L’àcid maslínic és un component bioactiu present en un ampli ventall de fonts naturals, des de plantes emprades en medicina tradicional asiàtica fins a fruites i verdures de consum habitual en el marc de la dieta mediterrània. Entre altres efectes biològics atribuïts a aquest triterpè pentacíclic destaquen l’antitumoral, antidiabètic, antioxidant, neuroprotector i antiparasitari. Actualment, però, són pocs els estudis que han caracteritzat l’àcid maslínic in vivo. Per aquest motiu, els objectius de la present tesi han inclòs l’avaluació de la seguretat d’aquest compost després de la seva administració oral així com també l’estudi de la seva absorció intestinal, lligada amb les concentracions que s’assoleixen tant en plasma com en la llum intestinal i amb el seu efecte sobre lesions preneoplàsiques en còlon. L’assaig de toxicitat subaguda ha posat de manifest que l’administració oral repetida d’àcid maslínic (50 mg/kg) a ratolins durant 28 dies no provoca alteracions en el pes corporal ni en les variables hematològiques i bioquímiques. L’anàlisi histopatològica dels principals òrgans tampoc no ha evidenciat signes de toxicitat derivats de l’exposició al triterpè. Un cop establerta l’absència d’efectes adversos s’ha desenvolupat un mètode de cromatografia de líquids d’alta eficàcia (HPLC) per a la determinació de l’àcid maslínic en plasma de rata, mitjançant el qual aquest compost s’ha quantificat fins a 60 min després de la seva administració oral (50 mg/kg). Les concentracions plasmàtiques s’han ajustat a un model farmacocinètic monocompartimental, a partir del qual s’ha estimat una Cmax de 3,74 µM i una Tmax de 18,0 min. Seguidament s’ha optimitzat i validat un mètode d’HPLC acoblada a espectrometria de masses (HPLC‐MS) per a la determinació de l’àcid maslínic en el contingut intestinal de rata. El mètode s’ha aplicat a mostres obtingudes d’animals que han rebut el triterpè (1, 2 o 5 mg/kg) per via oral durant dos dies consecutius i s’ha vist que la major concentració es troba en el cec, seguit del còlon i l’ili. A més, mitjançant espectrometria de masses d’alta resolució (HPLC‐APCI‐LTQ‐Orbitrap‐MS) també s’han identificat els principals metabòlits de l’àcid maslínic en aquestes mostres. El triterpè és sotmès a reaccions de fase I, concretament hidroxilacions i deshidrogenacions en diferents combinacions que donen lloc a onze derivats. L’estudi de l’absorció intestinal de l’àcid maslínic emprant la tècnica dels sacs evertits i la perfusió en jejú de rata ha mostrat que el compost travessa la paret intestinal per difusió simple, sense implicació de mecanismes de transport actiu, amb una constant aparent de difusió (Kd) de 6,95 µL/5 min∙mg pes sec, indicativa d’una baixa absorció. Així, donat que el còlon és un dels teixits diana de l’àcid maslínic, se n’ha avaluat l’activitat quimiopreventiva en rata en un model de lesions preneoplàsiques induïdes per 1,2‐ dimetilhidrazina. El tractament amb el triterpè a diferents dosis oral (5, 10 o 25 mg/kg) durant 49 dies, tant en mascles com en femelles, ha reduït l’aparició de focus de criptes aberrants en un 22–35% i un 21–29%, respectivament. En resum, els resultats obtinguts en la present tesi doctoral evidencien que l’àcid maslínic pot administrar‐se per via oral amb seguretat, que la seva absorció intestinal té lloc per un procés de difusió simple i que administrat com a ingredient funcional o nutracèutic podria exercir, entre altres, un efecte protector durant les primeres etapes del desenvolupament del càncer de còlon. / Maslinic acid is a bioactive compound found in a wide range of natural sources, from plants used in traditional Asian medicine to fresh vegetables and fruits regularly consumed as part of the Mediterranean diet. Several biological effects have been attributed to this pentacyclic triterpene, including antitumor, antidiabetic, antioxidant, neuroprotective and antiparasitic. Thus far, however, only a few studies have characterized maslinic acid in vivo. For this reason, the aims of this thesis have been to assess the safety of maslinic acid after its oral administration and to evaluate its oral absorption. Moreover, the latter has been related to the concentrations reached both in plasma and the intestinal lumen. Finally, the in vivo antitumor effect of the triterpene has been investigated on colonic preneoplastic lesions. The subacute toxicity assessment has evidenced that the repeated oral administration of maslinic acid (50 mg/kg) to mice over 28 days does not modify either the body weight or the hematologic and biochemical variables. Similarly, the histopathological examination of the main organs has not revealed any signs of toxicity derived from the exposition to the triterpene. Once the absence of adverse effects has been proved, a high performance liquid chromatography (HPLC) method has been developed to determine maslinic acid in plasma, which has been applied for the quantification of the triterpene up to 60 min after its oral administration to rats (50 mg/kg). Plasma concentrations have been best fitted to a pharmacokinetic monocompartmental model, from which a Cmax of 3.74 µM and a Tmax of 18.0 min have been estimated. An HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC‐MS) method has also been optimized and validated to determine maslinic acid in rat intestinal content. This method has been used for the analysis of samples obtained from rats after the oral administration of the triterpene (1, 2 or 5 mg/kg) for two consecutive days. The highest concentration has been found in the caecum, followed by the colon and the ileum. In addition, the main metabolites of maslinic acid have been identified in these samples by high resolution mass spectrometry (HPLC‐APCI‐LTQ‐Orbitrap‐MS). The triterpene undergoes phase I reactions giving a total of eleven hydroxylated and/or dehydrogenated derivatives. Maslinic acid intestinal absorption has been addressed by means of the ex vivo everted gut sac and the in situ intestinal perfusion techniques. The compound is absorbed by simple diffusion, without any active transport mechanism involved, and with an apparent diffusion constant (Kd) of 6,95 µL/5 min∙mg dry weight, which indicates a low absorption. Since the colon is a target tissue of maslinic acid, the chemopreventive activity of the triterpene has been evaluated in a rat model of preneoplastic lesions induced by 1,2‐ dimethylhydrazine. The treatment with the triterpene at different doses (5, 10 or 25 mg/kg) over 49 days, both in male and female rats, reduces the formation of aberrant crypt foci by 22–35% and 21–29%, respectively. In summary, the results obtained from the present thesis show that maslinic acid can be safely administered by the oral route, its intestinal absorption takes place by a simple diffusion process and its use as a functional ingredient or nutraceutical may exert, among others, a protective effect in the first stages of colon carcinogenesis.

