També adscrita al Dept. Farmàcia i Tecnologia Farmacèutica / En los últimos años, ha incrementado la importancia del estudio de los efectos cronobiológicos con respecto a la farmacología y el diagnóstico, no obstante, la aplicación de la cronobiología en la dermatología no ha sido prácticamente estudiada. Los ritmos circadianos pueden influir en la permeación y la absorción a través de la piel de fármacos administrados por vía dérmica y transdérmica o en la manifestación de enfermedades de la piel. Por otro lado, la melatonina es una sustancia que tiene propiedades demostradas muy diversas. Es la hormona principal en la regulación del ritmo de sueño-vigilia, pero también posee una potente actividad antioxidante y por tanto puede utilizarse para evitar la oxidación en los tratamientos con radioterapia y quimioterapia o por exposición a la radiación ultravioleta del Sol. En estos casos, pese a que la vía oral podría ser de elección, la piel sufre directamente la radiación UV y la radiación usada en la radioterapia. Conociendo la existencia de la cronofarmacocinética y de la cronofarmacología, ¿Sería lo mismo administrar una formulación con melatonina transdérmicamente a una hora del día que a otra? ¿Influyen los ritmo de la piel en cómo se absorbe la melatonina? Con el fin de responder a las preguntas planteadas, los objetivos de esta tesis doctoral han sido (1) la elaboración y caracterización de formulaciones con melatonina y otros compuestos para administración por vía dérmica/transdérmica capaces de ejercer una acción local como antioxidante y que pudiera absorberse para alcanzar la circulación sistémica y ejercer una acción reguladora de ritmos biológicos o antioxidante. (2) el estudio de variables funcionales de la piel en un modelo animal seleccionado para conocer si presentan un ritmo y si éstos siguen la ritmicidad del reloj biológico interno o bien tienen un funcionamiento libre, en distintas condiciones lumínicas y ambientales. (3) En base a los resultados del objetivo anterior, realizar un estudio cronofarmacocinético para evaluar si la presencia de los ritmos funcionales de la piel y del organismo tienen influencia en la farmacocinética de la melatonina. Los resultados obtenidos demuestran la presencia de ritmos en las variables funcionales de la piel analizadas y que éstos influyen en como la melatonina se absorbe a través de la piel, juntamente con el resto de variables del organismo que modulan los procesos de ADME, haciendo que durante la fase de reposo, la biodisponibilidad de la melatonina sea mayor. Por lo tanto, en el modelo animal utilizado, la fase de reposo es la recomendada para aplicar la melatonina por vía transdérmica tanto si se busca un efecto local como sistémico. / Circadian rhythms can influence the permeation and absorption of drugs through skin that are dermally or transdermally administered. Furthermore, melatonin is a substance that has very diverse properties demonstrated. It is the main hormone in regulating the rhythm of sleep-wake, but also has a potent antioxidant activity, therefore can be used to prevent the oxidation caused by treatment with radiation and chemotherapy or by exposure to ultraviolet radiation from the sun. In these cases, although the oral route may be preferred, the skin directly suffers the UV radiation and the radiation used in radiotherapy. Knowing the existence of chronopharmacokinetics and chronopharmacology, would it be the same to administer transdermally a formulation with melatonin at a time of the day or at another? Do the rhythms of the skin influence in the rate of melatonin that it is absorbed? In order to answer these questions, the objectives of this thesis were (1) the preparation and characterization of formulations with melatonin and other compounds for dermal/transdermal administration that would be able to exert a local action as an antioxidant, and that could be absorbed to reach the systemic circulation and exert a systemic antioxidant action or regulate biological rhythms (2) the study of skin function variables in an animal model, in different light and environmental conditions, to see if they are rhythmic and if they follow the rhythmicity of the internal biological clock, or on the contrary have a free run (3) based on the results of the previous objective, to perform a chronopharmacokinetics study to evaluate whether the presence of rhythms in the skin functions and in the body influence the pharmacokinetics of melatonin. The results have demonstrated the presence of circadian rhythms in skin functions for the parameters analyzed, and thus influence in melatonin absorption through the skin, along with other variables of the organism that modulate ADME processes. In the case of the rats, during the rest phase, the bioavailability of melatonin is greater than during activity phase. Therefore, in this animal model, the resting phase is the recommended for applying melatonin transdermally for obtaining a local or systemic effect.

Cocoa is a well recognized source of polyphenols, but studies on their consumption refer that it contributes with a low proportion to the daily polyphenol consumption. Cocoa polyphenol content is plenty recognized and the benefits from its consumption in human health are established. However, the contribution of cocoa to daily polyphenol intake is not totally clear due to the lack of studies estimating cocoa consumption. Taking these facts into account, the hypothesis of this thesis was that cocoa consumption is underestimated in overall food intake studies and perhaps it can be associated with healthy status. Therefore, the present thesis was carried out on the following aims: 1) to develop and validate a food frequency questionnaire (FFQ) including the main cocoa food products common in Catalan and Portuguese dietary habits in a young population; 2) to establish the consumption of cocoa in university students of Catalonia and Portugal; and 3) to establish the relationship between cocoa intake and healthy status, including the presence of allergies, and healthy lifestyle practices. The FFQ developed as well as the other questionnaires to validate them have been applied to a sample of 50 students from the University of Barcelona and to a sample of 70 students from Egas Moniz Health Sciences Institute. Afterwards, validated FFQ together questionnaires inquiring about physical activity and also health status were applied to a sample of 270 students from both institutions. The main results of this thesis consist in the development and validation of a FFQ devoted to know the real cocoa intake in University students in Spanish and Portuguese languages. This FFQ allows the assessment of more cocoa/chocolate product intake than others FFQ because it considered a wide range of products which were not included in others FFQ (dairy, pastry, desserts, cereals and spreads). According the developed FFQ, students from the University of Barcelona use to eat 2.5 portions of products containing cocoa or chocolate per day that represents 12 g of cocoa per day, whereas the students of the Egas Moniz Health Science Institute consume more than 3 products per day which represent 14 g of cocoa per day. Moreover, differential cocoa consumption patterns between both cohorts have been found. In a cohort of 270 students from both Universities it has been established correlations between cocoa consumption and physical activity, body mass index, blood pressure, recent illness and also allergic processes. In addition, the values of these variables were assessed in students grouped according their cocoa consumption (low, moderate and high