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Factores que afectan al proceso de criopreservación de los espermatozoides humanos

Martínez Soto, Juan Carlos 23 May 2013 (has links)
Tesis por compendio de publicaciones / En la presente tesis doctoral abordamos el estudio de diversos factores tanto extrínsecos como intrínsecos que afectan al proceso de criopreservación espermática. Entre los factores extrínsecos evaluados observamos que un protocolo de descongelación alternativo provoca mejoras en la funcionalidad de los espermatozoides. De igual modo la adición del antioxidante genisteína al medio de descongelación ocasiona una ligera mejoría en la motilidad así como una menor fragmentación de ADN, a la vez que modula el proceso de capacitación espermática. Por otra parte encontramos que la composición de ácidos grasos tanto en espermatozoides como en plasma seminal está estrechamente relacionada con la calidad seminal, antes y después del proceso de congelación-descongelación. La composición en ácidos grasos de la muestra junto con la capacidad antioxidante del plasma seminal pueden ser factores pronósticos del éxito de la criopreservación espermática / In the current study we analyzed several factors related to the success in the freeze-thawing sperm procedure. Extrinsic factors as thawing methodology and addition of the antioxidants substance as genistein to the media had a positive effect on the sperm functionality. Some improvement were detected in motility parameters and decrease the membrane lipid disorder and DNA damage in sperm after freeze thawing process. Finally, we analyzed the relationships between the fatty acid composition of human spermatozoa or seminal fluid and total antioxidant capacity in seminal plasma before freezing with sperm quality before and after freezing-thawing. These factors could be used as predictors of the capacity of sperm cryopreservation.
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Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius= Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius

Lucas Sánchez, Alejandro 02 April 2014 (has links)
Tesis por compendio de publicaciones / El objetivo de esta Tesis Doctoral, titulada “Fisiología del envejecimiento en peces teleósteos del género Nothobranchius” es caracterizar el envejecimiento de dos especies del género Nothobranchius (N. korthausae y N. rachovii), considerando aspectos hasta ahora no estudiados en este género: las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, concretamente de las distintas especies fosfolipídicas y los ácidos grasos que las integran, y los cambios en el sistema circadiano (CS) con la edad, considerando el ritmo de actividad locomotora como marcador de su funcionamiento. En primer lugar, se estableció una colonia permanente de estas especies en el Laboratorio de Cronobiología de la Universidad de Murcia. De este modo, se pudo disponer de individuos de cada una de las etapas del ciclo vital. Con el objetivo de determinar las variaciones relacionadas con el envejecimiento en la composición de las membranas lipídicas mitocondriales, se procedió en primer lugar a la separación de las mitocondrias del resto de componentes celulares en muestras de individuos de diferentes edades, usando para ello centrifugaciones seriadas en un gradiente de sacarosa, para después proceder a la extracción del lípido total de acuerdo con el método de Folch. A partir del lípido total mitocondrial, se separaron y cuantificaron las distintas fracciones fosfolipídicas mediante cromatografía de capa fina y se obtuvieron los perfiles de ácidos grasos de cada una de ellas mediante transmetilación catalizada por ácido y cromatografía gas-líquido. El funcionamiento del CS de los peces se midió a través del estudio del ritmo de actividad locomotora. Para ello, se situaron individuos de diferentes edades en cámaras específicamente diseñadas. Estas cámaras estaban dotadas de fotocélulas que registraban constantemente la actividad de los peces y enviaban la información a una placa de registro en un sistema informático. De este modo, se obtenían series temporales de datos que eran analizadas mediante un software específico para ritmos circadianos así como métodos analíticos desarrollados para esta Tesis Doctoral. Las dos especies de Nothobranchius estudiadas mostraron cambios morfológicos fácilmente identificables a simple vista, como una pérdida patente de coloración, pérdida de peso y curvatura de la espina dorsal. A nivel bioquímico, los peces mostraron membranas mitocondriales altamente insaturadas, lo cual está relacionado con una alta tasa metabólica y alto estrés oxidativo y es característico de especies que, como las dos estudiadas, presentan fases de crecimiento explosivo. Unas membranas mitocondriales altamente insaturadas están también relacionadas con un ciclo vital corto, debido a la alta tasa de oxidación de las moléculas mitocondriales, principalmente los lípidos de membrana, que desemboca en disfunción y apoptosis. Las membranas mitocondriales podrían ser los marcapasos de toda una serie de procesos que llevan al deterioro progresivo e irreversible que caracteriza al envejecimiento. Estos procesos afectarían a la funcionalidad de los sistemas fisiológicos del animal y aumentaría la fragilidad del individuo, que se mostraría incapaz de responder a estreses inesperados del ambiente. Los resultados del presente trabajo ponen de manifiesto que el CS de Nothobranchius es severamente afectado con la