La implicación de la salud oral en el rendimiento físico del deportista es un área que ha suscitado un interés creciente en los últimos años. Atendiendo a los factores etiológicos de las patologías orales y a las repercusiones que éstas pueden tener sobre el organismo, se plantean las siguientes hipótesis de trabajo: (i) los hábitos higiénicos y dietéticos de la población deportista los sitúan, a priori, en un grupo de riesgo para el desarrollo de caries y erosión dental; (ii) el ejercicio anaeróbico máximo podría inducir respuestas específicasa a nivel oral que determinaran una diferente experiencia de caries; (iii) la oclusión dental podría estar asociada a alteraciones en el equilibrio del sujeto, de especial trascendencia en especialidades con un alto componente técnico. Esta tesis doctoral se lleva a cabo a través de varios estudios con los siguientes objetivos: (i) analizar y comparar la experiencia de caries (índice CAOD) en atletas de disciplinas anaeróbicas en comparación con la población general; (ii) estudiar el efecto de la realización de ejercicio anaeróbico máximo en carrera (series interválicas de 300 metros) en el valor del pH salival. A la vez, valorar la posible correlación entre el valor de pH salival y el lactato sanguíneo; (iii) comprobar si realizando un ejercicio de carácter similar al descrito en el punto (ii) en condiciones de hipoxia (series de saltos con contramovimiento (CMJ)) se modifica el pH salival en comparación con el mismo protocolo de ejercicio realizado en normoxia. A la vez, valorar una posible correlación entre el valor de pH salival y la saturación arterial de oxígeno (SaO2); (iv) valorar la influencia de la oclusión dental en el control postural del sujeto bajo condiciones de estabilidad opuestas (estática vs dinámica) en plataforma inestable; y (v) determinar si la fatiga muscular resultante de la realización de ejercicio máximo (CMJ o circuito de fuerza general) altera el equilibrio y si la oclusión dental es un factor determinante en el control del equilibrio del sujeto después del ejercicio. Los resultados obtenidos aportan las siguientes conclusiones: (i) la población deportista especialista en disciplinas anaeróbicas manifiesta una menor experiencia de caries que la población general; (ii) la realización de ejercicio anaeróbico láctico provoca una alcalinización en el valor del pH salival. Sin embargo, pese a observar una tendencia incremental paralela en los valores de lactato sanguíneo y del pH salival, la correlación entre ambos valores es inconcluyente; (iii) cuando se realiza ejercicio anaeróbico máximo en condiciones de hipoxia normobárica se produce una mayor alcalinización del pH salival en comparación con normoxia. A la vez, parece existir una correlación estadísticamente significativa entre la SaO2 y el pH salival; (iv) la información aferente de la oclusión dental podría contribuir en mayor medida en el proceso de control postural en presencia de mayores condiciones de inestabilidad. Además, existen determinadas características de la oclusión dental que influyen negativamente en el control postural del sujeto: el resalte, la desviación de la línea media, la clase de Angle, la mordida abierta anterior, la mordida cruzada, y el apiñamiento; y (v) la fatiga muscular resultante de la realización de un ejercicio máximo no causa alteraciones inmediatas en el equilibrio. De manera global, se puede concluir que la práctica de ejercicio físico anaeróbico de alta intensidad produce una alcalinización en el pH salival. A la vez, la oclusión dental parece influir en el equilibrio de la población físicamente activa sólo en condiciones de alta inestabilidad. El ejercicio anaeróbico produce respuestas específicamente diferentes que el aeróbico en la fisiología oral y de la misma manera, el estado de salud bucodental puede influir de modo diferente en el rendimiento anaeróbico y aeróbico. / The influence of oral health on the sport performance is a matter of growing interest. Here we conduct several researches with the following aims: (i) to compare the DMFT index in athletes of anaerobic disciplines with general population; (ii) to determine if high intensity anaerobic exercise could affect the salivary pH response; (iii) to determine if high intensity exercise performed in hypoxia could affect the salivary pH response in comparison to normoxia; (iv) to assess a possible correlation between salivary pH values and blood lactate or SaO2; (v) to determine whether there are differences in balance between opposed dental occlusion (Intercuspal position (ICP)/Rest position (RP)) for two extreme levels of stability (stable/unstable); and (vi) to determine whether the muscle fatigue affects stability and if it differs according to the dental occlusion condition. Results allow us to obtain the following conclusions: (i) athletes of anaerobic disciplines has less dental decay experience than general population; (ii) performing anaerobic lactic acid-producing exercise has an effect on saliva alkalinization; (iii) exercise performed in normobaric hypoxia has stronger effects in saliva alkalinization than when performed under normoxia; (iv) significant negative correlation was found between salivary pH and SaO2 levels for the tests performed under hypoxia conditions, whereas correlation between salivary pH and blood lactate was inconclusive; (v) the stability index was significantly better when dental occlusion was set in RP than in ICP in unstable conditions; and (vi) the postural control was not affected after maximal exercise. These results suggest and important interactions of oral health status and the anaerobic performance that may differ from aerobic exercise. Specifically, conclusions indicate that (i) a salivary pH alkalinization may occur after performing maximal anaerobic exercise; and (ii) the sensory information linked to the dental occlusion for the balance control comes strongly into effect in unstable conditions.

