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Notch activation and downstream targets in embryonic hematopoiesis

Guiu Sagarra, Jordi, 1983- 26 November 2012 (has links)
La regió de l’aorta-gonada-mesonefros (AGM) és el primer nínxol de les cèl·lules mare hematopoètiques. Està descrit que la via de Notch és necessària per generar artèries i cèl·lules mare hematopoètiques. Les cèl·lules mare hematopoètiques es generen a partir de les artèries durant el desenvolupament embrionari. Tenint en compte que els vasos arterials es formen abans que les cèl·lules mare hematopoètiques, durant molt temps ha estat controvertit si la via de Notch només indueix la formació d’artèries i en canvi l’abscència de cèl·lules mare hematopoètiques és un efecte secundari o si per contra, la via de Notch participa activament en la inducció d’ambdós programes genètics, l’arterial i l’hematopoètic. Moltes de les funcions descrites de la via de Notch són conseqüència de l’expressió de les seves dianes transcripcionals: Hes i Hesrelated (Hrt). No obstant cada cop s’estan identificant noves dianes transcripcionals de la via de Notch que són específiques de teixit. En aquesta tesis doctoral, demostrem que l’activació de la via de Notch per part del lligand Jagged1 és necessària per activar el programa hematopoètic però no cal per establir el programa arterial. Aquest fet demostra que la via de Notch juga un paper clau i directe en l’hematopoèsi embrionaria. Per sota de la via de Notch mostrem que els embrions deficients en Hes1 i Hes5 mantenen intacte el programa arterial. Cal remarcar que també generen més quantitat de cèl·lules mare hematopoètiques però que no són funcionals. A més tal mutants, tenen nivells més alts d’expressió dels gens Runx1, Myb i Gata2; els quals són importants reguladors de l’hematopoèsi. Per acabar demostrem que Notch activa la transcripció de Gata2 i que HES-1 l’inhibeix. Això genera un Incoherent Feed-Fordward loop, el qual regula estretament els nivells de Gata2 necessàris per generar cèl·lules mare hematopoètiques. The aorta-gonad-mesonephros (AGM) is the first Hematopoietic Stem Cell (HSC) niche. It was previously shown that Notch pathway is required to induce the arterial fate as well as to generate Hematopoietic Stem Cells. HSC emerge at the site of arterial vessels during embryonic development. Since arterial fate precedes HSC generation, it has long been controversial whether Notch exclusively induces the arterial program and the lack of HSC is a secondary defect; or Notch is directly involved in activating both genetic programs, arterial and hematopoietic. The best-characterized Notch targets are Hes and Hesrelated genes (Hrt) since they are involved in most of described Notch functions, however there is a growing number of tissue-specific transcriptional Notch-targets. In this thesis, we found that Jagged-mediated activation of Notch is required for the correct execution of the definitive hematopoietic program but not for the establishment of the arterial fate, thus demonstrating that Notch exerts a specific hematopoietic function in the embryo. Downstream of Notch pathway, we also show that embryos deficient for Hes1 and Hes5 alleles contain an intact arterial program but produce increased numbers of non-functional hematopoietic stem cells associated to higher levels of the hematopoietic regulators Runx1, Myb and Gata2. Moreover, Gata2 transcription is positively regulated by Notch and negatively controlled by HES-1. This creates an incoherent feed-forward loop that tightly controls Gata2 levels to generate HSC.
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Effect of DYRK1A dose reduction on the transcriptome of the developing mouse cerebral cortex : implications in gliogenesis

Balducci, Elisa, 1981- 24 February 2012 (has links)
Cerebral cortex is essential to exert the highest functions in mammals. Understanding the developmental processes that underlie the generation and functionality of cortical cell populations represents a mayor issue in neurobiology. DYRK1A is a dosage-sensitive gene involved in neurodevelopment with putative roles in corticogenesis. In the present study, we show that the transcriptome of the cerebral cortex of newborn mice lacking one functional copy of Dyrk1a (Dyrk1a+/-) is substantially altered and is mostly the consequence of a delayed developmental gene expression program. We also show that neural progenitors of Dyrk1a+/- mice have a reduced capability to self-renew and to differentiate into oligodendroglial cells in vitro. Moreover, we demonstrate that the epigenetic state of S100b and Gfap glial genes in the cortex of Dyrk1a+/- embryos is altered at specific promoter positions before the onset of gliogenesis, suggesting that Dyrk1a+/- neural progenitors may have an increased astrogliogenic and a decreased oligodendrogenic potential in vivo. In accordance, the number of S100b+ oligodendrocytes is reduced in the postnatal cortex of Dyrk1a+/- mutants whereas the number of Gfap+ astrocytes is increased in the adult. Finally, we show that the myelin thickness of Corpus Callosum axons and of axons of the optic and sciatic nerves is significantly decreased in adult Dyrk1a+/- mice, indicating a possible role of Dyrk1a in myelination. Altogether our results indicate that Dyrk1a dose reduction alters the differentiation potential of the embryonic cortical progenitors and suggest a new role of Dyrk1a in glial development and function. L’escorça cerebral és essencial per dur a terme les funcions més complexes en els mamífers. Entendre el procés de desenvolupament involucrat en la generació i el funcionament de les poblacions cel·lulars de l’escorça representa un dels principals camps d’investigació de la neurobiologia. DYRK1A és un gen sensible a dosis involucrat en el neurodesenvolupament i molt possiblement en la corticogènesis. En aquest estudi demostrem que la reducció de la dosi gènica de Dyrk1a en ratolí (Dyrk1a+/-) provoca una alteració substancial del transcriptoma de l’escorça cerebral neonatal que es principalment la conseqüencia de un retard en el l’expresió seqüencial dels gens durant el desenvolupament. També hem demostrat que els progenitors neuronals dels ratolins Dyrk1a+/- tenen una menor capacitat d’autorenovació i diferenciació en cèl·lules oligodendroglials in vitro. El estat epigenetic dels gens glials S100b i Gfap es troba alterat en l’escorça d’embrions a posicions especifiques del promotor abans de l’inici de la gliogènesis, suggerint que els progenitors neuronals de ratolins Dyrk1a+/- podrien tenir un potencial astrogliogènic incrementat i un potencial oligodendrogènic disminuït in vivo. En concordança, l’escorça de ratolins Dyrk1a+/- neonatals presenta un major número de progenitors oligodendroglials S100b+, mentres que el número d’astròcits Gfap+ es troba incrementat en ratolins Dyrk1a+/- adults. Finalment, hem demostrat que la vaina de mielina dels axons del cos callos i del nervi òptic i ciàtic es troba significativament reduïda en els ratolins Dyrk1a+/- adults, fet que indica una posible implicació de Dyrk1a en mielinització. En conjunt els nostres resultats indiquen que la baixada de dosi de Dyrk1a altera el potencial de diferenciació dels progenitors embrionaris de l'escorça i suggereix un nou paper de Dyrk1a en el desenvolupament i en la funcionalitat glial.
