La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica, inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC) siendo la principal causa de discapacidad en adultos jóvenes después de los traumatismos. Su prevalencia en nuestra área geográfica es aproximadamente 60-70 pacientes cada 100.000 habitantes. La causa de la enfermedad es aún desconocida y se han implicado tanto factores genéticos como ambientales. Se considera que es una enfermedad mediada por el sistema inmunitario, donde linfocitos T activados en periferia son capaces de reconocer antígenos de la mielina en el SNC y desencadenar el proceso autoinmune que culminará con la destrucción de la mielina, de forma que la conducción nerviosa puede afectarse y aparecer los signos y síntomas clínicos característicos de la enfermedad. Existen evidencias de que el estrés oxidativo tiene una función importante en el desarrollo de la lesión en el SNC. En este sentido, se ha observado que el estrés oxidativo puede causar daño axonal y que el daño axonal contribuye a la discapacidad neurológica que se produce en la EM. En el SNC de pacientes con EM se ha observado expresión de marcadores de estrés oxidativo, correlacionándose con el proceso inflamatorio y desmielinizante que se produce en la enfermedad. Por otro lado, los pacientes con EM tienen disminuidos, respecto a controles sanos, los niveles séricos de diferentes antioxidantes naturales como enzimas, vitaminas, ubicuinona, etc. Las metalotioneínas (MT) son unas proteínas para las que se han descrito propiedades antioxidantes, anti-inflamatorias y neuroprotectoras en situaciones donde se produce estrés oxidativo. En este contexto, nos planteamos estudiar la función de las MT en la patogenia de la esclerosis múltiple y sus posibles implicaciones terapéuticas, para ello utilizamos el modelo animal de esclerosis múltiple, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Observamos que la expresión de MT está inducida en el SNC de ratones con EAE y que se correlaciona con la gravedad de la enfermedad. Los astrocitos y los macrófagos/microglía reactivos son la principal fuente de estas proteínas. El patrón de expresión de MT diverge del patrón de expresión de marcadores relacionados con procesos de neurodegeneración y, sin embargo, coincide con el de marcadores relacionados con procesos de reparación tisular. Por otro lado, la deficiencia en MT hace más susceptibles a los ratones a desarrollar la EAE potenciando la inflamación y los procesos de neurodegeneración en el SNC, mientras que los procesos de reparación tisular están disminuidos significativamente. Estos resultados se corroboraron en la enfermedad humana, en lesiones de EM, donde se observó el mismo patrón de expresión que se había observado previamente en el modelo animal. Estos resultados sugieren que las MT tienen una función importante en la patogenia de la EAE y podrían tener un potencial terapéutico en el tratamiento de esta enfermedad, limitando los procesos de neurodegeneración y potenciando los mecanismos de reparación tisular endógenos. / Multiple sclerosis (MS) is a chronic demyelinating disease of the central nervous system (CNS) and the most common cause of non-traumatic neurological dysfunction in young adults. Although the etiopathogenesis of the disease is still unknown, both genetic and environmental factors have been implicated. Several lines of evidence suggest that MS is an autoimmune disease, in which activated, myelin-specific CD4+ T lymphocytes recognize CNS myelin antigens, and various mechanisms including antibodies and complement, activated macrophages and microglia, and cytotoxic T cells contribute to CNS tissue damage.There is strong evidence pointing to oxidative stress as a major factor in CNS lesion development that contributes to axonal dysfunction, CNS degeneration and neurological disability in MS. It has been shown that MS plaques contain increased levels of oxidative stress markers. Furthermore, several studies indicate that MS patients have lower serum levels of endogenous antioxidant than controls.Metallothioneins (MT) are a family of proteins with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective properties. MT accumulate under conditions where oxidative stress has taken place. In this context, we aimed to study the role of MT in the pathogenesis of MS and their putative therapeutical implications using a well established animal model of MS, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). We observed that MT expression was not only induced during EAE, but that it also correlated with the severity of clinical signs. Astrocytes and microglia/macrophages were the main source of these antioxidant proteins. The time course of MT expression during EAE differed from the expression of molecules that are considered relevant for neurodegenerative processes. When compared with markers for regeneration/repair, the expression profile of MT followed a similar patter. In addition, MT-deficient mice were more susceptible to EAE and showed more CNS inflammation and neurodegeneration, whereas tissue repair mechanisms appeared compromised compared to wild-type mice. These data were in agreement with the results observed in the human disease in MS lesions. Overall, these findings suggest that MT play an important protective role in the pathogenesis of EAE and might be considered as potential therapeutic candidates to promote neuroregeneration in MS.