El trans-resveratrol (trans-3,5,4’-trihidroxiestilbè) és un polifenol que es troba a diferents components de la dieta amb propietats beneficioses per a la salut. Per aquesta raó, ha estat considerat com un compost bioactiu i, recentment, com un nutracèutic. En el present treball s’ha aprofundit en l’estudi d’aquest compost per tal de conèixer nous aspectes metabòlics i terapèutics del trans-resveratrol. En primer lloc, s’han estudiat els canvis que pateix durant el seu trànsit intestinal així com el seu metabolisme a l’enteròcit al ser administrat per via oral a la rata. S’ha demostrat que el trans-resveratrol és metabolitzat a l’enteròcit formant els seus conjugats glucurònid i sulfat. Aquests compostos retornen majoritàriament a la llum intestinal mitjançant les proteïnes transportadores ABC. El trans-resveratrol no absorbit i que arriba a l’intestí gruixut és convertit en dihidroresveratrol per acció de la microbiota que redueix el doble enllaç del trans-resveratrol. També el dihidroresveratrol és conjugat i convertit en els seus respectius glucurònid i sulfat. Per determinar aquests compostos, s’ha posat a punt una tècnica per a la determinació del dihidroresveratrol a plasma per extracció en fase sòlida i el resveratrol a contingut intestinal mitjançant una extracció líquid-líquid seguides de l’anàlisi per HPLC. Els mètodes que s’han descrit són exactes, precisos i tenen recuperacions superiors al 95%. En una segona part, s’ha posat a punt un model d’inducció de càncer de còlon en rata per tal d’avaluar l’efecte del trans-resveratrol sobre les lesions preneoplàstiques induïdes per 1,2-dimetilhidrazina. L’administració de 60 mg/kg durant 49 dies, ha demostrat que el trans-resveratrol, el sulfat, el glucurònid i el dihidroresveratrol es troben en el contingut intestinal i que es produeix una reducció del 52% dels focus de criptes aberrants i del 45% dels focus amb depleció de mucines. S’observa una correlació directa entre la disponibilitat del trans-resveratrol a còlon i la reducció de les lesions preneoplàstiques. A continuació s’ha fet un estudi de la biodisponibilitat en ratolins modificats genèticament que no expressen la glicoproteïna P (Mdr1a-/-) i, per últim, en ratolins sense la breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-), comparant-la amb la dels ratolins control. Els resultats indiquen similar biodisponibilitat en els controls i Mdr1a-/- mentre que es modifica en els ratolins Bcrp1-/- indicant que aquesta proteïna participa en l’absorció i la distribució del trans-resveratrol i els seus derivats. Finalment, s’ha desenvolupat un model farmacocinètic per al trans-resveratrol i els seus conjugats glucurònid i sulfat seguint una aproximació poblacional. El model que millor descriu les concentracions plasmàtiques en rata vincula els models bicompartimentals del trans-resveratrol, del glucurònid i del sulfat. Aquest model és robust i capaç de predir adequadament les concentracions plasmàtiques, possibilitant així la planificació de futurs estudis PK-PD per tal d’establir la contribució relativa dels conjugats en l'eficàcia del trans-resveratrol. / trans-Resveratrol (trans-3,5,4'-trihydroxystilbene) is a polyphenol found in several components of the diet with beneficial health properties. Therefore, it has been considered a bioactive compound, and most recently as a nutraceutical. This work has studied this compound in-depth to meet new therapeutic and metabolic aspects. Firstly, we evaluated the changes that occur during intestinal transit and metabolism in the enterocyte when it is orally administered in the rat. trans-Resveratrol is metabolized in the enterocyte forming its glucuronide and sulfate conjugates that mostly return back into the intestinal lumen by ABC transporters. Unabsorbed trans-resveratrol reaches the colon where microbiota converts this polyphenol in dihydroresveratrol by its double bond reduction which is also conjugated in its glucuronide and sulfate in the intestine. Two techniques have been developed to determine dihydroresveratrol in plasma by a solid-phase extraction and trans-resveratrol in the intestinal content by a liquid-liquid extraction followed by HPLC analysis. The methods are accurate, precise with recoveries exceeding 95%. Secondly, a colon cancer model in rats has been developed to evaluate the effect of trans-resveratrol on preneoplastic lesions induced by 1,2-dimethylhydrazine. After 49 days of administration, trans-resveratrol, its sulfate and glucuronide, and dihydroresveratrol are found in the intestinal content and produce a reduction of aberrant crypt foci and mucin-depleted foci. There is a direct correlation between the availability of trans-resveratrol in colon and the reduction of preneoplastic lesions. Afterward a study of the bioavailability has been carried out in mice lacking P-glycoprotein (Mdr1a-/-) and in knockout mice for breast cancer resistance protein (Bcrp1-/-) as compared with that in wild-type mice. The results indicate similar bioavailability in controls and Mdr1a-/- mice while it is altered in Bcrp1-/- mice indicating that only BCRP is involved in the absorption and distribution of trans-resveratrol and its metabolites. Finally, we have developed a pharmacokinetic (PK) model for trans-resveratrol and its glucuronide and sulfate conjugates following a population PK approach. A three-linked two-compartment model was built for trans-resveratrol, glucuronide and sulfate which describes the plasmatic concentration profile in rat. This model is robust and able to accurately predict plasmatic concentrations, thus enabling future PK/PD studies to establish the relative contribution of the conjugates in the efficiency of trans-resveratrol.

