerebral del estrés durante la administración crónica de morfina, lo que resultaría en cambios duraderos en los patrones de expresión génica en las áreas relacionadas con el estrés. 2. Aunque no hallamos cambios significativos en los niveles de miR-133b en el VTA, proponemos el papel de Ago2 en combinación con otros miRs en la regulación de la estabilidad y/o traducción del mRNA de TH en respuesta a la administración crónica de morfina y al síndrome de abstinencia a opiáceos. Nuestros resultados sugieren un papel importante de Nurr1 y Pitx3 en los cambios en la expresión génica durante la dependencia y abstinencia a opiáceos, y que la regulación epigenética de TH puede estar asociada a los mecanismos moleculares que contribuyen a los cambios en la función dopaminérgica inducida por los opiáceos. 3. La dependencia de morfina y el síndrome de abstinencia a la misma están asociados con alteraciones de la mayoría de los marcadores dopaminérgicos (DAT, VMAT2, DRD2) en la vía mesolímbica de recompensa, que se correlacionan con alteraciones en los factores de transcripción encargados del mantenimiento de las neuronas dopaminérgicas (Nurr1 y Pitx3). 4. Debido a la activación glial en el VTA durante la administración aguda y crónica de morfina, junto con el incremento de los niveles de mRNA de MK y PTN, proponemos la importancia de estas citoquinas al mediar, al menos en parte, las adaptaciones tróficas que se observan durante el fenómeno de adicción. / Opiate drugs, such as morphine, are a class of powerful analgesics that are used for treating many forms of acute and chronic pain. However, chronic use of opiates causes brain neuroadaptations that lead to undesirable effects, namely opiate addiction that is a significant medical and public health problem. Increasing evidence implicates various mechanisms of gene regulation (including epigenetic, molecular, cellular and circuit level effects) in the changes that drugs of abuse induce in the brain, indicating a potential therapeutic strategy for addiction therapy. We have focused the present study on several neurocircuits involved in opiate addiction: i) the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and extrahypothalamic stress systems; ii) the dopaminergic reward pathways; and iii) aversive memories-related neuronal circuits. 1. The first objective of the present study was designed after considering the above. We examined the role of glucocorticoids (GCs) in regulation of ΔFosB expression in specific populations of the brain stress system during morphine dependence. For that, expression of ΔFosB was measured in control (sham-operated) and adrenalectomized (ADX) rats that were made dependent on morphine. 2. Second objective: Given the important implications of dopamine (DA) neurotransmission in addiction disorders, we have focused this part of our study on identifying the DA markers that are altered in association with acute and chronic morphine exposure, as well as with morphine withdrawal in the ventral tegmental area (VTA) and nucleus accumbens [NAc(medial shell)]. For that, we have determined i) the expression of miR-133b and Argonaute (Ago2) in VTA; ii) tyrosine hydroxylase (TH) content and activity; and iii) dopaminergic activity (DA turnover and TH activation) in the mesolimbic system. 3. The third objective was to study: i) Nurr1 and Pitx3 mRNAs and proteins changes as well as the expression of Ago2 and TH mRNA and protein levels in specific region of the mesolimbic system; ii) dopaminergic activity in the NAc; iii) quantitative co-localization of Nurr1 and Pitx3 in the VTA TH-positive neurons; and iv) the plasticity changes in VTA DA neurons subpopulations in response to morphine, morphine dependence and morphine withdrawal. 