Tesis por compendio de publicaciones / OBJETIVOS 1. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en humana, usando como modelo experimental a estudiantes de veterinaria que tenían que realizar una presentación oral de un trabajo en lengua extranjera. 2. Evaluar el uso de la alfa amilasa salivar como marcador de estrés usando técnicas tradicionales (ensayos enzimáticos) en cerdos. 3. Implementar nuevos enfoques para la medición de la alfa-amilasa en muestras de saliva de varias especies (incluidos los seres humanos) mediante la cuantificación directa de la cantidad de la alfa-amilasa salival en lugar de mediante la medición de su actividad 4. Detectar e identificar nuevos biomarcadores de estrés en la saliva mediante técnicas de proteómica. Una técnica avanzada que permite la separación e identificación de múltiples proteínas. METODOLOGÍA Esta tesis doctoral es un compendio de los siguientes artículos publicados: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. En el primer artículo, se midió el cortisol salival y la actividad alfa-amilasa para evaluar el estrés asociado con una presentación oral pública de los estudiantes de Patología Clínica Veterinaria. Se recogieron muestras de saliva antes y directamente después de la presentación oral de 5 minutos y a los 20 y 35 minutos después del comienzo de la misma. El cortisol alcanzó su punto máximo 20 minutos después del comienzo de la presentación, mientras que la alfa-amilasa salival alcanzó su máximo justo al final del discurso. No existió relación entre estos cambios y el nivel de estrés que se indica por el estudiante en un cuestionario, ni con el sexo del estudiante, o la calidad de la presentación. El objetivo del segundo estudio fue validar un método espectrofotométrico automatizado para la medición de alfa-amilasa salival en cerdos y evaluar su posible aplicación como biomarcador de estrés no invasivo . La validación analítica incluyó la precisión intra- e inter- ensayo, linealidad bajo dilución, y límite de detección. Además, para estudiar el posible uso de alfa- amilasa salival como marcador de estrés, 12 cerdos en crecimiento de 3-4 meses de edad fueron sometidos a estrés por inmovilización durante al menos 1 min, obteniéndose muestras de saliva en diferentes puntos de tiempo. Los resultados de la validación analítica indicaron que el método era preciso y capaz de medir la alfa-amilasa de una manera lineal. Los resultados obtenidos en la prueba de esfuerzo mostraron un aumento significativo en la actividad salival alfa amilasa. El propósito del artículo 3 fue estudiar los cambios en el proteoma salival de cerdos sanos en situaciones de estrés para identificar cualquier posible nuevo biomarcador salival de estrés. Tres grupos de animales fueron sometidos a 3 modelos de estrés: restricción seguido de muestreo simulado de sangre de la vena cava; transporte breve por carretera; restricción de movimiento en una jaula digestibilidad. La saliva se obtuvo de cada animal antes, 15 y 30 min después de la inducción de estrés. Las muestras de los animales que mostraron el mayor incremento en la concentración de cortisol salivar se agruparon y se realizó una electroforesis en geles bidimensionales. Se tiñeron con Coomassie Brilliant Blue R-250 para la detección de spots y seleccionarlos para su identificación mediante espectrometría de masas. Los análisis estadísticos demostraron que 2 proteínas tenían diferencias significativas en la expresión antes y después de la inducción de estrés y fueron identificadas como fragmentos de albúmina y proteína de unión odorizante. CONCLUSIONES 1. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en estudiantes de Veterinaria tras someter a los individuos a una presentación pública oral. 2. La actividad enzimática de la alfa amilasa salivar puede ser usada como biomarcador de estrés en cerdos tras someter a los individuos a un protocolo de restricción de movimientos. 3. La concentración de alfa amilasa en saliva de humanos, cerdos, caballos y ovejas puede ser cuantificada mediante un ensayo de inmunofluorometría a tiempo resuelto. Este ensayo tiene una variación inter-individual baja y es más sensible que los ensayos enzimáticos para detectar estrés. 4. El proteoma salivar de los cerdos ha revelado diferencias entre animales en condiciones basales y bajo condiciones de estrés. Esto se reveló como una herramienta útil para buscar posibles nuevos biomarcadores de estrés in estos animales tales como la proteína de unión odorizante. / OBJECTIVES 1. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in human using a model in which veterinary students had to make an oral presentation in a foreing language. 2. To evaluate the use of salivary alpha-amylase as a marker of stress using traditional techniques (enzymatic assays) in pigs. 3. To implement new approaches for measuring alpha-amylase in saliva samples of several species (including human beings) by direct quantification of the amount of the salivary alpha-amylase instead of by measuring its activity (Article 3, Article 4, Article 5, Article 6). 4. To detect and identify new biomarkers of stress in saliva by proteomics. An advanced technique that allows separation and identification of multiple proteins. METHODOLOGY This PhD thesis is a compilation of the following published papers: 1) Assessment of Stress Associated with an Oral Public Speech in Veterinary Students by Salivary Biomarkers. Tecles F, Fuentes-Rubio M, Tvarijonaviciute A, Martínez-Subiela S, Fatjó J, Cerón JJ. (2014) J Vet Med Educ. Jan 21:1-7. [Epub ahead of print]. 2) Validation of an automated method for salivary alpha-amylase measurements in pigs (Sus scrofa domesticus) and its application as a stress biomarker. Fuentes M, Tecles F, Gutiérrez A, Otal J, Martínez-Subiela S, Cerón JJ. (2011) J Vet Diagn Invest. Mar;23(2):282-7. 