El objetivo general de esta tesis doctoral es determinar la influencia del contenido lipídico de las dietas administradas a reproductores de lubina (Dicentrarchus labrax L.) en el proceso reproductor de esta especie. Se llevaron a cabo tres experimentos diferentes, de dos años de duración cada uno, observando en cada uno de ellos la eficacia reproductora delubinas sometidas a distintos tratamientos nutricionales en dos estaciones de puesta consecutivas.Experimento 1El objetivo del primer experimento fue determinar si la calidad de las dietas o la cantidad total de lípidos ingerida por los reproductores puede afectar a los resultados de puesta debido a que estos factores alteren la composición de ácidos grasos de los huevos o bien porque puedan llegar a afectar a la cascada de fenómenos hormonales que controlan el proceso reproductor, lo cual podría llegar a reflejarse en los niveles plasmáticos de 17ß-estradiol (E2) o de vitelogenina (Vg). Se varió el contenido total de lípidos que tomaban los animales bien modificando el contenido lipídico de la dieta, bien variando la ración de alimento administrada a los animales. Se establecieron cinco grupos experimentales:o Grupo A. Recibió una dieta comercial con un 9% de lípidos a una ración de _ parte de la normal.o Grupo B. Recibió la misma dieta comercial que el grupo anterior pero a ración normalo Grupo C. La dieta administrada a este grupo poseía un 15% de lípidos y se le suministró a _ de la ración normal.o Grupo D. Recibió el pienso con un 15% de lípidos a ración normal.o Grupo Control. Se le administró un alimento natural, consistente en boga, Boops Boops, troceada y a ración normal.El grupo Control presentó unas fecundidades (número de huevos por hembra, fecundidad total, FT, y número de huevos por Kg de hembra, fecundidad relativa, FR) mayores que las de los otros grupos experimentales. Las tasas de viabilidad de los huevos (medida como porcentaje de huevos viables, flotantes, respecto al total de huevos, viables y no viables, es decir que se hundían en la probeta en la que se recogieron los huevos) y de eclosión fueron también significativamente (P<0.05) mayores en el grupo Control que en los grupos alimentados con dietas artificiales. Al analizar los ácidos grasos de la fracción lipídica de las dietas y de los huevos se observó que las proporciones de ácidos grasos de las dietas influían en las de los huevos. En particular, las relaciones entre los ácidos docosahexaenoico (DHA, 22:6n-3) y eicosapentaenoico (EPA, 20:5 n-3), y entre los ácidos grasos DHA y araquidónico (AA, 20:4 n-6) fueron mucho mayores en la dieta natural que en las artificiales así como en los huevos procedentes del grupo Control con respecto a los huevos de los otros grupos. Además, el grupo Control mostró unos niveles significativamente más altos de VTG y más bajos de E2 que los otros grupos en varios de los meses correspondientes al periodo de puesta. Se llegó a la conclusión de que la calidad de los huevos obtenidos estaba profundamente influida por las relaciones DHA /EPA y AA/EPA observadas en los huevos, que a su vez se iban a ver influidas por las relaciones DHA /EPA y AA/EPA que aparecen en las dietas. La composición inadecuada de ácidos grasos de las dietas artificiales estuvo asociada con las bajas concentraciones de VTG en los animales de los grupos A, B, C y D. Muy probablemente las concentraciones plasmáticas elevadas de E2 en estos animales fueron debidas a la presencia en los piensos de unas proporciones elevadas de ácidos grasos monoenoicos de cadena larga.Experimento 2El objetivo de este experimento fue determinar si una proporción inadecuada de ácidos grasos, particularmente DHA /EPA, podría ser compensada por un incremento de las cantidades absolutas de estos ácidos grasos ingeridas por los reproductores de lubina. El otro objetivo fue describir, por primera vez, los niveles plasmáticos de hormona gonadotropa II (GtH II) a lo largo del ciclo reproductor de la lubina.Se establecieron cuatro grupos experimentales:o Grupo A. Alimentado con una dieta comercial con un 9% de lípidoso Grupo B. Recibió el mismo pienso que el grupo A, pero el contenido de lípidos se elevó hasta un 22% mediante inmersión en un aceite comercial rico en ácidos grasos poliinsaturados de la serie n-3.o Grupo C. Se le administró un pienso formulado en el que la cantidad de lípidos se había elevado hasta un 30%o Grupo Control. Fue alimentado con boga troceadaEl grupo Control presentó mayores FT y FR que el resto de los grupos y también unas tasas de viabilidad y de eclosión de los huevos significativamente (P<0.05) mayores que las de los otros tres grupos. De nuevo, la mayor eficacia reproductora del grupo Control estuvo asociada con unas mayores relaciones DHA /EPA y AA/EPA en la comida natural que las observadas en las dietas de los otros grupos experimentales. Los huevos del grupo Control también presentaron relaciones DHA /EPA y AA /EPA mayores que las observadas en los huevos de los grupos alimentados con dietas artificiales. El grupo Control mostró de nuevo concentraciones plasmáticas de VTG significativamente (P<0.05) mayores que las observadas en los otros grupos experimentales en varios meses de la época de puesta. Contrariamente, las concentraciones plasmáticas de E2 en esos meses fueron mayores en los grupos alimentados con dietas artificiales que en el grupo Control, probablemente debido a la presencia de cantidades