4. Fourth Objective: The long-lasting effects of opiate withdrawal on Nurr1 and Pitx3 expression prompted us to investigate expression of other genes and proteins that are involved in the regulation of DA function, some of which represent putative targets of Nurr1 and Pitx3. For that, rats were exposed to acute and chronic morphine administration as well as to morphine withdrawal and analized: i) the expression of dopamine transporter (Dat)-DAT, vesicular monoamine transporter 2 (Vmat2)-VMAT2, dopamine receptor 2 (Drd2)-DRD2 and DRD1 in VTA/NAc(shell), dysfunction of which is causally linked to addiction; ii) the co-localization of Nurr1 and/or Pitx3 with TH-positive neurons in the VTA as well as the percentage of DA neurons expressing Nurr1 and Pitx3; and iii) the possible correlation between Nurr1/Pitx3 expression and DA markers levels in the VTA and/or NAc(shell). 5. Fifth Objective: There is increasing evidence that drugs of abuse produce alterations in CNS immunology. Thus, it has been proposed that astrocytes contribute to the synaptic plasticity during the development of drug addiction by the synthesis and release of substances, such as cytokines. The present study was focused on: i) identifying whether the expression of pleiotrophin (PTN), midkine (MK), receptor protein tyrosine phosphatase β/ζ (RPTPβ/ζ) and their intracellular signaling pathways are altered in association with acute and chronic morphine exposure as well as with morphine withdrawal in the VTA and NAc; ii) the possible activation of astrocytes; iii) identify those cell subpopulations that produced and secreted PTN and/or MK and those that expressed RPTPβ/ζ in response to morphine administration or morphine withdrawal. The conclusions from the present work are: 1. Present work provides evidence that GCs are critically involved in FosB/ΔFosB accumulation in the brain stress system after chronic morphine exposure, which might result in lasting changes of gene expression pattern in stress-related areas. 2. Although no significant changes of miR-133b levels are detected in the VTA, a role for Ago2 and specific miRs is hypothesized in regulating TH mRNA stability and/or translation in response to chronic morphine administration and naloxone-induced morphine withdrawal. Moreover, morphine dependence and withdrawal are associated with consistent alteration of transcription factors involved in the maintenance of dopaminergic neurons in the mesolimbic drug-reward pathway. 3. Morphine dependence and withdrawal are associated with consistent alteration of most of the DA markers (DAT, VMAT2, DRD2) in the mesolimbic drug-reward pathway which correlated with alteration of transcription factors involved in the maintenance of dopaminergic neurons (Nurr1 and Pitx3). Moeover, the correlations between DA markers and Nurr1/Pitx3 add evidence onto previous results. 4. Because of the glial activation in the VTA during acute and chronic morphine administration besides the enhancement in MK and PTN mRNAs, we propose a role for these cytokines in mediating, at least in part, the trophic adaptations that are observed during drug addiction.

INTRODUCCIÓN La zona pelúcida (ZP) es una matriz traslúcida, glicoproteica y acelular que rodea los ovocitos de los mamíferos implicada en importantes procesos durante la fecundación. Se ha considerado que la ZP estaba constituida por tres glicoproteínas (ZP1, ZP2 y ZP3) teniendo en cuenta estudios realizados en el ratón. Sin embargo, estudios posteriores demostraron que la ZP de cerda y de vaca también presentaba tres glicoproteínas, pero no estando presente en estos casos ZP1, siendo la composición ZP2, ZP3 y ZP4. Además, en estos últimos años se ha descrito que diferentes especies presentan cuatro glicoproteínas en su ZP, como es el caso de la mujer, la rata, el macaco coronado, el hámster, la coneja y la gata. OBJETIVOS: En la presente Tesis Doctoral ahondamos en la composición de la ZP en varios grupos de mamíferos: marsupiales, roedores y carnívoros. Estudiamos la evolución de los distintos genes y se analiza el comportamiento de la ZP de varias especies con diferente composición proteica mediante estudios funcionales como la fecundación in vitro (FIV) y la digestión