edad y su deterioro podría ser uno de los factores desencadenantes de las últimas etapas del proceso de envejecimiento. Esta Tesis Doctoral pone de manifiesto la idoneidad de la utilización de especies del género Nothobranchius como modelos para estudios de envejecimiento dadas sus características como un reducido ciclo vital, el bajo costo para su cría y mantenimiento en el laboratorio y por presentar un envejecimiento gradual fácil de caracterizar y extrapolable a humanos. Estas especies se han mostrado además útiles para testar el uso de agentes cronobióticos como la melatonina, abriendo todo un abanico de posibilidades para estudiar en el futuro cercano posibles tratamientos frente al envejecimiento. / The purpose of this Doctoral Thesis, entitled “Physiology of ageing in teleost fish of the genus Nothobranchius”, is to characterise the ageing process of two different species of the genus Nothobranchius (N. korthausae and N. rachovii) considering novel aspects never studied before in this genus: age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, particularly in the different phospholipid classes and fatty acids which compose them, and the age-related changes in the circadian system, using the locomotor activity rhythm as a circadian system status indicator. Firstly, a permanent colony of these species was established in the Chronobiology Laboratory of the University of Murcia. Thereby it was possible to have individuals of each stage of the life cycle. In order to determine the age-related variations in the mitochondrial lipid membrane composition, the first step was to separate the mitochondria from other cellular components in samples obtained from fish of different ages, using serial centrifugations in a sucrose gradient. And the second step was proceeding with the total lipid extraction according to the Folch method. The different phospholipidic fractions were separated from the mitochondrial total lipid and quantified by thin-layer chromatography, and the fatty acid profile was obtained of each one by acid-catalysed transmethylation and gas-liquid chromatography. Fish CS functioning was measured by the study of locomotor activity rhythm. For that, individuals of different ages were placed in specifically designed chambers. These chambers were equipped by photoelectric cells which constantly register the fish activity and send the information to an informatics system. Temporal series data were obtained and analysed by a specific software for circadian rhythms as well as by analytic methods developed for this Doctoral Thesis. The two Nothobranchius species studied showed easily recognizable morphological changes, as colouration and body mass loss and spine curvature with age. At a biochemical level, fish showed highly unsaturated mitochondrial membranes, which is associated with high metabolic rate and oxidative stress, being characteristic of species that show explosive growth stages, like both species used. Highly unsaturated mitochondrial membranes are also related to a short lifespan, due to the high oxidation rate of mitochondrial molecules, mainly membrane lipids, which results in dysfunction and apoptosis. The mitochondrial membranes could be the pacemaker of a number of processes leading to a progressive and irreversible impairment which characterise the aging process. These processes affect animal physiological systems functionality and increase the individual fragility, showing the individual unable to respond to unexpected environmental stresses. Results from the present work show that Nothobranchius CS is strongly affected by age and its impairment could be one of the trigger factors of the last stages in the ageing process. This Doctoral Thesis shows the suitability of using Nothobranchius species as ageing models because of their characteristics as short lifespan, low-cost breeding and maintenance in the laboratory and by showing a progressive ageing easy to characterise and to extrapolate to humans. Also, these species have shown their potential to test the use of chronobiotic agents as melatonin, bringing us new possibilities to study, in the near future, possible treatments against ageing.
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Privación selectiva de sueño rem en ratas : recuperación espontánea versus enmascaramiento: un estudio de homeostasis de sueño rem

Barrera del Pino, Norma January 2017 (has links)
Grado de magister en nuerociencias / La homeostasis de sueño REM refiere el proceso mediante el cual la cantidad de tiempo en este estado se mantiene dentro de límites mínimos aceptables; sin embargo existen reportes contradictorios respecto a si el sueño REM posee efectivamente este tipo de regulación. Utilizando la herramienta de Estimulación Fótica provocamos un exceso de sueño REM. Aplicando Pulsos de Oscuridad (PO) durante el periodo de luz, se logra con alta probabilidad y corta latencia una transición de sueño NREM a sueño REM en ratas albinas. De esta manera provocamos un exceso del estado y evaluamos la respuesta posterior. Se implementaron tres protocolos: (1) 4R, privación selectiva de sueño REM durante 4 horas (Zeitgeber time 4-7); (2) 10d, aplicación de Pulsos de Oscuridad de 10 minutos, alternados con 20 minutos de luz durante 2 horas (Zeitgeber time 8-9) y por último (3) 4R10d, que involucra la combinación de ambas condiciones experimentales. Los protocolos 4R y 4R10d mostraron una respuesta homeostática de rebote significativa posterior a la