El diagnòstic genètic preimplantacional (PGD) permet diagnosticar embrions obtinguts mitjançant tècniques de reproducció assistida. L’objectiu principal del PGD és diagnosticar els embrions de parelles portadores de malalties hereditàries greus, per tal d’aconseguir el naixement d’individus sans. S’ha postulat que les aneuploïdies són, en molts casos, responsables de la infertilitat o del fracàs de les metodologies de fecundació in vitro (FIV) per això, s’ha desenvolupat una variant del PGD, el PGS (Preimplantational Genetic Screening). Aquest té com a objectiu estudiar alteracions cromosòmiques, ja siguin numèriques o estructurals. Fins a l’actualitat la tècnica més emprada per al diagnòstic d’aquest tipus d’alteracions ha estat la FISH (Hibridació in situ Fluorescent). Rutinàriament amb aquesta metodologia s’estudien 9 cromosomes dels 24 totals del complement. Una altra metodologia per a l’estudi d’aneuploïdies és la CGH (Hibridació Genòmica Comparada), aquesta permet analitzar citogenèticament tot el complement cromosòmic de la cèl·lula d’estudi. L’anàlisi conjunta de malalties monogèniques familiars i d’aneuploïdies de tot el complement cromosòmic conformen el diagnòstic genètic preimplantacional de doble factor (DF-DGP). El primer objectiu d’aquesta tesi ha estat dur a terme un estudi bàsic que permetés aprofundir en el coneixement de les aneuploïdies pre-meiòtiques existents en l’oòcit utilitzant la tècnica de CGH. Estudiant 157 oòcits immadurs de dones de diferents edats i indicacions, s’ha determinat que el 15,9% dels oòcits estudiats presentaven aquest tipus d’anomalies. Aquestes alteracions cromosòmiques d’origen pre-meiòtic es troben en un nivell basal en totes les dones, sense veure’s afectades per l’edat materna o per problemes de fertilitat, i s’han trobat en un 33,9% de les dones estudiades. El segon objectiu ha estat posar a punt una nova aproximació per al DF-DGP, que permetés diagnosticar monogènicament i citogenèticament els embrions a Dia+3, per tal d’obtenir els resultats de l’anàlisi monogènica i citogenètica poc més de 30h després de la biòpsia i poder transferir els embrions sans i euploides dins del mateix cicle de FIV. S’han posat a punt dues aproximacions diferents de DF-DGP. La primera consisteix en biopsiar dos blastòmers dels embrions evolutius per fer-ne servir un per a l’anàlisi monogènica i l’altre per a la citogenètica. La segona aproximació consisteix en biopsiar un sol blastòmer i realitzar el doble diagnòstic a partir d’una sola cèl·lula. Ambdues aproximacions s’han aplicat clínicament en diferents parelles portadores de malalties monogèniques greus, obtenint embarassos i naixements d’individus sans. Algunes d’aquestes aplicacions per a determinades malalties monogèniques com per exemple la síndrome de Lynch, han estat pioneres a l’estat espanyol aconseguint per primera vegada el naixement d’individus sans per la malaltia. En conclusió, durant aquesta tesi doctoral s’ha demostrat la rellevància dels desequilibris cromosòmics en els oòcits i embrions estudiats, amb orígens molt diversos. És per això que les aproximacions del DF-DGP proposades prenen importància, ja que permeten seleccionar els embrions sans i que alhora són euploides, per tant, tindran més probabilitats d’implantar i de donar lloc al naixement d’individus sans. Cal destacar també, que tots aquests procediments diagnòstics es duen a terme durant el mateix cicle de FIV, i es pot realitzar transferència embrionària a final del dia+4 o dia+5, sense haver de criopreservar els embrions, fet que podria reduir la seva viabilitat. / Preimplantation Genetic Diagnosis (PGD) enables genetic analysis of embryos produced by assisted reproductive technologies. The aim of PGD is to diagnose embryos from couples carrying monogenic hereditary diseases, and to achieve birth of healthy individuals. It has been described that aneuploidies are the main causes of infertility or failure of IVF techniques (in vitro fertilisation), that is the reason why PGS (Preimplantational Genetic Screening) was developed. The most frequent technique to perform PGS is FISH (Fluorescent in situ hybridisation) where usually 9 chromosomes are analysed. Another methodology to screen aneuploidies is CGH (Comparative Genomic Hybridisation), which permits the assessment of the whole chromosome complement of the cell. Double Factor Preimplantation Genetic Diagnosis (DF-PGD) is based on the analysis of single gene diseases together with comprehensive aneuploidy screening of the embryos. The first objective of this work was to perform a basic study to have a better knowledge of the pre-meiotic aneuploidies found in oocytes using CGH. Different female groups were studied according to age and fertility problems. A total of 157 immature oocytes were analysed, and 15,9% of them showed aneuploidies originated before entering meiosis. The differences between the studied groups showed no significant differences. These type of abnormalities have been found in 33,9% of the females. The second aim of the study was to set up a new methodology for DF-PGD, that permits not only monogenic but also cytogenetic diagnosis of cleavage-stage embryos. Two different approaches were applied, the first one consists in biopsying two blastomeres from each evolved embryo at day+3, and use one of them for monogenic analysis, and the other for comprehensive aneuploidy screening by CGH. The other strategy was to biopsy a single blastomere to perform both analyses from the single biopsied cell. These two methodologies have been applied clinically in different diseases and birth of healthy individuals was achieved. Certain monogenic diseases such as Lynch syndrome, had never been analysed before by PGD in our country, but in this work were applied for the first time and birth of healthy offspring was achieved. In conclusion, this work has demonstrated the importance of chromosomal abnormalities originated in different stages either in oocytes or blastomeres. That is the reason why DF-PGD approaches catch importance, because they permit the selection of not only healthy but also euploid embryos for transfer. Therefore, theses embryos would have more implantation potential. All these DF-PGD procedures can be performed within approximately 30h, which permits embryo transfer in the same IVF cycle, avoiding cryopreservation steps that might be detrimental for the embryos.

