No description available.

In the last years our research has been focused on analyzing the signaling pathways induced by TGF-β in liver tumor cells, to understand the molecular mechanisms that confer resistance to its suppressor effects. TGF-β induces apoptosis in fetal and neonatal murine hepatocytes, as well as in liver tumor cells, and chronic exposure of these cells to TGF-β iinduces a process of Epithelial to Mesenchymal Transition (EMT). In the present work we wanted to identify TGF-β-regulated genes that being involved in EMT and cell invasion could also participate in the control of growth, apoptosis and/or differentiation. Firstly we analyzed the role of genes regulated by TGF-β and implicated in EMT that might participate in apoptosis control in hepatocytes, focusing on Snail and SPARC. Inhibition of Snail, through targeting knock-down with specific siRNA, impairs TGF-β-induced EMT in murine hepatocytes and significantly enhances their apoptotic response, which indicates that Snail plays a relevant role in conferring resistance to TGF-β-induced cell death. TGF-β also induces anti-apoptotic signals, mediated by the activation of the epidermal growth factor receptor (EGFR). Snail downregulation impairs the TGF-β-induced EGFR ligands expression and inhibits the phosphorylation of Akt, Erks and c-Src family, which is coincident with activation of mitochondrial-dependent apoptotic events and an earlier Smad3 phosphorylation in TGF-β-treated cells. We also demonstrate a role for Snail in sensitizing murine hepatocytes to cell death by anoikis, which is a relevant phenomenon in metastatic processes. Snail1 downregulation in human hepatocellular carcinoma (HCC) cells, which are partially or fully resistant to TGF-β suppressor effects, restores the apoptotic response to TGF-β. TGF-β induces SPARC expression in FaO rat liver tumor cells but not in neonatal murine untransformed hepatocytes. SPARC inhibition, through targeting knock-down with specific siRNA, reveals a role for SPARC in mediating TGF-β-induced EMT in liver tumor cells. Furthermore, SPARC knock-down significantly enhances the TGF-β-induced apoptotic response. Interestingly, SPARC effects might be mediated by Snail, since SPARC silencing impairs Snai1 up-regulation by TGF-β in FaO cells. We next wanted to study the tumorigenesis of FaO cells after in vitro chronic treatment with TGF-β for 4 weeks (TβT-FaO). For this, we injected these cells through both subcutaneous and intrasplenic procedures. Liver tumor formation derived from intrasplenic injection of FaO cells induced a multifocal highly proliferative hepatocarcinoma in all mice, whereas parallel inoculation of TβT-FaO cells promoted low proliferative unifocal and heterogeneous hepatic lesions which showed higher staining for phospho-Smad2. Detailed analysis of tumors revealed lesions with bile duct characteristics and lesions with a dedifferentiated (hepatoblast) phenotype. Primary culture of tumor cells from both FaO- and TβT-FaO-induced intrasplenic lesions indicated that only cells obtained from FaO-induced tumors undergo apoptosis in response to TGF-β, whereas TβT-FaO-derived tumors contain cells that are fully resistant. Analysis of the phenotype of tumors and their derived cells showed that intrasplenic injection of TβT-FaO cells may produce cholangiocarcinoma-like and hepatoblastoma-like tumors. In summary, chronic in vitro TGF- β treatment of FaO cells changed their tumorigenic potential. Tumor growth was slower but cells are resistant to apoptosis. Futhermore, phenotype of lesions reflected a stem-like phenotype which provokes the appearance of less differentiated tumors (hepatoblastomas) or transdifferentiation to a different liver tumor lineage (cholangiocarcinomas). / En el trabajo actual hemos querido identificar genes regulados por TGF-β que estando implicados en EMT e invasión celular puedan también participar en el control del crecimiento, apoptosis y/o diferenciación, centrándonos en Snail y SPARC. La inhibición de la expresión de Snail impide la EMT inducida por TGF-β en hepatocitos murinos y aumenta su respuesta apoptótica, indicando un papel importante de Snail confiriendo resistencia a la muerte inducida por TGF-β. El TGF-β también induce señales anti-apoptóticas, mediadas por la activación del EGFR. La cancelación de Snail impide la inducción mediada por TGF-β de los ligandos del EGFR e inhibe la fosforilación de Akt, ERKs y familia c-Src, hecho coincidente con la activación de eventos apoptóticos dependientes de la mitocondria y con una fosforilación temprana de Smad3 en las células tratadas con TGF-β. También demostramos el papel de Snail en la sensibilización de los hepatocitos a la muerte celular por anoikis. La disminución de los niveles de Snail1 en células de carcinoma hepatocelular humano (HCC), restaura la respuesta apoptótica al TGF-β. El TGF-β induce la expresión de SPARC en las células tumorales FaO de hepatoma de rata pero no en los hepatocitos neonatales murinos no transformados. La inhibición de la expresión de SPARC revela un papel de SPARC en la inducción de EMT y en la respuesta apoptótica mediada por TGF-β en células tumorales hepáticas. A continuación quisimos estudiar el potencial tumorogénico de las células FaO después de un tratamiento in vitro crónico con TGF-β durante 4 semanas (TβT-FaO). Inyectamos estas células en ratones inmunodeprimidos para provocar la formación de tumores tanto subcutáneos como ortotópicos (inyección intraesplénica). La inoculación intraesplénica de células FaO indujo un carcinoma hepatocelular multifocal altamente proliferativo en todos los ratones, mientras que la inoculación paralela de células TβT-FaO promovió la formación de lesiones unifocales, heterogéneas y con baja proliferación que mostraron un fuerte marcaje para Smad2 fosforilado. Un análisis detallado de los tumores mostró lesiones con características de ducto biliar y lesiones con un fenotipo desdiferenciado (hepatoblastos). El cultivo primario de las células provenientes de estos tumores indicó que sólo las células obtenidas de los tumores FaO sufren apoptosis en respuesta al TGF-β, mientras que los tumores derivados de los TβT-faO contienen células que son completamente resistentes. En resumen, el tratamiento crónico in vitro con TGF-β de las células FaO cambió su potencial tumorogénico. El crecimiento tumoral fue más lento pero las células son resistentes a la apoptosis. Además, el fenotipo de las lesiones refleja un fenotipo tipo célula progenitora que provoca la aparición de tumores menos diferenciados o la transdiferenciación a una línea tumoral hepática distinta.