privación. Durante el periodo de Estimulación Fótica se observó un importante incremento del tiempo en sueño REM en 4R10d en relación a BL y 4R que se extendió incluso durante el periodo de actividad de la rata. En el protocolo 10d se observó un incremento del tiempo en sueño REM equivalente al rebote post-privación obtenido en 4R, y el incremento ocurrido en 4R10d constituye la sumatoria del sueño REM obtenido producto de la privación más la acción de los Pulsos de Oscuridad. En conclusión, la recuperación post-privación mostró características homeostáticas, sin embargo no consideró el exceso de sueño REM obtenido mediante Estimulación Fótica. / There is a homeostatic mechanism that preserves the daily REM sleep quota. To be truly homeostatic, the underlying REM sleep hourglass process that keeps track of the cumulated REM sleep time should promote REM sleep in response to REM sleep deficits, as occurs after selective REM sleep deprivation (RD) in humans and rodent models, and postpone REM sleep occurrence when challenged by REM sleep excesses. In the albino rat, short dark pulses (DP) transiently increase REM sleep amount by shortening the latency of NREM to REM sleep transitions, phenomenon known as photic masking. Photic masking provides a useful strategy to explore the REM sleep hourglass process in response to REM sleep excess. Male albino rats were subjected to 4 hours of RD during the rest phase (zeitgeber time, ZT, 4-7; light:dark cycle= 12:12). It was compared the subsequent REM sleep rebound when occurring in the presence or absence of 10-minute DP given in the ZT 8-9 interval. REM sleep rebound in the ZT 8-11 interval after RD was 10.9 minutes and when occurring in the presence of DP was 22.2 minutes. Whereas REM sleep rebound after RD alone fully compensated REM sleep debt within 6 hours, REM sleep rebound with DP provoked a sustained REM sleep excess that was present after 16 hours of recordings. The additive effect of photic masking suggest that REM sleep hourglass process is insensitive to the activation of REM-on neurons targeted by retinofugal projections.
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Movimientos oculares como marcadores de la percepción de objetos visuales

Plaza Rosales, Ivan Antonio January 2016 (has links)
Grado de magíster en neurociencias / Nuestra percepción visual típicamente incluye la segmentación de objetos en una escena visual. Sin embargo, los mecanismos que determinan la construcción de estos objetos visuales son desconocidos. La exploración visual implica varios movimientos oculares tales como fijaciones, sacadas y microsacadas. Proponemos que la percepción visual de un objeto se constituye a través de la agrupación espacial de microsacadas y estas se correlacionan con el informe de los objetos percibidos, independientemente del tamaño y dependiente de la forma de estos objetos. Aquí, se muestra que usando una tarea de exploración libre, la agrupación de patrones de microsacadas se correlaciona de manera efectiva con los objetos percibidos. Contrastado con mapas de saliencia indican que las regiones con una mayor presencia de microsacadas representan la percepción de un objeto y no sólo son zonas que se destacan de la imagen por sus características físicas. La agrupación de microsacadas fue independiente del tamaño de los objetos percibidos, manteniendo el tamaño absoluto de la agrupación al escalar las imágenes de estímulo. Finalmente, encontramos que la disposición espacial de microsacádicos es dependiente de la forma de los objetos reportados, adoptando una forma parcial de acuerdo a la naturaleza de los objetos. Estos resultados pueden contribuir a la caracterización de la percepción de los objetos en una escena y arrojar luz sobre los mecanismos para la segmentación visual. / Our visual perception typically includes segmentation of objects in a visual scene. However, the mechanisms that end up building these visual objects are unknown. Visual exploration involves various eye movements such fixations, saccades and microsaccades. We propose that the visual perception of an object is comprised by spatial clustering of microsaccades and correlates with the report of the perceived objects, independently of the size and dependent on objects shape. Here, we show that using a free viewing task, grouping patterns on microsaccades effectively correlate with perceived objects. Contrast saliency maps indicate that regions with a greater presence of microsaccades represent the perception of an object and not only areas that stand out from the image by its physical characteristics. The microsaccades grouping was independent of the objects perceived, maintaining the absolute size while scaling the stimulus images. Finally, we found that the spatial arrangement of microsaccades is depended on the shape of the reported objects, adopting a biased shape according to the nature of the objects. These results can contribute to the characterization of the perception of objects in a scene and shed light on the mechanisms for visual segmentation.
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Efecto del fluido oviductal, α-L-fucosidasa y óxido nítrico sobre la interacción de gametos en la especie porcina = Effect of oviductal fluid,α-L-fucosidase and nitric oxide on porcine gamete interaction

Romero Aguirregomezcorta, Jon 20 February 2015 (has links)
La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. / The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.
