El objetivo general de esta tesis consistió en el estudio, in vitro (baño de órganos y microelectrodos), de la fisiología del cuerpo esofágico (EB) y del esfínter esofágico inferior (LES) con tejido de dos especies, humana y porcina. Permitiendo: Estudiar los neurotransmisores y mecanismos que controlan las respuestas inducidas por la estimulación de las motoneuronas (MNs) inhibitorias y excitatorias del plexo mientérico (MP) en el esófago (LES y EB) humano y animal. El modelo porcino está considerado como un modelo animal homólogo, ya que ambas especies tienen muchas similitudes tanto funcionales como estructurales respecto al tracto gastrointestinal. El objetivo del primer estudio, fue evaluar el efecto de la estimulación selectiva de las MNs inhibitorias y excitatorias en el LES porcino a través de los receptores nAChRs, 5-HT3 y P2X. Se estudiaron tiras de LES circular, de cerdos adultos, en baño de órganos. Se compararon los efectos de la estimulación de las MNs mediante estimulación eléctrica de campo (EFS:26V, 0.3-20Hz); nicotina (1-300μΜ); 5-HT y 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) y α,β-meATP (1-100μΜ) en tres soluciones: Krebs estándar, solución no-adrenérgica no-nitrérgica no-purinérgica (NANNNP) y solución no-adrenérgica no-colinérgica (NANC). Los resultados sugieren mecanismos selectivos para estimular las vías motoras inhibitoria y excitatoria en el LES porcino. Las MNs inhibitorias se estimulan intensamente mediante los receptores nAChRs y no responden a la estimulación de los receptores 5-HT3 y P2X. Por contra, las MNs excitatorias se estimulan a través de los receptores 5-HT3 y P2X, la estimulación a través de los nAChRs es difícil causando una respuesta débil. El objetivo del segundo estudio, fue explorar los mecanismos mientéricos de control de la motilidad esofágica humana y el efecto de los neurotransmisores nitrérgicos y no-nitrérgicos, mediante tiras esofágicas circulares en baño de órganos y microelectrodos. Se compararon las respuestas obtenidas tras la EFS de las MNs entéricas ó a través de los receptores nAChRs en el cuerpo esofágico (EB) y en las regiones clasp y sling del LES. Los resultados muestran una especialización regional en la estimulación de las MNs entéricas en el esófago humano, con respuestas inhibitorias más intensas en las fibras clasp del LES y respuestas excitatorias colinérgicas más intensas en el EB. Las respuestas inhibitorias están desencadenadas principalmente por las MNs entéricas nitrérgicas que median los potenciales postunión inhibitorios (IJP) en el LES y en el EB, la relajación-on inducida por EFS en las zonas clasp y sling del LES y la latencia en el EB. También se encontró un papel menor para las purinas (a través de receptores P2Y1) y el VIP mediando parte de la relajación no-nitrérgica en la zona clasp del LES. El objetivo del tercer estudio, fue caracterizar los neurotransmisores implicados en el origen y modulación de las contracciones del músculo liso circular del EB porcino. Se estudiaron las respuestas al EFS de las MNs de las tiras de EB en baño de órganos y microelectrodos. Se caracterizó el efecto de los antagonistas de los neurotransmisores inhibitorios (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) y excitatorios (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) y gangliónicos (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM). Los resultados sugieren que el timing (latencia) y amplitud de las contracciones esofágicas están determinadas por un equilibrio de interacciones complejas entre las MNs inhibitorias y excitatorias. La latencia depende de la activación de las MNs inhibitorias liberando NO y una contribución purinérgica menor a través de receptores P2Y1, y de las MNs excitatorias liberando ACh. La amplitud depende de una contribución principal de las MNs excitatorias liberando ACh y taquiquininas, y también de las MNs inhibitorias liberando NO, ATP o una purina relacionada y neurotransmisores peptidérgicos actuando como fuertes moduladores de la transmisión neuroefectora excitatoria. / The aim of this Doctoral Thesis was to study, in vitro, the physiology of the esophageal body (EB) and the lower esophageal sphincter (LES) with tissue from human and porcine species. To do these we used organ baths and microelectrodes, which have allowed us: To study both the neurotransmitters and the mechanisms that control the responses induced by stimulation of inhibitory and excitatory motorneurons (MNs) of the myenteric plexus (MP) in the human and animal esophagus (LES and EB). The porcine model is considered as a homologous animal model to human, as both species have many functional and structural similarities regarding the gastrointestinal tract. The aim of the first study was to assess the effect of selective stimulation of inhibitory and excitatory MNs in porcine LES through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs), 5-HT3 and P2X receptors. Circular LES strips from adult pigs were studied in organ baths. We compared the effects of stimulation of MNs by electrical field stimulation (EFS: 26V, 0.3-20Hz); nicotine (1-300μΜ; 5-HT and 2-Me-5-HT (1nM-30μΜ) and α,β-meATP (1-100μΜ) in standard Krebs solution, a non-adrenergic non-nitrergic non-purinergic (NANNNP) solution and a non-adrenergic non-cholinergic (NANC) solution. Our results suggest selective mechanisms for stimulation of intrinsic excitatory and inhibitory motor pathways in porcine LES. Inhibitory MNs are strongly stimulated by nAChRs and do not respond to stimulation of 5-HT3 and P2X receptors. By contrast, excitatory MNs are stimulated through 5-HT3 and P2X receptors, stimulation through nAChRs being difficult and causing a weak response. The aim of the second study was to explore the myenteric mechanisms of control of human esophageal motility and the effect of nitrergic and nonnitrergic neurotransmitters. Human circular esophageal strips were studied in organ baths and with microelectrodes. Responses following electrical field stimulation (EFS) of enteric motorneurons (MNs) or through nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) were compared in the esophageal body (EB) and in clasp and sling regions in the lower esophageal sphincter (LES). Our study shows a regional specialization to stimulation of EMNs in the human esophagus, with stronger inhibitory responses in clasp LES fibers and stronger cholinergic excitatory responses in the EB. Inhibitory responses are mainly triggered by nitrergic enteric MNs mediating the inhibitory junction potentials (IJP) in the LES and EB, EFS on-relaxation in clasp and sling LES sides, and latency in the EB. We also found a minor role for purines (through P2Y1 receptors) and vasoactive intestinal peptide-mediating part of nonnitrergic clasp LES relaxation. The aim of the third study was to characterize the neurotransmitters involved in the origin and modulation of circular smooth muscle esophageal body (EB) contractions in the porcine esophagus. Responses of porcine EB strips to electrical stimulation of motorneurons (MNs) were assessed in organ baths and with microelectrodes. The effect of antagonists of inhibitory (L-NAME 1mM, MRS2179 10μM) and excitatory neurotransmitters (atropine 1μM; SR140333 1μM-NK1ra-, GR94800 1μM-NK2ra-) and of ganglionic neurotransmitters (hexamethonium 100μM, ondansetron 1μM, NF279 10μM) were characterized. Our results suggest that timing (latency) and amplitude of esophageal contractions are determined by a balance of complex interactions between excitatory and inhibitory MNs. Latency depends on the activation of inhibitory MNs releasing NO and a minor purinergic contribution through P2Y1 receptors, and excitatory MNs releasing ACh. Amplitude depends on a major contribution of excitatory MNs releasing ACh and tachykinins, and also on inhibitory MNs releasing NO, ATP or related purines, and peptidergic neurotransmitters acting as strong modulators of the excitatory neuroeffector transmission.