Les molècules adaptadores són essencials en l'organització de les molècules de senyalització i en la coordinació i compartimentació de la seva activitat . 3BP2 és una proteïna adaptadora citoplasmàtica expressada ubiqüament però principalment en cèl·lules hematopoètiques. S'ha demostrat que actua com un regulador positiu transduïnt la senyal cel·lular en cèl·lules T , B i NK. 3BP2 és un important regulador en l’alliberació de grànuls citotòxics en les cèl·lules NK. Els mastòcits es desgranulen de manera similar després de l'agregació depenent d'antigen de l'alta afinitat del receptor per IgE (FceRI) a la superfície cel·lular. L'activació d'aquestes cèl·lules indueix l'alliberament de mediadors inflamatoris preformats i la síntesi de novo i també la secreció de citocines i quimiocines. El receptor KIT forma part dels receptors factors de creixement tirosin cinasa. El lligand de KIT és el SCF (stem cell factor), considerat com el factor de creixement més rellevant en mastòcits. L’activació de KIT a través del SCF és crucial per al desenvolupament, la diferenciació i la supervivència dels mastòcits, així com per a una òptima desgranulació depenent d'IgE i producció de citocines. En aquesta tesis s’estudia el paper del 3BP2 en la regulació de l’activitat cel·lular a través dels receptors de membrana, FcepcilonRI i KIT. Amb els resultats podem concloure que el 3BP2 és necessari per obtenir una òptima resposta del mastòcit, tan a nivell de les respostes immediates, com la desgranulació, com en les respostes tardanes com la secreció de IL-8 i de GM-CSF. En la transducció de senyals a traves del FceRI, el 3BP2 és un important regulador de l’activació de mastòcits humans. Per tant, 3BP2 podria ser una diana terapèutica potencial per les malalties inflamatòries mediades pels mastòcits dependents d'IgE. Per altre banda, el silenciament del 3BP2 redueix l’expressió del receptor KIT, tant en la superfície com a nivell transcripcional, això implica un paper del 3BP2 en aquest procés. De fet, el silenciament del 3BP2 condueix a una reducció de MITF, factor de transcripció implicat en l’expressió de KIT. Les mutacions d’activació en KIT s'han associat amb diverses malalties com la mastocitosi, per tant analitzem la capacitat de 3BP2 per regular l'expressió de KIT en la línia cel·lular HMC-1 on KIT es troba mutat. Trobem que el silenciament de 3BP2 en aquestes cèl·lules també redueix l’expressió de KIT. Curiosament el silenciament de KIT i la inhibició de l’activitat cinasa del receptor redueix l’expressió de 3BP2, tot això suggereix una estreta relació entre ambdues molècules. Per tant, 3BP2 podria ser una possible diana terapèutica, en malalties inflamatòries mediades per mastòcits i en trastorns on el KIT esta desregulat. Una d’aquestes malalties associades a la desregulació del receptor KIT son els tumors de cèl·lules de l'estroma gastrointestinal (GIST). La majoria dels GIST presenten mutacions en KIT (85%) o en el receptor PDGFRa (5%) que comporten un increment de l’activitat cinasa d’ambdós receptors. En el present treball es mostra que 3BP2 s'expressa en línies cel·lulars procedents de pacients amb GIST i que la reducció de l’expressió de 3BP2 indueix un decrement de l’expressió del KIT. Curiosament, el silenciament de 3BP2 també redueix l’expressió de PDGFRa. Per altre part, 3BP2 coprecipita amb els receptors KIT i PDGFRa indicant que la molècula pot ser mediador de la senyalització d’ambdós receptors. Aquests nous resultats destaquen la importància del 3BP2 en la regulació de l’expressió i senyalització d’aquests dos receptors oncogènics, mostrant un paper com a possible diana terapèutica en GIST, especialment rellevant en els casos de pacients que han adquirit resistència als inhibidors de l’activitat cinasa d’aquests receptors. / 3BP2 is a cytoplasmic adaptor protein mainly expressed by haematopoietic cells that has been shown to act as a positive regulator in T, B and NK cell signal transduction. 3BP2 is an important regulator of cytotoxic granule release in NK cells. Mast cells similarly degranulate following antigen-dependent aggregation of the high affinity receptor for IgE (FceRI) on the cell surface. Activation of these cells induces the release of preformed inflammatory mediators and the de novo synthesis and secretion of cytokines and chemokines. The KIT receptor whose ligand is the stem cell factor (SCF) is necessary for mast cell development, proliferation and survival as well as for optimal IgE dependent signal. This thesis studied 3BP2 role in regulating cellular activity through membrane receptors, FcepcilonRI and KIT. Our findings point to a requirement for 3BP2 in optimal immediate and late mast cells responses such as degranulation and IL-8 or GM-CSF secretion. In signal transduction through FceRI, 3BP2 is an important regulator of the activation of human mast cells. Moreover 3BP2 silencing reduces expression of KIT receptor both on the surface and at the transcriptional level, this implies a role in this process 3BP2. In fact, the silencing of 3BP2 leads to a reduction in MITF, transcription factor involved in expression of KIT. Our results suggest a potential of 3BP2 as a therapeutic target in mast cell-mediated inflammatory diseases and deregulated KIT disorders. One of this disorders are gastrointestinal stromal tumors (GIST). Most GISTS contain oncogenic gain-of­function of KIT (85%) or PDGFRa receptor (5%) which is accompanied by strong expression of the protein products of these oncogenes. We show that 3BP2 is also expressed in cell lines form GIST patients and there are an interaction with3BP2 and both receptors. Interestingly, silencing of 3BP2 reduce oncogenic KIT and PDGFRa expression. These novel findings highlight the importance of 3BP2 in the regulation of the two oncogenic receptors expression and signalling indicating a role as a potential target in GIST, including those cases containing mutations that confer resistance to the KIT/ PDGFRa kinase inhibitors.