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Study of the molecular mechanisms involved in the formation of hindbrain boundaries

Calzolari, Simone, 1983- 15 November 2013 (has links)
Durant el desenvolupament embrionari, els teixits s’especifiquen gradualment fins a que adquireixen un destí final. En els vertebrats el Sistema Nerviós Central (SNC) deriva del tub neural, una estructura embrionària transitòria que està regionalitzada al llarg de l'eix anteroposterior (AP) en tres diferents vesícules cerebrals i en la medul·la espinal. El romboencèfal, la vesícula cerebral posterior, és la més conservada evolutivament i donarà lloc a estructures importants com el cerebel. La part posterior del cervell està segmentada de manera transitòria al llarg de l'eix AP en diferents compartiments anomenats rhombòmeres (r). Aquesta organització segmentada determina el desenvolupament temporal i espacial de les estructures que es formen en un patró repetit, com els nervis cranials i les neurones reticulars. Els rombòmers són compartiments de llinatge cel·lular separats per fronteres, que restringeixen la barreja de cèl·lules dels diferents compartiments. Una combinatòria gènica específica confereix identitat molecular a cada rombòmer. Aquests gens refinen progressivament el seu límit de expressió, establint fronteres moleculars que prefiguren on es formaran les fronteres morfològiques que impediran que les cèl·lules es barregin. Fins avui, encara no està clar quins són els mecanismes cel·lulars i moleculars responsables de refinament de les fronteres i de la segregació cel·lular. En aquest treball es demostra que el cell-sorting és el principal mecanisme responsable del refinament dels límits moleculars en el romboencèfal. Per a això, vam realitzar un seguiment de les cèl·lules in vivo i una anàlisi de les seves trajectòries. Es demostra que el moviment cel·lular està restringit entre rombòmeres adjacents un cop els límits moleculars han estat refinats, a causa de la formació d'un cable de actomiosina a la part apical de les cèl·lules de la frontera. Finalment, hem demostrat que aquest procés està mediat per la via de senyalització Eph/Ephrin. During development, embryonic tissues are gradually patterned and they eventually are committed to a specific fate. In vertebrates, the entire Central Nervous System (CNS) derives from the neural tube, a transient embryonic structure that is regionalized along the anteroposterior (AP) axis in three different brain vesicles and the spinal cord. The hindbrain, the posterior brain vesicle, is the most evolutionary conserved and it will give rise to important structures such as the cerebellum. The hindbrain itself is transiently patterned along the AP axis in different metameric segments called rhombomeres (r). This organization dictates the temporal and the spatial development of structures that are formed in a repeated pattern, like cranial nerves and reticular neurons. Rhombomeres are cell-lineage compartments, divided by boundaries where cell mixing is restricted. A specific combinatory of gene expression confers molecular identity to each rhombomere. Rhombomeric-restricted genes are progressively refined during development transiting from jagged to sharp limits of expression, therefore establishing molecular boundaries. After that, morphological borders become visible and impede cell intermingling. Up to date, it was still not clear which are the cellular and molecular mechanisms responsible for boundary refinement and responsible of rhombomeric cell segregation. In this work we demonstrate that cell sorting is the main mechanism responsible for refinement of molecular boundaries in the hindbrain. For this, we performed in vivo cell tracking and fake-cell tracing analysis. We show that once molecular boundaries are refined cell movement is restricted between adjacent rhombomeres due to the formation of an actomyosin cable in the cellular cortex of the cells at the boundary. Finally, we demonstrate that this process is mediated by the Eph/Ephrin signaling pathway.
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Dual function of Notch signaling and role of Hes/Hey genes in the inner ear sensory development

Petrovic, Jelena, 1983- 18 July 2014 (has links)
Durante el desarrollo del oído interno, Notch presenta dos modos de funcionamiento: inducción lateral, que se asocia con la especificación prosensorial, e inhibición lateral, asociada a la determinación de las células ciliadas. Estos mecanismos dependen, respectivamente, en dos ligandos diferentes, Jagged1 (Jag1) y Delta1 (Dl1) y se basan en una misma cascada de señalización iniciada con la activación de Notch. En el otocisto de pollo, la expresión de Jag1 y Hey1 se correlacionan bien con la inducción lateral, mientras que Jag1 y Dl1 se expresan durante la inhibición lateral junto con Hey1 y Hes5. Otros Hes/Hey genes no muestran patrones restringidos de expresión en el epitelio ótico. Los experimentos muestran que Jag1 induce niveles más bajos de actividad de Notch que Dl1, y ello resulta en la expresión diferencial de Hey1 y Hes5. Además, Jag1 interfiere con la capacidad de Dl1 para inducir niveles altos de actividad de Notch. Modelando el epitelio sensorial para los dos ligandos se demuestra que la regulación de los ligandos, la fuerza de la señalización y la competencia por la señalización son fundamentales para permitir los dos modos de funcionamiento y para establecer el patrón alterno de las células ciliadas. Jag1, opera en el modo de inducción lateral cuando está sólo, pero facilita la inhibición lateral en presencia de Dl1. Este nuevo comportamiento emerge de que Jag1 actúa como un inhibidor competitivo de Dl1 para la señalización de Notch. Los experimentos muestran que el patrón de células ciliadas es muy robusto, y el modelo sugiere que la autoactivación del factor proneural Atoh1 es un componente fundamental para la robustez del patrón. Los resultados destacan la importancia de los niveles de señalización Notch y la competencia entre los ligandos para la función de Notch. Hey1 y Hes5 están regulados por Notch, sin embargo, el patrón de expresión Hey1 sugiere que puede ser también regulado por otros mecanismos. Los resultados muestran que las vías Bmp, Wnt y Ffg modifican la expresión de Hey1 y Hes5. Particularmente, Hey1 está regulado por Wnt a través de la señalización Jag1-Notch y los Bmps regulan diferencialmente a Hey1 y Hes5. Además, Hey1 y Hes5 muestran diferentes estabilidades de mRNA, lo que al menos en parte subyace a las respuestas temporales diferentes tras el bloqueo de Notch. La ganancia de la función de Hey1 o Hes5 muestra que existe una regulación cruzada y compleja. Tanto como Hey1 y Hes5 suprimen la expresión Dl1, lo que sugiere que cooperan durante la inhibición lateral. Por otro lado, a pesar de su asociación con Jag1, Hey1 no es instrumental para la inducción lateral. Se sugiere que Hey1 y Hes5, son objeto de una regulación compleja que incluye diferentes niveles de actividad de Notch, la estabilidad de sus transcritos, la regulación cruzada y por otras vías de señalización que pueden así determinar los diferentes roles de Hey1 y Hes5 en el oído interno. During inner ear development, Notch exhibits two modes of operation: lateral induction, which is associated with prosensory specification, and lateral inhibition, which is involved in