3) Porcine salivary analysis by two-dimensional gel electrophoresis in three acute stress models: a pilot study. Fuentes-Rubio M, Cerón J, de Torre C, Escribano D, Gutiérrez AM, Tecles F. (2014) Can J Vet Res. Apr;78(2):127-32. In the first article, salivary cortisol and alpha-amylase activity were measured to assess stress associated with a public oral presentation in Veterinary Clinical Pathology students. Stimulated saliva samples were collected before and directly after a 5-minute oral presentation and at 20 and 35 minutes after the beginning of the presentation. Cortisol peaked 20 minutes after the beginning of the presentation, whereas salivary alpha-amylase (sAA) peaked at 5 minutes, just at the end of the speech. These changes were not related to the level of stress that was indicated by the student in a questionnaire, the student’s sex, or the quality of the presentation. The aim of the second study was to validate an automated spectrophotometric method for salivary alpha-amylase measurement in pigs and evaluate its possible application as a noninvasive stress biomarker. The analytical validation included intra- and interassay precision, linearity under dilution, and limit of detection. In addition, to study the possible use of salivary alpha-amylase as a possible stress marker, 12 crossbred growing pigs of 3-4 months of age were subjected to restraint stress by a nasal snare for at least 1 min, and saliva samples were obtained at different time points. The results of analytical validation indicated that the method was precise and able to measure alpha-amylase in a linear manner. The results obtained in the stress test showed a significant increase in salivary alpha-amylase activity. The purpose of the research of article 3 was to study changes in the salivary proteome of healthy pigs in stressful situations to identify any potential new salivary biomarker of stress. Three groups of animals were subjected to 3 stress models: snaring restraint followed by simulated sampling of vena cava blood; brief transport by road; and restriction of movement in a digestibility cage. Saliva was obtained from each animal before and 15 and 30 min after the induction of stress. The samples from the animals that showed the greatest increase in salivary cortisol concentration were pooled and run on 2-dimensional gels. Coomassie Brilliant Blue R-250 was used for spot detection and mass spectrometry for spot identification. Statistical analyses showed that 2 proteins had significant differences in expression before and after the induction of stress. These proteins were identified as odorant-binding protein and fragments of albumin. CONCLUSIONS 1. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in Veterinary students after subjecting the individuals to a public oral presentation. 2. The enzymatic activity of salivary alpha-amylase can be used as biomarker of stress in pigs after subjecting the individuals to restraint of movement protocol. 3. Alpha-amylase concentration in saliva of humans, pigs, horses and sheep can be quantified by TR-IFMA This assay has a lower inter-individual variation and is more sensitive than enzymatic assays to detect stress. 4. Salivary proteome of pigs has revealed differences between animals in basal status and under stress conditions. It was shown as a useful tool to search possible new salivary biomarkers of stress in these animals such as odorant-binding protein.

Establecer el patrón de temperatura de la piel de la muñeca como ritmo marcador para evaluar el sistema circadiano humano. Para ello, se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Obtener el ritmo endógeno de temperatura periférica distal por medio de procedimientos matemáticos para eliminar y cuantificar los efecto enmascarantes. 2. Describir la ontogenia y el envejecimiento del patrón de temperatura periférica distal. 3. Caracterizar el régimen de exposición a la luz y su influencia sobre el sistema circadiano evaluado mediante el ritmo de temperatura en la muñeca. 4. Analizar el efecto de la temperatura ambiental sobre las variables termofisiológicas y cardiofisiológicas. 5. Evaluar el estilo de vida, la exposición a sincronizadores y la cronodisrupción en ancianos sanos comparados con jóvenes, y proponer un método para evaluar la edad del sistema circadiano sin tener en cuenta la edad biológica. 6. Estudiar la influencia del contraste día/noche en la exposición a sincronizadores y en los hábitos de vida sobre el sistema circadiano humano. 7. Idear una luminaria saludable para el sistema circadiano. MATERIAL Y MÉTODOS La presente tesis cumple los principios bioéticos para investigación humana. Se monitorizaron 456 voluntarios (99 bebés, 250 universitarios, 27 adultos y 80 ancianos) apropiadamente informados sobre el estudio. La temperatura de la piel se monitorizó mediante un data logger (Thermochron iButton, Maxim Integrated Products, Sunnyvale, California, USA). Actividad y posición se registraron mediante un actímetro (HOBO Pendant G Acceleration Data Logger UA-004-64, Onset Computer, Bourne, Massachusetts, USA). La exposición a la luz y la temperatura ambiental se monitorizaron mediante un luxómetro (HOBO Pendant Temperature/Light Data Logger UA-002-64, Onset Computer, Bourne, Massachusetts, USA). Las variables cardiovasculares se registraron mediante un holter de presión arterial (Mobil-O-Graph NG, IEM GmbH, Stolberg, Germany). Además, temperatura, actividad y posición se integraron en una nueva variable compuesta (TAP). Los patrones obtenidos se caracterizaron mediante análisis de series temporales utilizando programas específicos como Cosinor o El Temps (Antoni Díez-Noguera, Universitat de Barcelona, 1999) o diferentes versiones de Excel. Los análisis estadísticos se realizaron con SPSS (Inc. Chicago, Illinois, USA) o R, y los árboles de decisión se realizaron en WEKA 3.0.0 (University of Waikato, New Zealand). CONCLUSIONES Las principales conclusiones de la presente tesis fueron: 1. El ritmo de temperatura periférica distal presenta un fuerte componente endógeno a pesar de la influencia fase-dependiente de otras variables. 2. La maduración del patrón circadiano de temperatura periférica de la muñeca se asocia con un aumento de la circadianidad y el envejecimiento se relaciona con un adelanto de fase. 3. El contraste día/noche en la exposición a la luz y la calidad de la luz se relacionan con mejores patrones de temperatura de la muñeca y de sueño, mientras que la exposición a luz nocturna se asocia a los peores patrones. 4. Las variaciones en la temperatura ambiental afectan la presión arterial a través de cambios en la temperatura periférica distal. 5. El sistema circadiano del anciano se caracteriza por un menor contraste en las variables sincronizadoras, un avance de fase generalizado y un deterioro del orden interno; estas características permiten diferenciar entre jóvenes y ancianos. 6. Las alteraciones en el ritmo de temperatura se asocian con un bajo contraste día/noche. El modelado matemático apunta a que el aumento del contraste en el estilo de vida podría mejorar el ritmo de temperatura. 7. Se patentó un dispositivo de iluminación circadiana saludable. CONCLUSIÓN GENERAL La temperatura periférica de la piel de la muñeca ha demostrado ser un ritmo marcador fiable y cómodo con un fuerte componente endógeno que permite evaluar la robustez del sistema circadiano y el envejecimiento. / OBJECTIVES To establish distal skin temperature pattern as marker rhythm for human circadian system assessing. For this, the following specific objectives were approached: 1. To obtain the endogenous circadian pattern of wrist temperature rhythm by mathematical removing and quantifying masking. 