Les aplicacions xenogèniques podrien anar des del xenotrasplantament d'òrgans sòlids, a l'empelt de teixits o cèl·lules. El principal obstacle per a la seva aplicació és la forta resposta immunitària generada pel xenoempelt, mediada tant per mecanismes cel·lulars com humorals. Diverses vies de senyalització i molècules estan relacionades amb aquest rebuig. En aquest treball s'estudien la via del TNF/TNFR i del CD200/CD200R. El TNFα s'uneix específicament a dos receptors, el TNFR1 i el TNFR2. Diferents estudis han demostrat la seva implicació en el rebuig agut de l'empelt xenogènic. En aquest treball s'ha identificat i caracteritzat diverses variants del TNFR2 porcí generades a partir de dos tipus diferents de splicings. El primer, provoca la deleció de l'exó 4, per homologia amb la seqüència humana. El segon engloba el que correspondria per homologia als exons 7 al 10 humans i provoca que la predicció de la proteïna resultant sigui soluble. En els experiments de PCR en temps real es va detectar els dos tipus de splicing a nivell de RNA en tots els teixits analitzats. Els nivells globals més elevats els trobem en cèl·lules del sistema immunitari com els PBMC o els monòcits aïllats i en òrgans com la melsa i el pulmó. La determinació de les diferents variants per separat mostren com els dos tipus de splicings són més abundants en monòcits aïllats o PBMC. Els estudis de localització subcel·lular ens van permetre identificar dos patrons d'expressió diferents. Per una banda el pTNFR2 té un marcat patró membranal. En canvi, la isoforma que conté el splicing a l'exó 4 és totalment intracel·lular, amb una alta colocalització amb el reticle endoplasmàtic. Tot i així els estudis realitzats amb la tècnica de FRET, han posat de relleu la interacció entre pTNFR2 i pTNFR2ΔE4 en l'espai intracel·lular. Els receptors de TNF formen homotrímers per ser funcionals, en aquest treball també hem demostrat que les proteïnes solubles són capaces de combinar-se entre elles de forma específica i que aquesta combinació és funcional. El CD200 regula l'activitat de les cèl·lules mieloides a través de la interacció amb el seu receptor. Diferents estudis han descrit el paper immunoregulador de la interacció CD200-CD200R en el control del rebuig de l'al·lotrasplantament i del xenotrasplantament concordant. La segona part d'aquesta tesi està dedicada a la identificació i caracterització del CD200 i CD200R porcins. Els resultats obtinguts identifiquen, per primera vegada, el CD200 porcí i tres variants del seu receptor. Una anàlisi bioinformàtica va permetre caracteritzar la molècula i comprovar que té un patró molt similar al descrit pel CD200 d'altres espècies, dos dominis d'immunoglobulines, una transmembrana i una regió citosòlica curta sense motius senyalitzadors coneguts. La primera variant de receptor pCD200R1, té una homologia elevada amb la variant a del receptor humà. La primera i segona variant soluble, el pCD200R2 i pCD200R3, contenen un canvi en el marc de lectura i que fa aparèixer un codó de stop primerenc, just abans de la zona de transmembrana. El receptor porcí té els tres llocs d'unió a CD200 més crítics conservats. Gràcies a la tecnologia de la ressonància de plasmó de superfície, vam determinar que les constant d'afinitats entre CD200-CD200R estan al voltant de 10-7 i 10-8 M tan en sistemes al·logènics com xenogènics. Amb la finalitat d'identificar les proteïnes porcines del CD200 i del seu receptor, es van generar antipèptids i es van produir anticossos policlonals en conills útils tan en anàlisi de Western Blot com per citometria de flux. Els experiments de PCR en temps real van determinar i quantificar l'expressió del CD200 porcí. Els resultat van confirmar que està àmpliament distribuït per diferents teixits i tipus cel·lulars / Clinical xenotransplantation is precluded by the strong immune rejection of the xenograft in which several molecules and pathways are involved. In this doctoral thesis, we studied the TNF/TNFR2 and CD200/CD200R pathways in the pig-to-human xenogeneic setting. First, we cloned the cDNA of porcine TNF-Receptor 2 and obtained four isoforms, two membrane-bound (pTNFR2 and pTNFR2ΔE4) and two soluble (pTNFR2ΔE7-10 and pTNFR2ΔE4ΔE7-10), generated by 2 different alternative splicings. The global expression and the relative proportion of each alternative splicing were determined by quantitative RT-PCR. All cells/tissues tested expressed the receptor at various levels and had a low-to-moderate percentage of each alternative splicing. We never found pTNFR2ΔE4 on the cell surface, but demonstrated by FRET experiments that it was capable of associating to the full pTNFR2 intracellularly. Next, we produced fusion proteins with the two different extracellular domains and determined their affinity to pig and human TNFα by plasmon resonance. The pTNFR2-GST bound both pTNFα and hTNFα with high and comparable affinity to the human receptor. On the contrary, pTNFR2ΔE4-GST showed no binding to hTNFα and very little to pTNFα. We further confirmed with pull down experiments that pTNFR2 and pTNFR2ΔE4 bound together after producing them simultaneously as soluble fusion proteins with different tags in mammalian cells. Moreover, pTNFR2ΔE4-GST failed to inhibit the hTNFα effect on endothelial cells in a competition assay, but was able to diminish the TNF blockade mediated by pTNFR2-GST. Thus, we reveal a new way the TNF/TNFR pathway is regulated. In other hand, we have cloned porcine CD200 and three variants of its receptor. As in other species, the porcine CD200 mRNA expression was widely distributed in the multiple tissues tested. We produced rabbit anti-peptide and polyclonal antibodies specific for pig CD200 and both detected it successfully by flow cytometry and western blotting. We also examined if ligand and receptor binding was conserved among species by plasmon resonance. Porcine CD200 interacted with human CD200R with an affinity comparable to that of human CD200. Finally, we expressed recombinantly human and porcine CD200 on the surface of porcine cells in order to protect them against xenograft rejection.

Liver X receptors (LXRs) son miembros de la superfamilia de receptores nucleares que ejercen un papel clave en la homeaostasis lipídica y en la regulación negativa de la inflamación. Los macrófagos tienen funciones esenciales como reguladores de la inmunidad y la homeostasis, y su proliferación contribuye a la patogénesis de ciertos desórdenes. En este trabajo, mostramos que la inducción de la proliferación de los macrófagos en respuesta al factor de crecimiento M-CSF está modulada negativamente por agonistas que activan a LXR, tanto in vitro como in vivo. Ambas isoformas de LXR, alfa y beta, están implicadas en las acciones antiproliferativas de los agonistas de LXR en macrófagos. En cambio, M-CSF no ejerce efectos negativos sobre la expresión de genes regulados por este receptor nuclear. El tratamiento con los agonistas de LXR da lugar a una acumulación de macrófagos en la fase G0/G1 del ciclo celular, sin afectar la fosforilación de ERK-1/-2. El uso de siRNA o de ratones modificados genéticamente muestra que, en contraste con otros modelos celulares, la expresión funcional del inhibidor de quinasas dependientes de ciclinas p27KIP1 o de los transportadores de colesterol ABCA1 o ABCG1 no se requiere para los efectos antiproliferativos de los agonistas de LXR en macrófagos. El análisis de la expresión a nivel de proteína de moléculas clave en la regulación del ciclo celular, como las ciclinas D1 y B1 y las quinasas dependientes de ciclina 2 y 4, estaba reprimida por la activación de LXR. Estas observaciones sugieren un papel de los agonistas de LXR en la disminución de la respuesta proliferativa de los macrófagos en desórdenes patogénicos. Además de estos efectos sobre la proliferación de macrófagos de los agonistas de LXR, exploramos el impacto de la activación de LXR en la respuesta de los macrófagos a la