hair cell determination. These mechanisms depend respectively on two different ligands, Jagged1 (Jag1) and Delta1 (Dl1) and rely on a common signaling cascade initiated after Notch activation. In the chicken otocyst, expression of Jag1 and the Notch target Hey1 correlates well with lateral induction, whereas both Jag1 and Dl1 are expressed during lateral inhibition as are Notch targets Hey1 and Hes5. Other Hes/Hey genes do not show restricted expression patterns in the otic epithelium. We show that Jag1 drives lower levels of Notch activity than Dl1, which results in the differential expression of Hey1 and Hes5. In addition, Jag1 interferes with the ability of Dl1 to elicit high levels of Notch activity. Modeling the sensory epithelium when the two ligands are expressed together shows that ligand regulation, differential signaling strength and ligand competition are crucial for allowing the two modes of operation and for establishing the alternate pattern of hair cells and supporting cells. Jag1, while driving lateral induction on its own, facilitates patterning by lateral inhibition in the presence of Dl1. This novel behavior emerges from Jag1 acting as a competitive inhibitor of Dl1 for Notch signaling. Both modeling and experiments show that hair cell patterning is very robust. The model suggests that autoactivation of proneural factor Atoh1, upstream of Dl1, is a fundamental component for robustness. The results stress the importance of the levels of Notch signaling and ligand competition for Notch function. Hey1 and Hes5 are regulated by Notch, however, Hey1 expression pattern suggests that it may be also regulated by other Notch-independent mechanisms. The results show that Bmp, Wnt and Fgf pathways modify Hey1 and Hes5 expression in the inner ear. Particularly, Hey1 is regulated by Wnt through Jag1-Notch signaling and Bmps differentially regulate Hey1 and Hes5 expression. In addition, Hey1 and Hes5 show different mRNA stability that at least in part underlies differential temporal responses after Notch blockade. The gain of function of Hey1 or Hes5 shows that they cross-regulate each other in a rather complex manner. Both Hey1 and Hes5 suppress Dl1 expression, suggesting that they cooperate during lateral inhibition. On the other hand, in spite of its association with Jag1, Hey1 is not instrumental for lateral induction, which is promoted by Hes5. We suggest that Hey1 and Hes5, are subject of a rather complex regulation that includes different levels of Notch activity, the stability of their transcripts, cross regulation and other signaling pathways that may determine the different roles of Hey1 and Hes5 in inner ear.
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Resultados de la aplicación de un protocolo prequirúrgico de estadificaclón de maxima certeza en el tratamiento del carcinoma broncogénico

Obiols Fornell, Carme 19 December 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa El carcinoma broncogénico (CB) representa la primera causa de mortalidad por cáncer en ambos sexos en los países desarrollados. La evaluación prequirúrgica del mediastino es esencial para definir el pronóstico y guiar el tratamiento de estos pacientes. Las guías para la estadificación ganglionar mediastínica preoperatoria de la European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) recomiendan una exploración con certificación cito-histológica, ya sea con técnicas endoscópicas de punción guiada por ecografía o mediante una exploración quirúrgica del mediastino, en las siguientes situaciones: cuando la tomografía computerizada detecta ganglios mediastínicos de tamaño patológico, en tumores de localización central o cuando la tomografía por emisión de positrones (PET) muestra una hipercaptación mediastínica o hiliar. Así mismo, estas guías recomiendan la exploración y biopsia de, como mínimo, las siguientes estaciones ganglionares mediastínicas: paratraqueales inferiores derechas e izquierdas, y subcarínica, cuyo estudio puede llevarse a cabo mediante técnicas de punción eco-endoscópicas. Cuando no se dispone de estas técnicas o su resultado es negativo, debe realizarse una exploración quirúrgica del mediastino (principalmente una mediastinoscopia cervical estándar), por presentar un mayor valor predictivo negativo. En el caso de los tumores izquierdos también se recomienda explorar las estaciones ganglionares paraórtica y subaórtica, que no son accesibles a través de las técnicas de punción eco-endoscópica. Para llevar a cabo su exploración es necesaria una técnica quirúrgica como la mediastinotomía paraesternal izquierda, la mediastinoscopia cervical extendida (MCE) o la videotoracoscopia izquierda. La MCE permite explorar las estaciones paraórtica y subaórtica, utilizando la misma incisión cervical realizada para la mediastinoscopia cervical estándar, y por lo tanto, la vía transcervical permite una exploración completa del mediastino superior y de la ventana aorto-pulmonar. Los objetivos de la presente tesis, que se basa en dos artículos publicados y relacionados entre sí, son: evaluar los valores de estadificación obtenidos tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico de evaluación ganglionar mediastínica basado en las guías de estadificación de la ESTS, evaluar la rentabilidad de la MCE en la estadificación del CB izquierdo y, finalmente, evaluar la supervivencia de aquellos pacientes intervenidos quirúrgicamente con afectación ganglionar mediastínica insospechada N2p. El primer trabajo es un estudio retrospectivo (1998-2010) de 221 MCE de estadificación realizadas en pacientes con CB izquierdo. Se analizó la precisión diagnóstica de la técnica y del protocolo en 2 períodos: 1998-2003 con MCE sistemática y 2004-2010 con PET sistemática y MCE selectiva. Los resultados obtenidos mostraron que la MCE posee una elevada precisión diagnóstica (sensibilidad: 0.67; valor predictivo negativo: 0.94; exactitud diagnóstica: 0.95) para la detección clínica de N2. Su uso selectivo permite reducir la MCE en cerca del 30 % de los pacientes con sin disminuir el valor predictivo negativo del protocolo en ambos períodos. El segundo trabajo es un estudio retrospectivo (2004-2010) de 540 pacientes estadificados y operados siguiendo las guías de la ESTS. Se analizaron los valores de estadificación y la supervivencia del subgrupo de pacientes con resultado final N2p. Los resultados obtenidos mostraron que tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico basado en las guías de la ESTS se consigue unos valores de estadificación elevados (valor predictivo negativo: 0.91) con una baja tasa de falsos negativos (5.5%). Los pacientes con resultado final N2p insospechado presentan una mejor supervivencia (supervivencia a los 5 años del 40%) que la esperada en comparación con la observada en los pacientes quirúrgicos de la base de datos de la International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) utilizada para la 7ª edición de la clasificación TNM. En conclusión, las guías de la ESTS deben implementarse en la práctica clínica a la luz de los buenos resultados de estadificación y supervivencia. Preoperative mediastinal staging is essential to predict prognosis and to guide treatment in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) guidelines for preoperative mediastinal nodal staging recommend tissue confirmation when computed tomography