La neurotransmissió inhibitòria participa en el control de l’activitat motora del còlon. Els neurotransmissors inhibitoris hiperpolaritzen la membrana del múscul llis, generant un potencial d'unió inhibitori (”Inhibitory Junction Potential” IJP) que és la base electrofisiològica de la relaxació muscular. Així, l’adenosina trifosfat (ATP), l’òxid nítric (NO) i el sulfur d’hidrogen (H2S) són molècules de senyalització que poden exercir aquest control. L’objectiu d’aquesta tesi doctoral ha estat valorar la participació de l’ATP, el NO i el H2S en la transmissió neuromuscular inhibitòria en el còlon humà i de rata. El hidrogensulfur de sodi (NaHS) va ser utilitzat com font de H2S. Els antagonistes específics dels receptors P2Y1 van inhibir completament el component purinèrgic de l’IJP en el còlon humà i de rata (rang de potència: MRS2500>MRS2279>MRS2179). El β-NAD va produir hiperpolarització i relaxació de la musculatura del còlon humà. Tanmateix, la relaxació no va ser bloquejada pels antagonistes P2Y1. En el còlon de rata es va observar que l’alliberament de neurotransmissors inhibitoris produïa la generació d’IJP espontanis i un potencial de membrana muscular hiperpolaritzat. Mitjançant MRS2500 es va posar de manifest que els receptors P2Y1 participaven en la gènesi dels IJP espontanis. El Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) va permetre establir que l'estat de hiperpolarització tònic del potencial de membrana era d'origen nitrèrgic. L’ús d’apamina, spadina i ODQ va permetre valorar la participació dels canals de potassi de baixa conductància activats per calci (SKCa), els canals de potassi relacionats amb TWIK tipus 1 (TREK1) i la via de la guanilat ciclasa (GC) sobre la neurotransmissió purinèrgica i nitrèrgica. L’apamina va bloquejar tots dos components amb diferents nivells d'afinitat. L’ODQ només va bloquejar la neurotransmissió nitrèrgica. D’altra banda, tot i posar de manifest la presència de canals TREK1 en el còlon de rata, la spadina, un blocador de TREK1, no va bloquejar cap dels components. L’expressió dels enzims de síntesi del H2S es va determinar immunohistoquímicament en l’epiteli, el múscul i les neurones del còlon de rata. A més, es va demostrar que el teixit de rata era capaç de produir enzimàticament H2S. Tot i que en alguns casos es van observar efectes no específics dels inhibidors dels enzims de síntesi del H2S, aquestos van produir despolarització de les cèl·lules musculars i un increment de l’activitat mecànica del còlon. En segments de còlon de rata, el NaHS administrat per serosa va causar un efecte dual sobre els patrons de motilitat. El NaHS va inhibir les contraccions d'alta amplitud, mentre que va incrementar les contraccions de baixa amplitud. El NaHS va inhibir els potencials d'unió excitador i va hiperpolaritzar el múscul. Tanmateix, l’H2S no va alterar el marcapassos colònic situat a nivell del plexe submucós. El NaHS via luminal no va modificar la motilitat del còlon. La neurotransmissió purinèrgica al còlon humà i de rata es produeix a través del receptor P2Y1. L’ATP i el NO són alliberats per les neurones inhibitòries del plexe mientèric i tenen funcions complementàries en el còlon. D'una banda, l’ATP exerceix una acció fàsica sobre el potencial de membrana i l’activitat mecànica, mentre que el NO té una acció tònica. Ambdues respostes nitrèrgica i purinèrgica son en part sensibles a apamina, suggerint que els canals SKCa poden esta involucrats en les dues vies. El NO exerceix el seu efecte sobre el potencial de membrana a través de l’activació de la via de GC però no activa els canals TREK1. El H2S és produït i alliberat endògenament en el còlon de rata i pot actuar com una molècula de senyalització amb acció moduladora sobre la motilitat colònica. El seu mecanisme d’acció implica una inhibició de la neurotransmissió colinèrgica i hiperpolarització muscular. / Inhibitory neuromuscular transmission is involved in the control of colonic motility. Inhibitory neurotransmitters cause membrane hyperpolarization of smooth muscle, that is, an inhibitory junction potential (IJP) which is the electrophysiological basis of muscle relaxation. Thus, adenosine triphosphate (ATP), nitric oxide (NO) and hydrogen sulphide (H2S) are signalling molecules which can exert this control. The aim of this thesis was to evaluate the role of ATP, NO and H2S in inhibitory neuromuscular transmission in the rat and human colon. Sodium hydrosulphide (NaHS) was used as the source of H2S. Specific P2Y1 receptor antagonists completely inhibited the purinergic component of the IJP in the human and rat colon (potency range: MRS2500> MRS2279> MRS2179). β-NAD produced smooth muscle hyperpolarization and relaxation in the human colon. However, the relaxation was not blocked by P2Y1 antagonists. In the rat colon, it was observed that the release of inhibitory neurotransmitters produced both spontaneous IJP and a sustained muscle hyperpolarization. MRS2500 revealed that P2Y1 receptors were responsible for spontaneous IJP. Nω-nitro-L-arginine (L-NNA) allowed us to establish that the tonic state of muscle hyperpolarization was nitrergic in origin. Apamin, spadin and ODQ were used to assess the involvement of small-conductance calcium-activated potassium channels (SKCa), TWIK-related potassium channels 1 (TREK1) and the guanylate cyclase (GC) pathway on purinergic and nitrergic neuromuscular transmission. Apamin blocked both components with a different relative sensitivity. ODQ only blocked nitrergic neuromuscular transmission. Furthermore, even though the presence of TREK1 channels was revealed in rat colon, none of the components was blocked by spadin, an effective TREK1 channel inhibitor. The expression of H2S-producing enzymes was determined by immunohistochemistry in the epithelium, muscle and nerve cells in the rat colon. In addition, it was demonstrated that the rat tissue was able to enzymatically produce H2S. Although in some cases the effects of H2S-producing enzymes inhibitors were not specific, they caused muscle depolarization and an increase in colonic mechanical activity. In segments of rat colon, NaHS caused a dual effect on motility patterns when administered via serosa. NaHS inhibited propulsive contractions whereas it caused an increase in the amplitude of ripples. NaHS inhibited cholinergic excitatory junction potentials and hyperpolarized smooth muscle cells. However, NaHS did not modify the colonic pacemaker located at the level of the submucosal plexus. Luminal addition of NaHS did not modify motility patterns. Purinergic neurotransmission in the rat and human colon is mediated by P2Y1 receptors. ATP and NO are released by myenteric plexus inhibitory neurons and have complementary functions in the colon. I.e. ATP produces a phasic action on membrane potential and mechanical activity and NO has a tonic effect. Both purinergic and nitrergic responses are in part apamin sensitive suggesting a possible involvement of SKCa in both pathways. NO effects on membrane potential are produced by GC activation but TREK1 channels are not involved. In the rat colon, H2S is produced and released endogenously and it might be a signalling molecule modulating action on colonic motility. H2S mechanism of action involves inhibition of neurally mediated cholinergic responses and muscle hyperpolarization.