La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb Quists subcorticals (MLC) és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant de progressió lenta, que presenta com a principals característiques clíniques macrocefàlia acusada durant els primers anys de vida, deteriorament de les funcions motores, epilèpsia i retard mental de grau mig. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel·lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. Recentment s’ha descrit mutacions en ClC-2 associades a un tipus de leucodistròfia vacuolitzant. L’objectiu general d’aquesta Tesi és avançar en la comprensió del possible mecanisme d’acció i la funció de la proteïna GlialCAM i ClC-2 i així aprofundir en el coneixement de en el seu paper en les cèl·lules glials així com en la fisiopatologia de les leucoencefalopaties vacuolitzants. Per a realizar aquest objectiu es van realitzar estudis d’estructura-funció de GlialCAM mitjançant la caracterització bioquímica i funcional de noves mutacions en GLIALCAM associades a MLC. S’ha obtingut una classificació de les mutacions en GLIALCAM en funció del defecte que presentaven. S’ha descrit mutacions defectives en la expressió proteica, defectives en la homooligomerització i en el tràfic a les unions cel·lulars, defectives únicament en el tràfic cel·lular, mutacions sensibles a la manca de MLC1 i mutacions defectives en la internalització de la proteïna. Paral·lelament es va aprofundir en la relació bioquímica entre GlialCAM i ClC-2 a partir de l’estudi bioquímic i funcional de mutacions en CLCN2 associades a leucoencefalopaties vacuolitzants. S’ha observat que GlialCAM augmenta la funció del canal ClC-2 a través de la modificació del gating del canal i de la estabilització de ClC-2 a la membrana plasmàtica però no sembla que millori la sortida de ClC-2 del reticle endoplasmàtic. A més, aquesta estabilització requereix de la formació d’homocomplexes de GlialCAM. Per últim, es va generar i caracteritzar un model knock-down de la proteïna ClC-2 per aprofundir el paper de ClC-2 en els astròcits. Així com també es va avançar en la relació bioquímica i funcional entre GlialCAM i ClC-2 en la fisiologia astrocitària. S’ha descrit que en astròcits en cultiu en condicions d’alta concentració de K+, similar al que succeiria en situacions d’alta activitat neuronal, ClC-2 es transloca de l’aparell de Golgi a les membranes cel·lulars, modificant les seves propietats funcionals per l’efecte de GlialCAM. En canvi, en astròcits deficients de MLC1, ClC-2 es troba retinguda citoplasmàticament. Aquest fet, indicaria que aquestes proteïnes podrien tenir un paper en el procés de sifoneig del K+, i per tant, la deslocalització de ClC-2 podria donar lloc a un desordre en l’homeòstasi d’aigua i ions. / Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts (MLC) is a rare type of vacuolating leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. Recently, mutations in ClC-2 have been associated with a rare type of vacuolating leukodystrophy. The principal aim of this study is to advance in the knowledge of GlialCAM and ClC-2 in the glial cells and into the pathogenesis of vacuolating leukodistrophies. To accomplish the study, the group performed a biochemical and funcional characterization of new mutations in GLIALCAM associated with MLC. We suggest that the HEPACAM mutations described up to now can be classified in several groups. Some mutations can affect GlialCAM protein expression, affect its ability to cis-homooligomerize and consequently reduce their localization in cell–cell junctions. Some mutations can affect specifically only transinteractions between GlialCAM molecules or may be unstable without MLC1 and finally some mutations affect the protein internalization. Parallel progress was made in the biochemical relationship between GlialCAM and ClC-2 from biochemical and functional studies of mutations in CLCN2 associated with vacuolating leukodystrophies. GlialCAM has been observed to increase ClC-2 function by the modification of its gating and the stabilization of ClC-2 in the plasma membrane. In addition, the stabilization requires a previous formation of GlialCAM’s homocomplexes. Finally, a knock-down model of the CLC-2 protein was generated and characterized to deepen the role of CLC -2 astrocytes. As well as progress was made in biochemistry and functional relationship between CLC -2 and GlialCAM in the astrocitic physiology. It has been reported that astrocytes cultured in conditions of high concentrations of K + , similar to what happens in situations of high neuronal activity , CLC -2 translocates from the Golgi apparatus to the cell membrane , changing the its functional properties for the purpose of GlialCAM . However, in MLC1 deficient astrocytes, CLC -2 is retained intracellularly. This would indicate that these proteins could play a role in the potassium siphoning, and therefore the relocation of CLC -2 could lead to disorder in the homeostasis of water and ions.

"Acinetobacter baumannii" es una bacteria causante de infecciones nosocomiales a nivel mundial con una creciente incidencia y resistencia a todos los antibióticos. En el hospital de Bellvitge, desde 1992 se detectó una endemia por esta bacteria multirresistente de considerables proporciones. En este contexto realizamos diversos estudios epidemiológicos para clarificar los factores de riesgo para adquirir cepas con resistencia a carbapenémicos, que fueron: El estado previo de portador de cepas resistentes, haber recibido tratamiento con imipenem y haber estado en una unidad con otros pacientes colonizados o infectados por cepas carbapenem-resistentes. Aparte del clon previo sensible a imipenem, aparecieron 2 nuevos clones no relacionados epidemiológicamente resistentes a carbapenémicos, que rápidamente sustituyeron a los clones iniciales. No hubo diferencias significativas en las localizaciones de infección y la morbimortalidad entre las cepas sensibles y resistentes a carbapenémicos. Las medidas epidemiológicas de control, incluyendo la restricción del uso de carbapenémicos en las UCIs, fracasaron en el intento de control de la endemia. Las cepas con resistencia a todos los antibióticos, incluidos carbapenémicos, planteaban importantes dificultades en el tratamiento, puesto que según el antibiograma el único antibiótico que mantenía la sensibilidad in vitro era la colistina, y éste era un antibiótico en desuso, con importantes efectos secundarios y cuya actividad antibacteriana estaba en entredicho. Se planteó entonces la necesidad de un modelo experimental en animales, para intentar hallar algún antibiótico o combinación eficaz en las infecciones por cepas de "A. baumannii" resistentes a todos los antibióticos, incluso carbapenémicos. En este modelo de neumonía en ratón, utilizamos 3 cepas de "A. baumannii" con sensibilidad a imipenem, sensibilidad intermedia y resistencia de alto nivel. Analizamos la eficacia de diversos antibióticos con interés clínico en el tratamiento de estas infecciones: Imipenem, sulbactam, tobramicina, rifampicina y colistina, así como diversas combinaciones. Observamos que la colistina, el único antibiótico que mantenía in vitro la sensibilidad, era menos eficaz que otras combinaciones: En el clon con resistencia intermedia a carbapenémicos, las combinaciones de imipenem-tobramicina o sulbactam-tobramicina fueron los tratamientos más eficaces y superiores; a colistina mientras que en el clon con alta resistencia a carbapenémicos, las combinaciones de imipenem-rifampicina y tobramicina-rifampicina fueron las más activas, también más eficaces que colistina. Finalmente realizamos un estudio clínico piloto donde ensayamos, en 10 pacientes con infecciones por cepas resistentes a carbapenémicos, la pauta más activa obtenida del modelo animal (imipenem-rifampicina), concluyendo que aunque se consiguió la curación clínica en el 70 % de los pacientes, la combinación no consiguió evitar la aparición de resistencia a rifampicina en 7 de los casos. A la vista de nuestros resultados, aparte de la posible utilidad de otras combinaciones en la práctica clínica, parece que lo más efectivo en el control de las infecciones por A. baumannii multirresistente es asegurar las medidas de intervención epidemiológicas.