La tesi que es presenta tracta l’estudi cinemàtic i dinàmic de la marxa humana mitjançant tècniques de dinàmica de sistemes multisòlid. Per a aquest propòsit, s’utilitzen dos models biomecànics: un model pla format per 11 segments i 14 graus de llibertat i un model tridimensional format per 18 segments i 57 graus de llibertat. La formulació dinàmica multisòlid ha estat desenvolupada en coordenades mixtes (naturals i relatives). La marxa de l’individu s’enregistra al laboratori utilitzant un sistema de captura del moviment mitjançant el qual s’obté la posició de cadascun dels 37 marcadors situats sobre el cos del subjecte. Les dades de posició es filtren utilitzant un algorisme basat en el singular spectrum analysis (SSA) i les coordenades naturals del model es calculen mitjançant relacions algebraiques entre les posicions dels marcadors. Posteriorment, un procés de consistència cinemàtica assegura les restriccions de sòlid rígid. El processament cinemàtic continua amb l’aproximació de les posicions mitjançant corbes B-spline d’on se n’obtenen, per derivació analítica, els valors de velocitat i acceleració. En una anàlisi dinàmica inversa de la marxa humana, s’acostumen a utilitzar com a dades d’entrada els paràmetres antropomètrics (geomètrics i inercials) dels segments, les dades cinemàtiques i les mesures de les plaques de força. En contraposició al que fan la majoria d’autors, en aquesta tesi, les mesures de les plaques de força no són utilitzades directament en l’anàlisi sinó que només s’usen per solucionar el problema del repartiment del torsor resultant de les forces de contacte durant la fase de doble suport. En aquesta fase, els dos peus es recolzen sobre el terra i les mesures cinemàtiques són insuficients per determinar el torsor en cada peu. El nou mètode de repartiment que es proposa (anomenat contact force plate sharing, CFP) és una de les aportacions de la tesi i destaca pel fet que permet determinar un conjunt de forces i moments dinàmicament consistents amb el model biomecànic, sense haver de modificar-ne les coordenades cinemàtiques ni afegir forces o moments residuals en algun dels segments. Encara dins l’àmbit de l’estudi dinàmic invers, s’ha analitzat la sensitivitat dels parells articulars a errors comesos en estimar els paràmetres antropomètrics, a errors que poden contenir les mesures de les plaques de força i a errors que es poden cometre en el processament cinemàtic de les mesures. L’estudi permet concloure que els resultats són molt sensibles als errors cinemàtics i a les forces mesurades per les plaques, sent els errors en els paràmetres antropomètrics menys influents. La tesi també presenta un nou model tridimensional de contacte peu-terra basat en el contacte esfera-pla i els seus paràmetres s’estimen mitjançant dos enfocaments diferents basats en tècniques d’optimització. El model s’utilitza com un mètode alternatiu per solucionar el problema del repartiment durant la fase de doble suport en dinàmica inversa, i també s’utilitza en simulacions de dinàmica directa per estimar les forces de contacte entre el model biomecànic i el seu entorn. En l’anàlisi dinàmica directa és necessària la implementació d’un controlador que està basat, en aquest cas, en el filtre de Kalman estès. Les contribucions més importants de la tesi, en el cas de l’anàlisi dinàmica inversa, es centren en el mètode CFP i en l’ús del model de contacte per solucionar el repartiment de forces de contacte en la fase de doble suport. Referent a l’anàlisi de la influència dels errors en les dades d’entrada del problema dinàmic invers, la modelització estadística dels errors conjuntament amb la pertorbació conjunta de més d’un paràmetre antropomètric a la vegada (mantenint constant l’alçada i el pes de la persona) és també una novetat. Per altra banda, el model de contacte presentat és també una contribució original. En l’estat de l’art actual no es troben models que usin dades reals capturades al laboratori i que a la vegada s’utilitzin per solucionar el problema de repartiment en el doble suport i per simular el contacte peu-terra en una anàlisi dinàmica directa. Finalment, el fet de desenvolupar un model que s’utilitzi tant per a l’anàlisi dinàmica directa com inversa és també una de les aportacions d’aquesta tesi. Tot i que les dues anàlisis, per separat, són temes de recerca comuns en l’àmbit de la Biomecànica, es troben a faltar estudis que comprovin la validesa dels resultats que se n’obtenen. En aquesta tesi, els resultats de la dinàmica inversa s’han utilitzat com a dades d’entrada de l’anàlisi dinàmica directa, el resultat de la qual (el moviment) ha pogut ser comparat amb el que s’obté de la captura del laboratori (entrada de la dinàmica inversa). D’aquesta manera, el cercle es tanca i es pot verificar la validesa tant dels models com dels resultats obtinguts. / This thesis presents the kinematic and dynamic study of human motion by means of multibody system dynamics techniques. For this purpose, two biomechanical models are used: a 2D model formed by 11 segments with 14 degrees of freedom, and a 3D model that consists of 18 segments with 57 degrees of freedom. The movement of the subject is recorded in the laboratory using a motion capture system that provides the position along time of 37 markers attached on the body of the subject. Position data are filtered using an algorithm based on singular spectrum analysis (SSA) and the natural coordinates of the model are calculated using algebraic relations between the marker positions. Afterwards, a kinematic procedure ensures the kinematic consistency and the data processing continues with the approximation of the position histories using B-spline curves and obtaining, by analytical derivation, the velocity and acceleration values. This information is used as input of an inverse dynamic analysis. Differing to most published works, in this thesis the force plates measurements are not used directly as inputs of the analysis. When both feet contact the ground, kinematic measurements are insufficient to determine the individual wrench at each foot. One of the contributions of the thesis is a new strategy that is proposed to solve the this indeterminacy (called corrected force plate sharing, CFP) based on force plates data. Using this method, a set of two contact wrenches dynamically consistent with the movement are obtained with no need neither to add residual wrenches nor to modify the original motion. Also in the IDA field, the sensitivity of the joint torques to errors in the anthropometric parameters, in the force plate measurements and to errors committed during the kinematic data processing is studied. The analysis shows that the results are very sensitive to errors in force measurements and in the kinematic processing, being the errors in the body segment parameters less influential. A new 3D foot-ground contact model is presented and its parameters are estimated using optimization techniques. The model is used as an alternative method to solve the mentioned sharing problem during the double support phase and it is also used, in a forward dynamic analysis, to estimate the contact forces