Las variables clínicas en pacientes sometidos a cirugía cardíaca(CCA) se asocian con el pronóstico a corto y largo plazo en términos de mortalidad y morbilidad. Se han estudiado variables postoperatorias, aunque también variables pre- e intraoperatorias habituales, realizándose 5 líneas de investigación: paciente cirrótico, Acute Kidney Injury(AKI), cociente Presión parcial de oxígeno arterial/ Fracción inspirada de oxígeno (PaO2/FIO2), niveles de lactato arterial(LA), y el Índice de Masa Corporal(IMC). En el paciente cirrótico sometido a CCA la presión venosa central inicial es un factor independiente asociado a mortalidad hospitalaria, mientras que un SAPS III elevado y el volumen de orina menor en las primeras 24h fueron predictores de mortalidad a largo plazo. El MELD score(sensibilidad(S):85.7%;especificidad(E):83.7%) y el SAPS III(S:83.3%;E:64.9%)tienen el mejor poder predictivo a corto y a largo plazo respectivamente en esta población. La supervivencia global en toda la muestra(n=59) fue peor según el grado de hepatopatía (82.4% para Child A, 47.6% para Child B y 33.3% para Child C;P=0.001). Las características asociados a la fisiopatología del paciente cirrótico deben tenerse en especial consideración a la hora de someter estos pacientes a CCA. El desarrollo de AKI en el período postoperatorio tuvo una incidencia del 14%. Identificamos un mayor tiempo de circulación extracorpórea(CEC), una mayor necesidad de drogas vasoactivas y un mayor LA a las 24h tras ingresar en UCI como predictores de AKI. Una peor supervivencia se asoció a un mayor grado de AKI según la escala RIFLE modificada:74.9% para el subgrupo Risk,42.9% para el Injury, y 22.3% para el Failure(P<0.001) (seguimiento medio de 6.9±4.3años), siendo estos dos últimos asociados de manera independiente a una mayor mortalidad. El desarrollo de estrategias para la prevención de los factores de riesgo es básico para mejorar no tan sólo la incidencia de AKI, sino los resultados de la CCA en general. El cociente PaO2/FIO2 puede ser útil para la identificación de pacientes de CCA con mal pronóstico en el postoperatorio inmediato. Valores más bajos a las 3h tras el ingreso en UCI son los más útiles en términos de predicción de mortalidad. Asimismo hay una mayor mortalidad intra-UCI y complicaciones respiratorias con PaO2/FIO2<241 a las 3h. También se asoció a una peor supervivencia intrahospitalaria en comparación con PaO2/FIO2>241 a las 3h (88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% IC:1.293–1.786;P=0.004). El LA elevado(>3.0mmol•L-1)es frecuente en el postoperatorio de CCA y su elevación se asocia a mal pronóstico. La presencia de un LA>3.0mmol•L-1 fue un predictor para mortalidad hospitalaria(OR:1.468; 95% IC:1.239–1.739;P<0.001) y para la mortalidad a largo plazo(HR:1.511;95% IC:1.251–1.825;P<0.001). El antecedente de un infarto de miocardio(IAM) reciente y sufrir un mayor tiempo de CEC fueron predictores de un LA. El patrón dinámico del LA fue similar en supervivientes y no supervivientes pero con mayores valores en no supervivientes(ANOVA de medidas repetidas, P<0.001). Asimismo, el área bajo la curva objetivó mayores niveles de LA en los no supervivientes(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). Nuestros resultados objetivan una dinámica parecida de la curva de LA entre supervivientes y no supervivientes con mayores valores en estos últimos, lo cual podría sugerir un mecanismo similar del LA pero con una mayor producción en los no supervivientes. Aquellos pacientes que presentaron un LA>3.0mmol•L-1 y su pico se objetivó a las 24h tuvieron peor supervivencia(79.1%vs.86.7–89.2%;P=0.03)comparados con aquellos que presentaron su pico al ingreso, a las 6h o a las 12h durante el postoperatorio. La obesidad influencia de manera notable la estratificación y planificación de la CCA. Algunos estudios han objetivado mejores resultados en la población obesa en comparación con la población con IMC normal respecto a la mortalidad y supervivencia. Tras ajustar las variables preoperatorias e intraoperatorias mediante propensity score, una peor oxigenación y mejor estado nutricional, reflejados por una peor PaO2/FiO2 y unos niveles más elevados de albúmina, fue observado en pacientes con IMC elevado. Los pacientes obesos mostraron mayor riesgo para IAM peroperatorio(OR:1.768;95% CI:1.035-3.022;P=0.037)y sepsis(OR:1.489;95% CI:1.282-1.997;P=0.005). No hubo diferencias en la mortalidad hospitalaria entre grupos, aunque los pacientes con sobrepeso mostraron una mejor supervivencia al año comparados con la población normal(91.2%vs.87.6%;P=0.029). A pesar de ello, nuestros resultados no apoyan el concepto obesity paradox, que puede ser el resultado de sesgos en los diferentes estudios publicados. La mejoría del estudio pronóstico de variables en el postoperatorio inmediato las convierte en herramientas a pie de cama que ayudan al clínico en la toma de decisiones e influyen en la supervivencia de sus pacientes. Sin lugar a dudas, una mejor precisión pronóstica conlleva una mejoría en establecer el grado de vigilancia y cuidados que requiere cada paciente, y en consecuencia, los recursos destinados. La mayor precisión en el pronóstico a largo plazo tiene obvias e importantes ventajas, tanto desde el punto de vista clínico del paciente a nivel individual como desde el punto de vista sanitario y social. / The clinical variables in patients undergoing cardiac surgery(CS) are associated with prognosis in the short and long-term scenario in terms of mortality and morbidity. Five main areas of research are discussed: cirrhosis, Acute Kidney Injury(AKI), ratio of arterial partial pressure/oxygen fraction of inspired oxygen(PaO2/FIO2), arterial blood lactate levels(LA) and Body Mass Index(BMI). In the cirrhotic patient undergoing CS central venous pressure was an independent factor associated with hospital mortality, whereas a high SAPS III and lower urine volume during the first 24h were predictors of long-term mortality. The MELD score (sensitivity(S):85.7%;specificity(E):83.7%)and SAPS III(S:83.3%;E: 64.9%)showed the best predictive power in the short and long term scenarios, respectively. Overall survival(n=59)was worse with the degree of liver disease(82.4% for Child A, 47.6% for Child B and 33.3% for Child C;P=0.001). The pathophysiology associated with cirrhosis should be taken into account when referring these patients to CS. The development of AKI in the postoperative period was 14%. We identify a longer cardiopulmonary bypass time(CPB), a greater need for vasoactive drugs and greater LA at 24h after ICU admission as predictors of AKI. Worse survival was associated with a greater degree of AKI according to the modified RIFLE scale: 74.9% for the Risk group, 42.9% for the Injury group, and 22.3% for the Failure group(P<0.001)(mean follow up 6.9±4.3years). The latter two were independently associated with increased mortality. Developing strategies for the prevention of AKI is essential to improve their incidence and also the survival after CS. The PaO2/FIO2 can be useful for identifying patients with poor prognosis in the immediate postoperative period. Lower values at 3h after admission to ICU are most useful in terms of prediction of mortality. There was also a greater intra-ICU mortality and respiratory complications with PaO2/FIO2<241 at this time. It was also associated with worse in-hospital survival compared with PaO2/FIO2>241(88.8%vs.95.8%;P=0.002.Adjusted Hazard ratio(AHR):1.48;95% CI:1293-1786;P=0.004). A higher LA(>3.0mmol•L-1)is associated with poor prognosis after CS. The presence of an LA>3.0mmol•L-1 was a predictor of hospital mortality(OR:1.468;95% CI:1.239-1.739;P<0.001)and for long-term mortality(HR:1.511;95% CI:1251-1825;P<0.001). A history of recent myocardial infarction(AMI)and a longer CPB time were predictors of higher LA. The dynamic pattern of LA was similar in survivors and non-survivors but with higher values in non-survivors(repeated measures ANOVA,P<0.001). Also, the area under the curve was higher in non-survivors(80.9±68.2vs.49.71±25.8mmol•L-1•h-1;P=0.038). This might suggest a similar pathophysiology for LA but higher production in non-survivors. Those patients who had LA>3.0mmol•L-1 and its peak was at 24h after ICU admission had worse survival(79.1%vs.86.7-89.2%;P=0.03)compared with those who had their peak on admission, at 6 or 12 h postoperatively. Obesity influences significantly stratification risk of CS. However, some studies have showed better survival in the obese population compared to normal BMI population. After adjusting for confounding factors using propensity score, a worse oxygenation and better nutritional status, reflected by a lower PaO2/FiO2 and higher albumin levels, was showed in patients with higher BMI. Obese patients showed increased risk for perioperative AMI(OR:1.768;95% CI:1035-3022;P=0.037)and sepsis (OR:1.489;95% CI:1282-1997;P=0.005). There was no difference in hospital mortality between groups, although overweight patients showed better survival at one year compared to the normal population (91.2%vs.87.6%;P=0.029). However, our results do not support the obesity paradox, which may be the result of bias in different published studies. The improvement of the knowledge of clinical variables in the immediate postoperative period becomes a tool to help physicians in making decisions and influencing the survival of the patients who undergo CS. Undoubtedly, better prognostic accuracy implies an improvement in establishing the degree of resources by each patient. Indeed more accurate long-term prognosis has obvious and important advantages, both from the clinical and social point of view.