shows enlarged nodes, in central tumors or when positron emission tomography (PET) shows an increased mediastinal or hilar uptake. The recommendation is to explore the right and left inferior paratracheal, and subcarinal stations. In left-sided tumors, the exploration of subaortic and paraortic nodal stations is also recommended. This can be done by extended cervical mediastinoscopy (ECM). This thesis is based on two published and related articles, the objectives of which are: to evaluate the staging values after applying a preoperative mediastinal staging protocol according to the ESTS guidelines, to evaluate the accuracy of ECM for staging left-sided NSCLC and to evaluate the survival of surgically treated patients with unsuspected mediastinal pathological (p) N2 disease. The first publication is a retrospective study that includes 221 ECM for staging left NSCLC. The accuracy of the technique and of the protocol were calculated in two periods: 1998-2003 with systematic ECM and 2004-2010 with systematic PET and selective ECM. The results of this study show a high diagnostic accuracy of ECM (sensitivity: 0.67; negative predictive value: 0.94; accuracy: 0.95). Its selective indication allows reducing ECM in near 30% of the patients without reducing the negative predictive value of the protocol. The second publication is a retrospective study (2004-2010) including 540 patients staged and operated following the ESTS guidelines. The results of this study show that after applying the ESTS guidelines, high staging values (negative predictive value: 0.91) and low false negative rate (5.5%) are observed. Survival rate in patients with unsuspected pN2 disease was higher (5-year survival rate of 40%) than expected, compared with survival of surgical patients with pN2 of the International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) database used to inform the 7th edition of TNM classification. Therefore, the ESTS guidelines on preoperative mediastinal nodal staging should be used in clinical practice.
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Reconstrucción y cuantificación de estudios SPECT en animal pequeño

Pino Sorroche, Francisco 21 October 2014 (has links)
Los sistemas SPECT de animal pequeño alcanzan una resolución espacial inferior al milímetro. Para conseguirlo, es necesario utilizar colimadores pinhole, ya que la imagen del objeto proyectada en la gammacámara a través del pequeño orificio del colimador puede estar ampliada respecto al objeto. Con el fin de optimizar el proceso de reconstrucción y obtener resoluciones submilimétricas utilizando equipos de pequeño formato equipados con un colimador pinhole, es necesario utilizar métodos de reconstrucción iterativos. Estos algoritmos ofrecen una calidad de imagen superior y una mejor exactitud en la cuantificación que los métodos de reconstrucción analíticos, al poder corregir las diferentes degradaciones sufridas en el proceso de formación de la imagen. A continuación se detalla el trabajo desarrollado y los principales resultados obtenidos para conseguir este objetivo: 1. Implementación de un programa de calibración para calcular los parámetros geométricos que describen la adquisición de un equipo SPECT equipado con colimador pinhole. 2. Desarrollo de un algoritmo de reconstrucción iterativa OSEM para la reconstrucción de estudios SPECT con colimador pinhole. 3. Adaptación el algoritmo de reconstrucción y el programa de calibración a un equipo SPECT con colimador pinhole de pequeño formato desarrollado en nuestro centro. La resolución tomográfica del equipo fue de 1 mm para radios de adquisición pequeños. Las imágenes reconstruidas de estudios en ratones muestran la viabilidad del equipo para su utilización con pequeños animales. 4. Incorporación en la matriz de transición del sistema la geometría del sistema, la penetración septal a través del colimador y la respuesta del detector. La resolución, el contraste y los coeficientes de recuperación mejoran al incorporar la penetración septal respecto a la modelización geométrica, aunque la mejora más importante se obtuvo al incluir la respuesta del detector. El número de iteraciones utilizadas en la reconstrucción debe limitarse para evitar la aparición de artefactos de anillo. Estos artefactos son de mayor importancia cuando la modelización del sistema incorpora la geometría, la penetración septal y la respuesta del detector. 5. Comparación del algoritmo de reconstrucción desarrollado con un algoritmo de reconstrucción que calcula la matriz de transición con técnicas de Monte Carlo. El tiempo de cálculo de la matriz de transición del sistema con la aproximación analítica fue tres órdenes de magnitud inferior al de la aproximación por Monte Carlo. La resolución y el contraste de las imágenes reconstruidas mediante ambas aproximaciones fueron similares. Las imágenes reconstruidas con el modelo Monte Carlo presentaban una relación señal/ruido sensiblemente más baja, posiblemente asociada a problemas de precisión en el cálculo de los elementos de matriz por la utilización de un número insuficiente de historias de fotones en el cálculo. Small animal SPECT systems can achieve a spatial resolution of less than 1 mm. Such resolution is possible thanks to pinhole collimators, which can amplify the gamma camera projection of the object, and by using iterative reconstruction methods. These methods improve image quality and offer better quantification accuracy than analytic reconstruction methods, by correcting the different degradations that occur during the image formation process. The work developed and the main results are detailed as follows: 1. A calibration program to calculate geometric parameters that describe the acquisition process of a SPECT system with a pinhole collimator was implemented. 2. An OSEM iterative reconstruction algorithm for SPECT studies acquired with a pinhole collimator was developed. 3. The reconstruction algorithm and the calibration program were adapted to an in-house developed small SPECT device with a pinhole collimator. Tomographic resolution was 1 mm for small acquisition radii. Image reconstruction of mice studies showed the viability of using the equipment with small animals. 4. System geometry, septal penetration through the collimator and detector were incorporated response to the transition matrix. In the first approach, the system geometry was incorporated. Resolution, contrast, and recovery coefficients improved when septal penetration was modeled, although the greatest improvement was obtained when detector response was included. Iterations had to be limited to avoid the appearance of ring-artifacts. 5. The reconstruction algorithm developed (analytical model) was compared with a reconstruction algorithm which calculates the transition matrix based on Monte Carlo techniques (Monte Carlo model). The computation time of the transition matrix system using the analytical approach was three orders of magnitude lower than the Monte Carlo approach. Resolution and contrast of the reconstructed images using the two approaches were similar. Images reconstructed with the Monte Carlo model presented a lower signal-to-noise ratio than images reconstructed with the analytical model, possibly due to accuracy problems associated with the matrix elements because of an insufficient number of photons in the calculation.