2. To describe and differentiate distal skin temperature during maturation and aging. 3. To characterize human light exposure and its influence on the circadian system assessed by wrist temperature. 4. To analyze the effect of temperature exposure on thermophysiological and cardiophysiological variables. 5. To assess lifestyle, chronodisruption and synchronizers exposure in healthy elders comparing with young people and to propose a method for assessing circadian system aging without taking into account the biological age. 6. To study the influence of day/night contrast in lifestyle and synchronizers, on human circadian system. 7. To create a healthy circadian lighting design. MATERIALS AND METHODS The present thesis accomplishes the bioethical principles for human research. 456 volunteers were recruited (99 babies, 250 undergraduate students, 27 middle-aged adults and 80 elderly people) and properly informed about the study. Skin temperature was recorded using a temperature data logger (Thermochron iButton DS1921H, Maxim Integrated Products, Sunnyvale, California, USA). Activity and position were recorder by an actimeter (HOBO Pendant G Acceleration Data Logger UA-004-64, Onset Computer, Bourne, Massachusetts, USA). Light exposure and environmental temperature were recorded by a luxometer (HOBO Pendant Temperature/Light Data Logger UA-002-64, Onset Computer, Bourne, Massachusetts, USA). Cardiovascular variables were recorded by an automated oscillometric ambulatory system (Mobil-O-Graph NG, IEM GmbH, Stolberg, Germany). In addition, temperature, activity and position were integrated in a new variable (TAP). Rhythm characteristics were extracted by time series analysis using Cosinor or El Temps (Antoni Díez-Noguera, Universitat de Barcelona, 1999) or different versions of Excel. Statistical analysis was performed using SPSS (Inc. Chicago, Illinois, USA) or R, while decision trees were performed in WEKA 3.0.0 (University of Waikato, New Zealand). CONCLUSIONS The main conclusions of the present thesis are: 1. Wrist temperature rhythm has a strong endogenous component, in spite of the influence of other variables, which affect in a phase-dependent manner. 2. Distal skin temperature maturation is associated with an increase in circadianity, whereas aging is related to a phase advance. 3. Day-night contrast and light quality are related with more robust distal skin temperature and sleep patterns, whereas night-time light is associated with worse circadian patterns. 4. Variations in environmental temperature affect arterial blood pressure by changes produced in distal skin temperature. 5. Aged circadian system is characterized by less contrast in synchronizing variables, a generalized phase advance and internal order impairment; these differences allow discerning between a young and elderly people. 6. Temperature rhythm impairment is associated with low contrast between day and night. Mathematical modelling demonstrates that increasing contrast in lifestyle should improve temperature rhythm. 7. A healthy circadian lighting device was patented. GENERAL CONCLUSION Wrist temperature has demonstrated to be a comfortable and reliable marker rhythm with a strong endogenous component that allows evaluating circadian system robustness and ageing.

El cerebro requiere un elevado consumo de energía que obtiene mediante la fosforilación oxidativa mitocondrial. Esto hace del cerebro un órgano muy vulnerable a la hipoxia. Millones de ciudadanos que normalmente viven en zonas con altitudes próximas al nivel del mar, se desplazan a zonas de recreo en altitud, donde el contenido de oxigeno en la atmosfera está reducido. Desde hace siglos es conocido que la hipoxia induce respuestas fisiológicas adaptativas que favorecen el rendimiento deportivo. Por todo ello existe interés en conocer los efectos y los mecanismos implicados en la respuesta del cerebro a la hipoxia. Para el desarrollo de este trabajo fue planteado dos modelos experimentales. En el primero el objetivo era caracterizar el efecto de una exposición a hipoxia aguda (6 h) y severa (FiO2 = 7%) seguida de re-oxigenación (24h y 48h) sobre el estrés oxidativo y la inducción de apoptosis. Para el estudio del estrés oxidativo valoramos los niveles de MDA y AOPP, como indicadores de la oxidación de lípidos y proteínas y la formación de NO. El sistema antioxidante fue determinado a través de la medición de SOD y sistema glutatión. La actividad apoptótica era determinada valorando los niveles de citocromo c, AIF y la actividad de la caspasa 3. Los resultados muestran que la hipoxia induce un aumento de la actividad pro-oxidante y una disminución de la actividad antioxidante característica de estrés oxidativo. Las proteínas inductoras de apoptosis se incrementan, elevando el riesgo de lesión o daño celular. La exposición a la hipoxia lleva al cerebro a un estado de estrés oxidativo y a un aumento de la actividad apoptótica. La re-oxigenación hay una disminución de la actividad pro-oxidante y aumento de la actividad antioxidante, restableciéndose el equilibrio redox celular. En el segundo experimento el objetivo era estudiar el posible efecto neuroprotector de la exposición a hipoxia intermitente moderada sobre el efecto causado por la exposición a la hipoxia aguda severa observado en el primer experimento. Un grupo de animales es expuesto a hipoxia intermitente: una sesión de cuatro horas/día durante 8 días a una presión barométrica equivalente a 4000 m.s.n.m. (Pb=462 Torr; PO2=97 Torr), como factor neuroprotector cuando aplicada antes de una exposición a hipoxia aguda a 7% de FiO2. Los resultados demuestran que la hipoxia intermitente no induce estrés oxidativo en el cerebro de las ratas y que protege del daño causado por la hipoxia severa aguda. El grado del estrés oxidativo y de la actividad apoptótica observado en el cerebro de las ratas expuestas a hipoxia severa aguda era significativamente reducido si antes de la exposición a la hipoxia severa aguda, los animales eran expuestos a hipoxia intermitente. Los resultados muestran que el factor de transcripción NF-kappa-beta descrito como un factor protector anti-apoptótico en diferentes procesos celulares, en la hipoxia aparece asociado con el daño celular. Las expresión de proteínas EPO y VEGF descritas como mecanismos neuroprotectores en respuesta a la hipoxia era mayor en las ratas expuestas a la hipoxia intermitente. Igualmente la hipoxia intermitente inducia la sobreexpresión de las proteínas de choque térmico (HSP27 y 70) evidenciando la activación de mecanismos citoprotectores en los grupos tratados con hipoxia intermitente.