consumers). There was not a significant correlation of cocoa intake with physical activity and blood pressure, but there was a significantly lower proportion of overweight individuals in the high cocoa consumers group. The proportion of allergic people in the moderate and high cocoa consumers resulted statistically lower than that in the students in the low cocoa consumer group. Moreover, the cocoa intake, especially moderate consumption, was also associated with lower presence of allergic derived symptoms. In summary, the present study evidences the underestimation of cocoa consumption due to approach limitations and has generated a valid tool for estimating real cocoa consumption. Cocoa intake in University students has been assessed, and different patterns of consumption have been found between Portuguese and Spanish university students regarding the type of cocoa source more frequently consumed. Finally, some clear associations between cocoa consumption and health status have been found. Therefore, this study can be the first part of a new study using the same methodology in a higher number of participants or different type of population. Alternatively, these health improvements by cocoa consumption showed here can be confirmed by an interventional clinical study. / El cacao posee efectos beneficiosos para el organismo, si bien estudios sobre ingesta de alimentos revelan su bajo consumo. Los objetivos de esta tesis han sido: 1) desarrollar y validar una encuesta de frecuencia de consumo alimentario que incluya los alimentos con cacao frecuentes en la dieta de Cataluña y Portugal; 2) estimar la ingesta de cacao en estudiantes universitarios de los dos países; y 3) evaluar la asociación entre ingesta de cacao e indicadores de actividad física y de salud, incluyendo las alergias. El FFQ desarrollado se ha validado con 50 estudiantes de la Universidad de Barcelona y 70 estudiantes de Egas Moniz Health Sciences Institute. Posteriormente, se ha aplicado a 270 estudiantes de ambas instituciones junto con cuestionarios acerca de su actividad física y su estado de salud. Los resultados muestran el desarrollo y validación de un FFQ dedicado a conocer la ingesta real de cacao en los estudiantes universitarios. Su aplicación ha permitido evaluar la ingesta de más productos de cacao/chocolate que otros FFQ, puesto que considera una amplia gama de productos. Según el FFQ desarrollado, los estudiantes de la Universidad de Barcelona ingieren 2,5 porciones de productos con cacao/chocolate por día, lo que representa unos 12 g/día, mientras que los estudiantes del Egas Moniz Health Sciences Institute consumen más de 3 productos por día, que representan unos 14 g/día. Se han estudiado la relación entre el consumo de cacao y la actividad física, el índice de masa corporal, la presión arterial, una enfermedad reciente y también procesos alérgicos. No se ha hallado una correlación significativa entre la ingesta de cacao y la actividad física y la presión arterial, pero existe una proporción menor de personas con sobrepeso en el grupo de estudiantes con elevado consumo de cacao. El porcentaje de personas alérgicas en el grupo con moderado y elevado consumo de cacao ha resultado ser inferior a la de los estudiantes en el grupo de baja ingesta de cacao. Por otra parte, el consumo de cacao, especialmente el consumo moderado, también se ha podido asociar a una menor presencia de manifestaciones alérgicas.

La exposición a una sesión breve de choques eléctricos en un contexto determinado induce el desarrollo de miedo a dicho contexto, fenómeno conocido como condicionamiento de miedo al contexto. Además, produce a largo plazo una inhibición de la actividad en ambientes nuevos, efecto no necesariamente asociado a un aumento de la ansiedad, por lo que la interpretación de esta hipo-actividad se desconoce. Los resultados obtenidos indican que la aparición de la hipo-actividad inducida por la exposición previa a una sesión breve de choques eléctricos, sólo aparece si se ha podido desarrollar previamente un condicionamiento del miedo al contexto. Por otro lado, no observamos ninguna evidencia de un aumento de la conducta ansiosa. Este hallazgo sugiere que los animales que han podido desarrollar una generalización del miedo. Además, dicha hipo-actividad no iba asociada a un aumento de la respuesta del eje HPA y podía ser en gran medida revertida mediante la extinción del miedo condicionado. En el estudio de los efectos de la manipulación de la intensidad y el número de choques sobre los efectos condicionado, pudimos observar que desde un punto de vista conductual, la manipulación de los parámetros resultó poco efectiva, lo que contrasta con lo observado en la inducción de la hipoactividad, donde la variación de la intensidad si resultó relevante. Sin embargo, se observó una respuesta endocrina intensidad-dependiente delante del contexto condicionado. Por otro lado, la sensibilización hormonal observada tras la exposición a un ambiente nuevo está relacionada con la intensidad del choque recibido. Por último, el estudio de la IMO como estímulo estresante no mostró evidencias de condicionamiento ni a nivel conductual ni endocrino. Por lo tanto, concluimos que el desarrollo del condicionamiento del miedo, evaluado mediante medidas conductuales y endocrinas, no es una propiedad universal compartida por todos los estímulos estresantes, lo que ayudaría a explicar las divergencias en los efectos a largo plazo obtenidos con diferentes estímulos estresantes. / Exposure to a single session of footshock in absence of any specific cues results in the development of fear to the shock chamber, this is called contextual fear conditioning, that it is usually evaluated by time spend freezing. Furthermore, this shock exposure induces long-lasting inhibition of activity in unknown environments, these effects are not necessarily associated to an enhanced anxiety and the interpretation of the hypoactivity remains unclear. However, the development of contextual fear conditioning using other stressors remains poorly studied. Our results indicated that hypoactivity and a certain level of generalization of fear to the unknown environment only appeared when animals are able to developed fear conditioning, but no evidence for enhanced anxiety was found. These results suggest that if animals are able to associate an aversive experience with unknown environments, they display more caution behaviors in any unknown environments. In addition, this hypoactivity was not associated with greater HPA response in any different environment and it could be partially reversed by an extinction protocol. Moreover, the effect of shock intensity and number of shocks on both conditioned and unconditioned consequences was also studied. From the behavioural point of view the manipulation of intensity and number of shocks does not appear to be very relevant. But, an intensity-dependent endocrine response is observed when animals were exposed to the conditioned context. On the other hand, the endocrine sensitization after novel environments exposure is related to the high response showed after shock exposure. Regarding the use of other stressors to induce contextual fear conditioning, despite shock and IMO showed similar severity, no behavioural or endocrine evidence of conditioning was found if IMO was used as a stressor. Therefore, it can be concluded that development of fear conditioning, as evaluated by either behavioural or endocrine measures, appears to be dependent on the nature of the aversive stimuli. These phenomena could help to explain the divergences in long-lasting effects of each stressor.