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Estudio in vivo de la transferencia placentaria de ácidos grasos marcados con isótopos estables en sujetos con diabetes mellitus gestacional= In vivo placental transfer of fatty acids labelled with stable isotopes in gestational diabetes mellitus subjects

Pagán Bernabeu, Ana 17 January 2014 (has links)
Introducción: Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga son importantes para el desarrollo neuronal del feto. Estudios observacionales sugieren que el ácido docosahexaenoico (DHA) parece estar reducido en cordón de neonatos de madres con Diabetes Mellitus Gestacional (DMG). Objetivos: estudiar in vivo, la transferencia placentaria de ácidos grasos en embarazadas con DMG utilizando isótopos estables. Material y Métodos: 11 mujeres embarazas controles y 9 con DMG recibieron oralmente 13C-ácido palmítico, 13C-ácido oléico, 13C-ácido linoléico y 13C-ácido docosahexaenoico (13C-DHA) 12h antes de una cesárea electiva. Se tomaron muestras de sangre materna a las -12h, -3h, -2h, -1h, en el parto y +1h. También se tomaron muestras de placenta y sangre de cordón. Los ácidos grasos se cuantificaron por cromatografía gaseosa (GC) y el enriquecimiento en 13C por GC- espectrometría de masas de isótopo ratio. Resultados: El área bajo la curva de las concentraciones de los ácidos grasos marcados en los lípidos totales del plasma materno con DMG fue mayor que en los controles, excepto para el 13C-DHA. En los lípidos totales de placenta y sangre venosa de cordón la concentración de 13C-DHA fue significativamente menor en mujeres con DMG. Además la relación placenta/plasma materno y plasma fetal/plasma materno fueron menores para el 13C-DHA en mujeres con DMG respecto a controles, sugiriendo una menor captación placentaria de DHA. Conclusiones: En embarazadas con DMG, la transferencia placentaria de DHA podría estar reducida, conduciendo a menores concentraciones de 13C-DHA en sangre de cordón, lo que podría afectar a la programación del desarrollo neurológico de estos niños
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Atención emocional : influencia del contenido emocional sobre el direccionamiento etencional visual

Astudillo Valenzuela, Carolina Isabel January 2015 (has links)
Dada nuestra limitada capacidad de procesamiento de estímulos, la atención o habilidad de identificar y seleccionar la información relevante del ambiente externo o interno, es vital para la adaptabilidad del ser humano. Diferentes estímulos pueden capturar la atención de un individuo en forma automática, sin embargo durante la mayor parte del tiempo los sujetos observan libremente el entorno, dirigiendo y redirigiendo su atención hacia aquello que resulta relevante para la conducta en curso. Este direccionamiento atencional se acompaña de un direccionamiento de la mirada hacia el objeto o espacio atendido, a menos que se realice un esfuerzo voluntario para evitarlo, por lo que los movimientos oculares son un frecuente marcador atencional visual. A pesar del interés existente en cómo las propiedades físicas de los estímulos determinan la exploración visual, tales estudios no han logrado explicar la conducta en visión libre. Aspectos cognitivos de características top-down, tal como el procesamiento emocional, se encontrarían interactuando permanentemente con el direccionamiento atencional guiando así la exploración. En este estudio, utilizamos un paradigma de observación libre de imágenes con diverso contenido emocional, e investigamos cómo el valor emocional de los estímulos modula el direccionamiento atencional voluntario modificando el tiempo que los sujetos permanecen en cada categoría emocional y el número de fijaciones que en ellas realizan. Paralelamente, gracias a la medición continua del diámetro pupilar, dispusimos de un marcador de la respuesta emocional gatillada por las imágenes estableciendo el nexo entre emoción y direccionamiento atencional. Nuestros resultados confirman la relación entre emoción y direccionamiento atencional voluntario. Imágenes con contenido emocional, negativo y positivo, concentran un mayor tiempo de observación y número de fijaciones que imágenes neutras, especialmente las de naturaleza negativa. Similar efecto se obtiene al separar las imágenes según su nivel de arousal, posiblemente por el mayor arousal inherente a las imágenes negativas. La reactividad pupilar indica que imágenes de superiores arousals se acompañan de mayor dilatación pupilar, lo que reflejaría una rápida detección de la naturaleza de los estímulos y un consiguiente estado de activación autonómica preparatorio para una eventual respuesta conductual. Además de corroborar la hipótesis, nuestros resultados enfatizan la necesidad de considerar tanto la dimensión de valencia como el arousal en el estudio del procesamiento emocional y su interacción con otros procesos cognitivos tales como el direccionamiento atencional. / Attention is the ability of identifying and selecting relevant information from outside or inside sources. Since our capacity of stimuli processing is limited, attention is deemed of utmost importance in human adaptability. When a stimulus suddenly appears or is highly outstanding, attention is automatically directed to the stimulus in an involuntary process, although most of the time stimulus are rather constant or fade in and out and attention is oriented from one to another according to its relevance for current behavior in a voluntary manner. In this process, gaze is directed to the object or space being attended, unless a conscious effort is made, hence ocular behavior is often used as visual attention maker. Physical properties of stimulus could be involved in the automatically capture of attention while cognitive aspects with top-down characteristics, such as emotional processing, would guide the voluntary orienting of attention. In natural situations, both mechanisms are in constant interaction and define the ocular behavior observed during free viewing. Through showing an arrangement of pictures with multiple emotional value, we looked for the influence of emotional content on the voluntary visual attentional orienting, reflected in the dwelling time and number of fixations in each affective category. Also, through the constant measure of pupil diameter we obtained an autonomic marker of the emotional response triggered by the pictures establishing a connection between emotion and attentional orienting. Our results confirm the influence of emotional content on attentional orienting. Pictures with affective content, negative and positive, display increased dwelling times and number of fixations when compared to neutral pictures, and between affective categories negative pictures are associated with the larger effects. This modulation is not exclusive of the emotional value; the level of arousal also triggers a divergence observed in behavior and pupillary response. Higher arousals are associated with larger dwelling times, number of fixations and pupillary dilations. Besides confirming our hypothesis, our results emphasize that arousal and valence should be considered different dimensions of emotional processing, whose interact in particular ways with other cognitive process as voluntary attentional orienting.