Ischemia is defined by the arrest of blood flow in the organ cutting thus oxygen and metabolite supply indispensable for its survival and function. Restoration of blood flow in hypoxic tissue, called reperfusion, can paradoxically result in more destructive than beneficial effects. Ischemia reperfusion injury (IRI) is an inevitable problem in many clinical situation of liver surgery such as organ transplantation, trauma and liver resection. Therapeutic strategies against IRI have been developed during the last 60 years and great advance into the mechanisms responsible of injuries have been achieved. However, efficient therapy against IRI is still lacking and few clinical studies in phase III have proven their effectiveness. This could be due in part to the complexity of the mechanisms responsible of IRI and to the specific drugs activity and their potential adverse effects. Polyethylene glycols (PEGs) are water soluble nontoxic polymers that have been employed in many biomedical applications such as gastrointestinal disorders and drugs pegylation. Besides its usefulness as oncotic agents in preservation solutions, it has been shown that PEGs molecules protect against cold injury and ischemic damage. In contrast to the current pharmacological strategies used against IRI, PEG presents the advantages of being a multi-target strategy. In fact, IRI is a multifactorial disease including oxidative stress, inflammation, endoplasmic reticulum stress, mitochondrial damage, and cytoskeleton alterations which lead to cell death and organ dysfunction. PEG has been associated with the majority of these events as it has been shown that PEG reduces reactive oxygen species, prevents cell death, maintains mitochondrial integrity, and reduces inflammation and endoplasmic reticulum stress. From this perspective, it is reasonable to expect that PEG administration may be an effective therapeutic strategy against liver IRI. The aim of this thesis was to investigate the beneficial effects of PEG 35 in different models of IRI that mimic clinical situation of liver surgery. In the first study, we investigated the impact of the administration of intravenous PEG 35 before liver warm IRI. In the second one, we investigated whether intravenously administrated PEG 35 could protect against cold IRI in steatotic rat livers. Finally, we developed a new washout solution containing PEG 35 to prevent reperfusion injury after prolonged cold preservation. The results of the present thesis demonstrated that: - Intravenous administration of PEG 35 at 10 mg/kg protects the liver in an experimental model of warm IRI in rats. The protective mechanisms are associated with the activation of the pro survival pathways Akt and AMPK and the inhibition of apoptosis. PEG 35 also protects the hepatocyte morphology by increasing F/G-actin ratio and activating p-p38. - Intravenous administration of PEG 35 at 10 mg/kg protects steatotic livers in an experimental model of cold IRI in obese rats. The protective effects of PEG 35 are mediated by the preservation of mitochondrial status, the stabilisation of the cytoskeleton and the regulation of the cytoprotective AMPK and Akt signalling pathways. - Liver graft washout with a PEG 35-containing rinse solution increases the protection against IRI in a model of isolated perfused rat liver. .Protection was due to the inhibition of metalloproteinases, the activation of cytoprotective AMPK and eNOS signalling pathways and the preservation of cytoskeleton integrity. / La lesión por isquemia reperfusión (I/R) es un proceso complejo que tiene lugar cuando un órgano se ve privado del aporte sanguíneo (isquemia) y se manifiesta de forma predominante después del posterior restablecimiento del flujo sanguíneo (reperfusión). Existen numerosas situaciones en la práctica clínica en las que el hígado se ve sometido a una situación de I/R, entre ellas, la resección hepática y el trasplante hepático. Los polietilenglicoles (PEGs) son polímeros solubles en agua, no tóxicos y con diferentes pesos moleculares. Algunos de ellos, con un peso molecular de 20 kDa (PEG 20) y de 35 kDa (PEG 35) forman parte de la composición de soluciones de preservación de órganos (SCOT e IGL-1). Además, en varios modelos experimentales de in vivo e in vitro se ha reportado que varios PEGs ejercen efectos beneficiosos. Atendiendo a lo anteriormente expuesto, la utilización de PEGs puede constituir una excelente herramienta para prevenir el daño hepático por I/R. El objetivo de esta tesis es investigar los efectos beneficiosos del PEG 35 en diferentes modelos de lesión por I/R, que imitan una cirugía hepática. Nuestros resultados demuestran que: - EL PEG 35 administrado por vía intravenosa protege eficientemente el hígado de ratas contra la I/R caliente. Los mecanismos de protección están asociados con la activación de la supervivencia vía Akt y AMPK y la inhibición de la apoptosis. El PEG 35 también protege la morfología de los hepatocitos mediante el aumento de la F/G-actina y la activación de p-p38. - La administración intravenosa de PEG 35 protege los hígados esteatósicos en un modelo de I/R fría en ratas obesas. Los efectos protectores de PEG 35 están mediados por la preservación del estado mitocondrial, la estabilización del citoesqueleto y la regulación de las vías de señalización citoprotectoras AMPK y AKT. - La adición de PEG 35 a una nueva solucione de lavado aumenta la protección contra la lesión por I/R en un modelo de hígado de rata aislado y perfundido a través de la inhibición de las metaloproteinasas, la activación de vías de señalización citoprotectoras AMPK y eNOS y la preservación de la integridad del citoesqueleto.