I. INTRODUCCIÓLa insuficiència renal crònica (IRC) és una patologia d'incidència creixent i en conseqüència, els requeriments de tractament substitutiu renal són també cada cop majors a les societats occidentalitzades. El trasplantament renal és el tractament substitutiu d'elecció en els pacients que desenvolupen IRC terminal, aportant una major supervivència, qualitat de vida i és menys cosotosa que la resta de teràpies substitutives renals.Des de que al 1954 es realitzà el primer trasplantament renal reeixit fins a l'actualitat, s'ha recorregut un camí molt llarg. El trasplantament renal ha passat de ser una teràpia anecdòtica i exclusiva, practicada solament en casos molt seleccionats, a fer-se de forma rutinària com a tractament electiu als centres hospitalaris.Els resultats del trasplantament renal a curt termini han millorat de forma significativa en els darrers quinze anys, assolint una taxa de supervivència de l'empelt de quasi el 95% durant el primer any del trasplantament. És evident que l'avenç significatiu en el coneixement dels mecanismes de la resposta immunitària ha permès l'elaboració de noves drogues immunosupressores, cada cop més selectives dirigides sobre dianes específiques i claus en l'activació de la resposta immunològica. Entre aquests fàrmacs cal destacar l'aparició durant les dècades dels 80 i 90 dels inhibidors de la calcineurina (ciclosporina i tacrolimus) i l' antiproliferatiu micofenolat mofetil, i a partir del 2000 els inhibidors de m-TOR (mamalian target of rapamycin) i les noves formulacions de l'àcid micofenòlic així com nous anticossos monoclonals i policlonals utilitzats com a teràpia d'inducció. Amb ells, s'aconseguí una reducció significativa dels episodis de rebuig agut cel.lulars, passant d'una incidència del 30-40% a una incidència actual entre el 10-15%. Malgrat tot, l'aparició inexorable de disfunció crònica de l'empelt, que es tradueix histològicament en lesions inespecífiques de fibrosi intersticial i atròfia tubular, i la mort del pacient essencialment degut a malaltia cardiovascular i al càncer, ambdues causes paradoxalment relacionades a l'ús crònic d'aquestes potents teràpies immunosupressores, han fet que la supervivència de l'empelt renal a llarg termini no s'hagi incrementat en els darrers 15 anys tal i com s'hauria esperat. Per tant, malgrat les noves estratègies terapèutiques immunosupressores aparegudes en les darreres dues dècades, no s'ha pogut evidenciar un impacte significatiu en la supervivència de l'empelt a més llarg termini. És per aquest motiu que sorgeix en els darrers anys una corrent de pensament, cada cop més majoritària entre la comunitat científica, que es postula a favor d'intentar preparar o programar al sistema immunològic per assolir un estat d'hiporesposta o tolerància immunològica específica enfront el donant, amb la finalitat de poder reduir o fins i tot en casos seleccionats, eliminar totalment el tractament immunosupressor d'una forma segura. Per assolir aquest objectiu però, és essencial disposar de marcadors biològics i eines de monitoratge de la resposta immunològica amb prou sensibilitat i especificitat que ens permetin conèixer l'estat funcional d'aquesta resposta d'una manera dinàmica en els diferents períodes evolutius del trasplantament.Il. HIPÒTESILa hipòtesi que proposem en el nostre treball és que el monitoratge de les subpoblacions limfocitàries T de memòria/efectora secretora d'IFN-gamma i T reguladora FoxP3+ donantespecífiques en el trasplantament renal podria exercir un paper rellevant com a biomarcadors de la funció immunològica donant-específica i per tant relacionar-se amb la funció i el dany histològic de l'empelt, tant en protocols protolerogènics com en el seguiment del pacient trasplantat en tractament de manteniment.III. OBJECTIUS1. El primer objectiu del treball de tesi és avaluar si el monitoratge dels linfòcits T de memòria/efectors circulants donant-específics i activats per les dues vies de presentación antigènica (directe i indirecte) mitjançant la tècnica d'Elispot IFN-gamma en pacients portadors d'un empelt renal de llarga evolució (>2 anys), és un bon biomarcador capaç de discriminar aquells pacients que presenten alteracions de la funció renal. 2. El segon objectiu és avaluar si la presència de cèl·lules Tregs (CD4+CD25+FoxP3+) entre infiltrats cel.lulars en pacients diagnosticats de rebuig agut subclínic, és un bon biomarcador per a diferenciar entre infiltrats lesius d'aquells amb un rol protector sobre l'empelt.3. El tercer objectiu d'aquest treball és avaluar els mecanismes a través dels quals l'administració d'un protocol immunosupressor amb propietats inmunomoduladores basat amb un tractament inductor deplecionador limfocitari T amb rATG a dosis baixes, acompanyat d'un tractament de manteniment amb sirolimus i micofenolat mofetil, sense esteroides ni fàrmacs anti-calcineurínics, és capaç d'induir un estat d'hiporesposta donant-específica després del trasplantament renal. Per assolir aquest objectiu, es realitza un monitoratge acurat de les diferents respostes immunològiques efectores d'aquests pacients en diferents períodes del trasplantament; la resposta cel.lular donant-específica per tècnica d'Elispot IFN-gamma, la resposta humoral mitjançant l'estudi d'al'loanticossos donant-específics (DSA) circulants i presència de C4d a nivell de capil.lars peritubulars de l'empelt i la resposta reguladora estudiant la presència i comportament funcional de les TregsFoxP3+ tant en sang perifèrica com directament a nivell de l'empelt renal.