El estrés oxidativo (OS) es característico de muchas enfermedades y se produce cuando hay un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes, lo cual favorece un estado oxidativo que genera especies reactivas de oxígeno y de nitrógeno. Los lípidos de la membrana plasmática son dianas preferentes del OS y ello tiene como consecuencia la peroxidación lipídica. Este proceso modifica propiedades de la membrana tales como su fluidez, característica física muy importante conocida por modular la localización de las proteínas de membrana y las uniones receptor-ligando. Objetivos: 1) Evaluar el efecto del OS en la regionalización de la fluidez en la membrana plasmática de células vivas tales como macrófagos THP-1 y linfocitos MEC-1, de manera individualizada. 2) Analizar, en estas células, la relación entre la peroxidación lipídica y la fluidez de membrana. 3) Estudiar el efecto del OS sobre la unión receptor-ligando y sobre la fluidez de membrana: lipopolisacárido/receptores de tipo Toll (TLR2/4) en macrófagos y progesterone-induced blocking factor (PIBF)/PIBF-receptor en linfocitos. Material y Métodos: Se estandarizó la metodología two-photon microscopy por primera vez en la Universidad Autónoma de Barcelona, para analizar la fluidez de membrana en células vivas individuales. Conjuntamente se ha desarrollado un nuevo software capaz de medir el tamaño y el número de los dominios lipídicos de membrana. El OS se indujo mediante H2O2 y se empleó la sonda fluorescente Laurdan para detectar las diferencias de fluidez en la membrana plasmática. Se utilizaron LPS y PIBF soluble en macrófagos y linfocitos respectivamente, para analizar interacciones receptor-ligando en condiciones OS. Resultados: En los macrófagos se observó un aumento significativo, dependiente de la concentración de H2O2, en la frecuencia de regiones lipídicas rígidas principalmente compuestas por dominios lipid raft, a expensas de las regiones de fluidez intermedia. Asimismo, se detectó en condiciones de OS, un mayor número, aunque no un mayor tamaño, de dominios lipid raft. La activación de macrófagos con LPS incrementó la frecuencia de regiones fluidas en las membranas, efecto que fue inhibido en condiciones de OS. En cuanto a la función de los macrófagos, se detectó una disminución en la secreción de TNFα en condiciones oxidantes. En los linfocitos se observó un aumentó significativo en la frecuencia de regiones lipídicas rígidas, a expensas de las regiones fluidas, en condiciones de OS. Por otro lado, la unión del PIBF a su receptor, provocó un aumentó en la rigidez de la membrana plasmática debido al clustering de dominios lipid raft. Por el contrario, cuando se indujo OS en linfocitos en presencia de PIBF, se inhibió el clustering de dominios lipid raft y también disminuyó el reconocimiento del receptor de PIBF a su ligando. Conclusiones: 1) Se ha evaluado en células vivas, de forma individual, la dinámica lipídica de la membrana plasmática. 2) Una consecuencia general importante es que, durante el OS, tanto en macrófagos como en linfocitos la membrana plasmática se vuelve más rígida. 3) La fluidez de membrana cambia de forma distinta en los dos tipos celulares estudiados, como consecuencia de las interacciones receptor-ligando: durante la unión LPS-TLR2/4 se observó un aumento en la fluidez de la membrana plasmática de los macrófagos y, por el contrario, durante la unión PIBF/PIBF-R la membrana de los linfocitos se rigidificó, aumentando el clustering de los dominios lipid raft. 4) No obstante, en ambos casos el OS inhibió los cambios en la fluidez de membrana inducidos por la unión receptor-ligando. / Oxidative stress is present in many diseases and it is produced in cells when an imbalance between oxidants and antioxidants occurs, favoring an oxidant status which produce reactive oxygen and nitrogen species. Lipids in plasma membrane are one of the preferential targets giving rise to lipid peroxidation. This process modifies membrane properties such as membrane fluidity, a very important physical feature known to modulate membrane protein localization and receptor-ligand binding. Aims: 1) To evaluate the effect of oxidative stress on plasma membrane fluidity regionalization of single living THP-1 macrophages and MEC-1 lymphocytes. 2) To analyze, in these cells, the relationship between lipid peroxidation and membrane fluidity. 3) To study the effect of oxidative stress on receptor-ligand binding and membrane fluidity: lipopolysaccharide/toll-like receptors (TLR2/4) in macrophages and progesterone-induced blocking factor (PIBF)/PIBF-receptor in lymphocytes. Material and Methods: Two-photon microscopy was standardized for the first time in Universidad Autónoma de Barcelona by our laboratory, to analyze membrane fluidity in single living cells. It was also developed a new software application to analyze membrane lipid domain size and number. Cellular oxidative stress was induced by H2O2; the fluorescent probe Laurdan was applied to evaluate plasma membrane fluidity changes. LPS in macrophages or soluble PIBF in lymphocytes were used to analyze receptor-ligand interactions under oxidative stress. Results: Macrophages showed a significant H2O2 concentration dependent increase in the frequency of rigid lipid regions, mainly attributable to lipid rafts, at the expense of the intermediate fluidity regions. Under oxidative stress conditions, an increase in number, but not in size, of lipid raft domains was detected. Macrophage activation by LPS increase the frequency of fluid regions, which was inhibited by oxidative stress. Concerning macrophage function, secretion of TNFα under oxidative conditions was decreased. Lymphocytes showed a significant increase in the frequency of rigid lipid regions, at the expense of fluid regions, under oxidative stress conditions. Upon PIBF binding to its receptor, lymphocyte plasma membrane became more rigid due to clustering of lipid rafts. However, when PIBF bound lymphocytes were placed in oxidizing conditions, lipid raft clustering was inhibited and PIBF binding to its receptor was also decreased. Conclusions: 1) In single living cells plasma membrane lipid dynamics was evaluated. 2) An important general consequence of oxidative stress is that both in macrophages and lymphocytes plasma membrane becomes more rigid. 3) Receptor-ligand interactions have an effect on membrane fluidity, which vary greatly between the two cell types studied: macrophages and lymphocytes. Upon receptor-ligand binding, macrophage plasma membrane became more fluid while lymphocytes plasma membrane became more rigid. Our results suggest that lipid raft clustering is linked to cell function: upon PIBF binding to its receptor lipid raft clustering occurs in lymphocytes; however, upon LPS/TLR2/4 lipid raft clustering does not occur in macrophages. 4) Nevertheless, the effect induced by receptor-ligand binding on membrane fluidity was inhibited during oxidative stress in both cases.