between the biomechanical model and its environment. The forward dynamic simulation requires the implementation of a controller that is based, in this case, on the extended Kalman filter. The most important contributions of the thesis in IDA are focused on the CFP sharing method and regarding the analysis of the influence of errors in input data on the inverse dynamics results, the statistical modelling of the uncertainties together with the perturbation of more than one parameter at same time (remaining height and weight as a constant parameters) is also new in the literature. Moreover, the presented foot-ground contact model is also original. In the current state of the art, there are no models that use real data captured in the laboratory to solve the contact wrench sharing problem during the double support phase. Furthermore, there are few studies simulating the foot-ground interaction in a forward dynamic analysis using a continuous foot-ground contact model. Finally, developing a model that is used for both forward and inverse dynamic analysis is a relevant aspect of the methodology used. Although the two approaches separately are common research topics in the field of biomechanics, a small number of studies prove the validity of the obtained results. In this thesis, the results of the inverse dynamics are used as input data for the forward dynamic analysis, and the results of the latter (the motion) have been compared with the motion capture in the laboratory (input of the inverse dynamics analysis). Thus, the circle has been closed which allows us to validate the accuracy of both the models and the obtained results.

Antecedents del tema: La mesura de la força muscular es molt útil en la rehabilitació. Tant per planificar-la com per monitoritzar-la. Igualment es una eina fonamental en l’avaluació del dany corporal o seqüeles. La dinamometria isocinètica és una eina fiable de mesura de la força muscular dinàmica. No obstant per la seva validesa s’ha de garantir que el subjecte avaluat faci un esforç màxim. En certes poblacions (com ara els pacients laborals) avaluar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova esdevé crucial per les possibles implicacions mèdico-legals. En diferents articulacions i accions i, en concret, pel que fa a rotadors externs d'espatlla s'ha trobat que la diferència entre les ràtios excèntric-concèntric a velocitat alta i baixa (DEC) és un bon paràmetre per identificar esforços submàxims en una població de voluntaris sans. No obstant això, no es tenen dades sobre la seva utilitat en pacients laborals reals. Hipòtesi: El DEC és un paràmetre vàlid per estimar el nivell de col•laboració durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs a una població de pacients laborals reals. Objectius: Analitzar el comportament, i eventual utilitat, del DEC en una mostra de pacients reals afectats de patologia de l'espatlla i avaluats mitjançant dinamometria isocinètica al final del procés de rehabilitació. Metodologia: Estudi observacional de 74 pacients laborals amb patologia musculoesquelètica d'espatlla avaluats mitjançant dinamometria isocinètica de rotadors externs al costat afecte i contralateral. La prova es realitza a 30º/s i 120º/s a modalitat concèntrica i excèntrica .Es recullen dades demogràfiques (edat, sexe i pes), clíniques (diagnòstic, durada del procés i situació funcional a l'alta) i dinamomètriques (Pic de moment de força, Ràtios excèntrics concèntrics, DEC i dèficits comparant extremitat afecta i sana). Les dades s'analitzen per separat per a dones i homes i en relació al resultat del DEC. Resultats: Utilitzant el nivell de tall de DEC marcat per l'estudi previ en subjectes sans (0.81) la proporció de pacients etiquetats de no col•laboradors, especialment dones, era enorme. Per tant es va decidir usar els valors de l'extremitat sana per avaluar l'afectació. Aplicant aquest criteri, cinquanta-dos pacients van mostrar el costat afecte uns valors de DEC dins dels rangs considerats com normals i, per tant, es van etiquetar de col• laboradors. Deu tenien uns DEC superiors al límit superior i es van considerar no col•laboradors. Finalment hi havia 12 pacients amb uns valors de DEC extremadament baixos que es van considerar com no col•laboradors. La comparació entre sexes va mostrar una gran diferència significativa proporció de col•laboradors a favor dels homes . En els col•laboradors els dèficits registrats dels pacients sense incapacitat al final del procés mostraven uns valors molt significativament més baixos que els pacients que van acabar en incapacitat. Conclusions: El DEC pot ser una bona eina pel mesurament del nivell de col•laboració -i per tant per assegurar la validesa- durant la realització d'una prova isocinètica de rotadors externs d'espatlla en pacients laborals. No obstant això, es necessiten més estudis en dones i poblacions no laborals per definir millor la seva utilitat. La validesa de la dinamometria isocinètica, i implícitament la del DEC, en poblacions laborals es indicada per relació significativa entre els dèficits de força analitzats i el nivell d’incapacitat. / Introduction: Muscle strength measurement is crucial in rehabilitation Planning and results assessment. Isokinetic dynamometry is a reliable and valid strength measurement tool. However, its validity depends on the veracity of the measurements. Among other factors, patient collaboration during test performance is crucial. Thus an estimate of collaboration is highly desirable. The DEC (High and low velocity eccentric to concentric ratios difference) has been proven to be an efficient tool to assess maximility of effort in a number of joints and actions. However, its usefulness in real patient shoulder external rotator effort measurement has not been previously assessed. Hypothesis: The DEC is a valid parameter to assess the collaboration level in work injury patient during shoulder external rotator isokinetic tests. Objectives: to analyze DEC behavior and usefulness in maximality of effort assessment in a sample of shoulder work injury patient undergoing rehabilitation. Methods: Observational study of 74 shoulder injury patients evaluated through shoulder external rotator isokinetic tests. Concentric and eccentric performances of injured and uninjured sides were recorded at 30 and 120º/s. Results: Fifty-two patients had their injured side DEC values within the normal range and were thus labeled as maximal performers. Ten patients had higher than cutoff DEC values, indicating submaximal effort whereas 12 patients had exceedingly low DEC values. Gender comparison showed a significantly different proportion of maximal performers. Strength deficits registered in patients demonstrating maximal performance correlated with the final outcome. The findings support the application of the DEC for determination of the extent of weakness of shoulder external rotators in male patients. Conclusion: In terms of shoulder external rotators status in male worker injury, the results support the application of isokinetic tests both in the clinical and medico legal sense. However, the gender discrepancy warrants further research.