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Caracterización de células madre de la membrana timpánica : estudio de su localización anatómica en modelo animal

Moraleda Deleito, Javier 22 December 2015 (has links)
grecase@um.es,ntma@um.es;jmoraled@um.es / Objetivos: La membrana timpánica (MT) tiene capacidad de repararse fisiológicamente tras traumatismos, infecciones y otras patologías. Es lógico deducir que existe un nicho de células madre con capacidad regenerativa responsable de la reparación tisular a este nivel, pero existe muy poca información contrastada sobre ello. Nuestro objetivo fue confirmar la existencia y localización de células madre de la MT y realizar su aislamiento y caracterización. Metodología: Se utilizo un modelo murino C57BL/6J de 8-10 semanas, procedente del animalario de la Universidad de Murcia, siguiendo normativa vigente. Para extracción de MT se utilizaron varios protocolos quirúrgicos con inclusión o ausencia de martillo y annulus. Se realizaron técnicas de digestión enzimática y explantes para obtención de cultivo primario. Las células se sembraron a 1,25 x106 en frascos de cultivo de 25cm2 con alfa-MEM suplementado según protocolos estandarizados en estufas a 37ºC y 5% de C02. Se realizaron subcultivos, curvas de crecimiento y cuantificación de la proliferación celular con MTT. Se utilizó citómetro FACSCanto y un panel de 8 Ac monoclonales para la tipificación inmunofenotípica y RT-PCR para expresión de Nestina, Nanog y Slug. Se emplearon medios de cultivo específicos para la capacidad de diferenciación multipotente. El estudio del nicho se realizó mediante cortes histológicos en zonas estructuradas de la MT y análisis histológico convencional e inmuno-histoquímico para Ki-67, Nestina, Tuj-1 y Oct-3/4. Resultados: Se extrajeron 333 tímpanos de 207 ratones, de los que se lograron realizar 25 explantes. La digestión enzimática produjo una baja viabilidad y escasa proliferación celular en relación directa con el tiempo de exposición. En contraste las técnicas de explante produjeron una viabilidad >75% alcanzándose confluencia más rápidamente y durante mayor número de pases que con colagenasa. Los mejores explantes para cultivos primarios incluyeron el martillo y el annulus. En los cultivos primarios se observaron células de morfología epitelial y otras células de morfología fibroblástica. Las curvas de crecimiento demostraron un promedio de 3,54x105 en los explantes con martillo y annulus en comparación con 2,9 x105 y 3,1 x105 en los que no incluyeron annulus. El MTT mostró una proliferación exponencial proporcional al tiempo de cultivo y a la densidad de la muestra inicial. Las células de la MT fueron negativas para CD45, CD19 y citoqueratina, y positivas para CD90, CD105, CD73, (marcadores mesenquimales), así como para Ki67 y Nestina (marcadores de proliferación e inmadurez). Fueron parcialmente positivas para CD34. La PCR mostró positividad para Nanog, Slug y Nestina. La diferenciación adipocítica se demostró por la presencia de tinción celular positiva para Oil Red O; la diferenciación osteocítica por los depositos de calcio Alizarin red, tinción positiva de fosfatasa alcalina e inmunofluorescencia para osteopontina, y diferenciación condrocítica con inmunofluorescencia positiva a colágeno II. Los estudios histológicos fueron positivos para Ki67, Nestina y Oct-3/4 no así como para Tuj-I. Los nichos de células con características de células madres se encontraron en las áreas de engrosamiento de la membrana timpánica junto al mango del martillo y al annulus. Conclusiones: Nuestros datos confirman la presencia en la membrana timpánica de células progenitoras inmaduras con características de células madre. Las células madre de la MT se sitúan preferentemente en la zona de inserción del mango del martillo, y con menor frecuencia en el annulus. La técnica optima de explante para la obtención de cultivos primarios eficaces debe incluir el martillo y el annulus. Las células obtenidas del cultivo de la MT identificadas en nuestro estudio, tienen capacidad de diferenciación multipotencial a líneas celulares mesodérmicas y presentan un fenotipo inmunológico, compatibles con la definición de células madre mesenquimales aceptada por la ISCT, por lo que podrían emplearse en ensayos de terapia celular. / Goals: The tympanic membrane (TM) has the ability to repair after trauma, infections and other diseases. It is logical to conclude that there is a niche of stem cells with regenerative capacity responsible for tissue repair at this level, but there is little authoritative information about it. Our aim was to confirm the existence and location of these cells within the TM and to try to isolate and characterize them. Methododology: An 8-10 weeks mouse model C57BL/6J from the animal facility of the University of Murcia was used following current regulations. For the TM extraction, various surgical protocols were used including combinations of hammer or and annulus extractions. Different techniques were performed to obtain primary cultures including explants and enzymatic digestion. Cells were seeded at a concentration of 1.25 x 106 in 25cm2 culture flasks with alpha-MEM supplemented by standardized protocols