citoquina inflamatoria endógena IFN-gamma. Un estudio masivo de la regulación génica mediante el uso de microarrays de expresión demuestra que aproximadamente un 38% de la respuesta transcripcional inducida por IFN-gamma está reprimida por la activación de LXR en macrófagos. Los LXRs también median efectos inhibitorios sobre ciertos genes inducidos por IFN-gamma en células de microglía primarias y en un modelo in vivo de neuroinflamación inducida por IFN-gamma. La activación de LXR resulta en una reducción del reclutamiento de STAT1 a los promotores analizados en este estudio sin afectar a la fosforilación de STAT1. También analizamos como la señalización de IFN-gamma ejercía efectos recíprocos sobre genes diana de LXR. El tratamiento con IFN-gamma interfiere negativamente, de manera dependiente de STAT1, con la capacidad de LXR de inducir determinados genes diana, incluyendo Abca1 y Srebp1c. La represión de la expresión de Abca1 correlaciona con una disminución del eflujo de colesterol específico de la apolipoproteína A1 en macrófagos estimulados con IFN-gamma. Los efectos inhibitorios de IFN-gamma en la señalización de LXR no implicaron una reducción de la unión de LXR en el promotor de los genes diana. Los resultados mostrados en este estudio sugieren un importante nivel de bidireccionalidad negativa entre IFN-gamma/STAT1 y LXR con implicaciones tanto en el control de la respuesta inmunológica mediada por IFN-gamma como en la regulación del metabolismo lipídico. / Liver X receptors (LXRs) are members of nuclear receptor superfamily that exert key functions in lipid homeostasis and in the negative control of inflammation. Macrophages serve essential functions as regulators of immunity and homeostasis, and their proliferation contributes to pathogenesis of certain disorders. In this work, we show that induction of macrophage proliferation by the growth factor M-CSF is negatively modulated by agonists that activate LXR, both in vitro and in vivo. Both isoforms LXR a and β are involved in the antiproliferative actions of LXR ligands in macrophages without affecting ERK-1/2 phosphorylation. In contrast, M-CSF does not exert negative effects on LXR-mediated gene expression. The use of siRNA or genetically modified mice revealed that, in contrast to other cellular models, functional expression of either the cyclin-dependent kinase inhibitor p27KIP1 or the cholesterol transporters ABCA1 or ABCG1 was not required for the antiproliferative effects of LXR in macrophages. Western blot analysis revealed that protein expression of key molecules that regulate progression through the cell cycle, such as cyclins D1 and B1 and cyclin-dependent kinases 2 and 4, was downregulated upon LXR activation. Additionally to these effects on macrophage proliferation we have explored the impact of LXR activation on the macrophage response to the endogenous inflammatory cytokine IFN-g. Transcriptional profiling studies demonstrate that approximately 38% of the IFN-g-induced transcriptional responses are repressed by LXR activation in macrophages. LXRs also mediated inhibitory effects on selected IFN-γ-induced genes in primary microglia and in a model of IFN-γ-induced neuroinflammation in vivo. LXR activation resulted in reduced STAT1 recruitment to the promoters tested in this study without affecting STAT1 phosphorylation. Treatment with IFN-γ interfered negatively, in a STAT1-dependent manner, with the capability of LXRs to upregulate selective targets, including Abca1 and Srebp1c without affecting the recruitment of LXR on their promoters.

La hipótesis general de este trabajo se basa en que un protocolo de hipoxia hipobárica intermitente (IHH) combinada con ejercicio aeróbico ligero en normoxia, puede tener un efecto beneficioso en la regeneración de musculatura esquelética dañada y contribuir a una recuperación más rápida en este tipo de lesiones. Sin embargo, el conocido efecto hematopoyético de la exposición a hipoxia y del ejercicio, y el consiguiente aumento de hematocrito, podrían afectar a la dinámica del aporte de oxígeno a los tejidos, por lo que se hace necesario conocer y estudiar los potenciales efectos de estos tratamientos sobre la hematología y la reología sanguínea. Además, se ha dedicado especial atención a la presencia de células madre circulantes (CD34+) y a la población de “side population” (SP) en médula ósea para obtener evidencias de su posible incidencia en la recuperación de la lesión muscular. El núcleo fundamental de esta tesis doctoral está compuesto por dos estudios que tienen como objetivos: 1. Determinar si la respuesta hematopoyética durante un programa IHH, podría provocar alteraciones en el comportamiento hemorreológico, generando efectos negativos en el suministro de oxígeno a los tejidos. 2. Cuantificar y contrastar los efectos de la IHH y el ejercicio en el aumento del número de células progenitoras en la circulación sanguínea periférica. 3. Determinar los efectos de la IHH combinada o no con el ejercicio aeróbico ligero en normoxia, genera cambios en la presencia de SP. 4. Establecer la dinámica temporal en las modificaciones de la concentración de células madre CD34+ y SP en los diferentes grupos de animales, según las diferentes condiciones experimentales. La muestra se obtuvo de ratas Sprague-Dawley que fueron estudiadas en dos estados basales (no entrenadas y entrenadas) y comparadas durante la fase de recuperación de una lesión por contracción excéntrica repetida (inducida a ratas entrenadas) los días 1, 3, 7 y 14 posteriores a la lesión muscular. Los tres grupos experimentales estudiados durante la recuperación de sus lesiones musculares fueron: ratas con recuperación pasiva (CTRL); ratas expuestas a IHH después del daño muscular (HYP); y ratas entrenadas que además de IHH, realizaron sesiones de ejercicio aeróbico ligero (EHYP). Los resultados obtenidos en los estudios, nos permiten extraer las siguientes conclusiones: 1. Después de dos semanas de tratamiento, la IHH en combinación con ejercicio aeróbico ligero en normoxia, muestra parámetros hemorreológicos alterados en comparación a las demás condiciones experimentales. 2. Aunque la respuesta eritropoyética provocada por la exposición IHH tiende a aumentar la viscosidad de la sangre en el grupo EHYP, otros parámetros microrreológicos tales como mayor elasticidad y menor tiempo de relajación pueden contribuir a compensar este aumento. 3. Los ajustes compensatorios reológicos pueden considerarse como positivos desde un punto de vista funcional, pues contribuyen a mantener la microcirculación normal y un suministro adecuado de oxígeno, nutrientes y agentes químicos a los tejidos durante su proceso de reparación después de daño sufrido en el músculo esquelético. 4. La tinción DyeCycle Violet se retiene selectivamente para las células CD34+, que permite la discriminación de los dos subconjuntos de células, denominadas internamente como CD34+/DCVhigh y CD34+/DCVlow, debido a una intensidad más brillante o atenuada de la tinción. 5. En el séptimo día de la recuperación después de una lesión muscular, el grupo EHYP aumentó claramente el número de progenitores CD34+/CD45neg y CD34+/CD45+. 6. El grupo HYP aunque no muestra un aumento en células progenitoras después de la lesión muscular, es altamente sensible a la expresión de células SP las primeras horas de exposición. 7. La exposición a IHH parece ser decisiva en la expresión de la población SP, aunque el estímulo inducido por el ejercicio mostró un efecto inverso sobre su cinética. / The general hypothesis of this PhD dissertation document is based on the possible favorable effects of a protocol of intermittent hypobaric hypoxia (IHH) combined with light aerobic exercise in normoxia. We have tested if such IHH program can elicit a beneficial effect on the regeneration of skeletal muscle damage and contribute to a faster recovery in this type of injury. However, the well-known hematopoietic action of hypoxia exposure and exercise can alter the erythrocyte mass and even the circulatory dynamic at microcirculatory level. We have focused on the rheological properties of blood, presence of circulating stem cells and the dynamics of bone marrow side population (SP) cells. The core of this thesis is composed by two main studies whose general objective are: 1. To determine if the erythropoietic response elicited by intermittent hypobaric hypoxia exposure can alter blood rheology and thus affect in any way the oxygen delivery to tissues. 