La infertilitat és un problema que cada cop és més comú en la població actual. S’ha definit que la meitat dels casos de la infertilitat es deu a un factor masculí, no obstant, la gran majoria segueix sent d’etiologia desconeguda. Els grans objectius d’aquesta tesi es poden dividir en dos camps: (i) la cerca de factors genètics que puguin ser causa de la infertilitat masculina i (ii) la cerca de nous factors, com els RNAs i miRNAs, que puguin aclarir la patogenicitat de tipus determinats de infertilitat i el seu futur ús com a biomarcadors de la fertilitat. Vam utilitzar tres estratègies per identificar possibles gens candidats pel seu estudi mutacional: transcriptòmica diferencial, proteòmica diferencial i recerca bibliogràfica dels seus corresponents ratolins genoanul•lats. Els gens seleccionats van ser: (i) Protamina 1 (PRM1) i Protamina 2 (PRM2) (ii) Heat schock protein 2 (HSPA2) (iii) Subunitat 1 de la prohibitina (PHB1), (iv) Bromodomain testis specific (BRDT), (v) Bromodomain containing 2 (BRD2). Podem dividir els gens candidats seleccionats en dos tipus: (i) Gens candidats que la seva deleció en animals únicament comporten fallides en la fertilitat (PRM1, PRM2, HSPA2 i BRDT) i (ii) gens que els seus genoanul•lats presenten mort embrionària (PHB1 i BRD2). Els nostres resultats dels estudis mutacionals realitzats ens mostren que l’existència de variants potencialment patogèniques i d’alta penetrància són una causa infreqüent de la infertilitat masculina. Els nostres resultats van en concordança amb els resultats del primer estudi genome-wide en pacients azoospèrmics i oligozoospèrmics severs. Per tant, podem concloure que la infertilitat masculina possiblement sigui similar a la majoria de malalties complexes, degudes a un problema multigènic/multifactorial, on cap SNP sembla ser responsable d’una proporció considerable de casos d’infertilitat masculina idiopàtica. Per tant, cada variant rara que s’ha descrit pot tenir un petit efecte en el fenotip, però és el conjunt possiblement unit a l’ambient el que resulta en la infertilitat. Per tant, es necessita de més estudis en un nombre molt mes gran de individus, possiblement fent servir una estratègia de seqüenciació completa del genoma, per determinar els backgrounds genètics, possibles interaccions o efecte additiu entre variants i així començar a identificar les combinacions de factors responsables de la infertilitat masculina. Per altra banda tot i que l’avaluació dels paràmetres seminals és útil en el diagnosis de la infertilitat masculina té importants limitacions ja que no sempre bons paràmetres seminals són indicatius de un bon potencial de fertilitat. Per tant és necessari trobar marcadors addicionals que ens donin informació del potencial de fertilització de l’espermatozoide. S’ha descrit que l’espermatozoide humà madur conté RNA . Essencialment, hi ha dues hipòtesis que explicarien la presència de RNA en l’espermatozoide. Una és que podrien tenir una funció en la expressió de gens durant la embriogènesis primerenca. L’altra és que aquests RNA poden ser romanents de l’espermatogènesi però tot i aixo podrien ser útils com a marcadors de l’estat de fertilitat i per avaluar els esdeveniments passats que han ocorregut durant l’espermatogènesi. En aquest treball hem detectat en pacients astenozoospèrmics diversos RNAs amb una abundància alterada. Aquests resultats ens ofereixen la possibilitat d’aprofundir en l’ estudi dels mecanismes patogènics que poden actuar en l’astenozoospèrmia, com també en el plantejament de la futura utilització d’aquests RNAs alterats que hem detectat com a possibles futurs biomarcadors de la fertilitat, per tal d’aconseguir una millor caracterització dels pacients infèrtils. A més a més, els resultats ens mostren nous gens candidats per al seu estudi mutacional, amb la finalitat de cercar mutacions que ens puguin explicar les possibles alteracions en la seva transcripció, com en el cas de BRD2. En aquest treball també hem descrit un pool de miRNAs estables en els espermatozoides madurs de diferents mostres, el que ens fa pensar que aquests poden tenir una funció en els primers passos del desenvolupament embrionari o bé també ens poden explicar fets passats durant l’espermatogènesi. Per tant tenim tot un ampli camp a explorar per veure si alteracions en certs miRNAs poden estar associats a la infertilitat masculina. / There is some evidence that a significant proportion of idiopathic male infertility is due to recessive inheritance. Linkage analysis is applied in most hereditary diseases however are not appropriate in the case of infertility, because there are only one or few members’ affections in families studied. The alternative is performing mutational studies of candidate genes or genetic association studies using cases (infertile patients) and controls (fertile men). We had used three different strategies in order to identify candidate genes and therefore genetic factors associated with male infertility (comparative proteomics analysis, comparative transcriptomics analysis and bibliographic research of animal models infertile). We performed mutation analyses of 6 genes: PRM1, PRM2, HSPA2, PHB1, BRDT and BRD2 gene in different types of infertile patients. Our results in accordance with the first genome-wide study suggest that no pathogenic high penetrance mutations cause male infertility. The evaluation of seminal parameters is useful in the diagnosis of male infertility. However these parameters have important limitations since not always good seminal parameters are indicative of a good fertilization potential. Therefore there is a need for additional markers useful in the assessment of the sperm fertility potential. It is well known, that the mature human sperm cell contains RNA. Independently of the functions of the sperm RNA, the differences in RNA amounts between infertile patients and controls provide a means to assess the fidelity of past events of spermatogenesis. Therefore the analysis of the sperm RNA has the potential to be used as a marker to assess the fertility status. Our results identified several differential transcripts present in athenozoozospermic patients as compared to controls. These results open up the possibility to investigate the implication of these genes in the pathogenic mechanisms in asthenozoospermia and to consider their potential utility as infertility biomarkers.