La modalidad de trabajo a gran altitud en Chile denominada hipobaria intermitente crónica a gran altitud abarca tanto la explotación de la gran minería, como la actividad de los grandes centros astronómicos, puestos fronterizos y centros recreativos en la zona norte del país. La gran expansión del trabajo en hipobaria intermitente crónica en las últimas décadas, ha provocado que alrededor de 170.000 personas trabajen en ésta modalidad, la mayoría directamente en las faenas y el resto vinculado a las actividades relacionadas al encadenamiento productivo de éste rubro; con un incremento potencial de la masa laboral hacia el 2020 debido a nuevas inversiones tanto en ésta área como en el de la astronomía. Los estudios realizados hasta hoy establecen que en cada nuevo ascenso a gran altitud por razones laborales persisten las alteraciones del sueño, la sintomatología de mal agudo de montaña, el aumento de la presión arterial sistémica, de la presión arterial pulmonar y deterioro de la capacidad cognitiva y física, independiente del nº de años que las personas lleven en esta modalidad de trabajo o que haya ocurrido algún grado de aclimatación ventilatoria o hematológica. En esta tesis doctoral hemos tratado de determinar la efectividad y viabilidad de algunas medidas preventivas dirigidas a prevenir, mejorar o mitigar los desajustes fisiopatológicos inducidos por la exposición intermitente crónica en trabajadores de gran altitud. Se ha escogido el caso de la construcción y puesta en marcha del observatorio ALMA en el llano de Chajnantor (Norte de Chile) por sus peculiares condiciones de trabajo: la instalación de las antenas de radiofrecuencia a una altitud muy cercana a la altitud extrema en el llano de Chajnantor a 5050 msnm y a la gran diferencia de altitud entre el trayecto del campamento base (2900m) y el sitio de las antenas (5050m), lo que obliga a transiciones rápidas de trayecto entre estas dos diferentes altitudes, desplazamiento en función de demandas que no siempre se ajustan a los tiempos de progresión del ascenso/descenso recomendados tradicionalmente para evitar los efectos agudos de la hipoxia hipobárica, constituyéndose en una oportunidad natural de investigar precisamente esta fase de la exposición laboral a altitud que no ha respondido a la aclimatación. Nuestros hallazgos y conclusiones permiten establecer ciertas premisas en este tipo de trabajos. El uso de oxígeno suplementario portátil para el trabajo a campo abierto, incluso a bajo flujo y según sea requerido por el trabajador, ha sido una medida eficaz, económica y segura para garantizar un desempeño laboral más saludable y que permite mejorar el desempeño a gran altitud. Los desplazamientos continuos de los conductores de vehículos e incluso de quienes viajan como pasajeros en vehículos de los vehículos de transporte, sufren ciclos de hipoxia/re-oxigenación que pueden desencadenar eventos arrítmicos y que hemos comprobado que ocurren con mayor frecuencia durante la etapa de descenso desde la mayor altitud y con una mayor incidencia entre los trabajadores más jóvenes. El tiempo de permanencia a 5050 msnm se asoció positivamente a la ocurrencia de eventos arrítmicos; de tal manera que una medida preventiva derivada de lo anterior es limitar el tiempo de permanencia a gran altitud, medida que ha sido implementada para todos los visitantes al sitio. Finalmente el uso de luz azul podría mantener un mayor estado de alerta y corregir algunos de los indicadores de fatiga cognitiva en condiciones de hipoxia hipobárica y a futuro podría ser una medida de mitigación de la somnolencia y la fatiga especialmente para conductores en horario nocturno. / In this thesis dissertation, we have tried to determine the effectiveness and viability of some preventive measures to avoid or ameliorate the pathological disturbances induced by chronic intermittent exposure at high altitude workers. We have chosen the case of the construction and commissioning of ALMA on the Chajnantor plateau (North of Chile) for their particular conditions. 1) The wide altitude difference between two well-defined areas of work: base camp (2900m) and antenna array site (5050m), 2) The rapid work shifts according to technical demands, which do not always fit in the ascent times traditionally considered as secure by mountain and expedition medicine, and 3) The large number of workers involved in this project. Our findings and conclusions allow establishing certain assumptions in this type of work. The use of supplemental oxygen, even in small quantities, as required by the worker is an efficient, economical and safe measure. The continuous movement of vehicle drivers between the different altitude places can trigger arrhythmic events, which are more frequent in younger workers. The use of blue light could maintain a better alertness and improve the indicators of cognitive and physical fatigue in high workplaces, especially for nighttime workers. The blue light appears to have also differential effects between men and women.