Tesi realitzada a l'Hospital Universitari Mútua Terrassa / El carcinoma broncogénico (CB) representa la primera causa de mortalidad por cáncer en ambos sexos en los países desarrollados. La evaluación prequirúrgica del mediastino es esencial para definir el pronóstico y guiar el tratamiento de estos pacientes. Las guías para la estadificación ganglionar mediastínica preoperatoria de la European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) recomiendan una exploración con certificación cito-histológica, ya sea con técnicas endoscópicas de punción guiada por ecografía o mediante una exploración quirúrgica del mediastino, en las siguientes situaciones: cuando la tomografía computerizada detecta ganglios mediastínicos de tamaño patológico, en tumores de localización central o cuando la tomografía por emisión de positrones (PET) muestra una hipercaptación mediastínica o hiliar. Así mismo, estas guías recomiendan la exploración y biopsia de, como mínimo, las siguientes estaciones ganglionares mediastínicas: paratraqueales inferiores derechas e izquierdas, y subcarínica, cuyo estudio puede llevarse a cabo mediante técnicas de punción eco-endoscópicas. Cuando no se dispone de estas técnicas o su resultado es negativo, debe realizarse una exploración quirúrgica del mediastino (principalmente una mediastinoscopia cervical estándar), por presentar un mayor valor predictivo negativo. En el caso de los tumores izquierdos también se recomienda explorar las estaciones ganglionares paraórtica y subaórtica, que no son accesibles a través de las técnicas de punción eco-endoscópica. Para llevar a cabo su exploración es necesaria una técnica quirúrgica como la mediastinotomía paraesternal izquierda, la mediastinoscopia cervical extendida (MCE) o la videotoracoscopia izquierda. La MCE permite explorar las estaciones paraórtica y subaórtica, utilizando la misma incisión cervical realizada para la mediastinoscopia cervical estándar, y por lo tanto, la vía transcervical permite una exploración completa del mediastino superior y de la ventana aorto-pulmonar. Los objetivos de la presente tesis, que se basa en dos artículos publicados y relacionados entre sí, son: evaluar los valores de estadificación obtenidos tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico de evaluación ganglionar mediastínica basado en las guías de estadificación de la ESTS, evaluar la rentabilidad de la MCE en la estadificación del CB izquierdo y, finalmente, evaluar la supervivencia de aquellos pacientes intervenidos quirúrgicamente con afectación ganglionar mediastínica insospechada N2p. El primer trabajo es un estudio retrospectivo (1998-2010) de 221 MCE de estadificación realizadas en pacientes con CB izquierdo. Se analizó la precisión diagnóstica de la técnica y del protocolo en 2 períodos: 1998-2003 con MCE sistemática y 2004-2010 con PET sistemática y MCE selectiva. Los resultados obtenidos mostraron que la MCE posee una elevada precisión diagnóstica (sensibilidad: 0.67; valor predictivo negativo: 0.94; exactitud diagnóstica: 0.95) para la detección clínica de N2. Su uso selectivo permite reducir la MCE en cerca del 30 % de los pacientes con sin disminuir el valor predictivo negativo del protocolo en ambos períodos. El segundo trabajo es un estudio retrospectivo (2004-2010) de 540 pacientes estadificados y operados siguiendo las guías de la ESTS. Se analizaron los valores de estadificación y la supervivencia del subgrupo de pacientes con resultado final N2p. Los resultados obtenidos mostraron que tras la aplicación de un protocolo prequirúrgico basado en las guías de la ESTS se consigue unos valores de estadificación elevados (valor predictivo negativo: 0.91) con una baja tasa de falsos negativos (5.5%). Los pacientes con resultado final N2p insospechado presentan una mejor supervivencia (supervivencia a los 5 años del 40%) que la esperada en comparación con la observada en los pacientes quirúrgicos de la base de datos de la International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) utilizada para la 7ª edición de la clasificación TNM. En conclusión, las guías de la ESTS deben implementarse en la práctica clínica a la luz de los buenos resultados de estadificación y supervivencia. / Preoperative mediastinal staging is essential to predict prognosis and to guide treatment in patients with non-small cell lung cancer (NSCLC). The European Society of Thoracic Surgeons (ESTS) guidelines for preoperative mediastinal nodal staging recommend tissue confirmation when computed tomography shows enlarged nodes, in central tumors or when positron emission tomography (PET) shows an increased mediastinal or hilar uptake. The recommendation is to explore the right and left inferior paratracheal, and subcarinal stations. In left-sided tumors, the exploration of subaortic and paraortic nodal stations is also recommended. This can be done by extended cervical mediastinoscopy (ECM). This thesis is based on two published and related articles, the objectives of which are: to evaluate the staging values after applying a preoperative mediastinal staging protocol according to the ESTS guidelines, to evaluate the accuracy of ECM for staging left-sided NSCLC and to evaluate the survival of surgically treated patients with unsuspected mediastinal pathological (p) N2 disease. The first publication is a retrospective study that includes 221 ECM for staging left NSCLC. The accuracy of the technique and of the protocol were calculated in two periods: 1998-2003 with systematic ECM and 2004-2010 with systematic PET and selective ECM. The results of this study show a high diagnostic accuracy of ECM (sensitivity: 0.67; negative predictive value: 0.94; accuracy: 0.95). Its selective indication allows reducing ECM in near 30% of the patients without reducing the negative predictive value of the protocol. The second publication is a retrospective study (2004-2010) including 540 patients staged and operated following the ESTS guidelines. The results of this study show that after applying the ESTS guidelines, high staging values (negative predictive value: 0.91) and low false negative rate (5.5%) are observed. Survival rate in patients with unsuspected pN2 disease was higher (5-year survival rate of 40%) than expected, compared with survival of surgical patients with pN2 of the International Association for the Study of Lung Cancer (IASLC) database used to inform the 7th edition of TNM classification. Therefore, the ESTS guidelines on preoperative mediastinal nodal staging should be used in clinical practice.