in a stove at 37C with 5% C02. Subcultures, growth curves and quantification of cell proliferation was performed with MTT. A FACSCanto cytometer with a panel of 8 monoclonal Antibodies was used for immunophenotypic characterization and RT-PCR for expression of Nestin, Nanog and Slug. Specific culture media for multipotential differentiation capacity were used. To localize the stem cell niche structured sections of different TM areas were performed using conventional histological staining and immunohistochemical analysis for Ki-67, Nestin, Tuj-I and Oct-3/4. Results: 333 eardrums of 207 mice were extracted, of which we were able to perform 25 explants. Enzymatic digestion produced a low viability and low cell proliferation in direct relation to the exposure time. In contrast explants techniques produced viability greater than 75% with confluence being reached more quickly and for most passes compared with collagenase. The best explants for primary cultures included the hammer and the annulus. In primary cultures cell with epithelial and fibroblast morphology were observed. The growth curves showed an average 3,54x105 cells in explants of hammer and annulus compared to 3.1x105 and 2.9x105 cells in the two explants that didn’t include annulus. The MTT showed proportional exponential proliferation to the time of cultivation and initial cell density. TM cells were negative for CD45, CD19 and cytokeratin, and positive for CD90, CD105, CD73, (mesenchymal markers) and Nestin and Ki67 (proliferation markers and immaturity). They were partially positive to CD34. The PCR was positive for Nanog, Slug and Nestin. Adipocyte differentiation was demonstrated by the presence of cell staining positive for Oil Red O. The osteocytic differentiation by calcium deposits Alizarin red, positive staining of alkaline phosphatase and immunofluorescence for osteopontin. Chondrocyte differentiation by collagen II was positive in immunofluorescence. Histological studies were positive for Ki-67, Nestin and Oct-3/4 and not to Tuj-I. Cells with characteristics of stem cells were found in the areas of thickening of the tympanic membrane near the handle of malleus and the annulus. Conclusions: Our data confirms the presence in the TM of immature progenitor cells with stem cell characteristics. TM stem cells are preferably located in the insertion of the handle of the malleus, and less frequently in the annulus. The optimum explants technique for obtaining efficient primary cultures should include hammer and annulus. The cells obtained from culture of TM identified in our study, have multipotential differentiation capacity to mesodermal cell lines and express a immunological phenotype compatible with the definition of mesenchymal stem cells accepted by the ISTC, so could be used in for cell therapy.
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Implementación de una vía clínica de atención al paciente subsidiario de nutrición enteral domiciliaria en el Servicio Murciano de Salud

Ferrer Gomez, Mercedes 21 December 2015 (has links)
OBJETIVO. Elaborar e implementar una vía clínica de atención al paciente subsidiario de nutrición enteral domiciliaria en el Sistema Murciano de Salud. Tras su puesta en marcha se evalúan las mejoras en la calidad asistencial y en la contención del consumo de dietoterápicos en el Área Sanitaria I Murcia Oeste, así como el impacto del proyecto sobre el gasto regional en estos productos tras la generalización del procedimiento al resto de áreas. MÉTODO. Inicialmente se diseñó la vía y se llevaron a cabo los pasos necesarios para su aplicación, en fase de pilotaje, en el Área de Salud I Murcia Oeste. Posteriormente se procede a realizar un análisis prospectivo y descriptivo de 1.192 peticiones recibidas en la Unidad de Nutrición del Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca, mediante una serie de indicadores de calidad definidos en la Guía de Nutrición Enteral Domiciliaria publicada por el Ministerio de Sanidad y otros propios. Este estudio se realiza en un periodo inicial (2010), antes de la puesta en marcha del trabajo y en uno final (2013-2014), tras su completa instauración. Por otra parte se estudia la evolución del gasto en nuestra área y a nivel regional en nutrición enteral domiciliaria, antes y después de la implantación del nuevo protocolo de soporte nutricional. RESULTADOS. Existe un bajo cumplimento de ambos tipos de índices de calidad en el grupo de pacientes portadores de nutrición enteral domiciliaria antes de la implementación de la vía clínica que mejora significativamente cuando el control se lleva a cabo desde la unidad de nutrición. Por otro lado, en los años de aplicación del protocolo (2010-2014) se ha conseguido una importante contención acumulada del consumo de dietoterápicos tanto en nuestra área, donde asciende al 240% en envases y a los siete millones de euros en importe, como a nivel regional, con cifras del 126,58% (-244.096) en envases y más de 23 millones de euros en importe. En los dos últimos años se alcanza una meseta en ambas medidas de gasto. CONCLUSIÓN. El perfil de pacientes con soporte nutricional enteral domiciliario descrito en este estudio es similar a otras experiencias, aunque