Tesi realitzada al Servei de Bioquímica i Genètica Molecular / Hospital Clínic / Les alteracions cromosòmiques constitucionals representen una de les principals causes d’anomalies congènites a la població, i el seu diagnòstic durant l’etapa prenatal és el principal objectiu de la majoria de procediments invasius que es realitzen durant l’embaràs. Actualment, el cariotip convencional és el gold standard del diagnòstic citogenètic prenatal, però els avanços tecnològics dels últims anys han portat al desenvolupament de tècniques de citogenètica molecular que ofereixen característiques molt atractives, la principal de les quals és l’elevada resolució. Donat que el paper que han de tenir aquestes tècniques durant l’etapa prenatal encara no està ben definit, els objectius de la present tesi han estat: a) determinar el potencial diagnòstic i la utilitat del cariotip i les tècniques de citogenètica molecular Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) i Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) en diagnòstic prenatal, especialment per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques; i b) valorar la necessitat de modificar els procediments actuals de diagnòstic citogenètic prenatal. En primer lloc, s’han revisat els resultats dels 29.883 cariotips en líquid amniòtic realitzats entre 1998 i 2009 a l’Hospital Clínic de Barcelona. Els resultats obtinguts corroboren que el cariotip és una eina efectiva i robusta per a l’obtenció del cariotip fetal, revelant alteracions cromosòmiques en el 2,9% de les gestacions que es sotmeten a un procediment invasiu. La translucidesa nucal incrementada i les anomalies ecogràfiques destaquen com a indicadors excel•lents d’anomalia cromosòmica. En segon lloc, s’ha avaluat la utilitat de l’MLPA subtelomèrica per a l’estudi de gestacions amb troballes ecogràfiques i cariotip normal. Dels 229 fetus analitzats, 3 presentaven desequilibris subtelomèrics críptics (1,3%). Donat que la freqüència d’aquests desequilibris és baixa, i a més la correlació genotip-fenotip observada és pobra, l’MLPA subtelomèrica no sembla ser una eina crucial per a l’estudi d’aquestes gestacions. D’altra banda, s’ha estudiat la idoneïtat de reemplaçar els estudis de FISH de la regió 22q11.2 per kits d’MLPA dissenyats per a l’estudi d’aquesta regió i altres regions genòmiques associades a cardiopaties. S’han analitzat mitjançant aquests kits 55 gestacions amb troballes cardíaques, cariotip normal i estudi de FISH negatiu per a la microdeleció típica de 22q11.2, i no s’ha detectat cap anomalia. Aquest fet, juntament amb que l’MLPA presenta una taxa de repetició i de no obtenció de resultats superiors a la FISH, i que generalment requereix cultiu cel•lular, indica que la FISH hauria de seguir sent la tècnica d’elecció per a l’estudi de fetus amb troballes cardíaques (enfront l’MLPA). També s’ha volgut determinar la freqüència dels diferents tipus d’alteracions cromosòmiques, tant microscòpiques com críptiques, en fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. L’anàlisi retrospectiu dels resultats obtinguts en el període 2009-2011 a l’Hospital Clínic de Barcelona en aquest grup de gestacions (N=276) ha revelat una freqüència d’anomalies cromosòmiques microscòpiques i casos de Síndrome de la deleció cromosòmica 22q11.2 del 15,9% i 6,4%, respectivament; uns resultats que corroboren la forta associació existent entre troballes ecogràfiques cardíaques i anomalies cromosòmiques. A més, aquesta associació varia significativament en funció del tipus de troballa ecogràfica cardíaca i de la presència d’anomalies extracardíaques. D’altra banda, s’han analitzat mitjançant array CGH 51 fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques, cariotip normal, i sense estudi o resultat de FISH negatiu per a la Sd. de la deleció cromosòmica 22q11.2. En aquest grup de gestacions, la taxa de detecció de variants en número de còpia patogèniques ha estat del 2%, i no s’han detectat variants de significat clínic incert. Si en la nostra sèrie de 276 gestacions amb troballes ecogràfiques cardíaques s’hagués utilitzat l’estratègia QF-PCR + CMA enlloc de cariotip, totes les anomalies cromosòmiques amb repercussió clínica clara diagnosticades per citogenètica convencional s’haguessin identificat, s’haguessin detectat els casos de delecions de 22q11.2, i s’hagués incrementat un 2% el nombre de casos diagnosticats. Per tant, aquests resultats mostren el potencial de les plataformes de microarray per al diagnòstic prenatal de fetus amb troballes ecogràfiques cardíaques. Finalment, s’han utilitzat les tècniques de citogenètica molecular FISH, MLPA i/o CMA per a la caracterització de 6 alteracions cromosòmiques visibles al cariotip però de difícil caracterització per citogenètica convencional. En tots els casos, la utilització d’aquestes tècniques ha contribuït a la correcte descripció de l’alteració identificada, posant de manifest la seva utilitat quan s’utilitzen de forma complementària al cariotip. L’elaboració d’aquesta tesi i la literatura recentment publicada evidencien la necessitat d’un nou plantejament dels protocols clínics de diagnòstic citogenètic prenatal, especialment en relació a la utilització de plataformes de microarray en diagnòstic prenatal. / Strategies for genetic diagnosis of fetuses with congenital malformations. Genotype-phenotype correlations. Constitutional chromosomal abnormalities represent one of the main causes of congenital abnormalities in the population, and their diagnosis during pregnancy is the main objective of most invasive procedures. Nowadays, conventional karyotyping is the gold standard for prenatal cytogenetic diagnosis, but recent technological advances have led to the development of molecular cytogenetic techniques which offer much higher resolution. Since there is still not a consensus on the role of these techniques in prenatal diagnosis, the goals of the present PhD work have been: a) to determine the diagnostic potential and usefulness of karyotype and molecular cytogenetic techniques Fluorescent In Situ Hybridization (FISH), Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA) and Chromosomal Microarray-based Analysis (CMA) in prenatal diagnosis, especially in pregnancies with ultrasound findings; and b) to establish the need for modifications in current prenatal cytogenetic diagnostic protocols. The results obtained: - Corroborate the effectiveness and robustness of conventional karyotyping. The observed detection rate of chromosomal abnormalities in 29,883 consecutive amniotic fluid samples has been 2.9%, with increased nuchal translucency and ultrasound abnormalities being excellent indicators for chromosomal abnormalities. - Suggest that subtelomeric screening in pregnancies with ultrasound findings and normal karyotype is not a crucial tool, as detection rate of subtelomeric imbalances is low (1.3%; 3/229), and genotype-phenotype correlations are poor. - Reveal that FISH of 22q11.2 region is preferred to MLPA kits specific for this chromosome region and other genomic regions previously associated with congenital heart defects. - Reveal a strong association between cardiac ultrasound findings and chromosomal abnormalities, both microscopic and cryptic. In pregnancies with cardiac findings, the observed frequency of microscopic chromosomal abnormalities and chromosome 22q11.2 deletion syndrome has been 15.9% (44/276) and 6.4% (5/78), respectively. Moreover, CMA has been performed in 51 fetuses with cardiac ultrasound findings, normal karyotype and negative or no FISH study for chromosome 22q11.2 deletion syndrome, and the detection rate of pathogenic copy number variants has been 2%, without detection of variants of unknown clinical significance. If in the initial series of 276 pregnancies the strategy QF-PCR + CMA would have been applied; all the chromosomal abnormalities with clear clinical repercussion diagnosed by conventional cytogenetics would have been identified, together with the deletions of 22q11.2 region and an extra 2% of chromosomal abnormalities. These results show the potential of CMA for the prenatal diagnosis of these pregnancies. - Show the usefulness of the molecular cytogenetic techniques FISH, MLPA and CMA when used as a complement to conventional karyotyping in cases with chromosomal abnormalities not accurately characterizable by conventional cytogenetics. Accordingly, the results obtained suggest the need for updating current prenatal cytogenetic diagnostic protocols.

Tesi realitzada a la Unitat de Biofísica i Bioenginyeria - Facultat de Medicina / INTRODUCTION The pressure to contain health costs, particularly by avoiding hospitalizations and promoting the early discharge of patients, is generating a greater demand for home healthcare at a time when this resource is rapidly becoming less available. Telemedicine has been defined as the use of information and communications technologies (ICT), to deliver health services and transmit health information at distance for the purpose of improving patient’s care and education and to facilitate communication between patients and healthcare professionals. Most of the studies on telemedicine showed a lot of potentialities and possibilities, but did not develop further in the clinical routine because of problems and difficulties involving the use of this technology. Therefore, it seems clear the need of simple and straightforward applications, which can provide useful and widely applicable services to healthcare and as well as reliable data to assess the actual impact of telemedicine on homecare. 2) GENERAL AIM To design, develop, validate and assess the benefit of new Information and Communication Technology (ICT) applications in healthcare at patient’s home. 3) HYPOTHESES 1. An Internet-based support system for monitoring newborn patients after discharge from nursery would improve care, be well accepted by parents and reduce unplanned healthcare, particularly visits to the emergency department; 2. The development of a specific web-based tool could introduce a new strategy for the continuous positive airway pressure (CPAP) therapy follow-up of patients with obstructive sleep apnea syndrome (OSAS), which could improve the CPAP compliance, reduce face-to-face clinical visits, and be more cost-effective; 3. A new telemedicine system for remote CPAP therapy monitoring could provide valuable and useful data about treatment compliance and efficacy for the follow-up of OSAS patients. 4) STUDY 1 - A new Internet-based monitoring tool for the neonatal home care after discharge was successfully developed; - This new monitoring approach resulted in a high level of parental satisfaction with the service; - Using a societal perspective, the cost of the Internet-based follow-up resulted much lower than that of the conventional hospital-based follow-up. Additionally, ED visits in the first month of patients’ life decreased with the use of the Internet-based monitoring system. This telemedicine follow-up strategy proved absolute dominance (both more clinically effective and less costly) over the standard follow-up based on hospital visits; - This Internet-based tool has been effectively transferred to the health system since it is in routine clinical use at the Hospital de Sant Pau in Barcelona (www.petitsacasa.santpau.cat). 5) STUDY 2 - The opinion of the interviewed patients and medical staff about the helpfulness and satisfaction of the telemedicine monitoring approach indicated that the web-based support tool together with the televisit are potentially useful to support the home follow-up of CPAP treatment in OSAS patients; - The high patients’ compliance to the remote monitoring through the online questionnaire suggested this strategy to be helpful and practical for the long-period CPAP therapy control; - The multicenter support system we developed represents a new telemedicine approach to CPAP therapy follow-up for OSAS patients, which seeks enforcing patients’ confidence and improving therapy adherence; - The developed telemedicine support system has been effectively transferred to the health system since it is in use in a multinational clinical trial currently involving 18 hospitals (www.mi-cpap.com). 6) STUDY 3 - The geometry of the telemonitoring device (NOWAPI) does not influence the CPAP treatment; - NOWAPI showed good compatibility with the CPAP machines and an excellent performance in estimating the duration of the CPAP treatment and in detecting residual respiratory events in simulated OSAS patients. The results of this study demonstrated that NOWAPI system could be a valuable tool for telemonitoring the treatment of obstructive sleep apnea;