El glaucoma és una de les principals causes de ceguesa no traumàtica i afecta a milions de persones a tot el món. Aquesta patologia es caracteritza per una degeneració progresiva de les cèl·lules ganglionars de la retina i del nervi òptic i d'una pèrdua gradual del camp visual. Un dels principals factors de risc del glaucoma és l'augment de la pressió intraocular (IOP).L'humor aquós contingut a les cambres anterior i posterior de l'ull i l'equilibri entre la seva síntesi i evacuació determina la IOP. Quan l'evacuació de l'humor aquós disminueix, aquest fluid s'acumula a les cambres oculars i provoca un excés de pressió. En humans l'humor aquós s'evacua a través de la xarxa trabecular i el canal d'Schlemm. La xarxa trabecular és una estructura en forma de malla que modula l'evacuació de l'humor aquós mitjançant diferents mecanismes. Alteracions en aquest teixit comporten un augment de la resistència al pas de l'humor aquós, produint un augment de la IOP. Entre d'altres factors, el volum de les cèl·lules trabeculars modula activament la resistència al pas de l'humor aquós. Les cèl·lules trabeculars presenten un mecanisme homeostàtic en resposta a un augment de volum que es coneix amb el nom de regulatory volume decrease (RVD) i els permet recuperar el seu volum inicial amb l'eflux d'ions de potassi (K+), clorur (Cl-) i la sortida pasiva d'aigua.Ja que els canals de Cl- són claus en la regulació del volum cel·lular i que aquest mecanisme és un factor determinant en l'evacuació, és de gran interès estudiar els canals de Cl- a les cèl·lules trabeculars. Els resultats mostren que aquestes cel·lules expresen els canals de Cl- dependents de voltatge ClC-2, 3, 4,5,6 i 7. L'augment del volum cel·lular per hipotonicitat sobreexpressa el canal ClC-2 a les cel·lules trabeculars. L'elevada IOP durant una hora sobreexpressa el ClC-2 respecte el CIC-3. En canvi el canal ClC-3 se sobreexpressa en relació al ClC-2 després de 4 i 7 dies. Aquests resultats indiquen que ambdós canals podrien participar en el mecanisme homeostàtic que regula l'evacuació de l'humor aquós i estar relacionats amb la fisiopatologia del glaucoma.A les cel·lules trabeculars i amb la tècnica de patch clamp hem identificat els corrents de Cl- mitjançats pel canal ClC-2 que es caracteritzen per una rectificació d'entrada. La magnitud del corrent augmenta amb l'acidificació extracel·lular, l'AMPc i l'augment del volum cel·lular mentre que es bloqueja amb cadmi. La seqüència de permeabilitats aniòniques del corrent és Cl->Br->I->F->. Les cel·lules trabeculars també presenten corrents activats en condicions hipotòniques amb rectificació de sortida, inactivació dependent del temps als potencials positius i una seqüència de permeabilitats aniòniques de I-> Br->Cl->F>glucomnat-. L'activació del corrent requereix la presència d'ATP intracel·lular i es bloqueja amb Tamoxifen, DIDS i ATP extracel·lular. Les propietats electrofisiològiques i farmacològiques del corrent indiquen que es tracta del corrent de Cl- conegut amb el nom d' IClswell.Amb la tècnica fluorimètrica amb calceïna hem quantificat el mecanisme de RVD a les cel·lules trabeculars que els permet recuperar un 20% del seu volum después de 25 d'un augment del volum induït per hipotonicitat. L'aplicació de bloquejants específics dels diferents canals de Cl- indica que IClswell participa en el RVD de les cel·lules trabeculars mentre que el canal ClC-2 no col·labora en aquest mecanismo. Finalment, la hipotonicitat disminueix l'evacuació de l'humor aquós per l'augment del volum cel·lular i es recupera de manera progressiva per l'activació del RVD. Amb bloquejants específics hem determinat la implicació d' IClswell i del canal de K+ dependent de calci BKCa en la modulació de la facilitat d'evacuació mentre que el CIC-2 no hi té un paper rellevant. Per tant, les cèl·lules trabeculars poden modular de manera activa el seu volum i l'evacuació de l'humor aquós a travès dels canals Clswell i BKCa. / "Chrolide channels in the trabecular meshwork cells and their role in the aqueous humor outflow facility"In the eye, the balance between aqueous humor (AH) inflow and outflow determines intraocular pressure (IOP). The major AH outflow pathway in humans, is through the trabecular meshwork (TM) and the Schlemm's canal (SC). Impairment of AH outflow leads to ocular hypertension, which is the main risk factor to develop glaucoma. It is accepted that both TM cells and SC cells have an active role in modulating the IOP. Changes in TM cells volume may determine the AH outflow rate. Because cell volume is essential to TM function, we investigate cell volume and outflow facility regulation.The results showed that all members of the CLCN gene family but ClC-1 were detected in TM cells. After short periods of elevated pressure ClC-2 induction was significantly higher than that of ClC-3. In contrast, after long pressure insults ClC-3 mRNA was significantly increased. The expression of ClC-2 and ClC-3 were modified by cell swelling and dexamethasone, respectively.CIC-2 currents activated in TM cells were modified by changes in extracellular pH, 8Br-cAMP and hypotonicity-induced cell swelling. The anionic permeability sequence was CI->Br->I->F-. The electrophysiological data presented correlates nicely what the CIC-2 mRNA expression found in TM cells, thus we can conclude that TM cells express functional ClC-2 channels. Hypotonic media also activated a swelling-activated CI- current (Clswell) in TM cells. The current are characterized by an outward rectification, a time dependent decay at depolarizing voltages and an anion permeability sequence I>Br->Cl->F->gluconate-. The currents were inhibited by Tamoxifen, DIDS and external ATP.Cell swelling activates a regulatory volume decrease (RVD) mechanism that implies activation of K+ and Cl- currents. Our results obtained by blocking ClC-2 and Clswell currents showed that CIC-2 had no effect on RVD mechanism while the major contributor to CI- efflux is Clswell in TM cells. Hypotonic media decreased outflow facility in perfused anterior segments, which recovered to baseline levels. Clswell and BKCa channels are involved in a RVD because their selective blockade impair outflow facility recovery after cell swelling while CIC-2 block did not modify the outflow facility and are not involved in RVD mechanism.