no totalmente comparables por las diferencias en los registros. Se ha revertido el desequilibrio existente en Murcia respecto al Sistema Nacional de Salud en consumo de productos dietoterápicos, y se han obtenido unos resultados sin precedentes en contención de gasto farmacéutico. Además, se ha logrado mejorar la calidad asistencial en este proceso en el Área de Salud I Murcia Oeste, estableciendo un circuito de coordinación centrado en las unidades de nutrición hospitalarias. / OBJECTIVE. To develop and implement a clinical pathway for subsidiary patients to home enteral nutrition support in the ‘Región de Murcia’ Health Service (Spain). After its implementation in a western area (Área I Murcia Oeste), improvements in the quality of care and containment consumption are evaluated, as well as the regional spending of these products after the expansion of the procedure to other areas. METHOD. Initially the pilot phase was designed for the western area of Murcia Health Service, in which the way and the bases for its implementation were established. Then, prospective descriptive analysis of 1,192 received petitions in the Nutrition Unit of the `Hospital Clínico Universitario Virgen de la Arrixaca’ (Murcia) are analized following quality indicators defined in the Home Enteral Nutrition Guide published by the Ministry of Health and others defined for us. This study was performed in two periods, first in 2010, were the design was developed, and secondarily between 2013 and 2014, after complete compliance. Moreover, the changes in home enteral nutrition expenditure of our area and the rest of the region, before and after implementation of the new nutritional support protocol, are studied. RESULTS. Before implementation of the clinical pathway, the group of patients with home enteral nutrition sparsely meet both types of quality rates. These indicators improve significantly when control is carried out by the nutrition unit. In addition, during the application of the protocol (2010-2014) a significant accumulated restriction of containment consumption, both in our area, which reaches 240% in packaging and seven million Euros, as well as regional level, up to 126.58% in containers and tweinty-three million Euros. In the last two years of the study, a plateau is reached in both spending measures. CONCLUSION. The profile of patients with home enteral nutritional support described in this study is similar to other experiences, albeit not entirely comparable because of the differences in the records. The Imbalance of products consumption has been reversed in Murcia compared to the National Health Service, and we have obtained unprecedented results in containment of pharmaceutical expenditure. In addition, quality of care has been improved in the western area of `Región de Murcia’ Health Service, establishing a circuit coordinated by the Hospital Nutrition units.
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Cronificación de perforación timpánica en ratas con mitomicina C

Esteban Sánchez, Tomás 19 January 2016 (has links)
La otitis media crónica en humanos es una afectación del oído medio que se presenta de distintas formas clínicas, siendo la más frecuente la perforación timpánica. Esta entidad es una solución de continuidad del tímpano y su tratamiento consiste en una intervención denominada miringoplastia. Otro tipo de otitis media crónica es la otitis seromucosa, descrita como la acumulación de contenido mucoso en oído medio. Su tratamiento consiste en el drenaje del moco y la colocación de una prótesis transtimpánica para mantener abierta la perforación (miringotomía) realizada. La gran variedad de materiales utilizados en la miringoplastia es evidencia de que los resultados no son satisfactorios y por ello se mantiene abierta la investigación sobre nuevas alternativas de andamiajes biológicos que pudieran facilitar la cicatrización, como la membrana amniótica. Para ello necesitamos un modelo animal con cronificación de perforación timpánica. En nuestra revisión de la literatura encontramos estudios que conseguían la cronificación de las perforaciones timpánicas mediante la realización de miringotomías con láser y la aplicación de hidrocortisona o mitomicina C, siendo esta última un citostático que se ha utilizado para retrasar la cicatrización en diversas patologías de oftalmología y otorrinolaringología. Debido a que el láser no está disponible habitualmente en los laboratorios de investigación, se decidió desarrollar un modelo de cronicidad de perforación timpánica mediante miringotomías incisionales con mitomicina C. Se ha realizado un ensayo prospectivo analítico con 34 ratas machos Sprague Dawley, con un peso medio de 331.4 gramos, distribuídas en tres grupos: A, B y C. El grupo A formado por 10 ratas a las que se les ha realizado una miringotomía con amputación del mango del martillo y aplicación posterior de mitomicina C (0.4 mg/ml) a los oídos izquierdos (brazo A1) y solución salina (0.9%) a los oídos derechos (brazo A2). El grupo B lo constituían 12 ratas divididas en 4 brazos, dos brazos (B1 y B2) formados por 10 oídos cada uno, a los que se les aplicó mitomicina C antes de las miringotomías sin amputación de los mangos