L’àcid maslínic (2a, 3ß-dihidroxilean-12-ene-28oic) és un triterpè pentacíclic que s’ha aïllat de diferents espècies vegetals, tant medicinals com comestibles, i al qual se li han atribuït efectes beneficiosos per a la salut. A la present memòria s’ha estudiat la toxicitat i la biodisponibilitat d’aquest compost per tal d’aprofundir en el seu coneixement. En primer lloc, s’ha posat a punt una tècnica per determinar l’àcid maslínic a plasma de rata mitjançant una doble extracció líquid-líquid i posterior anàlisi per HPLC-MS. Aquest mètode ha demostrat ser lineal (R>0,997), exacte (<4,82%), sensible (LLOQ 5 nM), precís, tant intra-dia (5,45%) com inter-dia (8,38%), amb una recuperació del 99% i un efecte matriu del 24%. El mètode va permetre la determinació de l’àcid maslínic a plasma 24 h després de l’administració oral de 10, 25 i 50 mg/kg a rates mascle Sprague-Dawley tot indicant que és apropiat per a ser emprat en estudis de biodisponibilitat. A continuació, s’ha avaluat si l’administració de dosis elevades d’àcid maslínic presenta efectes nocius seguint les normes OECD (2008). La toxicitat subaguda s’ha avaluat administrant l’àcid maslínic (50 mg/kg) diàriament per via oral a ratolins mascle Swiss CD-1 durant 28 dies. No s’han observat alteracions ni anomalies causades pel tractament ni en el pes corporal, ni en les magnituds hematològiques i bioquímiques ni a l’examen histopatològic dels òrgans vitals. Un cop establerta l’absència de resultats de rellevància toxicològica es va estudiar la biodisponibilitat, com a pas previ al seu ús futur com a nutricèutic. Per això, es va administrar el triterpè a rates mascle Sprague-Dawley per via oral (50 mg/kg) i intravenosa (1 mg/kg) i es va extreure sang a diferents temps durant 24 hores. Les concentracions plasmàtiques de l’àcid maslínic obtingudes després de l’administració oral i intravenosa van ser analitzades simultàniament seguint una aproximació poblacional amb el programa NONMEN. El model bicompartimental amb absorció de primer ordre i eliminació lineal és el que millor descriu el comportament de l’àcid maslínic a l’organisme. L’anàlisi de les constants farmacocinètiques indiquen que aquest compost bioactiu té una absorció relativament ràpida (Ka = 0,52 1/h) amb una concentració màxima de 4,03 µM a les 0,51 h i una biodisponibilitat del 5,13%. Per últim, s’han estudiat els metabòlits de l’àcid maslínic després de l’administració oral a rata (50 mg/kg), mitjançant l’HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. S’han identificat 7 metabòlits a plasma resultants del metabolisme de fase I, corresponents a les relacions massa/càrrega (m/z) de 487,3 (M1 - M4), 485,3 (M5) i 501,3 (M6 i M7) i a orina s’han detectat només 4 (M1, M4, M5 i M6) sent l’àcid maslínic majoritari en ambdues matrius. En conclusió, l’àcid maslínic no presenta efectes adversos in vivo, té una baixa biodisponibilitat i es metabolitza poc donant derivats únicament de fase I. Els resultats obtinguts constitueixen un primer pas en l’ús futur de l’àcid maslínic com a nutricèutic. / Maslinic acid (2a, 3ß-dihydroxyolean-12-en-28oic) is a pentacyclic triterpene isolated from medicinal and edible plants, and with health-enhancing effects. Therefore, the present work aims to assess the toxicity and bioavailability to get an in-depth knowledge of maslinic acid. Firstly, a method was set up to determine maslinic acid in rat plasma by means of a double liquid-liquid extraction and HPLC-MS analysis. The method is lineal, accurate, sensitive and precise with a recovery of 99% and a matrix effect of 24%. The method allowed the determination of maslinic acid in plasma withdrawn 24h after the administration of 10, 25 and 50 mg/kg to rats. Secondly, it was evaluated whether high doses of maslinic acid have harmful effects, following the OECD guidelines (2008). Subacute toxicological evaluation was performed through the daily oral administration of 50 mg/kg maslinic acid to mice for 28 days. The treatment did not modify the body weight and did not exert harmful effects as shown in the hematology, clinical biochemistry and histopathology evaluation. Thirdly, the bioavailability of maslinic acid has been studied by the administration of the triterpene to rats orally (50 mg/kg) and intravenously (1 mg/kg). Blood was collected at different times over 24 h and the plasmatic concentrations of maslinic acid obtained after both administrations were analyzed simultaneously following a population PK approach with the NONMEM software. These concentrations were best fitted to a bicompartmental model with first order absorption and lineal elimination processes. The pharmacokinetic parameters obtained indicate that maslinic acid has a relatively rapid absorption and a low bioavailability. Finally, the metabolites of maslinic acid were studied after its oral administration to rats (50 mg/kg) by HPLC-LTQ-Orbitrap-MS. Seven metabolites were identified in plasma resulting from phase I reactions and corresponding to mass/charge ratios of 487.3 (M1 - M4), 485.3 (M5) and 501.3 (M6 and M7). Only 4 of them were detected in urine (M1, M4, M5 and M6). Maslinic acid was the main compound in both matrices. In conclusion, maslinic acid does not exert adverse effects in vivo, and has a low bioavailability and metabolism with biotransformations mainly attributable to phase I.

Nombroses malalties resulten d’una alteració de las propietats mecàniques dels teixits i/o d’una alteració en la resposta cel·lular a les forces (mecanotransducció). La fibrosi es el paradigma de la mecànica tissular alterada, caracterizant-se per una excessiva acumulació de matriu extracel·lular (MEC) que destrueix l’arquitectura de l’òrgan. La fibrosi pulmonar idiopàtica (FPI) és una forma de malaltia pulmonar intersticial (MPI) de causa desconeguda i molt mal pronòstic, amb una supervivència del 30-50% als 5 anys. En aquest treball s’ha desenvolupat una estratègia de cribratge biomecànic que s’ha aplicat l’estudi de la FPI per identificar gens mecanosensibles potencialment rellevants com a dianes terapèutiques. Es van cultivar fibroblasts pulmonars primaris, la cèl·lula responsable del remodelat i enduriment de la MEC, en substrats coberts de col·lagen I de 5 rigideses distintes al llarg del rang fisiopatològic del pulmó, des de la normal (<1 kPa) fins la pròpia de la fibrosi (~30-40 kPa) i en presència de TGF-β. Es van incloure 3 classes de fibroblasts: FPI, control i MPI distintes de la FPI i es va realitzar un perfilat transcripcional mitjançant microarrays d’expressió. S’ha definit el mecanotranscriptoma dels fibroblasts pulmonars, format per 63 gens mecanosensibles, la transcripció dels quals està controlada pels canvis en les propietats mecàniques de la MEC. Un 57% dels gens van ser sobreexpressats amb l’enduriment i 21 gens van discriminar entre la FPI i las altres dos classes de fibroblasts. Para entendre las xarxes reguladores associades al mecanotranscriptoma, es va construir l’interactoma dels seus components, el qual va revelar tres xarxes emergents, les quals poden ser rellevants per entendre l’adaptació de les cèl·lules a l’enduriment del substrat en la FPI i en la mecanobiologia en general: 1) elements del citoesquelet i les fibres d'estrés, 2) quinases MAPK i les seves fosfatases i 3) proteïnes relacionades amb el factor de creixement similar a la insulina (IGF) i proteases del sistema de fibrinòlisi. Després de validar l’expressió a nivell de mRNA i de proteïna de diversos candidats del mecanotranscriptoma, es van caracteritzar diversos aspectes de la proteïna d’unió al factor de creixement similar a la insulina 3 (IGFBP-3). La concentració d’IGFP-3 secretada pels fibroblasts va ser distintivament superior en els fibroblasts de FPI. Per altra banda, amb l’enduriment del substrat es va detectar un factor de mecanosensibilitat de l’odre 3X en totes les classes de fibroblasts, mentre que el TGF-β la va induir 150 vegades. L’efecte dels dos factors va ser independent, mentre que la seva combinació va potenciar sinèrgicament els nivells d’IGFBP-3. L’efecte de la duresa del substrat en l’acumulació d’IGFBP-3 va ser independent de la senyalització a través del receptor de TGF-β. Per altra banda, els efectes van ser dependents del receptor de col·lagen integrina β1. Aquests resultats mostren que la IGFBP-3 es una proteïna important en la fibrogènesi pulmonar mediada por l’enduriment, que portaria a una acumulació de MEC i a la destrucció de l’arquitectura del teixit. / A new strategy based on a biomechanical screening has been developed and it was applied to the study of idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) to identify mechanosensitive genes that might be potential therapeutic targets for the disease. The transcriptional profile of lung fibroblasts (control and fibrotic of different types) cultured on substrates of different stiffness spanning the normal to fibrotic (stiffened) range was obtained. The mechanotranscriptome of the cells was established, which consisted of 63 mechanosensitive genes, 57% of which were upregulated by tissue stiffening. It was built an interactome, showing the regulatory networks associated with the mechanotranscriptome, revealing three different subnetworks: 1) elements of the cytoskeleton and stress fibers; 2) MAPK quinases and their phosphatases; 3) proteins associated with insulin-like growth factor and the fibrinolysis pathway. After validating expression at the mRNA and protein levels for different selected candidates from the mechanotranscriptome, different biological aspects of insulin-like growth factor binding protein 3 (IGFBP-3) were analyzed. Concentration of IGFBP-3 secreted by fibroblasts was distinctively higher in IPF fibroblasts. With substrate stiffening, a mechanosensitivity factor of 3X was detected in all classes of lung fibroblasts, while transforming growth factor- β (TGF- β) induced protein levels by 150X. The effect of tissue stiffening on IGFBP-3 accumulation was independent of signaling through the TGF-β receptor and dependent of the collagen receptor integrin β1. These results show that IGFBP-3 is an important protein for lung fibrogenesis mediated through stiffness and that it could lead to an accumulation of extracellular matrix and contribute to the destruction of the lung architecture.