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Influencias de los iones salinos sobre el fraccionamiento cromatográfico de la bilirrubina

Carreras Barnés, Josep, 1943-2014 1 January 1969 (has links)
Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Medicina La distinción de diferentes formas o compuestos de bilirrubina se ha basado durante mucho tiempo en algunas particularidades de la diazoreacción que sirve para detectar la presencia del pigmento y para determinarlo cuantativamente por colorimetría. En los últimos lustros han sido introducidas algunas técnicas de análisis cromatográfico que han permitido separar distintas fracciones de bilirrubina, pero se sigue recurriendo a la diazorreacción para caracterizarlas y distinguirlas. En 1913, Hijmans Van den Bergh y Snapper introdujeron la reacción diazoica para la determinación cuantitativa de la bilirrubina en el suero, usando etanol con el fin de eliminar las proteínas y obtener un medio homogéneo, en el que fueran solubles la bilirrubina y el agente acoplante. Unos años más tarde Van den Bergh y Müller descubrieron, accidentalmente, que el alcohol no es necesario para el desarrollo del color cuando la reacción se realiza en la bilis y en ciertos sueros ictéricos, y describieron dos tipos de reacción: la “reacción directa", caracterizada por ocurrir en ausencia de alcohol, inmediatamente antes de los 30 segundos, y alcanzando rápidamente la máxima intensidad, y la "reacción indirecta", en la que el color, en ausencia de alcohol, tarda en aparecer de 2 a 4 minutos o incluso más tiempo y alcanza la intensidad máxima muy lentamente. Investigaciones posteriores condujeron a nuevas subdivisiones, ya que se distinguieron tres subtipos de "reacción directa": la inmediata, la retardada y la bifásica. No obstante, como destaca Witt, la diferenciación entre ellas es muy forzada; en realidad todos los sueros, incluso los que se consideran de reacción indirecta típica, pueden dar, sin necesidad de añadir alcohol, una ligera coloración que se inicia después de media hora, una hora o más tiempo, según los casos, y se intensifica lentamente, alcanzando su máxima intensidad en varias horas, hasta 24 en algunos casos (Katznelson, 1920). Las únicas disoluciones con una reacción verdaderamente negativa son las soluciones coloidales acuosas de bilirrubina pura, que no reaccionan aunque se añada alcohol o cualquier otra sustancia. Como resultado de estas investigaciones y las realizadas más adelante, se han descrito diversos "agentes acoplantes" capaces de acelerar la reacción diazoica y de convertir en “directa" la reacción “indirecta" de ciertos sueros y de las disoluciones puras de bilirrubina. Entre ellos se encuentran los alcoholes y otros disolventes orgánicos (acetona, piridina), ciertos ácidos orgánicos (acético glacial, acetoacético, butírico y cítrico), algunas sales de ácidos débiles (acetato sódico, benzoato sódico, salicilato sódico), los ácidos y las sales biliares, y diversas sustancias como cafeína, urea, acetamina y antipirina. En algunos casos el efecto acelerador o acoplante puede ser atribuido a modificaciones del pH, a acciones físicas facilitadoras de la solubilidad de la bilirrubina o a la formación de compuestos moleculares más fácilmente solubles; pero en otros casos, el mecanismo de acción permanece sin explicar. Además, se han encontrado algunos compuestos (ácido ascórbico, cisteína y glutation) capaces de actuar en forma contraria, inhibiendo la reacción diazoica y se ha comprobado que ciertos iones, aniones y cationes, ejercen también una considerable influencia, generalmente aceleradora, sobre la diazorreacción. (Texto extraído y adaptado de la Tesis)
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Bases moleculars de la Leucoeocefalopatia Megalencefàllca amb Quists subcorlicals. Utilització de models animals i cel.lulars

Sirisi Dolcet, Sònia 19 September 2014 (has links)
Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals, també anomenada MLC, és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel•lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. En la present tesi s’han generat i estudiat diferents models animals i cel•lulars per a l’estudi de la malaltia. En primer lloc, s’ha generat i s’ha caracteritzat un model de ratolí knock-out per a Mlc1. Gràcies a aquest model s’ha observat que la proteïna MLC1 és únicament astrocitària i que la proteïna GlialCAM no es independent de MLC1, ja que en absència d’aquesta es troba deslocalitzada en el cerebel. També s’ha pogut descriure per primer cop la implicació del canal de Cl- ClC-2 en la fisiopatologia, ja que els seus nivells de proteïna disminuixen en el cerebel i el canal es troba gairebé inactiu en els oligodendròcits de l’animal knock-out. Les característiques fenotípiques que presenta el model de ratolí equivalen a les característiques observades en els pacients en fases inicials de la malaltia, ja que l’animal tot i que mostra presència de vacuoles no presenta deteriorament motor i macrocefàlia aparent. També s’ha generat un model de peix zebra knock-out per a zmlc1. Aquest model presenta avantatges respecte el ratolí, com per exemple el baix cost o l’aplicació de tècniques genètiques a gran escala. Aquest model ha permés observar de nou que realment GlialCAM necessita a MLC1 per a la seva correcta localització. També s’ha observat que l’ortòleg zGlialCAMa conserva la seva funció de entre espécies ja que també es capaç de modificar les corrents de ClC-2. Aquests resultats obtinguts amb els models s’han pogut comparar amb el cervell d’una pacient. Aquest cervell demostra que MLC1 és necessària per a la correcta localització de GlialCAM en la regió del cerebel. Per altra banda, s’han desenvolupat diferents models cel•lulars. Primerament s’han estudiat els astròcits del ratolí knock-out. Aquestes cel•lules mancades de MLC1 també presenten vacuoles per tot el citoplasma, però no mostren canvis en la localització ni en els nivells de proteïna de GlialCAM i ClC-2. Aquest fet juntament amb altres estudis del grup van fer pensar si la condició necessària per a que es veguessin afectades aquestes proteïnes estaria relacionada amb el procés del sifoneig de K+. Estudis realitzats en astròcits de rata demostren que en condicions d’un alt contingut de K+, com per exemple durant una alta activitat neuronal, GlialCAM i ClC-2 és localitzen juntament a les membranes cel•lular i ClC-2 canvia les seves propietat de canal. Paral•lelament, estudis realitzats en oligodendròcits de rata també demostren que aquest fet també succeix en aquest tipus cel•lular. Megalencefalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, also known as MLC, is a rare type of leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. In this work we have developed two different models to study the physiopathology. The results show that GlialCAM affected by the absence of MLC1. It has been also demonstrated that ClC-2 is implicated in the disease.These results were compared with a patient brian and has been shown that MLC1 is important for the correct location of GlialCAM in the cerbellum. Have also been developed a different cellular models. The results with this models show that GlialCAM and ClC-2 could have a functional role in the process of potassium siphoning.