2. To outline if the IHH exposure can help to increase the number of peripheral blood circulating progenitor cells (CD34+) and bone marrow side population stem cells, in order to establish the usefulness of this intervention for skeletal muscle repair. Male Sprague-Dawley rats were studied in two basal states: untrained and trained and compared with trained rats that suffered skeletal muscle injury (down-hill running until exhaustion) at four stages (1, 3, 7 and 14 days) during damage recovery. Three experimental groups of wounded trained rats were studied: rats with passive recovery (CTRL); rats exposed to IHH after muscle damage (HYP); and, rats that, in addition to IHH, performed light aerobic exercise sessions (EHYP). The results obtained in this thesis allow us to conclude that the IHH in combination with light aerobic exercise in normoxia showed a higher erythropoietic effect, but without threatening the perfusion of damaged muscle because advantageous hemorheological adjustments. DyeCycle® Violet staining is selectively retained into CD34 + cells, thus allowing to the discrimination of two subsets of cells, internally referred as CD34+/DCVhigh and CD34+/DCVlow cells. Finally, IHH in combination with light aerobic exercise increased the number of CD34+/CD45neg and CD34+/CD45+ cells on the 7th day in EHYP group, although the exercise-induced stimulus showed a reverse effect on SP kinetics.

Un programa de quatre setmanes d'exposició intermitent a hipòxia hipobàrica (HHI) de quatre hores per sessió, s'ha demostrat com un estímul eficaç per induir hematopoesi en rata, influir de manera variable en l'efecte angiogènic de diversos músculs (miocardi, tibialis anterior i diafragma) i preservar la pèrdua de massa corporal. Quatre grups experimentals van ser estudiats: hipòxic, Post-hipòxic 20 dies, Post-hipòxic 40 dies i els seus corresponents Controls, els quals s’uniren en un sol grup en no diferir entre si. Degut a l’augment de massa eritrocitària, seria d’esperar un increment de la viscositat de la sang. Tot i que s’observà una tendència coherent, les propietats hemoreològiques no van ser substancialment alterades, quan es van comparar els quatre grups entre si. Es proposen certs mecanismes compensatoris com serien el descens de la viscositat del plasma i possibles canvis microreològics eritrocítics (deformació i agregació). Malgrat l'increment del volum d'eritròcits i hemoglobina, els índexs indicadors de transport d'oxigen van ser similars per als grups experimentals. Es van estudiar paràmetres histoquímics-morfomètrics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.), bioquímics (enzim lactat deshidrogenasa, enzim citrat sintasa, mioglobina i proteïnes totals) i indicadors d'estrès oxidatiu (enzims CAT i SOD, i TBARS) per a cada un dels músculs a dalt esmentats. Per contrastar els resultats obtinguts després d'aplicar el protocol HHI amb unes condicions d’hipoxèmia sostinguda, es va dissenyar un procediment d’anemització que provoqués també una limitació en el subministrament d'oxigen als teixits. Es va dissenyar aquest protocol amb l'objectiu de no sotmetre els animals als efectes deleteris que indueix la hipòxia hipobàrica crònica. S’estudiaren paràmetres histoquímics (tipus de fibra, capil.larització, densitat de fibres musculars, etc.) i bioquímics dels músculs soleus i extensor digitorum longus. Una situació d'hipòxia provoca un estat d'estrès en la majoria d'animals que la pateixen. Per tal d’afrontar aquesta baixa disponibilitat d'oxigen, l'organisme desenvolupa respostes compensatòries per fer front a aquesta nova situació. D’aquesta manera, és capaç de dur a terme ajustaments fisiològics i morfològics per tal de mantenir un mínim nivell de metabolisme aeròbic durant aquestes condicions de transport limitat d'oxigen als teixits. Aquests ajustaments segueixen el principi de simmorfosi, mitjançant el qual la formació d'elements estructurals en els organismes animals s'orienta a aconseguir una reestructuració equilibrada amb l'objectiu d'adaptar-se a les noves situacions, però mai sense excedir els requeriments funcionals necessaris. En els nostres estudis aquest principi significaria que, les respostes perifèriques (hemàtiques i reològiques) i centrals (ventilació i control cardíac) induïbles per una situació hipòxica, han estat acompanyades d'uns ajustaments en el bescanvi de gasos i en la capacitat oxidativa, especialment en múscul esquelètic i miocardi. Després de dur a terme els nostres protocols HHI i d’anemització podem concloure que, els reajustaments fisiològics i morfològics desencadenats en les dues condicions, poden ser utilitzats com a procediments que permetin orientar aquestes respostes adaptatives cap a canvis transitoris o permanents. Tots aquests canvis fisiològics tindrien múltiples aplicacions en medicina de muntanya, de l'esport i en d’altres futures aplicacions biomèdiques. / An intermittent hypobaric hypoxia (IHH) program consisting of a daily 4-h sessions during four weeks of hypoxia exposure, has been proven as an effective stimulus to induce hematopoiesis in rats, influence in a variable way the angiogenic effect of various muscles (myocardium, tibialis anterior and diaphragm) and preserve the body mass loss. Four experimental groups were studied: hypoxic, post-hypoxic 20 days, post-hypoxic 40 days and their corresponding Controls. Due to the increase of red cell mass, an increase in blood viscosity would be expected. Although there was a consistent trend, the hemorheological properties were not substantially modified, when comparing the four groups. Some compensatory mechanisms are proposed such as the plasma viscosity decrease and microrheological erythrocyte changes. Despite the increase of volume of erythrocytes and hemoglobin, oxygen transport indicators rates were similar for the experimental groups. Histochemical, morphometric and biochemical parameters, as well as indicators of oxidative stress were studied for each muscle above mentioned. To compare the results obtained after applying the IHH protocol with sustained hypoxemia conditions, an anaemization procedure was designed to lead limitation in oxygen supply to tissues. This protocol was used in order to not submit the animals to the deleteric effects induced by chronic hypobaric hypoxia. Histochemical and biochemical parameters were also studied in soleus and extensor digitorum longus muscles. Hypoxia is a stressful situation for most animals. To cope with the oxygen requirements, the organism is able to perform physiological and morphological adjustments to maintain a minimum level of aerobic metabolism under conditions of poor oxygen delivery to the tissues. These adjustments follow the symmorphosis principle, which states that structural elements are formed to satisfy functional requirements without excess. In our studies, this principle would mean that peripheral and central responses, induced by a hypoxic situation, have been accompanied by some adjustments in gas exchange and oxidative capacity. After conducting our protocols IHH and anemia, we conclude that physiological and morphological adjustments triggered in the two different conditions can be used as procedures to lead these adaptive responses to transient or permanent changes. All these physiological changes would have multiple applications in mountain and sport medicine, and in other future biomedical applications.