Los sistemas SPECT de animal pequeño alcanzan una resolución espacial inferior al milímetro. Para conseguirlo, es necesario utilizar colimadores pinhole, ya que la imagen del objeto proyectada en la gammacámara a través del pequeño orificio del colimador puede estar ampliada respecto al objeto. Con el fin de optimizar el proceso de reconstrucción y obtener resoluciones submilimétricas utilizando equipos de pequeño formato equipados con un colimador pinhole, es necesario utilizar métodos de reconstrucción iterativos. Estos algoritmos ofrecen una calidad de imagen superior y una mejor exactitud en la cuantificación que los métodos de reconstrucción analíticos, al poder corregir las diferentes degradaciones sufridas en el proceso de formación de la imagen. A continuación se detalla el trabajo desarrollado y los principales resultados obtenidos para conseguir este objetivo: 1. Implementación de un programa de calibración para calcular los parámetros geométricos que describen la adquisición de un equipo SPECT equipado con colimador pinhole. 2. Desarrollo de un algoritmo de reconstrucción iterativa OSEM para la reconstrucción de estudios SPECT con colimador pinhole. 3. Adaptación el algoritmo de reconstrucción y el programa de calibración a un equipo SPECT con colimador pinhole de pequeño formato desarrollado en nuestro centro. La resolución tomográfica del equipo fue de 1 mm para radios de adquisición pequeños. Las imágenes reconstruidas de estudios en ratones muestran la viabilidad del equipo para su utilización con pequeños animales. 4. Incorporación en la matriz de transición del sistema la geometría del sistema, la penetración septal a través del colimador y la respuesta del detector. La resolución, el contraste y los coeficientes de recuperación mejoran al incorporar la penetración septal respecto a la modelización geométrica, aunque la mejora más importante se obtuvo al incluir la respuesta del detector. El número de iteraciones utilizadas en la reconstrucción debe limitarse para evitar la aparición de artefactos de anillo. Estos artefactos son de mayor importancia cuando la modelización del sistema incorpora la geometría, la penetración septal y la respuesta del detector. 5. Comparación del algoritmo de reconstrucción desarrollado con un algoritmo de reconstrucción que calcula la matriz de transición con técnicas de Monte Carlo. El tiempo de cálculo de la matriz de transición del sistema con la aproximación analítica fue tres órdenes de magnitud inferior al de la aproximación por Monte Carlo. La resolución y el contraste de las imágenes reconstruidas mediante ambas aproximaciones fueron similares. Las imágenes reconstruidas con el modelo Monte Carlo presentaban una relación señal/ruido sensiblemente más baja, posiblemente asociada a problemas de precisión en el cálculo de los elementos de matriz por la utilización de un número insuficiente de historias de fotones en el cálculo. / Small animal SPECT systems can achieve a spatial resolution of less than 1 mm. Such resolution is possible thanks to pinhole collimators, which can amplify the gamma camera projection of the object, and by using iterative reconstruction methods. These methods improve image quality and offer better quantification accuracy than analytic reconstruction methods, by correcting the different degradations that occur during the image formation process. The work developed and the main results are detailed as follows: 1. A calibration program to calculate geometric parameters that describe the acquisition process of a SPECT system with a pinhole collimator was implemented. 2. An OSEM iterative reconstruction algorithm for SPECT studies acquired with a pinhole collimator was developed. 3. The reconstruction algorithm and the calibration program were adapted to an in-house developed small SPECT device with a pinhole collimator. Tomographic resolution was 1 mm for small acquisition radii. Image reconstruction of mice studies showed the viability of using the equipment with small animals. 4. System geometry, septal penetration through the collimator and detector were incorporated response to the transition matrix. In the first approach, the system geometry was incorporated. Resolution, contrast, and recovery coefficients improved when septal penetration was modeled, although the greatest improvement was obtained when detector response was included. Iterations had to be limited to avoid the appearance of ring-artifacts. 5. The reconstruction algorithm developed (analytical model) was compared with a reconstruction algorithm which calculates the transition matrix based on Monte Carlo techniques (Monte Carlo model). The computation time of the transition matrix system using the analytical approach was three orders of magnitude lower than the Monte Carlo approach. Resolution and contrast of the reconstructed images using the two approaches were similar. Images reconstructed with the Monte Carlo model presented a lower signal-to-noise ratio than images reconstructed with the analytical model, possibly due to accuracy problems associated with the matrix elements because of an insufficient number of photons in the calculation.

PART 1. EFECTE DE LA HIPÒXIA I FACTORS POINFLAMATORIS SOBRE EL REMODELAT CARDÍAC EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. Els mecanismes moleculars pels quals la isquèmia miocardíaca es tradueix en remodelat ventricular i insuficiència cardíaca són poc coneguts. HIPÒTESI. La hipòxia i factors proinflamatoris són inductors específics de recanvi de matriu extracel•lular en els cardiomiòcits humans. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars humans adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condicions de tensió reduïda d’oxigen, CoCl2 (activador del factor de transcripció induïble per hipòxia 1, HIF-1), rotenona (inhibidor de HIF-1), TNFα, IL1β, LPS o vehicle durant intervals de temps variables. Un cop completats els períodes d’incubació, van obtenir-se els sobrenadants i el RNA cel•lulars per determinar la secreció cel•lular i l’expressió gènica de factors relacionats amb el recanvi de matriu extracel•lular. RESULTATS. La hipòxia indueix la producció de PIIINP (propèptid aminoterminal del del procolàgen tipus III) i inhibeix la síntesi i producció de TIMP1 (inhibidor tissular de metaloproteinases tipus 1) en els cardiomiòcits. La IL1β estimula la producció de PIIINP, TIMP1 i àcid hialurònic en cardiomiòcits. CONCLUSIÓ. La hipòxia i la IL1β activen el remodelat de matriu extracel•lular en cardiomiòcits ventriculars humans. Els resultats suggereixen que la hipòxia i la IL1-β són factors contribuents a la dilatació ventricular i insuficiència cardíaca en la malaltia cardíaca isquèmica. PART 2. EFECTE DE LA HIPÒXIA SOBRE LA SECRECIÓ DEL PÈPTID NATRIURÈTIC TIPUS B (BNP) EN CARDIOMIÒCITS VENTRICULARS HUMANS. INTRODUCCIÓ. El principal estímul per la síntesi i secreció de BNP es la distensió de la paret cardíaca. Evidències recents suggereixen que la isquèmia cardíaca pot induir també la producció de BNP. HIPÒTESI. La tensió reduïda d’oxigen estimula directament l’expressió gènica i la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans en absència d’estímuls hemodinàmics o neurohormonals. MÈTODES. Cardiomiòcits ventriculars adults (cèl•lules AC16) van ser incubats en condiciones normòxiques o hipòxiques amb o sense la presència de rotenona. L’acumulació de BNP, ANP i VEGF es va mesurar en els sobrenadants cel•lulars. L’expressió gènica d’aquests factors va determinar-se mitjançant PCR a temps real. L’activitat transcripcional de HIF-1 va determinar-se en extractes nuclears cel•lulars mitjançant un enziminmunoassaig lligat a la seqüència d’unió de HIF-1 al DNA. RESULTATS. L’activitat transcripcional de HIF-1 va induir-se en condicions hipòxiques. La hipòxia va estimular la secreció i l’expressió gènica de BNP i VEGF però no d’ANP en els cardiomiòcits. La inhibició de HIF-1 en condicions hipòxiques va disminuir la secreció de BNP i VEGF. CONCLUSIONS. La hipòxia indueix la síntesi i secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars humans a través d’un mecanisme depenent de l’activació transcripcional de HIF-1. PART 3. ESTUDI DE LA SIGNIFICACIÓ CLÍNICA DE LES CONCENTRACIONS PLASMÀTIQUES DE BNP A L’INGRÉS EN PACIENTS AMB SÍNDROME CORONÀRIA AGUDA (SCA). INTRODUCCIÓ. Els pacients SCA presenten concentracions plasmàtiques elevades de BNP atribuïdes a la distensió de la paret ventricular. Existeix poca informació sobre el valor clínic d’aquest marcador cardíac en pacients amb SCA i fracció d’ejecció ventricular esquerra (LVEF) preservada. La demostració que la hipòxia estimula directament la secreció de BNP en cardiomiòcits ventriculars permet formular la hipòtesi que els pacients amb SCA sense insuficiència cardíaca i/o disfunció ventricular presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades, en relació al grau d’hipòxia cel•lular. Mètodes. L’estudi es va realitzar en 1806 pacients amb SCA ingressats de forma consecutiva dins les primeres 24 hores posteriors a l’inici dels símptomes. Es va realitzar un seguiment durant un any de l’aparició d’esdeveniments adversos. RESULTATS. La concentració plasmàtica de BNP en els pacients amb SCA i LVEF preservada va ser superior a l’observada en un grup control d’individus sans. Durant el seguiment, l’aparició d’esdeveniments adversos va ser del 10,0% en els pacients amb LVEF reduïda i del 7,9% en els pacients amb LVEF preservada. Els pacients amb BNP>150 pg/ml van presentar una major probabilitat d’esdeveniments