de los martillos (B1) y con amputación (B2). Los 4 oídos restantes de este grupo fueron tratados con solución salina previamente a la miringotomía, dos sin amputación de los mangos de los martillos (B3) y otros dos con amputación (B4). El grupo C formado por 12 ratas estaba estructurado igual que el grupo B, pero se les añadió dexametasona (4mg/ml) en las cuatro primeras revisiones de los brazos C1 y C2 y se aplicó solución salina en las mismas revisiones de los brazos C3 y C4. Los resultados muestran una duración media de las perforaciones en los oídos tratados con solución salina de 8.3 días. Los oídos tratados con mitomicina C tuvieron una duración media de las perforaciones de 18.6 días el grupo A, 15.1 días el grupo B y 112.7 días el grupo C. No obtuvimos diferencia entre realizar miringotomía con amputación del mango del martillo o sin amputación, como tampoco la hubo entre aplicar la mitomicina C antes o después de la miringotomía. Sí hubo diferencia significativa entre las perforaciones tratadas con mitomicina C y las tratadas con solución salina y también entre las tratadas con mitomicina C sola y con mitomicina C asociada a dexametasona. Como la cronicidad de las perforaciones timpánicas en animales se establece a partir de 8 semanas, podemos considerar como modelo murino de perforaciones timpánicas crónicas cuando aplicamos mitomicina C previamente a la miringotomía incisional y asociamos dexametasona. La duración de las perforaciones timpánicas en nuestro modelo, mayor de 3 meses, justificaría promover ensayos para estudiar este método como tratamiento de las otitis seromucosas, sin utilizar drenajes transtimpánicos. / Chronic otitis media in humans is an affectation of the middle ear that occurs in different clinical forms, the most frequent of them is eardrum perforations. This entity is an integral part of the tympanic membrane and its treatment is a procedure called myringoplasty. Another type of chronic otitis media is otitis media with effusion which is described as the accumulation of mucus in the middle ear. Treatment consists on draining the mucus and placing a transtympanic prosthesis to hold the previously made drilling (myringotomy) open. The great variety of materials used in the myringoplasty is evidence that the results are unsatisfactory and therefore research into new alternatives for biological scaffolds that may promote healing, such as amniotic membrane remains open. For this, we need an animal model with chronicity of perforated eardrum. In our review of the previous research, we have found studies that could get the chronicity of the tympanic perforations by conducting laser myringotomy and applying hydrocortisone or mitomycin C, the latter being a cytostatic that has been used to delay healing various diseases in ophthalmology and otolaryngology. Due to the fact that a laser is not routinely available in research laboratories, it was decided to develop a model of chronic tympanic perforation by incisional myringotomy with mitomycin C. We performed a prospective analytical trial with 34 male Sprague Dawley rats with an average weight of 331.4 grams, divided into three groups: A, B and C. Group A consisted of 10 rats which have undergone a myringotomy with amputation of the handle of the hammer and subsequent application of mitomycin C (0.4 mg / ml) to the left ears (subgroup A1) and saline solution (0.9%) to the right ears (subgroup A2). The B group were 12 rats divided into 4 subgroups, two of them (B1 and B2) formed for 10 ears each, which were applied mitomycin C before myringotomies without amputation of the handles of the hammers (B1) and with amputation (B2). The remaining 4 ears of this group were treated with saline prior to myringotomy , two of them without amputation of the handles of the hammers (B3) and the other two with amputation (B4). The C group of 12 rats was structured like the B group, but dexamethasone (4 mg / ml) was added in the four first reviews of the C1 and C2 subgroups and saline in the same revisions of the C3 and C4 subgroups. The results show an average duration of the drillings in the ears treated with saline of 8.3 days. Ears treated with mitomycin C had an average duration drillings of 18.6 days in group A, group B 15.1 days and 112.7 days group C. There was no significant difference between performing myringotomy obtained with or without amputation of the hammer handle, nor was there when appliying mitomycin C before or after myringotomy. But there was a significant difference between those drillings treated with mitomycin C and those treated with saline and also between the drillings treated exclusively with mitomycin C and those treated with mitomycin C together with dexamethasone. As the chronicity of the tympanic perforations in animals is set from 8 weeks, we can consider murine model of chronic tympanic perforations when applying mitomycin C prior to incisional myringotomy and associate dexamethasone. The duration of the tympanic perforations in our model, greater than 3 months, would justify to increase trials to study this method for the treatment of otitis media with effusion without using ear tubes.

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