Tesi realitzada conjuntament amb el Departament de Ciències Fisiològiques II / En la actualidad existe una gran evidencia científica sobre los múltiples beneficios que ofrecen la actividad física y el ejercicio físico en la promoción y mantenimiento de la salud. Los diferentes estudios han mostrado un abanico de resultados favorables en todas las poblaciones estudiadas. El correcto funcionamiento del endotelio vascular es de vital importancia en la salud cardiovascular y la incorporación de programas de ejercicio físico pueden representar un medio eficaz en la atención primaria y secundaria de la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares. Las células madre hematopoyéticas CD34+, se originan fundamentalmente en la médula ósea y son trasportadas en la sangre periférica, a su vez, contribuyen a la hematopoyesis y pueden ser activadas mediante la actividad física contribuyendo en la formación de nuevos vasos sanguíneos y en la regeneración en los casos de existir lesión. Por otro lado, las diferentes investigaciones no son muy claras sobre los efectos de los diferentes programas de ejercicio físico (aeróbico, fuerza y mixto) en las concentraciones de sangre periférica de células madre CD 34+, tampoco sobre los tiempos de mayor concentración sanguínea pos-esfuerzo. Así mismo, existe poca información sobre los efectos sobre la presión arterial en reposo, en ejercicio submáximo y ejercicio máximo, después de los diferentes programas de ejercicio físico mencionados anteriormente. El objetivo principal ha sido examinar los efectos fisiológicos producidos en el organismo después de realizar diversas actividades y/o programas de ejercicio físico específico (aeróbico, de fuerza o mixto). En conclusión, la realización de una única actividad física aeróbica de muy larga duración produce aumentos en la concentración sanguínea de células madre hematopoyéticas CD34+ circulantes a los 5 días post-esfuerzo. La realización de 3 diferentes programas de ejercicio físico de 6 semanas de duración (aeróbico, fuerza o mixto) no produjo cambios significativos en la concentración sanguínea de células madre hematopoyéticas CD34+. Dado que se detectó una relación inversa entre los cambios observados en la concentración sanguínea de las células madre hematopoyéticas CD34+ y los valores de las mismas al inicio del estudio, deberán tenerse en cuenta los valores basales y su variabilidad siempre que se deban evaluar los cambios observados tras un estímulo de cualquier naturaleza. La realización de un programa de ejercicio físico aeróbico de 6 semanas de duración aumenta la potencia máxima y el VO2máx con respecto a los valores obtenidos inicialmente. La ejecución de un programa de entrenamiento mixto de 6 semanas produce mayor disminución de la presión arterial en reposo que el obtenido solo con ejercicio aeróbico o de fuerza. La presión arterial durante un ejercicio submáximo y máximo disminuye tras un programa de 6 semanas de duración ya sea de tipo aeróbico, de fuerza o mixto, manteniéndose el descenso de dichos valores tras 3 semanas de desentrenamiento. / In the actuality there is great scientific evidence about the multiple benefits offered by physical activity and exercise in promoting and maintaining health. The correct functioning of the vascular endothelium is vital for cardiovascular health, incorporating physical exercise programs is important in primary and secondary care of atherosclerosis and cardiovascular disease. The circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells are bone marrow-derived cells that are mobilized into the circulation and incorporated at sites of injury where they are believed to participate in vascular repair through re-endothelization, but there are contradictory results regarding the increased levels and schedule of the cells after exercise. The circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells levels in the days following a long-distance walking exercise have not been studied, neither after 3 different types of training programs: aerobic, resistance, and a combination of both. Also, it is important to know changes in blood pressure during submaximal and maximal exercise after physical training period. This study has provided initial evidence of important medium-term changes in the circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells levels following to single session in long endurance exercise, on the other hand, no changes in the circulating CD34+ hematopoietic progenitor cells were detected after training programs: aerobic, resistance, and a combination of both. Moreover, it found clear differences in blood pressure changes among the three training groups, with exercise programmes clearly able to decrease the blood pressure during a submaximal and maximal exercise. These results indicate than we can no longer only consider how blood pressure is affected by exercise in general, but that we must also consider the effects of different training programmes on blood pressure.

El sildenafil ha demostrado reducir eficazmente el aumento de la presión de la arteria pulmonar provocada por la vasoconstricción pulmonar hipóxica. Sin embargo, su papel como un posible factor que podría aumentar el rendimiento en el ejercicio en condiciones de hipoxia queda por demostrar. Paradójicamente, el uso de sildenafil ha aumentado entre los montañeros no como un fármaco preventivo del edema pulmonar de gran altitud, sino como un medio que podría ayudar a mejorar el rendimiento deportivo. Varios estudios han tratado de abordar este tema con resultados contradictorios. Actualmente, los datos no son concluyentes en altitud simulada o real, y con la clara evidencia de que en normoxia sildenafil no mejora el rendimiento, se está utilizando esta droga (y, a veces en exceso) por personas que suben a altas cumbres. La magnitud de estos efectos parece estar determinada por la gravedad de la hipoxemia e hipoxia y de la susceptibilidad individual a la vasoconstricción pulmonar hipóxica y la respuesta individual al efecto del fármaco. Otro de los temas de investigación sobre el sildenafil es la existencia de sujetos que no responden positivamente a efectos de la droga, por lo que significaría que existen diferencias individuales que afectarían a la respuesta al fármaco. Se realizó un estudio doble ciego cruzado durante cuatro semanas consecutivas, los sujetos fueron sometidos a pruebas a nivel del mar en dos días (un día para el placebo y el otro para el sildenafil), y a una altura simulada de 4000 metros en una cámara hipobárica para determinar los efectos de sildenafil en los parámetros cardiovasculares respiratorios y metabólicos en normoxia y durante la exposición aguda a la hipoxia hipobárica durante pruebas de ejercicio máximo y submáximo. Una hora antes de la prueba, se administró sildenafil (100 mg) o placebo oralmente a 11 voluntarios. En hipoxia no se encontraron mejoras importantes entre el placebo y sildenafil en ningún parámetro ni hubo una mejora en el rendimiento. Tampoco se encontraron diferencias entre hombres y mujeres con la administración del sildenafil. El análisis estadístico permitió reconocer dos grupos de sujetos dependiendo de la respuesta al sildenafil en la hipoxia, usando el volumen sistólico y gasto cardíaco como factores similares. Respondedores podrían tener una respuesta la vasoconstricción pulmonar hipóxica exagerada, por lo tanto, los efectos de sildenafil sería significativo, pero sólo en términos absolutos, ya que no mostraron una mejoría significativa en comparación con el grupo de no-respuesta. Con base en los resultados de las investigaciones, parece poco probable que el sildenafil puede ejercer efectos beneficiosos en la entrega de oxígeno durante la práctica de ejercicio en altitudes inferiores a 4.000 m Teniendo en cuenta que, a excepción de los escaladores, ningún otro deporte se practica en esta altitud, el uso de sildenafil para una ayuda ergogénica parece no tener efectos beneficiosos. Por el contrario, los posibles efectos adversos pueden ser causados por este medicamento, tales como dolores de cabeza o hipotensión. Más información acerca de los efectos del sildenafil u otros medicamentos que inhiben PDE5 en altitud todavía tienen que aclararse: dosis del medicamento, grado de aclimatación de los sujetos y la intensidad del ejercicio que se debe llevar a cabo para evaluar los efectos beneficiosos reales sobre la capacidad física durante la exposición hipoxia aguda de estos inhibidores de la PDE5.