de la ZP mediante proteasas. METODOLOGÍA: En este estudio realizamos un análisis in silico de las distintas especies de marsupiales y carnívoros disponibles en distintas bases de datos (Ensembl y Pubmed); así como un análisis molecular en un marsupial australiano (wallaby de Bennett y koala), un marsupial sudamericano (zarigüeya común), tres roedores (Mastomys coucha, Mus mattheyi y Mus pahari) y dos carnívoros (perro y zorro). Para ello, se aisló ARNm de ovarios de las distintas especies con el que se sintetizó ADNc y en otros casos se obtuvo ADNg a partir de tejidos. El ADN se empleó en las amplificaciones por PCR usando cebadores diseñados a partir de las secuencias de las distintas ZPs. A continuación, realizamos análisis filogenéticos a partir de alineamientos múltiples de las secuencias empleando SEAVIEW. El modelo de evolución se eligió empleando iMOLDETEST y el árbol se construyó usando el método de máxima verosimilitud mediante el programa PHYLM. Por otro lado, se realizó un análisis por proteómica en los roedores analizados para determinar la composición proteica de su ZP. Por último, se realizaron análisis funcionales determinando el tiempo de digestión completa de la ZP usando tripsina en roedores y se realizan ensayos de FIV homólogos y heterólogos empleando roedores de diferentes especies. RESULTADOS Y CONCLUSIONES: Marsupiales: La composición de la ZP es diferente en los marsupiales australianos y sudamericanos, pudiendo estar formada por 4 a 6 glicoproteínas. En el orden Didelphimorphia de los marsupiales sudamericanos, la ZP podría estar formada por ZP1, ZP2, ZP3-b y ZP3-c y en los marsupiales australianos podría estar formada por ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b, ZP3-c y ZP4. Detectándose pseudogenización del gen ZP4 en los marsupiales del orden Didelphimorphia además de en dos xenartros, el armadillo y el perezoso. Roedores: En el ovario de Mastomys coucha, Mus mattheyi y Mus pahari se expresa el ARNm de ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4 demostrándose la presencia de estas proteínas mediante análisis proteómico. La pseudogenización de ZP4 en la subfamilia Murinae se estima que ocurrió hace 5-7 millones de años, afectando únicamente al subgénero Mus. La ZP de ratonas con 4 glicoproteínas se digiere antes que la ZP de ratonas con 3 glicoproteínas y los espermatozoides de ratones con 3 proteínas en su ZP pueden fecundar el ovocito de ratones con 4 proteínas en su ZP. Carnívoros: En el ovario de la hurona se expresa el ARNm de ZP1, ZP2, ZP3 y ZP4, mientras que en el ovario de la zorra se expresa el ARNm de ZP2, ZP3 y ZP4, estando ZP1 pseudogenizado. La pseudogenización de ZP1 parece afectar únicamente a la familia Canidae. / INTRODUCTION: The zona pellucida (ZP), a translucent, glycoproteic and acellular matrix that surrounds the mammalian oocytes, is involved in important steps during fertilization. Based on studies in mouse, it was long considered that the ZP is formed of three glycoproteins (ZP1, ZP2 and ZP3). However, later studies demonstrated that pig and cow ZP is also formed of three glycoproteins, although ZP1 is not present in these cases, the composition being ZP2, ZP3 and ZP4. Furthermore, in more recent years other species have been found to contain four glycoproteins in their ZP, e.g. human, bonnet macaque, hamster, rabbit and cat. OBJECTIVES: In the present thesis we take a deep look at the ZP composition in placental mammals (carnivores and rodents) and in metatherian mammals (marsupials). We also study the evolution of the different ZP genes and analyze the ZP behaviour in several species of different protein composition by means of functional studies, such as in vitro fertilization (IVF) and ZP digestion with proteases. METHODS: An in silico analysis was made of the marsupial and carnivore species for which information is available in the databases Ensembl and Pubmed. In addition we made a molecular analysis of two Australasian marsupials (Bennett’s wallaby and koala), one South American marsupial (Common opossum), three mice (Mastomys coucha, Mus mattheyi and Mus pahari) and two carnivores (dog and fox). For this, mRNA was isolated from the ovaries and cDNA was synthesized; in other cases, gDNA was obtained from tissues. The DNA was used in PCR amplifications and primers were designed according to the different ZP sequences. Next, a phylogenetic analysis was made using SEAVIEW from multiple alignments of the obtained sequences. The evolution model was chosen using iMOLDETEST and the phylogenetic tree was constructed using the maximum likelihood method with the PHYLM program. In addition, a proteomic analysis was conducted in the studied mice to determine the protein composition of their ZP. Finally, functional analyses were made, calculating ZP digestion time using tripsine and doing homologous and heterologous IVF analysis using different mice species. RESULTS AND CONCLUSIONS: Marsupials: ZP composition differs between Australasian and South American marsupials; since it may be formed of four to six glycoproteins. In the South American order Didelphimorphia, the ZP is probably formed of four glycoproteins (ZP1, ZP2, ZP3-b and ZP3-c), whilst in Australasian marsupials the ZP is probably formed of six proteins (ZP1, ZP2, ZP3-a, ZP3-b, ZP3-c and ZP4). A ZP4 pseudogenization was detected in the Didelphimorphia order of marsupials and also in two xenarthrans, the armadillo and the tree sloth. Rodents: In the ovaries of Mastomys coucha, Mus mattheyi and Mus pahari, the mRNA of ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed and the presence of these proteins was demonstrated by proteomic analysis. The pseudogenization of ZP4 in the Murinae subfamily is estimated to date from around 5-7 million years, affecting only the subgenus Mus. The digestion of ZP from mice with 4 glycoproteins occurs before than the digestion from mice with 3 glycoproteins. Furthermore, mice with 3 ZP proteins can fertilize mice with 4 ZP proteins. Carnivores: The mRNA of ZP1, ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed in ferret ovaries, whilst in fox the mRNA of ZP2, ZP3 and ZP4 is expressed, ZP1 being a pseudogene. Such ZP1 pseudogenization seems to only affect the Canidae family.

Introducción: La zona pelúcida (ZP) es una matriz extracelular transparente que rodea la membrana plasmática de los ovocitos de los mamíferos. Para que se produzca la implantación, es necesaria la completa expansión del blastocisto, acompañado por el afinamiento de la ZP y la eclosión del pre-embrión favorecida por la disolución de la ZP. Sin embargo, este proceso no siempre sucede, y si el blastocisto no puede salir de la ZP no será posible que se produzca la implantación. Durante las dos décadas pasadas, se han utilizado diferentes métodos para la manipulación de la ZP en mujeres de edad avanzada (Balaban et al., 2002). Una revisión sistemática (Das et al., 2009), revela que la Eclosión asistida (EA), puede incrementar las tasas de éxito en mujeres con fallo de implantación y probablemente en edad avanzada, pero se debe analizar con más profundidad los datos obtenidos respecto a las tasas de gestación múltiple. Parece ser que, tanto la edad avanzada como el cultivo in vitro de los pre-embriones pueden causar un endurecimiento de la ZP haciendo necesaria la aplicación de la técnica de EA para facilitar la eclosión de los blastocistos, para aumentar las tasas de gestación e implantación (Magli et al., 1998). Objetivos: Objetivo principal: analizar si la aplicación del afinamiento de la zona pelúcida (AZPL) es una herramienta útil para aumentar la tasa de gestación en pacientes que se sometan a un TRA, en ciclos de FIV/ICSI, según edad de la paciente (38-39 años y ≥ a 40 años) y según grosor de la ZP (< 15µm y ≥ 15µm). Objetivos secundarios: analizar si la aplicación del AZPL es una herramienta útil para aumentar las tasas de implantación y RNV y disminuir la tasa de aborto, RNV en