El present treball ha estudiat el paper de la insulina i els factors de creixement tipus insulina (IGFs) en el creixement i metabolisme de la truita ("Oncohrynchus mykiss") i l´orada("Spaurus aurata"). Per assolir aquest objectiu s´han realitzat experiments "in vivo" en ambdues espècies en les quals s´ha provocat una situació de creixement compensatori. Mitjançant la tècnica de RT-PCR real time s´ha analitzat l´expressió dels principals reguladors miogènics (miogenina, myoD), així com dels FGFs, miostatina, IGF-I e IGF-II, i de les dues isoformes del receptor d´IGF-I, durant el creixement compensatori de la truita irisada. De la mateixa manera s´ha estudiat la variació en els nivells de binding dels receptors d´insulina i d´IGF-I en la musculatura blanca durant aquest mateix fenomen. En l´orada s´ha estudiat el paper dels receptors d´insulina i d´IGF-I en la musculatura blanca, així com els valors plasmàtics d´insulina, i d´IGF-I durant els diferents períodes experimentals, igualment, s´ha analitzat la mobilització de les diferents reserves energètiques (lípid, proteïna i glicogen) en el múscul blanc i el fetge. Per a completar els nostres estudis in vivo, s´ha analitzat mitjançant la tecnica de RT-PCR real time i per primera vegadaen peixos, el patró d´expressió dels receptors d´hormona de creixement (GHRs) en la musculatura blanca i el fetge de truita irisada, així com l´expressió dels IGFs en ambdós teixits durant la realimentació de la truita irisada. Després de l´obtenció de nombrosos i novedosos resultats in vivo, es va procedir a la posada a punt d´un cultiu de cèl·lules musculars d´orada. En aquest sistema in vitro s´ha estudiat el paper de la insulina i dels IGFs en l´estimulació de les diferents vies de transducció de la senyal al llarg del cultiu. De la mateixa manera, s´ha estudiat el paper metabòlic d´aquests pèptids realitzant estudis de captació de glucosa i d´alanina en els diferents dies del cutliu. Per a confirmar els efectes d´aquests pèptids eren mediatitzats per la presència de receptors específics s´han realitzat estudis de binding per al receptor d´IGF-I en els diferents dies de cultiu i s´ha estudiat l´efecte de diferents inhibidors de les vies de transducció de la senyal al llarg del cultiu. / The aim of the present work is to study the role of insulin and insulin like growth factors (IGFs) on growth and metabolism processes in the rainbow trout ("Oncohrynchus mykiss") and in the gilthead sea bream ("Spaurus aurata"). The goal of this thesis has been assessed by means of "in vivo" experiments in both species evoking a situation of compensatory growth. By means of RT-PCR real time the expression profile of several important muscle regulators (miogenin, myoD), IGFs (IGF-I and IGF-II), fibroblast like growth factors (FGFs), myostatin and IGF-I receptor isoforms (a and b), has been analyzed during this situation in the rainbow trout. In the same manner the binding levels for IGF-I receptor has been studied under this conditions in this species.We have performed similar experiments using the gilthead sea bream. We have measured changes on insulin and IGF-I receptors in the white skeletal muscle, plasma levels of insulin, IGF-I and free fatty acids. In the same manner we have correlated this plasma changes with variations in body energy storages mobilization (lipids and glycogen). Our studies in vivo have been concluded analyzing as a first time in fishes, the time course expression profile of growth hormone receptors (GHRs)in both liver and muscle during refeeding, together with the analysis of the expression profile of IGFs in the same organs.After all the approximations in vivo we have developed a primary muscle cell culture in the gilthead sea bream. We have studied the role of insulin and IGFs in the stimulation in the main cell signalling pathways (AKT and MAPK). In the same manner, we have studied the metabolic role of these peptides analyzing both glucose and amino acid uptake among the different days of the cell culture. In order to confirm that all this mechanisms are mediated by IGF-I receptors, binding studies have been performed throughout the cell culture and the effect of several transduction pathways inhibitors has been also investigated.

El sargo picudo es capaz de componer, seleccionando entre preparaciones encapsuladas de macronutrientes puros, una dieta completa que se ajusta a sus necesidades fisiológicas, aún en ausencia de la información orosensorial del alimento. La técnica de encapsulación ha permitido comprobar este último extremo, resaltando la complejidad de losmecanismos implicados en la regulación de la ingesta en peces. El perfil omnívoro de la especie está caracterizado por una menor dependencia de la proteína de origen animal y una mayor aceptación de la proteína vegetal, así como por una alta capacidad para la utilización de los carbohidratos de la dieta. El sargo picudo manifiesta una gran capacidad para mantener sus funciones en presencia de bajas concentraciones de HUFA en la dieta, recurriendo en tales casos, no a un aumento de las actividades de desaturación/elongación de ácidos grasos, sino a una alta bioconservación de los HUFA en detrimento de los PUFA C18. / Sharpsnout seabream are capable, selecting among encapsulated preparations manufactured with pure macronutrient, to compound a complete diet that matches their physiological needs in spite the absence of orosensory information from diet. The encapsulation technique has revealed this last point, highlighting the complexity of the mechanisms involved in the food intake regulation in fish. The omnivorous pattern of this species is characterized by a less dependence of animal protein and a greater acceptance of vegetable protein so as, a high capacity for the utilization of dietary carbohydrates. Sharpsnout seabream show a high ability to maintain their functions with low concentrations of HUFA in the diet, using in such cases, not an increase in the activities of fatty acid desaturation/elongation, but high bioconservation of HUFA in detriment of C18 PUFA.