En aquesta tesi s'ha estudiat l'efecte de l'activació del canal de potassi dependent de ATP (KATP) amb un fàrmac activador, la diazoxida, sobre el perfil fenotípic de la microglia en dos models diferenciats: un de in vitro amb una línia cel•lular i un de in vivo en un model de lesió excitotòxica a l'hipocamp de la rata. També s'ha estudiat com aquesta modulació afecta a la progressió de la lesió excitotòxica i la neurogènesis que porta associada. Finalment, s'ha descrit la presència del canal de calci dependent de voltatge (VGCC) a microglia i com la seva inhibició també regula la activitat microglial in vivo i in vitro. / In this thesis we have studied the effect of the activation of the potassium channetl ATP-dependent (KATP channel) with the drug diazoxida, a KCO (potassium channel opener), over the phenotypic expression profile of microglial cells. We did it with two different approaches: an in vitro model with the murine cell line BV2; and an in vivo model of excitotòxic lesion in rat hippocampus. We have also studied how this modulation affects the progression of the damage of the excitotòxic lesion and the hipocampal neurogènesis associated. Finally, we have described the presence of voltage-gated calcium channels (VGCC) in microglia and how its regulation also affects to the activity of microglia in vivo and in vitro.

Còpia digital de l'exemplar imprès de la tesi dipositat a la Biblioteca de la Facultat de Medicina / La distinción de diferentes formas o compuestos de bilirrubina se ha basado durante mucho tiempo en algunas particularidades de la diazoreacción que sirve para detectar la presencia del pigmento y para determinarlo cuantativamente por colorimetría. En los últimos lustros han sido introducidas algunas técnicas de análisis cromatográfico que han permitido separar distintas fracciones de bilirrubina, pero se sigue recurriendo a la diazorreacción para caracterizarlas y distinguirlas. En 1913, Hijmans Van den Bergh y Snapper introdujeron la reacción diazoica para la determinación cuantitativa de la bilirrubina en el suero, usando etanol con el fin de eliminar las proteínas y obtener un medio homogéneo, en el que fueran solubles la bilirrubina y el agente acoplante. Unos años más tarde Van den Bergh y Müller descubrieron, accidentalmente, que el alcohol no es necesario para el desarrollo del color cuando la reacción se realiza en la bilis y en ciertos sueros ictéricos, y describieron dos tipos de reacción: la “reacción directa", caracterizada por ocurrir en ausencia de alcohol, inmediatamente antes de los 30 segundos, y alcanzando rápidamente la máxima intensidad, y la "reacción indirecta", en la que el color, en ausencia de alcohol, tarda en aparecer de 2 a 4 minutos o incluso más tiempo y alcanza la intensidad máxima muy lentamente. Investigaciones posteriores condujeron a nuevas subdivisiones, ya que se distinguieron tres subtipos de "reacción directa": la inmediata, la retardada y la bifásica. No obstante, como destaca Witt, la diferenciación entre ellas es muy forzada; en realidad todos los sueros, incluso los que se consideran de reacción indirecta típica, pueden dar, sin necesidad de añadir alcohol, una ligera coloración que se inicia después de media hora, una hora o más tiempo, según los casos, y se intensifica lentamente, alcanzando su máxima intensidad en varias horas, hasta 24 en algunos casos (Katznelson, 1920). Las únicas disoluciones con una reacción verdaderamente negativa son las soluciones coloidales acuosas de bilirrubina pura, que no reaccionan aunque se añada alcohol o cualquier otra sustancia. Como resultado de estas investigaciones y las realizadas más adelante, se han descrito diversos "agentes acoplantes" capaces de acelerar la reacción diazoica y de convertir en “directa" la reacción “indirecta" de ciertos sueros y de las disoluciones puras de bilirrubina. Entre ellos se encuentran los alcoholes y otros disolventes orgánicos (acetona, piridina), ciertos ácidos orgánicos (acético glacial, acetoacético, butírico y cítrico), algunas sales de ácidos débiles (acetato sódico, benzoato sódico, salicilato sódico), los ácidos y las sales biliares, y diversas sustancias como cafeína, urea, acetamina y antipirina. En algunos casos el efecto acelerador o acoplante puede ser atribuido a modificaciones del pH, a acciones físicas facilitadoras de la solubilidad de la bilirrubina o a la formación de compuestos moleculares más fácilmente solubles; pero en otros casos, el mecanismo de acción permanece sin explicar. Además, se han encontrado algunos compuestos (ácido ascórbico, cisteína y glutation) capaces de actuar en forma contraria, inhibiendo la reacción diazoica y se ha comprobado que ciertos iones, aniones y cationes, ejercen también una considerable influencia, generalmente aceleradora, sobre la diazorreacción. (Texto extraído y adaptado de la Tesis)