pacientes que se sometan a TRA, en ciclos de FIV/ICSI, (38-39 años y ≥ 40 años) y según grosor de la ZP (< 15µm y ≥ 15µm). Materiales y Métodos: Este estudio retrospectivo se realizó en IVI-Murcia, entre Marzo del 2006 y Diciembre del 2012. Consta de 308 ciclos que fueron distribuidos, de forma aleatoria, en 2 grupos según se realizara o no AZPL: A: 154 ciclos en los que no se realizó el AZPL (No-AZPL) a los pre-embriones. B: 154 ciclos en los que sí se les realizó el AZPL (AZPL) a los pre-embriones. Estos 2 grupos se subdividieron, según edad, en: 38-39 años y ≥ 40 años: -Pacientes con 38-39 años, a cuyos pre-embriones no se les realizó el AZPL: No-AZPL 38-39 años. -Pacientes con 38-39 años, a los que sí que se les realizó AZPL: AZPL 38-39 años. -Pacientes con edad ≥ 40 años sin AZPL: No-AZPL ≥ 40 años. -Pacientes con edad ≥ 40 años con AZPL: AZPL ≥ 40 años. El grosor de la ZP fue analizado y dividido en: A: pre-embriones cuyo grosor medio de la ZP fuera ≥15µm. B: pre-embriones con diámetro medio de la ZP <15µm. A su vez, estos grupos fueron analizados, evaluando el impacto del AZPL, según la edad: 38-39 años y ≥ 40 años. -Pacientes con 38-39 años con pre-embriones con: ZP < 15µm y ZP ≥ 15µm. -Pacientes ≥ 40 años con pre-embriones con: ZP < 15µm ZP ≥ 15µm. A cada pre-embrión a transferir, en D3, se le realizó un AZP utilizando el sistema Octax láser shot (MTG-Octax Alemania), cuando le correspondía el AZPL. El análisis estadístico se realizó con el test de Fisher. Los resultados se consideraron estadísticamente significativos cuando se obtuvo un valor de P <0.05. Resultados globales de AZPL y No-AZPL en mujeres ≥ 38 años Los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar en el grupo control (No-AZPL) son: 32,1%, 20,8%, 20,0%, 26,7% y 5,7 respectivamente, mientras que los resultados en el grupo de las pacientes 38-39 años con AZPL, en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son:46,9%, 35,0%, 26,7%, 42,7 y 17,7% respectivamente, siendo estadísticamente significativos los resultados de gestación y tasa de RNV respecto al grupo control (p<0,05) En las pacientes con edades de 40 años o más que pertenecen al grupo No-AZPL, los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son 24,4%, 16,4%, 45,4%, 15,5% y 9,1% respectivamente sin haber diferencias estadísticamente significativas en ninguna de las variables. Los resultados en pacientes con edades de 40 o más años, con AZPL, las tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son 22,4%, 14,0%, 46,2%, 13,8% y 7,7% respectivamente, sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas en ninguna dalas variables. Resultados globales de AZPL y No-AZPL con ZP ≥ 15µm Los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar en el grupo de pacientes No-AZPL con 38-39 años y ZP ≥ 15µm son: 30,2%, 21,5%, 21,7%, 26,3% y 13,0% respectivamente sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas. Mientras que en el grupo de pacientes que pertenecían al grupo estudio (AZPL 38-39 años), las tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y tasa de gestación gemelar son 50,8%, 38,8%, 20,0%, 50,8% y 20,0% respectivamente existiendo diferencias estadísticamente significativas en las tasas de gestación, implantación y RNV a favor del grupo estudio (p<0,05). Respecto a las pacientes con 40 años o más en el grupo No-AZPL con ZP ≥ 15µm, los resultados en cuanto a tasas de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son: 40,0%, 23,8%, 40,0%, 28,0 y 0% respectivamente sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas. Los resultados de las pacientes con 40 años o más años, en cuanto a tasa de gestación, implantación, aborto, RNV y gestación gemelar son: 23,1%, 15,6%, 55,5%, 12,8% y 11,1% respectivamente sin haber diferencias estadísticamente significativos. Conclusiones: En pacientes de 38-39 años: Las tasas de gestación e implantación obtenidas son significativamente superiores (p<0,05) cuando se realiza el AZPL, en ovocitos frescos cuyas ZPs