La microbiota comensal del intestino se considera un factor clave en la homeostasis gastrointestinal. Las alteraciones funcionales gastrointestinales (síndrome del intestino irritable, SII) y las enfermedades inflamatorias intestinales (EII) se han relacionado con alteraciones de la microbiota comensal (disbiosis). Estos pacientes muestran una activación inmune local anormal, con respuestas motoras y sensoriales alteradas, que en el SII se traducen en estados de hipersensibilidad visceral. El papel causal de la microbiota no se conoce con exactitud, pero la presencia de disbiosis y los efectos positivos asociados al tratamiento con antibióticos o ciertos probióticos sugieren un papel destacado. Este trabajo explora la importancia de la microbiota intestinal modulando los sistemas sensoriales intestinales relacionados con el dolor visceral y sus efectos en respuestas nociceptivas viscerales. Para ello, se ha trabajado con ratas y ratones en los cuales se ha inducido un estado real (cambios adaptativos espontáneos, cambios inducidos por tratamiento con antibióticos) o simulado (estimulación directa de sistemas de interacción hospedador-microbiota) de disbiosis cólica. La microbiota (luminal y adherida al epitelio) se caracterizó usando hibridación in situ con sondas fluorescentes (FISH) y qPCR. La respuesta inmune local y los mecanismos de interacción hospedador-microbiota se valoraron determinando cambios en la expresión génica (RT-qPCR) de citoquinas, péptidos antimicrobianos, integrinas y receptores de tipo Toll (TLR), la producción de IgA secretora, alteraciones histopatológicas y el estado de la barrera de moco. Simultáneamente, se evaluaron cambios en la expresión de marcadores sensoriales. La sensibilidad visceral se valoró mediante el test de Writhing o la administración intracólica de capsaicina. La disbiosis cólica inducida por antibióticos, pero no la observada durante un proceso de adaptación espontánea al ambiente, se asoció a un estado de activación inmune local caracterizado por una regulación selectiva (tanto al alza como a la baja) de citoquinas pro-inflamatorias y de marcadores de interacción hospedador-microbiota y por cambios en los niveles luminales de IgA. Respuestas similares se observaron cuando se simuló al simular un estado de disbiosis mediante la estimulación local del TLR4 (lipopolisacárido) o del TLR7 (imiquimod). En ningún caso se observaron signos macroscópicos o microscópicos de colitis. Tanto en la rata como en el ratón, los estados de disbiosis cólica, real o simulada, se asociaron a una modulación local de la expresión de marcadores sensoriales (sistemas endocanabinoide, serotonérgico, opioide y vaniloide). Se observaron tanto regulaciones al alza como a la baja (RT-qPCR/inmunohistoquímica) dependiendo del modelo de disbiosis y del marcador sensorial considerado. Estos cambios moleculares se tradujeron en cambios funcionales relacionados con respuestas nociceptivas viscerales. Así, en ratones con disbiosis cólica inducida con antibióticos, las repuestas de dolor visceral determinadas con el test de Writhing o tras la administración intracólica de capsaicina mostraron una atenuación significativa con respecto a las observadas en animales control, sugiriendo un estado de hipoalgesia. Estos animales mostraron además una contractilidad cólica alterada (baño de órganos), indicativa de un estado de hipermotilidad. Estos resultados muestran que en estados de disbiosis intestinal se produce una activación inmune local, dirigida, probablemente, a la restauración de la composición de la microbiota. Se observa que la microbiota es capaz de modular la actividad de los sistemas sensoriales intestinales, generando cambios funcionales que se traducen, en las condiciones experimentales presentes, en una modificación de las respuestas de dolor visceral compatible con un estado de tipo analgésico. Mecanismos similares podrían explicar los efectos beneficiosos asociados al tratamiento con antibióticos o al uso de probióticos observados en pacientes con SII o EII. Estudios posteriores deberían centrarse en la caracterización de los grupos bacterianos específicamente responsables de estos efectos. Estos resultados muestran la importancia de la microbiota como factor patogénico en las alteraciones gastrointestinales y su interés como aproximación terapéutica para las mismas. / Gut commensal microbiota (GCM) is a key component of gastrointestinal homeostasis. Functional gastrointestinal disorders (mainly irritable bowel syndrome, IBS) and inflammatory bowel diseases (IBD) have been related to states of altered GCM (dysbiosis). Simultaneously, IBS and IBD patients show local states of abnormal immune activation with altered motor and sensory responses. In particular, in IBS patients sensory alterations lead to characteristic states of visceral hypersensitivity. The exact causal role of GCM remains unclear, but the presence of dysbiosis and the positive effects of antibiotics and some probiotics suggest a key role for the microbiota. The present work explores the potential role of gut microbiota affecting visceral pain-related sensory systems within the gut and the effects on nociceptive responses. For this purpose, states of real (spontaneous adaptive microbial changes, antibiotic treatment-derived microbial changes) or simulated (direct stimulation of host-bacterial interaction systems) colonic dysbiosis were generated in rats and mice. Colonic microbiota (luminal and wall-adhered) was characterized by fluorescent in situ hybridization (FISH) and qPCR. The immune status of the colon and bacterial-host interactions were determined assessing the expression (RT-qPCR) of pro- and anti-inflammatory cytokines; antimicrobial peptides, integrins and Toll-like receptors (TLRs), the production of secretory IgA (s-IgA), the presence of histopathological alterations and the state of the mucous barrier. Simultaneously, changes in sensory related markers were also assessed. Changes in viscerosensitivity were determined in conscious mice using the Writhing test or following the intracolonic administration of capsaicin. Overall, antibiotics-induced alterations of the GCM, but not spontaneous changes associated to environmental adaptation, generated a state of local immune activation within the colon. This state was characterized by selective up- and down-regulation of pro- and anti-inflammatory cytokines and host-bacterial interaction markers and changes in the amounts of s-IgA. Similar immune response was observed when a dysbiotic state was simulated in rats by the direct stimulation of colonic TLR4 with bacterial lipopolysaccharides (LPS) or TLR7 with the selective agonist imiquimod. Although these changes, and regardless the model considered, no macroscopical or microscopical signs of colonic inflammation were detected. In both, mice and rats, real or simulated colonic dysbiotic states were also associated to a local modulation of sensory-related markers (endocannabinoid, serotonergic, opioid and vanilloid systems), with specific treatment-related up- and down-regulatory responses (RT- qPCR and immunohistochemistry). These variations at the molecular level translated in functional changes as it relates to visceral pain-related responses. In mice with antibiotic-induced dysbiosis, visceral pain responses assessed using the Writhing test or the intracolonic administration of capsaicin were significantly attenuated when compared to non-dysbiotic animals; thus suggesting a hypoalgesic state. Moreover, colonic contractility assessed in vitro (organ bath) was also altered in dysbiotic mice, indicating a state of increased colonic motility. Generally, results obtained show that during states of dysbiosis of the GCM there is a complex host response that implies a local immune activation, probably directed towards the reshaping of the microbiota. Data obtained shows that the microbiota is able to influence gut sensory systems and that these changes translate at a functional level in the modulation of visceral pain, eliciting, at least in the present experimental conditions, analgesic-like responses. Similar underlying mechanisms might be responsible for the beneficial effects observed in IBD and, particularly, in IBS patients during antibiotic treatments or during the use of certain bacterial strains as probiotics. Further studies should address the characterization of the specific bacterial groups implicated in these effects. These results highlight the importance of the microbiota as pathogenic factor in gastrointestinal disorders and its potential as a therapeutic approach.