elevadas de ácidos grasos monoenoicos de cadena larga en los piensos. Los niveles plasmáticos de GtH II presentaron un pico claro en el punto medio del periodo de puesta, cuando mayor es la proporción de oocitos en maduración y ovulación, indicando el papel fundamental de esta hormona en el control de la maduración final de los oocitos y de la ovulación, igual que en otras especies de vertebrados. Además, los niveles absolutos de GtH II fueron mayores en los grupos alimentados con dietas artificiales que en el grupo Control, evidenciando un efecto de retroalimentación positiva del E2 sobre la síntesis de GtH II en la hipófisis.Experimento 3El objetivo de este experimento fue determinar si hay una variación estacional en las necesidades de ácidos grasos de los reproductores de lubina, dependiendo del momento del ciclo reproductor en el que se encuentren. Se utilizaron dos tipos de dieta, una dieta comercial normal, con un 9% de lípidos, que en los otros experimentos había estado asociada con malos resultados de puesta. Y una dieta rica en ácidos grasos esenciales (EFA), que se preparó sumergiendo los granos de pienso de la dieta mencionada anteriormente, en aceite de pescado.Se establecieron cuatro grupos experimentales:o Grupo Sep-Feb: recibió una dieta rica en EFA entre el 15 de septiembre y el 15 de febrero. Es decir, en la época de vitelogénesis, y primera mitad del periodo de puestao Grupo Feb-Abr: recibió la dieta rica en EFA entre el 15 de febrero y el 15 de abril, durante la segunda mitad del periodo de puesta.o Grupo Abr-Sep: recibió la dieta rica en EFA entre el 15 de abril y el 15 de septiembre, es decir en la época de postpuestao Grupo Ene-Dic: recibió la dieta rica en EFA a lo largo de todo el añoEn la primera época de puesta estudiada, el grupo Sep-Feb y el grupo Ene-Dic presentaron unas tasas de viabilidad y de eclosión de los huevos significativamente más elevadas que las de los otros dos grupos. En la segunda época de puestas, estos dos grupos mostraron de nuevo los valores más altos de viabilidad y de eclosión de los huevos, y en el grupo Abr-Sep estas tasas de viabilidad y de eclosión se elevaron enormemente con respecto al año anterior y al grupo Feb-Abr. Al realizar los análisis de ácidos grasos de los huevos se observó que las mejores tasas de eclosión de los grupos Sep-Feb y Ene-Dic estuvieron asociadas con unas relaciones DHA / EPA y ácidos grasos de la serie n-3 con respecto a ácidos grasos de la serie n-6 (n-3 / n-6) mayores que las aparecidas en los huevos de los otros grupos experimentales. La mejoría en la eficacia reproductora observada en el grupo Abr-Sep en el segundo año con respecto al primero se produjo después de que este grupo recibiera, en este segundo ciclo experimental, el pienso rico en EFA durante 5 meses (en el primer ciclo experimental lo había recibido solamente durante dos meses ya que el experimento comenzó en julio). La elevación de las tasas de viabilidad y de eclosión en este grupo estuvo asociada con una elevación de las proporciones DHA / EPA y n-3 / n-6 en la fracción lipídica de los huevos, en el segundo año con respecto al primero. / ABSTRACSea bass (Dicentrarchus labrax L.) broodstock were fed with different diets, containing different quantity of lipids or different fatty acid proportions in three different experiments. Every experiment began at the end of the summer and lasted for two years, in order to observe the results of two consecutive spawning seasons (from January to April). During spawning, egg quality and egg hatching rates were measured. Fish were sampled monthly and vitellogenin (VTG), 17ß-estradiol (E2) and gonadotrophin II (GtH II) were analysed. In the first experiment, five groups were established feeding different quantities of lipids. It was observed that better egg quality was associated with high VTG and low E2 plasma concentrations, and also with a high ratio 22: 6 n-3 / 20:5 n-3 (DHA:EPA) in the fatty acid composition of the diets, that was reflected in the fatty acid composition of the eggs. In the second experiment the fatty acid composition of the diets was controlled to confirm if a higher DHA/EPA ratio was really positively influencing egg quality. The importance of a high DHA/EPA ratio for the egg quality was confirmed. It was also observed that the ratio 20:4 n-6 / 20:5 n-3 (AA:EPA) was determinant for the egg quality. VTG and E2 plasma levels behave as in the previous experiment. GtH II plasma levels were analyzed. A direct relationship between E2 and GtH II plasma levels was observed, indicating the importance of the E2 mediated feed-back mechanisms in the regulation of GtH II production and release in the pituitary. In the third experiment, the importance of the time of fatty acid ingestion for the spawning performance was studied. Experimental groups received a diet rich in EPA and DHA at different times of the year: pre-spawning, spawning, post-spawning or all along the year. Egg quality from the group fed all the year with a diet rich in EPA and DHA was similar to that of the group fed with this diet in the pre-spawning period. That means that fatty acids administered only during the pre-spawning period are able to reach the developing oocytes in the ovary and is not necessary to feed these fatty acids all along the year.

La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. / The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.