son ≥15µm, al compararlas con pacientes en las que no se ha aplicado el AZPL a sus pre-embriones antes de la transferencia. La tasa de aborto no se ve afectada cuando se aplica el AZPL a los pre-embriones antes de la transferencia. La tasa de RNV obtenida es significativamente superior (p<0,05) cuando se realiza el AZPL, en ovocitos frescos cuyas ZPs son ≥ 15µm al compararlas con pacientes en las que no se ha aplicado el AZPL a sus pre-embriones antes de la transferencia. No hay diferencias estadísticamente significativas en las tasas de gestación gemelar obtenidas en los subgrupos de este grupo de edad. / Introduction: The zona pellucida (ZP) is a transparent extracellular matrix surrounding the oocyte plasma membrane of mammals. In order for implantation to occur, the full expansion of the blastocyst, accompanied by thinning of the ZP and the emergence of pre-embryo favored by the dissolution of the ZP is necessary. However, this process does not always happen, and if the blastocyst can not leave the ZP, it would not be possible for the implantation to occur. Over the last two decades, different methods have been used for handling the ZP in old women (Balaban et al., 2002). A systematic review (Das et al., 2009) reveals that assisted hatching (AH), can increase success rates in women with implantation failure and probably old women, but the data of rates of multiple pregnancy must be analysed more deeply. It seems that the advanced age and the in vitro culture of the pre-embryos can cause hardening of the ZP, so making the application of Assisted hatching (AH) technique to facilitate the hatching of blastocysts necessary, and then to increase pregnancy rates and implantation (Magli et al., 1998). Objectives: Main objective: to analyse whether the application of laser assisted zona thinning (LAZT) is a useful tool to increase the pregnancy rate in patients who undergo in ART, in cycles of IVF/ICSI, according to patient age (38- 39 years and ≥ 40 years) and thickness according to ZP (<15 µm and ≥ 15 µm). Secondary objectives: to analyse whether the application of AZPL is a useful tool to increase implantation rates, LB in patients undergoing ART, and decrease miscarriages rates in cycles of IVF / ICSI (38-39 years and ≥ 40 years) and according ZP thickness (<15 µm and ≥ 15 µm). Materials and Methods: This retrospective study was performed in IVI-Murcia, between March 2006 and December 2012. It consists of studying 308 cycles which were distributed randomly in 2 groups as placed or not LAZT: A: 154 cycles in which the LAZT (Non- LAZT) is not performed on pre-embryos. B: 154 cycles in those that underwent the LAZT on pre-embryos. These two groups were subdivided according to age, in: 38-39 years rank and ≥ 40 years rank: • Patients with 38-39 years, whose pre-embryos underwent the LAZT: No- LAZT 38-39 years. • Patients with 38-39 years, who underwent yes LAZT: LAZT 38-39 years. • Patients with age ≥ 40 years without LAZT: No- LAZT ≥ 40 years. • Patients aged ≥ 40 years with LAZT: LAZT ≥ 40 years. The thickness of the ZP was analysed and divided into: A: pre-embryos whose average thickness was ≥ 15μm ZP. B: pre-embryos ZP average diameter of <15µm. And in turn, these groups were analysed, evaluating the impact of LAZT, according to age: 38-39 years and ≥ 40 years. • Patients with 38-39 years with pre-embryos: ZP <15µm and 15µm ≥ ZP. • Patients ≥ 40 years with pre-embryos: ZP <15µm and ZP ≥ 15µm. To each pre-embryo transfer, in D3, was performed a LAZT OCTAX system using laser shot (MTG-OCTAX Germany), when belonging to LAZT. Statistical analysis was performed using Fisher's test. The results were considered statistically significant when P <0.05 was obtained. Overall results of LAZT and Non- LAZT in women ≥ 38 years Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 32,0%, 20,8%, 20,0%, 26,7% and 5,7% respectively in patients belonging to LAZT in patients with 38-39 years. And in patients belonging to LAZT 38-39 years