adversos. L’anàlisi estadístic multivariat mostra que la contribució de BNP en la predicció d’esdeveniments adversos es manté desprès d’ajustar en funció de la LVEF. CONCLUSIONS. Els pacients amb SCA i LVEF preservada presenten concentracions plasmàtiques de BNP elevades a l’ingrès, que constitueixen un factor predictor independent de presentar nous episodis de SCA i/o mortalitat. / MOLECULAR MECHANISMS OF MYOCARDIAL SECRETION: VENTRICULAR REMODELING AND SECRETION OF B-TYPE NATRIURETIC PEPTIDE. The molecular mechanisms by which myocardial ischemia translates in ventricular remodeling and heart failure remain unclear. In the current thesis it was explored whether hypoxia and proinflammatory factors are specific inducers of matrix remodeling in cardiomyocytes. Adult human ventricular cardiomyocytes (AC16 cells) were incubated at normoxic or hypoxic conditions and stimulated with proinflammatory factors. Matrix remodeling and cellular secretion and gene expression of matrix remodeling factors were analyzed. Results show that hypoxia activates matrix remodeling and induces the production of PIIINP (procollagen III N-terminal propeptide) and inhibits the production of TIMP-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase 1). IL1β stimulated the cardiac production of PIIINP, TIMP1 and hyaluronic acid. Results suggest that hypoxia and IL1β may contribute to ventricular dilation and heart failure in ischemic heart diseases. The effect of hypoxia on the cardiac secretion of B-type natriuretic peptid (BNP) was also evaluated. Hypoxia stimulated the protein release and mRNA levels of BNP and VEGF but not ANP in AC16 cells. The analysis of the transcriptional activity of the hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) in nuclear extracts showed that HIF-1 activity was induced under hypoxic conditions. The treatment of AC16 cells with the HIF-1 inhibitor rotenone in hypoxia inhibited BNP and VEGF release. In conclusion, data indicate that hypoxia induces the synthesis and secretion of BNP in human ventricular myocytes, likely through HIF-1-enhanced transcriptional activity. This observed direct effect of hypoxia on BNP secretion in human ventricular myocytes allowed hypothesizing that patients with acute coronary syndromes (ACS) without ventricular dysfunction or heart failure present high plasma levels of BNP related with their degree of cardiac hypoxia. Thus, prognostic significance of BNP plasma levels was evaluated in a cohort of 1806 consecutive patients with ACS admitted within the first 24 hours after the onset of symptoms. The follow up for adverse events was of one year. Plasma levels of BNP in ACS patients with preserved left ventricular ejection fraction (LVEF) were higher than in the control group without ACS. During follow-up, adverse events was 10.0 % in patients with reduced LVEF and 7.9 % in patients with preserved LVEF. Patients with BNP>150 pg/ml presented significantly higher probability of adverse events during follow up. Results show that ACS patients with preserved LVEF present higher BNP levels at admission, which constitute an independent predictor of presenting new ACS and mortality.

La soca de ratolins amb senescència accelerada SAMP8 és utilitzada habitualment com a model de senescència; i el seu ús per a l’estudi de la malaltia d’Alzheimer s’ha estès degut a la manifestació espontània dels seus trets histopatològics distintius. En estudis recents es va identificar la presència de grànuls amiloides a l’hipocamp dels ratolins SAMP8. Aquests clústers de grànuls augmenten amb l’edat i s’estenen al llarg de l’hipocamp. A més a més, les característiques morfològiques dels grànuls amiloides són molt similars als grànuls tenyits amb Periodic Acid Schiff (PAS), descrits anteriorment en els SAMP8 i en ratolins envellits d’altres soques. L’objectiu principal d’aquesta tesi ha estat estudiar la composició, l’origen i el desenvolupament dels grànuls que apareixen amb l’edat a l’hipocamp dels ratolins senescents SAMP8 amb la finalitat d’aportar nova informació sobre la neuropatologia d’aquests ratolins per al seu ús com a model de la malaltia d’Alzheimer. En aquest treball s’ha identificat la correspondència entre els grànuls amiloides i els grànuls PAS de l’hipocamp d’aquests animals. Aquests grànuls són el resultat d’un procés degeneratiu present en els astròcits i que pot afectar també zones properes, i estan formats per fragments membranosos provinents de l’acumulació de restes d’estructures i orgànuls, com els mitocondris. A més a més, s’ha identificat la presència d’un neo-epítop en el nucli dels grànuls que és, almenys parcialment, de naturalesa glucídica. Aquest neo-epítop és reconegut per anticossos IgM contaminants presents en anticossos comercials produïts en ascites de ratolí o sèrum de ratolí i conill. Aquestes IgM contaminants són probablement anticossos naturals, i algunes IgM hemaglutinen de forma positiva i específica els eritròcits humans de tipus A. La presència tant del neo-epítop com de les IgMs han estat la causa de falses tincions positives que han generat interpretacions errònies del significat fisiopatològic dels grànuls. És el cas, per exemple, de la presència de β-amiloide o la proteïna tau en aquestes estructures. Finalment, les lesions cerebrals de pacients associades a malalties neurodegeneratives i a l’envelliment no corresponen als clústers de grànuls de l’hipocamp d’aquests ratolins, tot i que seria interessant estudiar la presència del neo-epítop en aquestes condicions fisiopatològiques. / SAMP8 mice present an accelerated senescence and are usually used as a model of aging. Because this strain of mice spontaneously expresses several histopathological features of Alzheimer’s disease (AD), it has been recently used as a model for studying this disease. Alterations in the expression of β-amyloid (Aβ) peptides, tau hyperphosphorilation, an increase of oxidative stress and gliosis suggest that SAMP8 mice could be a relevant model for studying the first stages of sporadic AD and its relation to aging. Recent studies in our group identified the presence of Aβ clustered granules in the hippocampus of SAMP8 mice when immunohistochemical stainings were performed with antibodies directed against Aβ peptides. These clustered granules increase in number and extension with age, and they spread throughout the hippocampus. The features of Aβ clustered granules are very similar to the granules stained with Periodic Acid Schiff (PAS) already described in SAMP8 mice, as well as in aged mice of other strains. On the other hand, human brain lesions present in aging and other neurodegenerative diseases, such as AD, may vary their chemical composition with time, suffering substantial alterations in the principal components and the addition of secondary components. The main objective of this thesis is to study the composition, origin and development of the granules that appear with age in the hippocampus of SAMP8 mice, with the aim of further describing the neuropathology of these animals and provide new information for using them as a murine model of AD. Therefore, in this thesis we studied the composition and order of appearance of the constituents of the hippocampal granules of SAMP8 mice, and the possible coincidence between Aβ and PAS granules. The morphology, ultrastructure, cellular origin and formation process of these structures has been also ascertained; and a comparison between these structures and human brain lesions of neurodegenerative diseases have been performed. The results obtained in this thesis allowed reaching several conclusions. The pathological clustered granules of the hippocampus of aged SAMP8 mice correspond to the PAS granules described in aged mice of several mouse strains. These granules are the result of a degenerative process located in astrocytes that could affect the surrounding neuropil. In the granules formation process, several abnormal membranous structures and cellular organelles, like mitochondria, produce membranous waste that finally accummulates forming the core of the granules. On the other hand, a neo-epitope absent before the granules formation appears in the membranous residues. This neo-epitope is located in the nucleus of the mature granules and contains at least some structures of glycosidic nature. The neo-epitope is recognized by contaminant IgM antibodies present in a wide range of commercial antibodies produced in mouse ascites or mouse and rabbit sera, which are probably natural antibodies, and some of these IgMs haemmagglutinate A-type human erythrocytes, but not B and O subtypes. The neo-epitope could be considered an A-like epitope because monoclonal antibodies anti-A-type human erythrocytes do not recognize it. Both the neo-epitope presence in the granular structures and the IgMs contained in commercial antibodies have been the cause of false-positive stainings, and as a result, they have generated misunderstandings about the composition and physiopathological significance of the hippocampal granules of aged mice, as is the case of Aβ peptides and tau protein, which are not contained in these granules. Finally, human brain lesions described to date in patients of neurodegenerative diseases or aged individuals do not correspond to the clustered pathological granules present in the hippocampus of aged mice. The study of the presence of the neo-epitope in diseased human brain could be interesting in the understanding of the neuropathology of aging and neurodegenerative diseases.