El receptor nuclear PPARgamma controla y regula variedad de procesos biológicos como la adipogénesis, respuestas inflamatorias, y la homeostasis de los carbohidratos y lípidos. En relación con la EHGNA, el aumento de expresión de PPARgamma es una característica general de la esteatosis hepática demostrada tanto en estudios clínicos como en experimentales. Aunque se ha demostrado que la administración de TZDs mejora la esteatosis hepática en pacientes con EHGNA. En el contexto de la inflamación y fibrosis hepática no se ha establecido el papel que ejerce PPARgamma. Se han descrito las funciones antiinflamatorias que puede ejercer PPARgamma modulando el estado de activación de los macrófagos. Por otro lado, múltiples publicaciones demuestran que la recuperación de la expresión de PPARgamma en las células hepáticas estrelladas (CHE) revierte el estado de activación característico de la fibrosis hacia el de quiescencia. No obstante, otros estudios muestran resultados opuestos considerando que las acciones antiinflamatorias de las TZDs pueden ser limitadas, no aplicables para todas las fases de la EHGNA y actuar de forma independiente a la activación de PPARgamma. Debido que a PPARgamma se le han atribuido funciones controvertidas sin definir sus funciones exactas en los estadios de la enfermedad hepática, el objetivo principal de la tesis fue determinar cómo contribuye la expresión de PPARgamma de las células del parénquima y sinusoide hepático en la patogénesis de la EHGNA. Para ello, hemos utilizado la tecnología Cre-LoxP para generar modelos genéticos (ratones knockout o KO condicionales) en los que se ha eliminado selectivamente el gen para PPARgamma de forma específica en hepatocito, en macrófago así como en las células de Kupffer (CK) y en CHE. El primer estudio proporciona evidencias que PPARgamma es un factor pro-esteatótico en los hepatocitos y su expresión contribuye en la progresión del hígado graso inducido por la obesidad. La eliminación del gen para este receptor nuclear en los hepatocitos, y en menor medida en los macrófagos, protege a los ratones frente al modelo de obesidad y esteatosis inducido por una dieta rica en grasa. Los experimentos in vitro en cultivos de cortes de alta precisión de hígado (CAPH) y cultivos primarios de hepatocitos demostraron que el agonista de PPARgamma (rosiglitazona) induce la acumulación intrahepática de triglicéridos, un efecto que fue bloqueado por el antagonista de PPARgamma BADGE. Finalmente, observamos que los hepatocitos y los cultivos de CAPH de ratones deficientes para PPARgamma en hepatocitos presentaron una respuesta mitigada frente al estímulo proesteatotico de ácido oleico. En el segundo estudio se examinó el papel específico de PPARgamma en la respuesta aguda y crónica frente un agente hepatotóxico (CCl4). Se observó que la deleción de PPARgamma en los macrófagos y CK origina una respuesta inflamatoria exacerbada que conduce a la acentuación del daño hepático y la fibrogénesis. Estos hechos se confirmaron in vitro en cultivos de CAPH de los ratones control y deficientes para PPARgamma en los macrófagos/CK tras someterlos a un estímulo inflamatorio agudo con LPS. Curiosamente, los ratones KO condicionales en los hepatocitos mostraron menor daño hepático frente al modelo crónico de CCl4, y se observó una protección parcial frente el daño agudo hepático a través de CCl4 o el estímulo con LPS en cultivos de CAPH. Al evaluar la respuesta de los ratones KO condicionales en las CHE frente al modelo crónico de daño hepático se observó daño hepático exacerbado y una respuesta fibrogénica agravada, por lo que la expresión de PPARgamma en las CHE también ejerce un papel antifibrótico importante. En conclusión, nuestros hallazgos sugieren la existencia de roles divergentes específicos de célula e incluso funciones opuestas para PPARgamma en la patogénesis de la EHGNA y el daño hepático. / PPARgamma plays an essential role in the transcriptional regulation of genes involved in lipid and glucose metabolism, insulin sensitivity and inflammation. In the project we investigated hepatic PPARgamma function by using Cre-loxP technology to generate hepatocyte (Albumin-Cre), macrophage (LyzM-Cre) and hepatic stellate cells (aP2-Cre) -specificPPARgamma conditional knockout mice. In the first study published in FASEB Journal (2011), we provided evidence that PPARgamma plays a causative role in hepatocyte lipid deposition, contributing to the pathogenesis of hepatic steatosis. Targeted deletion of PPARgamma in hepatocytes (and to a lesser extent in macrophages) protected mice against high-fat diet model. We demonstrated that Rosiglitazone (insulin sensitized drug) increased oleic acid-induced steatosis in both liver slices and primary hepatocytes, we provided rosiglitazone not only activates hepatic PPARgamma but also induces its expression. In the second study published in Journal of Hepatology (Nov 2013), we studied the role of PPARgamma in inflammatory and fibrogenic liver injury. Our results revealed that inflammatory and fibrogenic responses to chronic exposure to CCl4 are exacerbated in mice with macrophage-specific disruption ofPPARgamma . The deleterious effects of PPARgamma  disruption in liver macrophages were confirmed in an acute model of CCl4 injury as well as in PCLS incubated with LPS. Importantly, hepatic stellate cells-specific PPARgamma knockout mice also showed exacerbated liver damage and fibrogenic response to CCl4. In summary, these data suggest that PPARgamma exerts specific cell roles and even opposing functions in the pathogenesis of NAFLD and liver damage. While PPARgamma in hepatocytes is a pro-steatotic factor but it also has antiinflammatory and antifibrogenic roles in non-parenchymal liver cells in NAFLD’s progression.