the results in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 46,9%, 35,0%, 26,7%, 42,7% and 17,7% respectively. There are statistically significant in pregnancy and LB rate (p<0.05). In patients No- LAZT ≥ 40 years, the results are in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and Twins Pregnancy rate: 24,4%, 16,4%, 45,4%, 15,5% and 9,1% respectively. In patients LAZT ≥ 40 years, the results are in pregnancy rate, implantation rate, abortion rate, LB rate and Twins Pregnancy rate: 22,4%, 14,0%, 46,2%, 13,8% and 7,7% respectively (p>0,05). Overall results of LAZT and Non- LAZT in women ≥ 38 years with ZP ≥ 15µm Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 30,2%, 21,5%, 21,7%, 26,3% and 13,0% respectively in patients belonging to No-LAZT in patients with 38-39 years and ZP ≥ 15µm. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 50,8%, 38,8%, 20,0%, 50,8% and 20,0% respectively in patients belonging to LAZT with 38-39 years and ZP ≥ 15µm.There are results statistically significant in pregnancy, implantation and LB rate. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 40,0%, 23,8%, 40,0%, 28,0% and 0% respectively in patients belonging to No-LAZT with ≥ 40 years and ZP ≥ 15µm. Pregnancy rate, implantation rate, miscarriage rate, LB rate and twins pregnancy rate are: 23,1%, 15,6%, 55,5%, 12,8% and 11,1% respectively in patients belonging to LAZT with ≥ 40 years and ZP ≥ 15µm. No statistically significant differences in this group. Conclusions: In patients from 38 to 39 years old: The pregnancy and implantation rates obtained are significantly higher (p <0.05) when the LAZT is done in fresh oocytes which are ≥15μm ZPS, when it is compared with patients that have not been applied LAZT their pre-embryos before transfer. The abortion rate is not affected when the LAZT is applied to pre-embryos before embryo transfer. LB obtained rate is significantly higher (p <0.05) when the LAZT is performed in fresh oocytes which are ZPs ≥ 15 μm as compared to patients where it has not been applied LAZT their pre-embryos prior to transfer. No statistically significant differences in twin pregnancy rates are obtained from subgroups of this age group.

El objetivo del estudio fue evaluar la influencia del sobrepeso y obesidad en las gestantes con diabetes gestacional, en su perfil de ácidos grasos en suero materno y en el aporte transplacentario al feto, comparándolo con gestantes normopeso con y sin diabetes gestacional. El sobrepeso y la obesidad en gestantes con DMG no modificó la concentración total de ácidos grasos o sus porcentajes, en suero materno ni en el tejido placentario. Sin embargo, en suero de vena umbilical la DMG con o sin obesidad disminuyó la concentración total de ácidos grasos fetales y los porcentajes de los ácidos grasos esenciales y condicionalmente esenciales. Como conclusión podemos afirmar que la diabetes gestacional con o sin obesidad disminuye los niveles de ácidos grasos poliinsaturados en sangre de cordón, lo cual puede ser debido a una alteración en el transporte placentario de estos nutrientes. / The aim of the study was to evaluate the influence of overweight and obesity in pregnant women with gestational diabetes in their fatty acid profile in maternal serum and fetal transplacental intake, compared with normal weight pregnant women with and without gestational diabetes Overweight and obesity in pregnant women with gestational diabetes mellitus did not alter the total concentration of fatty acids or their percentage in maternal serum or placental tissue. However, in the umbilical vein serum with or without obesity gestational diabetes mellitus decreased total fatty acid concentration and the percentage of fetal essential fatty acids and conditionally essential. We can affirm that gestational diabetes mellitus, with or without overweight or obesity, reduces polyunsaturated fatty acids levels in cord blood, which might be due to impaired placental transport of these nutrients.