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Spinal cord injury: Role of endothelial differentiation gene family lysophosphatidic acid receptors

Santos Nogueira, Eva 18 December 2014 (has links)
El daño tisular secundario que se produce tras una lesión de la médula espinal contribuye de manera significativa a las pérdidas funcionales que se observan pacientes que padecen este tipo de afectación. Aunque la regeneración axonal y la sustitución de las neuronas dañadas tras el traumatismo medular son objetivos importantes para reparar estas lesiones, el desarrollo de estrategias experimentales que tengan como meta evitar el daño secundario sobre axones, neuronas, mielina y las células gliales, sea probablemente más factible de conseguir. La respuesta inflamatoria que se produce después de la lesión contribuye de manera significativa al daño secundario. Actualmente se conocen varios mecanismos encargados de promover el reclutamiento de leucocitos de la circulación periférica al tejido medular lesionado, y la activación de las células gliales endógenas. Sin embargo, las moléculas que desencadenan y modulan estas respuestas no se conocen con detalle. El ácido lisofosfatídico (LPA) es un potente mediador lipídico que activa y regula una gran variedad de respuestas celulares, tales como la homeostasis de calcio, la remodelación del citoesqueleto, la proliferación y supervivencia , la adhesión y migración, y la respuesta inflamatoria . El LPA ejerce todas estas funciones biológicas mediante la activación de 6 receptores acoplados a proteínas G, conocidos como LPARs (LPAR1-6). Estudios recientes ponen de manifiesto la implicación del LPA en el desarrollo de varias patologías, coma la arteriosclerosis, el cáncer y la fibrosis pulmonar, entre otros. Sin embargo, escasos estudios han evaluado hasta el momento si LPA está implicado en el transcurso de patologías que afectan sistema nervioso. Varias observaciones que proceden de cultivos celulares revelan que el LPA es capaz de activar las células microgliales y astrogliales, de inducir la muerte de neuronas, y promover la retracción axonal. Estudios realizados con animales de experimentación también muestran que el LPA está implicado en la etiología de la hidrocefalia fetal, y en el desarrollo de dolor neuropático tras la lesión del nervio ciático y tras isquemia cerebral. Sin embargo, se desconoce actualmente si el LPA participa de manera activa en la fisiopatología de la lesión medular. Durante los últimos 3 años hemos obtenido datos experimentales que demuestran que los niveles de LPA aumentan rápidamente en la médula espinal lesionada. También tenemos evidencias convincentes que sugieren que el aumento de los niveles de LPA que se produce en el parénquima medular tras una lesión por contusión desempeña un papel clave en la activación de una respuesta inflamatoria y en el desarrollo del daño secundario, y consecuentemente, en la aparición de déficits funcionales. En la presente tesis hemos elucidado qué receptores del LPA pertenecientes a la familia génica de diferenciación endotelial (LPA1-3) ejercen efectos nocivos en la lesión medular. Demostramos que los receptores LPA1 y LPA2 contribuyen a la generación del daño tisular tras la lesión medular y a la generación de déficits functionales, mientras que el receptor LPA3 ejerce efectos neutrales. Asimismo, describimos los mecanismos por los cuales los receptores LPA1 y LPA2 promueven daño neuronal y desmielinización. Dado que las principales compañías farmacéuticas están interesadas en el desarrollo de agonistas y antagonistas de los distintos receptores del LPA para el tratamiento de varias patologías de gran repercusión clínica, dicha estrategia tiene una gran posibilidad de traslación clínica. Secondary tissue damage that occurs after spinal cord injury (SCI) contributes significantly to permanent functional disabilities. Although regeneration of damaged axons and replacement of lost neurons are important goals to repair the injured spinal cord, the secondary damage to axons, neurons, myelin and glial cells that follows the initial trauma is likely to be more easily amenable to treatment. Therefore, preventing or minimizing such secondary damage after SCI is expected to substantially reduce functional deficits. The inflammatory response that occurs after SCI strongly contributes to secondary injury. A number of mechanisms underlie the recruitment of leukocytes from the peripheral circulation, and the activation of these cells and endogenous microglia and astrocytes within the injured spinal cord. However, the molecules that trigger these responses are not completely known. Lysophosphatidic acid (LPA) is a potent, biologically active lipid mediator that regulates many physiological functions such as of cellular Ca2+ homeostasis, cytoskeleton remodeling, proliferation and survival, adhesion and migration and inflammation. LPA exerts all these functions by signaling via 6 G-protein coupled receptors known as LPARs (LPA1-6). Recent studies highlight the involvement of LPA in the development of many human diseases, such as atherosclerosis, cancer and pulmonary fibrosis. However, few studies have assessed so far whether LPA contributes to nervous system pathologies. Several in vitro observations reveal that LPA activates astrocytes and microglial cells, causes neuronal cell death, and promotes axonal retraction. In vivo studies also show that LPA is involved in the etiology of fetal hydrocephalus, as well as the development of neuropathic pain after sciatic nerve injury and cerebral ischemia. However, whether LPA is involved in the pathophysiology of SCI is still unknown. We currently have novel unpublished data demonstrating that LPA levels rapidly increased in the contused spinal cord. We have also clear evidences indicating that administration of LPA into the uninjured spinal cords triggers glial cell activation and demyelination, and leads to motor impairments. Altogether, our preliminary results strongly suggest that the increased levels of LPA that occurs after SCI may play an important role in triggering secondary damage and functional impairments. The present thesis aimed at assessing which of endothelial differentiation gene family LPA receptors (LPA1-3) exert such harmful effects in SCI. We found that LPA1 and LPA2 contribute to tissue damage and functional impairments after SCI, whereas LPA3 has a neutral effect.. Moreover, we reveal the mechanisms underlying neuronal cell death and demyelination triggered by LPA1 and LPA2. Since major pharmaceutical companies are interested in the development of LPA receptor agonists and antagonists for the treatment of several human diseases, such treatments have a high likelihood of progressing rapidly to the clinic.