Voltage-gated Ca2+ channels (VGCCs) are essential for initiating and regulating cardiac function. During the cardiac action potential, Ca2+ influx through L-type channels triggers the sarcoplasmic reticulum Ca2+ release that enables the EC coupling. Ca2+ can also enter cardiac myocytes through low-voltage-activated T-type channels, which are expressed throughout cardiac development until the end of the neonatal period, and can contribute to pacemaker activity as well as EC coupling to some extent. Importantly, T-type channels are re-expressed in ventricular myocytes under diverse pathological conditions such as ischemia or hypertrophy, suggesting that they play a role in cardiac disease. In a first part of this study, we examined the effects of VGCC blockers on the homeostasis and viability of primary cultures of cardiac myocytes (CMs), because of the importance of apoptosis and necrosis in cardiac disease. In a second part, we analyzed the cell mechanisms unleashed by hypoxic and hypertrophic stimuli, the involvement of VGCCs and the putative cytoprotective effects of VGCC blockade. Our results show that L-type and T-type channel blockers induce a low-level and transient ER stress, albeit with a distinct conveyance into cell macroautophagy and viability: whereas L-type channel blockers trigger a macroautophagic process in CMs, ultimately promoting apoptosis, T-type channel blockers exerts the opposite effect, by decreasing the autophagic flux and not affecting cell death. Furthermore, the blockade of T-type channels reduces Beclin-1-dependent autophagy and protects CMs subject to hypoxia-reoxygenation (as an in vitro paradigm for ischemia-reperfusion). We thus identify L-type and T-type channels as new targets for macroautophagy regulation of CMs, and provide new clues to the beneficial actions reported in clinical trials for T-type channel blockers, particularly against pathophysiological conditions involving a maladaptive autophagy. / Els canals de calci dependents de voltatge (CCDV) són essencials per a iniciar i regular la funció cardíaca.Durant el potencial d'acció cardíac, l'influx de Ca2+ a través dels canals de tipus L desencadena l'alliberament de Ca2+ del reticle sarcoplasmàtic necessària per l'acoblament E-C. El Ca2+ també pot entrar en els miòcits a través de canals de Ca2+ de tipus T, que s'expréssen durant el desenvolupament cardíac fins el final del període neonatal, i poden contribuïr a l'activitat marcapassos així com a l'acoblament EC. De forma destacable, els canals de tipus T es re-expréssen als cardiomiòcits ventriculars en diverses condicions patològiques com la isquèmia i la hipertròfia, el què suggereix que juguen un rol relevant en l'enfermetat cardíaca. En una primera part d'aquest estudi, vàrem examinar els efectes dels bloquejants de CCDV sobre l'homeostasi i la viabilitat de cultius primaris de cardiomiòcits (CMs), degut a la importància de l'apoptosi i la necrosi en l'enfermetat cardíaca. En una segona part, vàrem analitzar els mecanismes cel·lulars desencadenats per estímuls d'hipòxia i d'hipertròfia, així com l'implicació dels CCDV i els possibles efectes citoprotectors deguts al bloqueig dels CCDV. Els resultats obtinguts mostren que els bloquejants de canals de tipus L i T indueixen un estrés de reticle de baix nivell i transitori, però que divergeixem pel què fa al seu efecte sobre la viabilitat celular: mentre que els bloquejants de canals de tipus L exacerben la macroautofàgia, provocant la mort cel·lular, els bloquejants de canals de tipus T redueixen el flux autofàgic i no afecten negativament la viabilitat dels CMs. Addicionalment, el bloqueig dels canals de tipus T redueix l' autofàgia dependent de Beclin-1 i protegeix els CMs tractats amb hipòxia-reoxigenació (un paradigma in vitro de l'isquèmia-reperfusió). En definitiva, en aquets estudi hem identificat els canals de tipus L i T com a noves dianes per la regulació de l'autofàgia en CMs, i obtingut dades novedoses sobre les accions beneficioses dels bloquejants de canals de tipus T descrites en assaigs clínics, particularment front patologies que impliquen una autofàgia maladaptativa. / Los canales de calcio voltaje-dependientes (CCDV) son esenciales para iniciar y regular la función cardíaca.Durante el potencial de acción cardíaco, el influjo de Ca2+ a través de los canales de tipo L desencadena la liberación de Ca2+ del retículo sarcoplasmático necesaria para el excitación-contracción (EC). El Ca2+ también puede entrar en los miocitos a través de canales de Ca2+ de bajo umbral o tipo T, que se expresan a lo largo del desarrollo cardíaco hasta el final del período neonatal, y pueden contribuir a la actividad marcapasos así como al acoplamiento EC. De forma destacable, los canales de tipo T se re-expresan en cardiomiocitos ventriculares bajo diversas condiciones patológicas incluyendo la isquemia y la hipertrofia, sugiriendo que juegan un rol relevane en la enfermedad cardíaca. En una primera parte de este estudio, examinamos los efectos de los bloqueantes de CCDV sobre la viabilidad y la homeostasis de cultivos primarios de cardiomiocitos (CMs), debido a la importancia de la apoptosis y la necrosis en la enfermedad cardíaca. En una segunda parte, analizamos los mecanismos celulares desencadenados por estímulos de hipoxia e hipertrofia, así como la implicación de los CCDV y los posibles efectos citoprotectores debidos al bloqueo de los CCDV. Nuestros resultados muestran que los bloqueantes de canales de tipo L y T inducen un estrés de retículo de bajo nivel y transitorio, aunque divergiendo en lo que respecta la viabilidad celular: mientras que los bloqueantes de canales de tipo L exacerban la macroautofagia, provocando la muerte celular, los bloqueantes de canales de tipo T reducen el flujo autofágico y no afectan negativamente a la viabilidad de los CMs. Adicionalmente, el bloqueo de los canales de tipo T reduce la autofagia dependiente de Beclin1 y protege a los CMs tratados con hipoxia-reoxigenación (un paradigma in vitro de la isquemia-reperfusión). Con respecto al efecto de la estimulación hipertrófica, los resultados conseguidos perfilan un escenario complejo en el que la macroautofagia constitutiva de los cardiomiocitos es inhibida, dando paso a formas alternativas de degradación proteica. En conclusión, en este estudio hemos identificado a los canales de tipo L y T como nuevas dianas para la regulación de la autofagia en CMs, y obtenido datos novedosos sobre las acciones beneficiosas de los bloqueantes de canales de tipo T descritas en esayos clínicos, particularmente frente a condiciones patofisiológicas que implican una autofagia maladaptativa.