La especie porcina es considerada el modelo animal idóneo para el estudio y desarrollo de terapias contra enfermedades humanas debido a sus similitudes genéticas, anatómicas y fisiológicas con el hombre. Sin embargo, la eficiencia de la producción in vitro (PIV) de embriones porcinos para utilizarlos con este fin sigue siendo muy baja, pues aun persisten los problemas de la fecundación polispérmica y las condiciones de cultivo subóptimas. Por estos motivos, se pretende profundizar en el conocimiento de los diferentes factores relacionados con el oviducto porcino que pudieran ser utilizados para modular el proceso de la fecundación in vitro (FIV) y contribuir a la mejora de los sistemas de PIV de embriones. La presente tesis aborda tres posibles vías de mejora diferentes en cuanto a complejidad e implicaciones fisiológicas consistentes en la adición al medio de cultivo de tres tipos de compuestos: fluido oviductal (FO), α-L-fucosidasa y óxido nítrico (NO). El objetivo del primer estudio fue determinar las condiciones óptimas de inclusión del FO en los protocolos de FIV. Para ello, se preincubaron ovocitos madurados in vitro con FO pre o postovulatorio y se realizó FIV. Se midieron las concentraciones de E2 y P4 en el FO. Finalmente se comparó la eficiencia de la FIV al utilizar semen fresco o congelado con ovocitos preincubados en FO preovulatorio. La eficiencia de la FIV porcina mejoró con la preincubación en FO preovulatorio. Cuando se utilizó semen congelado su capacidad de penetración aumentó comparando con semen fresco. La concentración de E2 en el FO preovulatorio fue mayor que la determinada en sangre para la misma fase del ciclo estral y la adición de E2 al medio de FIV a la concentración detectada en el oviducto produjo un efecto similar al de la adición de FO. Concluimos que la preincubación de los ovocitos en FO preovulatorio o la adición de E2 pueden considerarse protocolos adecuados para aumentar la eficiencia de la FIV porcina con semen fresco. En el segundo estudio se investigó el papel de la α-L-fucosidasa durante la FIV porcina. Para ello se añadió la enzima al medio de FIV y se observó un incremento en la penetración y en la unión de espermatozoides a la zona pelúcida (ZP). Se realizó inmunofluorescencia indirecta para detectar la α-L-fucosidasa espermática y finalmente se realizaron estudios de capacitación espermática, demostrándose que la α-L-fucosidasa aumenta los niveles de [Ca2+] intracelular y la fosforilación de tirosina. Por lo que concluímos que la α-L-fucosidasa estimula eventos relacionados con la capacitación en espermatozoides porcinos, dando lugar a una mayor capacidad de unión a la ZP y de penetración al ovocito. En el tercer estudio se investigó el papel del NO durante la maduración in vitro (MIV) porcina. Para ello se suplementó el medio de MIV con tres inhibidores distintos de la óxido nítrico sintasa (NOS) y con un donante de NO. Se estudió la expansión de las células del cúmulus y la reanudación de la meiosis, la resistencia de la ZP a la digestión enzimática y parámetros relacionados con la FIV. Los resultados mostraron que los tres inhibidores ejercían un efecto sobre la expansión de las células del cúmulus y que la reanudación de la meiosis solamente se vio detenida al añadir el inhibidor aminoguanidina. Posteriormente, se planteó la posibilidad de que la inhibición de las NOS afectara a la S-nitrosilación de proteínas del ovocito. Para ello se realizó nitrosilación in situ cuantificándose la intensidad de fluorescencia. De este modo, se demostró que la S-nitrosilación de proteínas es una de las vías por la que el NO ejerce su efecto en el ovocito, revelando la importancia del NO en la MIV. / The porcine species, owing to their genetic, anatomic, and physiologic similarities with humans, is considered as the ideal animal model for studying and developing novel therapies against human diseases. However, the efficiency of porcine embryo in vitro production (IVP) is nowadays still unacceptably low, because the problem of polyspermic fertilization has still not been adequately worked out and the embryo in vitro culture conditions are still considered to be suboptimal. For these reasons, the present doctoral thesis aims to deepen the understanding of the different factors related to the physiology of the pig oviduct that could be used to modulate the in vitro fertilization (IVF) process and contribute to improve pig embryo IVP systems. Therefore, we investigate three different ways of improvement, in terms of complexity and physiological implications, such as: 1) the oviductal fluid (OF), 2) α-l-fucosidase, 3) nitric oxide (NO). The aim of the first study was to determine the optimal conditions for the OF inclusion in the IVF protocols. For this purpose, in vitro matured oocytes were pre-incubated in OF collected before or after ovulation and subsequently used for IVF. Steroids concentrations in OF were measured and used in IVF experiments. Finally the IVF efficiency was compared between fresh or frozen semen with oocytes preincubated in preovulatory OF. Results showed that pig IVF efficiency improved with preincubation in preovulatory OF. When frozen-thawed semen was used with preovulatory OF incubated oocytes, penetration ability and polyspermy increased. The estradiol (E2) concentration in preovulatory OF was greater than that determined in blood serum at the same phase of the estrous cycle. We conclude that preincubation of oocytes in preovulatory OF or the addition of E2 can be considered suitable tools to increase the efficiency of IVF, only with fresh semen, in the pig. In the second study the role of α-L-fucosidase in pig IVF was investigated. Therefore, the enzyme was added to the IVF medium and a significant increase in sperm binding to the zona pellucida (ZP) and penetration was observed. Thereafter, the sperm-associated α-L-fucosidase was detected by indirect immunofluorescence. In this case, neither the intensity of fluorescence nor the patterns of sperm-associated α-L-fucosidase distribution were affected. Finally, experiments focused on the study of the capacitation events were conducted. The results showed that the addition of exogenous α-L-fucosidase increased the sperm intracellular [Ca 2+] and P-tyrosine phosphorylation, suggesting a role in promoting capacitation and at the same time protecting the sperm cells from premature acrosome reaction. This sequence of events would, in turn, explain the increased ability of this population of treated spermatozoa to bind ZP and penetrate the oocyte. The third study arose to determine the effect of NO during pig oocyte maturation. In vitro maturation (IVM) medium was supplemented with three NOS inhibitors, and a NO donor. The effects on cumulus cells expansion, meiotic resumption, ZP resistance to enzymatic digestion and various parameters related to IVF were studied. The results showed that after IVM, the three NOS inhibitors exerted an inhibitory effect on cumulus cells expansion, while meiotic resumption was suppressed only when the inhibitor aminoguanidine was added. Subsequently, to determine whether the NOS inhibition affect the S-nitrosylation of oocyte proteins, we performed in situ S-nitrosylation and the fluorescence intensity was quantified. Thus, it was shown for the first time that the S-nitrosylation of proteins is one of the ways by which NO exerts its effect on porcine maturation, revealing the importance of NO in both IVM and subsequent fertilization.