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Especificidad de las poblaciones neuronales activadas en respuesta a distintos estímulos estresantes emocionales

Marín Blasco, Ignacio Javier 7 July 2014 (has links)
La exposición a estímulos estresantes de tipo emocional induce activación neuronal en muchas regiones del SNC que cursa en paralelo con una estimulación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA). La activación neuronal suele valorarse mediante la inducción de genes de expre-sión temprana como c-fos, mientas que la activación del eje HPA se basa en la expresión del factor liberador de corticotropina (CRF) en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) y en la liberación de hormonas como la ACTH y los glucocorticoides. Numerosos estudios sugieren que la expresión de c-fos y CRF alcanza un máximo alrededor de los 15-30 min de iniciada la exposición al estrés, para disminuir posteriormente a pesar de la persistencia del estímulo estre-sante. Esta disminución de la respuesta podría obedecer a cambios en las señales estimuladoras y/o inhibidoras que llegan a la neurona como consecuencia de la exposición prolongada al mis-mo estímulo estresante, o bien a mecanismos de represión intracelular. Razonamos que si la hipótesis de los cambios en las señales es correcta, la expresión de dichos genes se restablecería en gran medida en respuesta a un nuevo estímulo estresante, en tanto que si la segunda hipótesis es la válida, la expresión debería estar bloqueada. Utilizando la rata como modelo, hemos estudiado en un primer experimento mediante hibrida-ción in situ (ISH), los cambios en la expresión de c-fos y CRF, y los cambios en los niveles plas-máticos de ACTH y corticosterona tras la exposición prolongada (unas 4 h) a una inmoviliza-ción en plancha (IMO) y cómo esta exposición a la IMO afecta a la respuesta a un nuevo estímu-lo estresante (nado forzado). Los resultados de expresión de c-fos indicaron que en la corteza prefrontal medial (mPFC), el septum lateral ventral (LSv) y la amígdala medial (MeA) la res-puesta al nado tras la IMO prolongada es capaz de restablecerse en gran medida, dando validez a la hipótesis de una reducción de las señales que llegan a las neuronas. Sin embargo, en el PVN la expresión de c-fos en respuesta al nado tras la IMO prolongada se encuentra en su mayor parte bloqueada, sugiriendo un bloqueo intracelular. En consonancia con los resultados de expresión de c-fos en el PVN, tanto la expresión de CRF como la secreción de ACTH en respuesta al nado se encuentran totalmente bloqueadas tras la IMO prolongada. Una interpretación correcta de estos primeros resultados, precisa conocer si las poblaciones neuronales activadas durante la IMO prolongada coinciden o no con las que responden al nado tras esta IMO. Al objetivo de identificar estas neuronas hemos realizado un nuevo experimento similar al anterior pero incluyendo un grupo de animales que fue liberado de la IMO prolonga-da y re-expuesto a una nueva IMO. La finalidad de este grupo era diferenciar la activación debi-da exclusivamente al nado de la que pudiera producirse por otros procesos como la simple ma-nipulación del animal o la propia liberación de la IMO. Para identificar las poblaciones neuro-nales que responden a la IMO prolongada y al nado, hemos realizado un doble marcaje de la proteína c-Fos y el mRNA que codifica para esta proteína mediante inmunofluorescencia e ISH fluorescente (IF-FISH). Basándonos en la dinámica de ambos marcadores, las neuronas que responden a la IMO prolongada mostrarían fundamentalmente proteína y poco o nulo mRNA, mientras que las que responden al nado aplicado tras esta IMO mostrarían fundamentalmente mRNA y nula proteína. Tras este análisis hemos observado que en regiones como el mPFC, el LSV y la MeA, la exposición al nado tras la IMO prolongada provocó la activación de nuevas neuronas sugiriendo cierta especificidad en la respuesta a ambos estímulos estresantes. Sin em-bargo, en el PVN con la exposición al nado tras la IMO prolongada no provocó activación de nuevas neuronas, confirmando la existencia de una sola población neuronal que responde indis- tintamente frente a estímulos estresantes de distinta naturaleza que es bloqueada tras una esti-mulación prolongada. Una gran parte de la activación neuronal observada en términos de expresión de c-fos en res-puesta a los distintos estímulos estresantes podría deberse a procesos de activación generalizada o de arousal que enmascararía aquellas neuronas que son realmente importantes en la respuesta al estrés. En un último experimento hemos pretendido disminuir la aportación del arousal, ad-ministrando a nivel sistémico DSP-4, una neurotoxina altamente selectiva para las terminales noradrenérgicas provenientes del LC. Una semana después de la administración de DSP-4, ex-pusimos a los animales a estímulos estresantes de diferente intensidad (ambiente nuevo, olor al depredador e IMO) para posteriormente analizar la expresión de c-fos mediante FISH en el mPFC, el LSv, la MeA y el PVN. El alcance de la lesión sobre las terminales noradrenérgicas del LC se valoró mediante inmunoflorescencia de la dopamina beta-hidroxilasa (DβH). En concor-dancia con datos de la literatura, sólo en el mPFC y la MeA se pudo apreciar una disminución en las terminales noradrenérgicas. La lesión con el DSP-4 no tuvo un impacto sobre la expresión de c-fos en respuesta a los distintos estímulos estresantes, salvo en la respuesta del LSv a la IMO donde se observó una disminución. En conjunto, los resultados sugieren que en la reducción de la expresión de c-fos observada tras la exposición prolongada a un estímulo emocional pueden intervenir tanto la familiarización con el estímulo y la consiguiente reducción de las señales estimuladoras como la represión in-tracelular de la expresión del gen. La contribución de cada uno de los mecanismos es marcada-mente dependiente del área estudiada. Por otro lado, parecen existir poblaciones de neuronas que responden específicamente a la IMO y al nado, aunque muchas de ellas pueden ser comunes a ambos. En la respuesta del eje HPA podrían