Glucocorticoids (GC) induce cell cycle arrest and apoptosis in different cell types and therefore are widely used to treat a variety of diseases including autoimmune disorders and cancer. This effect is mediated by the GC receptor (GR), a ligandactivated transcription factor that translocates into the nucleus where it modulates transcription of target genes in a promoter-specific manner. Glycogen synthase kinase-3 (GSK3) regulates GR response by genomic and nongenomic mechanisms, although the specific role of each isoform is not well defined. We used GSK3 pharmacological inhibitors and isoform-specific small interfering RNA to evaluate the role of GSK3 in the genomic regulation induced by GC. The study was made in cell lines from different origin. GSK3 inhibition reverted GC-induced apoptosis by preventing GC-dependent MCL-1 downregulation and caspase-3 and -9 activation. GSK3 inhibition also resulted in the reduction of GC-induced mRNA expression of GC-induced genes such as BIM, HIAP1, and GILZ. Knockdown of GSK3β but not GSK3α reduced endogenous GILZ induction in response to dexamethasone and GRdependent reporter gene activity. Interestingly, GSK3 inhibition did not affect GCinduced transrepression. Chromatin immunoprecipitation experiments revealed that GSK3 inhibition impaired the dexamethasone-mediated binding of GR and RNA polymerase II to endogenous GILZ promoter through a mechanism that affects GR protein localization by decreasing early GR nuclear levels. These results indicate that GSK3β is important for GR transactivation activity and that GSK3β inhibition suppresses GC-stimulated gene expression. Furthermore, we show that genomic regulation of the GR by GSK3 occurs through a mechanism not involving known GSK3β phosphorylation sites. We propose that GC-dependent transcriptional activation requires functional GSK3β signaling and that altered GSK3β activity influences cell response to GC. / Los glucocorticoides (GC) inducen la parada del ciclo celular y la apoptosis en diferentes tipos de células y por lo tanto se utilizan ampliamente para tratar una gran variedad de enfermedades incluyendo enfermedades autoinmunes y cáncer. Este efecto es mediado por el receptor de GC (GR), un factor de transcripción activado por ligando que transloca al núcleo donde modula la transcripción de genes diana de una manera específica de promotor. La glucógeno sintasa quinasa-3 (GSK3) regula la respuesta del GR por medio de mecanismos genómicas y no genómicas, aunque la función específica de cada isoforma no está bien definida. En este estudio se utilizaron inhibidores farmacológicos de la GSK3 y siRNAs específicos de cada isoforma para evaluar el papel de la GSK3 en la regulación génica inducida por los GC. La inhibición de la GSK3 resultó en la reducción de la expresión de ARNm inducida por GC de genes tales como BIM, HIAP1, y GILZ. El silenciamiento de la GSK3β pero no de la GSK3α redujo la inducción endógena de GILZ en respuesta a la dexametasona y la actividad luciferasa dependiente del GR. Curiosamente, la inhibición de la GSK3 no afectó la transrepresión inducida por GC. Los experimentos de inmunoprecipitación de la cromatina revelaron que la inhibición de la GSK3 afecta la unión mediada por la dexametasona del GR y la ARN polimerasa II en el promotor endógeno de GILZ a través de un mecanismo que afecta la localización de la proteína del GR por medio de la disminución sus niveles nucleares. Estos resultados indican que la GSK3 es importante para la actividad de transactivadora del GR y que la inhibición de la GSK3 suprime la expresión génica estimulada por los GC. Además, se demuestra que la regulación genómica del GR por la GSK3 ocurre a través de un mecanismo que no implica los sitios conocidos de fosforilación por la GSK3. Por lo tanto, proponemos que la activación transcripcional dependiente de GC requiere una señalización funcional de la GSK3ß y que la alteración de la actividad de la GSK3β influye en la respuesta celular a los GC.

This study provides a baseline data description of 117 individuals, a prospective approach and a therapeutical performance analysis of 83 individuals with cardiovascular risk factors in order to establish the strength of association of hearing with endothelial function. The main objective is to study the association of the auditory function of patients with high cardiovascular risk with the endothelial function and the arterial stiffness, measured at small arteries, before and after one-year lifestyle intervention. The most relevant conclusions of the study are: 1. A major arterial stiffness and therefore a high increase rate corresponds with a worst hearing function. 2. The endothelial function measured by the hyperaemic reactivity rate shows no relationship with the auditory function. 3. Changes in lifestyle for a year did not contribute to improve neither the vascular risk factors nor the vascular function parameters and therefore no hearing function improvement was observed. 4. Patients with cardiovascular risk factors have worse hearing function than individuals without risk factors. 5.The alteration of the hearing function is associated in a statistically significant way to the presence of hipertriglyceridemia, high abdominal circumference and high ApoB levels. 1. In this study hearing loss was directly associated to the increase of E-selectin, showing no relationship with other biochemical parameters of oxidative stress, inflammation and endothelial dysfunction. 2. Arterial stiffness and abdominal circumference were the main determinants of auditory function. / Se trata de un estudio descriptivo de los datos basales que consta de 117 individuos y prospectivo y de actuación terapéutica sobre 83 individuos con factores de riesgo cardiovascular para establecer la fuerza de asociación de la audición con la función endotelial. El objetivo principal es estudiar la asociación de la función auditiva de pacientes con elevado riesgo cardiovascular con la función endotelial y la rigidez arterial medidas en las arterias de pequeño calibre antes y después de intervención de un año sobre el estilo de vida. Las conclusiones más relevantes del estuido son: 1. Una mayor rigidez arterial y por tanto un índice de aumento elevado se corresponde con una peor función auditiva. 2. La función endotelial medida por el índice de reactividad hiperémica no muestra relación con la función auditiva 3. Los cambios en los hábitos de vida durante un año no supusieron una mejoría de los factores de riesgo vascular ni de los parámetros de función vascular, consecuentemente tampoco observamos mejoría en la función auditiva. 4. Los pacientes con factores de riesgo cardiovascular tienen peor función auditiva que los individuos sin factores de riesgo. 5. La alteración de la función auditiva se asocia de forma estadísticamente significativa a la presencia de hipertrigliceridemia, perímetro abdominal elevado y APOB elevada. 6. La pérdida de audición en nuestro estudio se asoció de forma directa con el incremento de E-selectina, no mostrando relación con el resto de parámetros bioquímicos de estrés oxidativo, inflamación y disfunción endotelial. 7. Las rigidez arterial y el perímetro abdominal fueron los principales determinantes de la función auditiva