La malaria y la anemia se encuentran entre los principales problemas de la salud pública mundial. Los recién nacidos y los niños pequeños son uno de los grupos de la población más afectados por ambas patologías. En áreas endémicas de malaria, la frecuente coexistencia de ferropenia, procesos inflamatorios y malaria dificulta la interpretación de las magnitudes bioquímicas utilizadas para valorar el metabolismo del hierro. Otra dificultad añadida en la interpretación de los resultados es la falta de valores normales en estas poblaciones. En los últimos años se ha desarrollado otro test indicador del contenido corporal de hierro, el receptor soluble de transferrina, que aumenta en aquellos pacientes con anemia por deficiencia de hierro mientras que no se altera en la anemia asociada a procesos infecciosos o inflamatorios. Se han realizado pocos estudios sobre la utilidad de este marcador en niños que viven en áreas endémicas de malaria y con resultados contradictorios.Los objetivos de esta investigación son: estudiar el metabolismo del hierro en un grupo de lactantes que viven en un área endémica de malaria, determinando el efecto de la inflamación y de la malaria, así como valorar la utilidad del receptor soluble de transferrina en el diagnóstico diferencial de la anemia en esta población. Se analizan, durante el primer año de vida, las magnitudes bioquímicas y hematológicas utilizadas habitualmente para valorar el metabolismo del hierro. Se ha observado que la edad influye sobre la prevalencia de las principales patologías que en esta zona afectan a este metabolismo y sobre las magnitudes bioquímicas y hematológicas estudiadas. Asimismo estas magnitudes se alteran en los niños con malaria y/o procesos inflamatorios. El receptor soluble de transferrina no contribuye al diagnóstico del tipo de anemia en los lactantes que viven en estas áreas, puesto que su concentración se eleva con la hemólisis asociada a la malaria además de con la ferropenia. Se recomienda continuar las búsqueda de nuevos test no invasivos que permitan detectar la deficiencia de hierro en estas zonas.

INTRODUCCIÓN. La familia HERC humana está formada por seis proteínas en cuyas secuencias se hallan invariablemente un dominio HECT (Homólogo al extremo C-terminal de E6AP) y uno o varios dominios RLD (Homólogos al regulador de la condensación cromosómica RCC1). La presencia del HECT sugiere que estas proteínas poseen actividad ubiquitina ligasa, mientras que la presencia de RLDs plantea la posibilidad de que posean además actividad intercambiadora de nucleótidos de guanina sobre GTPasas monoméricas. La proteína HERC1 es una proteína gigante (532 kDa) que ha sido implicada en el tráfico intracelular de membranas en virtud de su interacción con la cadena pesada de la clatrina (CHC) y con GTPasas de las familias ARF y Rab.OBJETIVOS. Con el fin de ampliar nuestros conocimientos acerca de la proteína HERC1 establecimos los siguientes objetivos: (1) identificación de moléculas que interaccionen con HERC1; (2) análisis de la localización subcelular de HERC1; (3) estudio de los efectos de la silenciación de HERC1 por RNAi; (4) análisis de formas truncadas y mutadas de HERC1.MÉTODOS. Para hallar móleculas capaces de unirse a HERC1 usamos técnicas tales como ensayos de doble híbrido en levadura, pull-downs, coinmunoprecipitaciones o ensayos de unión lípido-proteína. Las interacciones halladas fueron caracterizadas usando ensayos de ubiquitinación y de intercambio de nucleótidos, cromatografía de filtración en gel o medición de actividades enzimáticas. La distribución subcelular de HERC1 se estudió por microscopía confocal usando marcadores de varios compartimentos intracelulares. La silenciación de HERC1 se logró mediante transfección de un siRNA específico de ésta en células HeLa, en las que se estudió a continuación el funcionamiento de las vías de tráfico endocítico y secretor. Finalmente, el estudio de formas truncadas y mutadas de HERC1 se basó en el análisis microscópico de varias proteínas de fusión entre la proteína fluorescente verde (GFP) y las mencionadas formas de HERC1. RESULTADOS. La isoforma M2 del enzima glucolítico piruvato quinasa (M2PK) se identificó como una nueva proteína de unión a HERC1. No obstante, M2PK no es sustrato de ubiquitinación de HERC1, y ésta tampoco afecta la actividad enzimática ni la estructura cuaternaria de M2PK. También se demostró la presencia de la cadena ligera de la clatrina en un complejo citosólico en el que se hallan además HERC1, CHC y la chaperona Hsp70. HERC1 interacciona asimismo con la GTPasa ARF6, sobre la cual estimula la disociación de GDP. Dicha actividad se probó que depende de la unión a HERC1 de fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PIP2). Éste no es el único fosfolípido capaz de unirse a HERC1, ya que también lo hacen otros fosfoinosítidos. En cuanto a su distribución subcelular, HERC1 se halla en vesículas asociadas al Golgi pero no en endosomas. HERC1 es además reclutada a protrusiones de membrana ricas en actina por activación de ARF6. En relación a la silenciación de HERC1 por RNAi, ésta no afecta el tráfico endocítico ni secretor. Por último, ciertas formas delecionadas o mutadas de HERC1 forman agregados intracelulares ricos en ubiquitina, mientras que otras provocan cambios en el citoesqueleto de actina o inhiben la endocitosis del factor de crecimiento epidérmico (EGF).CONCLUSIONES. M2PK, CLC, ARF6 y varios fosfolípidos, tales como PIP2, han sido identificados como nuevas moléculas capaces de interactuar con HERC1. Esta proteína se halla asociada al aparato de Golgi y se transloca a protrusiones de actina. HERC1 no es, sin embargo, esencial para el adecuado funcionamiento de las vías celulares de endocitosis y secreción proteica, aunque la sobreexpresión de ciertos dominios de HERC1 causa alteraciones en el citoesqueleto de actina y la endocitosis de EGF. / INTRODUCTION. The human HERC family consists of six proteins whose sequences contain both HECT (Homologous to E6AP C-terminus) and RCC1-like domains (RLDs). While HECT domains are known to act as E3 ubiquitin ligases, RLDs behave, in at least some cases, as guanine nucleotide exchange factors for small GTPases. HERC1 is a giant (532 kDa) protein which has been implicated in membrane trafficking pathways through its ability to interact with clathrin heavy chain (CHC) as well as ARF- and Rab-family GTPases. OBJECTIVES. In this study, we sought to (i) identify new HERC1-binding molecules, (ii) pinpoint HERC1's subcellular localization, (iii) analyze the effects of siRNA-mediated HERC1 knockdown and (iv) characterize the behavior of truncated and mutant versions of HERC1.METHODS. HERC1-interacting molecules were found using yeast two-hybrid screens, pull-down, coimmunoprecipitation and lipid-protein overlay assays. The interactions were further characterized using ubiquitination and nucleotide exchange assays, gel filtration chromatography and enzyme activity measurements. The subcellular distribution of HERC1 was studied by confocal epifluorescence microscopy in several cell lines, which were also used to determine the effects upon intracellular trafficking pathways of a HERC1-specific siRNA and of a number of chimeric proteins between the green fluorescent protein (GFP) and various truncated and mutant forms of HERC1. RESULTS. M2-type pyruvate kinase (M2PK) was shown to interact with HERC1. However, HERC1 does not influence M2PK enzyme activity, oligomeric structure or ubiquitination. Clathrin light chain (CLC) and ARF6 also bind HERC1. Moreover, HERC1 stimulates GDP dissociation from ARF6, which, in turn, requires the presence of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) bound to HERC1. Other phospholipids apart from PIP2 also display affinity for HERC1. Regarding its subcellular localization, HERC1 appeared partly in Golgi-associated vesicles and was seen to translocate to actin-rich membrane protrusions in an ARF6-dependent manner. On the other hand, HERC1 siRNA was shown not to affect endocytic or secretory pathways whereas, by contrast, some GFP-HERC1 chimeras cause alterations in endocytosis and the actin cytoskeleton. CONCLUSIONS. M2PK, CLC, ARF6 and several phosphoinositides have been identified as HERC1-binding molecules. HERC1 is Golgi-associated and probably has a regulatory function in membrane trafficking and/or in cytoskeletal rearrangements.