El epitelio intestinal forma una barrera que permite el paso de nutrientes pero restringe el de substancias potencialmente nocivas. La alteración de dicha función se relación a con enfermedades gastrointestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal (IBD) en la que, además, la producción de eicosanoides en la mucosa intestinal se encuentra incrementada. Por ese motivo, el objetivo del presente trabajo ha sido investigar el papel de los eicosanoides producidos en la cascada del ácido araquidónico en la regulación de la función epitelial de barrera en un modelo intestinal de células Caco-2. La permeabilidad paracelular (PP) se ha estudiado en cultivos mantenidos sobre filtros, a partir de la determinación de la resistencia eléctrica transepitelial (TER) y de los flujos de dextrano. La concentración intracelular de Ca2+ ([Ca2+]i) se ha determinado por espectrofluorimetría, y la de AMPc así como la activación de NFkB por enzima inmuno ensayo. La fosforilación de la cadena ligera de miosina (MLC) se ha realizado por western blot y la localización de las proteínas de la unión estrecha (TJ) por inmunofluorescencia. Los resultados revelan que la PGE2, la PGE3, el LTD4 y los 5-, 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE son capaces de romper la función barrera. En cambio, la PGD2, el LTB4, el 13-HODE, el 20-HETE, los 11,12- y 14,15-EET, los 11,12 y 14,15-DHETE y el 12-HEPE no tienen este efecto. La PGE2 y PGE3 incrementan la PP al interacciónar con los receptores EP1 y EP4 que a su vez activan la vía de la PLC-IP3-Ca2+ y la via del AMPc-PKA, respectivamente. En el caso de LTD4, se ha observado que el receptor implicado en la disrupción de la función barrera es el CysLT1R. En el caso del 5-HETE se ha descartado la participación de BLT1, BLT2, CysLT1R y CysLT2R. En el caso del LTD4 y 5-HETE, además de inducir un incremento de la [Ca2+]i, se ha demostrado la activación de la vía de la PLC-Ca2+/PKC y de la vía de la PKA independiente de AMPc y de NFkB. En el caso de 12-(R)-, 12-(S)- y 15-HETE también se ha observado un incremento de la [Ca2+]i pero no de AMPc, a excepción de 12-(S)-HETE que si que incrementa la concentración de AMPc. En todos los casos en los que un eicosanoide ha alterado la función epitelial de barrera se ha observado una relación entre el incremento de la PP y la redistribución hacia el citosol de las proteínas de la TJ ocludina y claudina-4, sin alteración de la localización de ZO-1, claudina-1 o claudina-2. Dichos eicosanoides, a excepción del 5-HETE, también incrementan la actividad de la MLCK provocando la desorganización del anillo de actina. A pesar de que la disrupción de la función epitelial de barrera observada en pacientes con IBD se ha atribuido tradicionalmente al efecto de citocinas proinflamatorias como TNF-α e IFN-γ, en la presente memoria se aportan evidencias del papel de los eicosanoides en la regulación de la PP. Además se aporta una posible explicación para los efectos negativos de la inhibición de la COX en pacientes con IBD y la posibilidad de nuevas estrategias terapéuticas. Si bien se ha descrito un efecto beneficioso del consumo de aceite de pescado o ácidos grasos n-3 en pacientes con IBD, este no puede ser atribuido a la reducción de la relación PGE2/PGE3 ya que ambas PG tienen un efecto negativo sobre la función epitelial de barrera. Sin embargo, dicho efecto sí que podría atribuirse a la generación de 12-HEPE que al contrario que 12-HETE no altera la PP. / The intestinal epithelium forms a barrier that allows the passage of nutrients but restricts the passage of potentially harmful substances. Alteration of epithelial barrier function is the mechanism responsible for the persistence of inflammation that occurs in gastrointestinal diseases such as inflammatory bowel disease (IBD) in which various eicosanoids are increased in the mucosa. For this reason, the objective of this study was to investigate the role of eicosanoids produced by different pathways of AA metabolism in the regulation of epithelial barrier function in a Caco-2 cell model. The paracellular permeability (PP) was estimated in Caco-2 cell cultures from the transepithelial electrical resistance (TER) and dextran fluxes. Intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]i) was quantified by spectrofluorimetry, cAMP and NFkB levels by enzyme immunoassay, MLC phosphorylation by Western blot and the state of the tight junction (TJ) proteins by immunofluorescence. The results indicate that PGE2, PGE3, 5-, 12-(R)-, 12-(S)-, 15-HETE and LTD4 are able to increase PP, whereas no alteration is induced by 13-HODE, 20-HETE, 11,12- and 14,15-EET, 11,12- and 14,15-DHETE or 12-HEPE. PGE2 and PGE3 alter the barrier function through the interaction with EP1 and EP4 receptors that activate the PLC-IP3-Ca2+ pathway and the cAMP-PKA pathway, respectively. In the case of LTD4 and 5-HETE, along with an increase in [Ca2+]i there is an activation of PLC-Ca2+/PKC and PKA independent of cAMP and NFkB pathways. For 12- and 15-HETE we have also observed an increase in [Ca2+]i but not in cAMP, except for 12-(S)-HETE which did increase cAMP levels. From the study of the TJ protein immunolocalization, in all cases in which an eicosanoid has increased PP a redistribution of occludin and claudin-4 without altering ZO-1, claudin-1 or -2 can be observed. Furthermore, the alteration of the actin ring and the increase in MLCK activity has been observed in all the eicosanoids that increased PP except for 5-HETE. Although the disruption of epithelial barrier function observed in IBD patients has been traditionally attributed to the effect of proinflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ, this thesis evidences a role for the eicosanoids in the regulation of PP, opening up possibilities for new therapeutic strategies.