añadirse bloqueos adicionales que probablemente contribuyen a reducir el posible impacto negativo de una liberación excesiva de glucocorticoi-des. El escaso impacto de la administración de DSP-4 podría explicarse por la existencia de me-canismos compensatorios y por lo tanto sería necesario valorar otras alternativas para disminuir la aportación del arousal a la respuesta de estrés. Exposition to emotional stressful stimuli leads to neuronal activation of several regions of the Central Nervous System (CNS) that converge into the stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). This neuronal activation can be measured by the induction of early expression genes (IEG) such as c-fos, while the activation of the HPA axis can be measured by the expression of the corticotrophin-releasing-factor (CRF) in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) and also by the release of hormones such as ACTH and glucocorti-coids. There are several studies that suggest the expression of c-fos and CRF to reach its maxi-mum around 15-30 min after initiation of the exposition to stress. A decline in these parameters is observed even with the persistence of the stressful stimuli. This decline could be due to chang-es in the stimulatory/inhibitory signals arriving to the neurons as a consequence of a prolonged exposition to the same stressful stimuli, or it could also be due to intracellular repression mech-anisms. If the former hypothesis is correct, the expression of such genes would be mostly reestablished in response to new stressful stimuli, however, if the second hypothesis is valid, the expression should be blocked. In a first experiment we studied changes in the expression of c-fos and CRF in the rat CNS and changes in plasma levels of ACTH and corticosterone after a prolonged exposure (4 h approx.) to immobilization (IMO). We then assessed how this exposure could affect the response to a new stressor (forced swim). The results of expression of c-fos indicated that in the medial pre-frontal cortex (mPFC), the ventral lateral septum (LSv) and the medial amygdala (MeA) the response after prolonged IMO can be greatly restored, validating the hypothesis of a reduction of signals arriving to the neurons. However, in the PVN, the c-fos expression in response to forced swimming after prolonged IMO is largely blocked, suggesting an intracellular repression. Corroborating the results of c-fos expression in the PVN, the expression of CRF and ACTH secretion in response to forced swim are completely blocked after prolonged IMO. A correct interpretation of these first results requires knowing whether the neuronal popula-tions activated during prolonged IMO are the same as those responding to the forced swim ap-plied after the prolonged IMO. In order to identify these neurons we performed a new experi-ment which was similar to the previous one but including a new group of animals that was re-exposed to a second IMO instead of the forced swim. The purpose of this group was to differen-tiate activation due exclusively to forced swim from the one that could be produced by other processes such as the simple manipulation of the animal or the release of IMO. To identify the neuronal populations that respond to prolonged IMO and forced swim, we have performed a double labeling of c-Fos protein and its mRNA. Given the dynamics of both markers, the neu-rons which respond to the prolonged IMO would show essentially protein and little or no mRNA, while those responding to forced swim applied after this IMO would show essentially mRNA and no protein. After this analysis we found that in regions such as the mPFC, LSV and MeA, exposure to forced swim after prolonged IMO triggered activation of new neurons sug-gesting some specificity in the response to both stressors. However, in the PVN exposure to forced swim after the prolonged IMO did not cause activation of new neurons, confirming the existence of a single neuronal population that responds similarly to different stressful stimuli, by which activation is inhibited after prolonged stimulation. A great part of the neuronal activation observed in terms of expression of c-fos in response to various stressful stimuli could be due to generalized activation or arousal processes. This activa- tion could mask those neurons that are really important in the stress response. In a final experi-ment we tried to decrease the contribution of arousal administrating DSP-4, a neurotoxin that is highly selective for LC noradrenergic terminals. One week after the administration of DSP-4, we exposed the animals to stressful stimuli differing in intensity (new enviroment, predator odor and IMO) and then we analyzed the expression of c-fos in the mPFC, LSV, MeA and PVN . The extent of the lesion on the noradrenergic terminals of LC was assessed by immunofluorescence of dopamine beta-hydroxylase (DβH). We observed only a decrease in noradrenergic terminals in the mPFC and MeA supporting data found in the bibliography. The DSP-4 lesion had no effect on the expression of c-fos in response to various stressors, except in the LSV in animals exposed to IMO where a decrease was observed. The results of this work suggest that the reduction of c-fos expression observed after prolonged exposure to an emotional stimulus may involve both familiarization with the stimulus, with the consequent reduction of stimulatory signals, as well as an intracellular repression of this gene. The contribution of each mechanism seems to be markedly dependent of each region con-cerned. On the other hand, it seems to exist neuronal populations that respond specifically to IMO and forced swim, although many of them may be common to both. The HPA axis response could probably include additional blockages that may help to reduce the negative impact of an excessive glucocorticoid release. The limited impact of the DSP-4 administration could be ex-plained by the existence of compensatory mechanisms, therefore other alternatives to reduce the contribution of arousal to stress response should be considered.

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