The aim of this thesis was to study the function and regulation of two of the major players in the carbohydrate metabolism regulated by insulin, the facilitative glucose transporters GLUT2 and GLUT4, in teleost fish. In order to investigate the role of factors exerting a control on the transcription of the GLUT4 gene, we cloned the GLUT4 promoter in Fugu. The 5 ́-flanking region of the Fugu GLUT4 gene showed similar features to that in mammals. Structurally, comparative analysis between the cloned promoter sequence and that of other fish promoters revealed a high degree of conservation among teleost species. Furthermore, we demonstrated the functionality of the cloned Fugu GLUT4 promoter, and by generating several deletion constructs we were able to determine the minimal promoter. In this study, we have observed that the activity of the Fugu GLUT4 promoter is inhibited by insulin in a dose- and time-dependent manner. Furthermore, all the deletion constructs were repressed by insulin, suggesting the presence of regulatory elements downstream of the TSS. Next, we investigated the effects of PPARγ activation in L6 murine muscle cells transfected with the cloned Fugu GLUT4 promoter. Our results showed that stimulation with PG-J2 significantly stimulated the activity of the Fugu GLUT4 promoter and that this effect was abolished in the Fugu GLUT4 promoter deletions lacking the PPAR/RXR motifs. Finally, we investigated the in vitro effects of experimentally controlled muscle fiber contraction using C2C12 contractile cells expressing the construct containing the Fugu GLUT4 promoter. Using this system to mimic the effects of exercise in vitro in differentiated myotubes we showed an increase in the transcriptional activity of the Fugu GLUT4 promoter. Next studying the function of GLUT2 at early developmental stages we investigated the expression pattern of GLUT2 during embryonic development in zebrafish by ISH, observing transcripts in the liver, pronephric tubules, anterior intestine, endocrine pancreas and neurons surrounding the hindbrain region. To study its function during the early developmental stages in zebrafish we knocked down GLUT2 using antisense morpholinos. Our results showed that embryos lacking GLUT2 display a delay of the whole body development with severe alterations in the midbrain and hindbrain ventricles. Next, by studying the functional alterations triggered by the lack of GLUT2 we observed that morphant embryos displayed an impairment of glucose uptake in the whole body but especially in the head region. Interestingly, a similar pattern was found when assaying cell viability in these embryos, showing a significant increase in apoptotic cell death, mainly located in the cephalic area. Furthermore, blocking the expression of GLUT2 resulted in alterations in the asymmetric distribution of some endoderm-derived organs shown to express this glucose transporter, namely the liver and the endocrine and exocrine pancreas. Additionally, we studied the transcriptional alterations in these embryos by microarray analysis. Finally, we set out to establish an in vitro system using the mammalian β-cell line MIN6 in order to further study the physiological function of zebrafish GLUT2. Our results showed that we were able to knockdown endogenous GLUT2 leading to a loss of glucose-stimulated insulin secretion in MIN6 cells. Furthermore, we successfully established the conditions for the expression of zebrafish GLUT2 in MIN6 and observed a significantly increase in the basal glucose uptake in the pancreatic cells. In addition, preliminary results point to a possible increase in the glucose uptake in cells expressing the rat GLUT2 construct. / El objetivo de esta tesis fue estudiar la función y regulación de dos de los principales implicados en el metabolismo glucídico regulado por la insulina, los transportadores de glucosa GLUT2 y GLUT4, en los peces teleósteos. En vertebrados no mamíferos, GLUT2 ha sido poco caracterizado hasta la fecha. Se ha demostrado en varias especies de teleósteos que GLUT2 se expresa en los principales tejidos sensibles a la insulina, similar a lo que se describe en los mamíferos. Sin embargo, las propiedades funcionales y el papel fisiológico de GLUT2 apenas han sido descritos en peces. En vista de ello, se ha caracterizado GLUT2 en el pez cebra, ya que dicha especie es uno de los modelos más reconocidos para el estudio de la fisiología, el desarrollo y el metabolismo. En cuanto a GLUT4, nuestro grupo ha sido pionero en la investigación de este transportador en peces teleósteos desde que Planas et al. caracterizaron el primer homologo de GLUT4 en vertebrados inferiores. A pesar de que se ha estudiado más este transportador de glucosa que GLUT2, la información sobre los factores que intervienen en la regulación de la transcripción del gen GLUT4 han sido escasamente caracterizados en mamíferos, mientras que no hay datos disponibles en los vertebrados inferiores. Para ello, en este estudio hemos analizado la regulación de un promotor de GLUT4 de teleósteos bajo la acción de estímulos con conocida capacidad para modular la transcripción y la expresión de GLUT4 en los mamíferos, como la insulina, la contracción de fibras musculares y PPARs.