Els mecanismes d'adhesió plaquetària i formació de trombes arterials venen determinats en gran mesura per l'entorn biomecànic, concretament per la velocitat i l'esforç de cisalla local. El present treball pretén aprofundir en el coneixement de diferents mecanismes inflamatoris implicats en el desencadenament de la trombosi arterial, concretament en els processos d'adhesió i activació plaquetàries.La creixent importància de la proteïna C-reactiva (CRP), un reactant de fase aguda, no només com a marcador sino com a modulador de la malaltia cardiovascular, així com la controvèrsia que ha sorgit dels seus estudis ens va plantejar estudiar l'efecte de les diferents isoformes de la CRP sobre el creixement del trombe en condicions de flux arterial. Així, vam conloure que les diferents isoformes de la CRP difereixen en els seus efectes sobre el creixement del trombe. Concretament, la isoforma monomèrica de CRP (mCRP) té un fenotip protrombòtic que indueix activació i adhesió plaquetària i el creixement del trombe en condicions de flux arterial, tant quan es troba en forma circulant com immobilitzada, mitjançant l'increment de P-selectina a la superfície plaquetària. En canvi, la isoforma nativa (natCRP) no té cap efecte en l'adhesió plaquetària ni en el creixement del trombe. Tanmateix, la CRP interacciona amb les plaquetes i s'incorpora a l'estructura tridimensional del trombe.D'altra banda, es desconeix si l'oclusió coronària per se, en absència de malaltia ateroscleròtica subjacent i altres factors de risc, pot produir una resposta inflamatòria aguda tant local com sistèmica que indueixi l'activació i adhesió de les plaquetes. Així, vam demostrar en un model porcí d'infart de miocardi que la isquèmia miocàrdica, en absència d'aterosclerosi, indueix expressió de mCRP cardíaca i provoca una resposta inflamatòria local i sistèmica i una major adhesió i activació plaquetària.Finalment, degut a que els efectes beneficiosos de les estatines en la prevenció de la malaltia aterotrombòtica van més enllà dels seus efectes hipolipemiants, es va estudiar l'efecte de la rosuvastatina sobre la formació del trombe amb l'objectiu d'identificar nous potencials mecanismes protectors de la rosuvastatina. Mitjançant un sistema de perfusió in vitro vam demostrar que la rosuvastatina inhibeix l'adhesió plaquetària en condicions de flux arterial i venós. Mitjançant un abordatge proteòmic vam demostrar que la rosuvastatina produeix un augment de GRP78 a la membrana de les plaquetes perfundides, que interacciona amb el factor tissular (TF), reduint la seva activitat procoagulant. / Mechanisms of thrombus formation and platelet adhesion are regulated by flow-mediated interactions where shear rate and shear stress play a key role. The present work aimed to study the role of inflammation in thrombus formation and platelet adhesion. The growing interest of C-reactive protein (CRP), an acute phase reactant, not only as a marker but also as a maker of cardiovascular disease, lead us to study the effect of the different CRP isoforms on thrombus formation under arterial flow conditions. We found that CRP isoforms differ in their effects on thrombus growth. Indeed, the monomeric isoform (mCRP) shows a prothrombotic phenotype and enhances platelet activation and adhesion under flow, both in a circulating form and immobilized with the activating substrate increasing platelet surface P-selectin expression. In contrast, native CRP (natCRP) has no effect on thrombus growth. Additionally, we observed that CRP isoforms interact with adhered platelets and incorporate on the structure of the growing thrombi.On the other hand, we studied whether coronary occlusion per se, in the absence of atherosclerotic disease and other risk factors, induces an inflammatory response triggering platelet adhesion and activation. We found in a porcine model of myocardial infarction that ischemia, in the absence of atherosclerosis, induces cardiac mCRP expression and produces a local and systemic inflammatory response triggering platelet adhesion and activation.Finnally, since beneficial effects of statins (lipid lowering drugs) go beyond its lipid-lowering effects, we studied the effect of rosuvastatin, a new available statin, on thrombus formation under flow with the aim to identify novel potential beneficial effects of rosuvastatin. Indeed, we found that rosuvastatin inhibits platelet adhesion under venous and arterial flow conditions. By means of a proteomic approach, we showed that rosuvastatin increases GRP78 (Glucose-regulated protein 78) on the platelet surface, which interacts with tissue factor reducing its procoagulant activity.