L’espermatozoide és una cèl•lula molt especialitzada amb una estructura de la cromatina única formada per dos dominis principals: el domini nucli-protamínic on la gran majoria del DNA es troba empaquetat per protamines en toroides molt compactes, i el domini nucli-histònic on una petita proporció del DNA roman empaquetat per histones, d’una manera més accessible. Cada vegada són més les evidències que suggereixen que l’espermatozoide madur presenta una funció més enllà de la simple transmissió del material genètic patern a la següent generació. La hipòtesi principal d’aqueta tesi consisteix en que aquesta contribució paterna no és solament basada en la transmissió de patrons de metilació de DNA o modificacions d’histones concretes, si no que també es troba influïda per l’estat de la cromatina espermàtica i, en especial, per la seva composició proteica. Per aquest motiu, en aquesta tesi doctoral s’ha caracteritzat detalladament el contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà normal mitjançant dues estratègies diferents. Per una banda, les proteïnes majoritàries del nucli espermàtic, les protamines, han sigut analitzades per extraccions i electroforesis àcides per tal d’estudiar la seva implicació en la conservació de la cromatina. S’ha observat una relació negativa significativa entre la quantitat de protamines i el dany al DNA espermàtic (mesurat per la tècnica COMET) en pacients infèrtils que cursen tècniques de reproducció assistida. Aquests resultats han suggerit una funció de les protamines referent a la protecció del material genètic patern. A més a més, mitjançant tècniques basades en espectrometria de masses (Top-down proteomics), s’ha observat com les protamines podrien contenir modificacions post-traduccionals en la seva seqüència (fosforilacions, acetilacions, metilacions), el que suggeriria també una funció reguladora per aquestes proteïnes espermàtiques. En segon lloc, mitjançant espectrometria de masses també s’han caracteritzat la resta de proteïnes presents en el nucli del gàmeta masculí madur. S’han arribat a identificar centenars de proteïnes, la meitat de les quals corresponen a histones, variants d’histones, modificadors d’histones, factors de transcripció, proteïnes addicionals associades a la cromatina i proteïnes modificadores de la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, mitjançant anàlisis bioinformàtics es pot observar com el nucli de l’espermatozoide humà madur es trobaria enriquit en proteïnes involucrades en processos reguladors com la modificació de la cromatina, modificació d’histones, expressió gènica i transcripció. Aquestes tendències també es trobarien presents en altres espècies de mamífers, com per exemple el ratolí, la rata o el macaco. La presència d’aquests grups de proteïnes intactes en una cèl•lula considerada transcripcionalment inerta ha suggerit una funció epigenètica/reguladora durant els primers estadis del desenvolupament embrionari. Addicionalment, en aquesta tesi doctoral s’ha observat que les proteïnes espermàtiques nuclears es poden diferenciar en dos grups diferents segons la seva afinitat per la cromatina espermàtica. D’aquesta manera, les proteïnes unides més fortament al DNA es trobarien majoritàriament implicades en funcions estructurals, mentre que les proteïnes unides al DNA d’una forma més feble es trobarien relacionades amb processos reguladors o epigenètics. Aquesta observació, juntament amb el fet conegut de que la regió més accessible de la cromatina espermàtica (associada a les histones) es troba especialment enriquida en promotors i gens del desenvolupament, suggeriria que part de les proteïnes nuclears espermàtiques podrien estar relacionades amb la regulació de la transcripció d’aquests gens, a més a més d’altres processos com la remodelació de la cromatina en el pronucli masculí. Per tant, mitjançant la caracterització del contingut proteic del nucli de l’espermatozoide humà, s’ha augmentat el coneixement d’aquesta cèl•lula i de la seva funcionalitat, recolzant la hipòtesi de que a més a més del propi material genètic patern, l’espermatozoide contribueix en la fertilització amb informació epigenètica, la qual inclou una composició proteica específica de la cromatina. / The mammalian spermatozoon is a very specialized cell with a unique chromatin structure: while the vast majority of the DNA is condensed by high compact toroids (avoiding any transcriptional and translational activity), a small part of the DNA remains packaged by nucleosomes. An increasing body of evidence is showing that, in addition to the transmission of the paternal genetic message to the next generation, the sperm cell is also involved in the transmission of epigenetic information. The main hypothesis of the present doctoral thesis is that, in addition to histone modifications, DNA methylation patterns and RNA content; protein composition of the sperm chromatin is also essential in epigenetic inheritance. Therefore, the protein content of the human sperm nucleus has been characterized using proteomic techniques. Firstly, by acid extraction and electrophoresis, it has been shown a negative relationship between protamine quantities and DNA damage in infertile patients who undergo assisted reproduction techniques, confirming an involvement of those proteins in the protection of the paternal DNA. In addition, by top-down proteomics, it has been detected several post-translational modifications in protamine sequences, which have suggested a potential regulatory role for those major sperm nuclear proteins. Secondly, it has been described the human sperm nuclear proteome using mass spectrometry techniques. A rich network of histones, histone variants, histone modifiers, transcription factors, chromatin-associated proteins and chromatin modifying proteins has been identified in the human sperm nucleus. In addition, based in Gene Ontology information, the human sperm nucleus seemed to be enriched in processes as chromatin remodelling, histone modification, transcription and gene expression. Furthermore, proteomic dissection of the sperm chromatin results in two groups of proteins differing in chromatin affinity. Higher-affinity sperm chromatin proteins seemed to be mainly involved in structural roles, while proteins with potential regulatory/epigenetic roles were identified with a lower sperm chromatin affinity. Altogether, the results obtained in this doctoral thesis have contributed in the knowledge of the nucleus of the male gamete and have suggested an involvement of the sperm nuclear proteins in post-fertilization events, as the chromatin remodelling in the male pronucleus or the transcription regulation of histone-bound paternal developmental genes.