La ecografía se utiliza en el diagnóstico de patologías y alteraciones del aparato reproductor del perro. El Doppler pulsado es empleado para describir las características de la onda espectral de la arteria testicular y establecer los valores de referencia de sus parámetros cuantitativos (velocidad del pico sistólico, VPS; velocidad al final de la diástole, VFD) y semicuantitativos (índice de resistividad, IR; índice de pulsatilidad, IP). En humana, el valor del IR de las arterias testiculares puede ser un indicador de la espermatogénesis y en el perro un marcador de la calidad seminal. Existe poca información sobre las características y parámetros cuantitativos y semicuantitativos de las arterias testiculares en el perro y su aplicación como predictores de la calidad espermática. El objetivo del presente estudio fue describir la morfología de la onda espectral y los valores de referencia de la VPS, VFD, IR e IP de las arterias testiculares en el perro y determinar la correlación entre los valores del IR de dichas arterias con la concentración y motilidad espermática. Se utilizaron cinco perros de la raza Beagle con una edad media de 4 años y un peso medio de 19 kg. Para el examen ecográfico se empleó un ecógrafo con una sonda electrónica lineal de 11 MHz. Los animales no fueron sedados, para evitar alteraciones sobre el flujo sanguíneo testicular. La recogida seminal se realizó de forma individual, por el mismo personal y franja horaria. Valorándose únicamente su fracción espermática. El estudio se dividió en dos experiencias. En la primera experiencia se realizaron cinco ensayos, consistentes en un examen ecográfico Doppler color y pulsado de las arterias testiculares de ambos testículos. En la segunda experiencia, se hicieron 15 ensayos basados en un examen ecográfico y una extracción y contrastación seminal, valorándose los parámetros de concentración y motilidad espermática, utilizando un sistema de análisis computerizado (ISAS® CASMA). Para la interpretación de los datos obtenidos se utilizó un análisis estadístico SPSS versión 15.0. En la primera experiencia, las arterias testiculares se identificaron fácilmente con el Doppler color y pulsado, presentando un modelo de flujo espectral de baja resistencia. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores de VPS, VFD, IR e IP entre las distintas arterias, encontrándose los valores más altos en la arteria supratesticular y los más bajos en las arterias intratesticulares. Este comportamiento se repitió en todos los ensayos. Los valores medios obtenidos en la arteria supratesticular fueron: VPS= 15.32 cm/s ± 5.28, VFD= 6.76 cm/s ± 1.88, IR= 0.53 ± 0.13 e IP= 0.88 ± 0.39; en la arteria marginal: VPS= 10.72 cm/s ± 3.86, VFD= 6.24 cm/s ± 2.19, IR= 0.41 ± 0.10 e IP= 0.63 ± 0.20; y en las arterias intratesticulares: VPS= 6.34 cm/s ± 1.51, VFD= 4.10 cm/s ± 0.86, IR= 0.35 ± 0.07 e IP= 0.49 ± 0.12. Estos resultados podrían utilizarse como valores de referencia de los parámetros cuantitativos y semicuantitavos que definen a las arterias testiculares en la especie canina. Los resultados de la segunda experiencia sugieren la existencia de una correlación positiva estadísticamente significativa débil entre el IR de las arterias testiculares y los parámetros de calidad y motilidad seminal. Esta correlación se evidenció tanto a Tiempo a como a Tiempo b. En las arterias intratesticulares se evidenció el mayor número de correlaciones positivas (con la motilidad progresiva, VSL, VAP, LIN, STR y BCF) y la única correlación negativa significativa, con la concentración espermática. Aunque serían necesarios futuros estudios, este resultado podría indicar que la medición del IR en las arterias intratesticulares podría ser un parámetro predictor de la calidad seminal a nivel cuantitativo en el perro. / La ecografía se utiliza en el diagnóstico de patologías y alteraciones del aparato reproductor del perro. El Doppler pulsado es empleado para describir las características de la onda espectral de la arteria testicular y establecer los valores de referencia de sus parámetros cuantitativos (velocidad del pico sistólico, VPS; velocidad al final de la diástole, VFD) y semicuantitativos (índice de resistividad, IR; índice de pulsatilidad, IP). En humana, el valor del IR de las arterias testiculares puede ser un indicador de la espermatogénesis y en el perro un marcador de la calidad seminal. Existe poca información sobre las características y parámetros cuantitativos y semicuantitativos de las arterias testiculares en el perro y su aplicación como predictores de la calidad espermática. El objetivo del presente estudio fue describir la morfología de la onda espectral y los valores de referencia de la VPS, VFD, IR e IP de las arterias testiculares en el perro y determinar la correlación entre los valores del IR de dichas arterias con la concentración y motilidad espermática. Se utilizaron cinco perros de la raza Beagle con una edad media de 4 años y un peso medio de 19 kg. Para el examen ecográfico se empleó un ecógrafo con una sonda electrónica lineal de 11 MHz. Los animales no fueron sedados, para evitar alteraciones sobre el flujo sanguíneo testicular. La recogida seminal se realizó de forma individual, por el mismo personal y franja horaria. Valorándose únicamente su fracción espermática. El estudio se dividió en dos experiencias. En la primera experiencia se realizaron cinco ensayos, consistentes en un examen ecográfico Doppler color y pulsado de las arterias testiculares de ambos testículos. En la segunda experiencia, se hicieron 15 ensayos basados en un examen ecográfico y una extracción y contrastación seminal, valorándose los parámetros de concentración y motilidad espermática, utilizando un sistema de análisis computerizado (ISAS® CASMA). Para la interpretación de los datos obtenidos se utilizó un análisis estadístico SPSS versión 15.0. En la primera experiencia, las arterias testiculares se identificaron fácilmente con el Doppler color y pulsado, presentando un modelo de flujo espectral de baja resistencia. Se hallaron diferencias estadísticamente significativas entre los valores de VPS, VFD, IR e IP entre las distintas arterias, encontrándose los valores más altos en la arteria supratesticular y los más bajos en las arterias intratesticulares. Este comportamiento se repitió en todos los ensayos. Los valores medios obtenidos en la arteria supratesticular fueron: VPS= 15.32 cm/s ± 5.28, VFD= 6.76 cm/s ± 1.88, IR= 0.53 ± 0.13 e IP= 0.88 ± 0.39; en la arteria marginal: VPS= 10.72 cm/s ± 3.86, VFD= 6.24 cm/s ± 2.19, IR= 0.41 ± 0.10 e IP= 0.63 ± 0.20; y en las arterias intratesticulares: VPS= 6.34 cm/s ± 1.51, VFD= 4.10 cm/s ± 0.86, IR= 0.35 ± 0.07 e IP= 0.49 ± 0.12. Estos resultados podrían utilizarse como valores de referencia de los parámetros cuantitativos y semicuantitavos que definen a las arterias testiculares en la especie canina. Los resultados de la segunda experiencia sugieren la existencia de una correlación positiva estadísticamente significativa débil entre el IR de las arterias testiculares y los parámetros de calidad y motilidad seminal. Esta correlación se evidenció tanto a Tiempo a como a Tiempo b. En las arterias intratesticulares se evidenció el mayor número de correlaciones positivas (con la motilidad progresiva, VSL, VAP, LIN, STR y BCF) y la única correlación negativa significativa, con la concentración espermática. Aunque serían necesarios futuros estudios, este resultado podría indicar que la medición del IR en las arterias intratesticulares podría ser un parámetro predictor de la calidad seminal a nivel cuantitativo en el perro.