Cancer immunotherapy represents a treatment strategy which is being clinically tested to complement surgery, radiotherapy and chemotherapy – the current cornerstones of our fight against cancer. It has become clear now, that tumors not only escape immune recognition but also actively suppress antitumor immune responses. In order to improve cancer immunotherapy, effective manipulation of the immune system to break self-tolerance need to be designed and approaches that counteract immunosuppressive mechanisms need to be developed. The tumor microenvironment encompasses a wide variety of immune cells, which macrophages comprise the most dominant portion of them and thus are the major players in the connection between inflammation and cancer. These tumor-associated macrophages (TAMs) are derived from blood monocyte precursors and subsequently acquire distinct characteristics as a result of tumor micro-environmental cues. Monocytes are a heterogeneous population in the blood with an enormous plasticity whose fate and functions are dictated by the microenvironment. Therefore, the roles of specific Monocytes subsets in tumor progression and the molecular mechanisms for their impacts need to be elucidated. Ly6Chigh and Ly6Clow are two main different types of murine monocytes subsets that have been defined by distinct phenotypes and immunoregulatory functions. Recent data demonstrates that Ly6Chigh monocytes can recruit to inflammation loci while Ly6Clow monocytes are patrolling cells. We have developed a method to produce large number of Ly6Chigh monocytes in vitro. In our study we observed that, injection of these cells affects tumor progression in breast cancer and C26 colon carcinoma. Activation of Ly6Clow monocytes by pro- or anti-inflammatory cytokines, results in a genetic expression profile, corresponding to pro- or anti-inflammatory genes, respectively. Injection of pre- activated Ly6Clow monocytes toward pro- or anti-inflammatory polarization in C26 colon carcinoma showed that anti-inflammatory activated monocytes are more beneficial in delaying cancer cachexia. Increased knowledge of monocytes improves the chances to find therapies against a broad spectrum of diseases including cancer, where monocytes have opposing roles of either being beneficial or detrimental to the host. Using C26 cancer model we were interested to study the impact of activation of Ly6Chigh monocytes toward pro or anti-inflammatory phenotype on the progression of cancer. We conducted the C26 cancer model injecting Ly6Chigh monocytes treated with IL-4 or INF-. before injection. Among the groups of treatment, Ly6Chigh monocytes activated with IL-4 were the most beneficial on cancer progression, since they had the highest survival rate and the least tumor volume rise among all groups. Since the whole cachectic muscles are inflamed and injured in C26-bearing mice and activated Ly6Chigh monocytes injected in this cancer model apart from recruiting to tumor site have played substantial role by affecting cachectic muscle repair. In summary, we defined a new regulatory role of recruiting Ly6Chigh monocytes in cancer, which might be clinically relevant in developing novel immunotherapeutic strategies. Although, underlying mechanism by which Ly6Chigh monocytes influences the tumor progression have yet to be established and it requires further studies to characterize the phenotype of these cells after recruitment in cancer. So far, since the inflammatory genes involved in tumor progression were differently regulated in tumors infiltrated with Ly6Chigh monocytes, our hypothesis is that the recruitment of Ly6Chigh monocytes, alter the balance of pro-inflammatory/anti-inflammatory pool of macrophages in the cancer and this is the main reason why modulation impacts occur in this study. While pro-inflammatory macrophages will be able to induce wound hilling and revascularization, the anti-inflammatory macrophages will block the tumor growth through the production of fibrosis.

Aicardi-Goutières Syndrome (AGS) is a rare encephalopathy which mimics a viral intrauterine infection and is characterized by calcifications of the basal ganglia, cerebral atrophy and IFN-a in the cerebrospinal fluid. AGS is a heterogenic disease associated with mutations in the gene of the exonuclease TREX1, in any of the genes codifying for the ribonuclease H2, in the phosphohydrolase SAMHD1, in the deaminase ADAR1 or in the cytoplasmic sensor MDA5. The knowledge of these functions is basic for the comprehension of the beginning of the pathogenesis of AGS. In this thesis we focused in the mechanism of Samhd1 transcription. We have seen that Samhd1 is induced by pro-inflammatory stimuli but neither by anti-inflammatory stimuli nor TNF-a, and that the induction of Samhd1 is through STAT1 pathway. We wanted to know a bit more about Samhd1 induction so we focused on the study of its promoter. We did a construct in a luciferase-reporter vector with 1500bp of Samhd1 promoter, and we saw that this region of the promoter is enough to induce luciferase expression. From this construct, we did new plasmids and when deleting a specific region, the luciferase expression was abolished, indicating that in Samhd1 promoter, 161bp are critical for Samhd1 induction. EMSA assays showed that Samhd1 expression is repressed in basal conditions by an unknown protein, and ChIP assays also showed that IRF1 is involved in Samhd1 induction by IFN-.. We hypothesized that the regulation mechanism is depending in an STAT1-depending pathway, through IRF1, and also in an STAT1-independing pathway, through an unknown mechanism up to date. We checked with proteomics analysis the protein which might be involved in Samhd1 repression but the results were not significant. We also constructed a conditional KO mouse for TREX1, and now we are crossing it with different CRE­Socs2 expressing strands. Homozygous KO expressing CRElitter, show a similar phenotype to TREX1 total KO. We are in the process to obtain homozygous KO expressing CRELysM, but due to problems with the penetrance of this CRE allele we have some difficulties. All together, the results of this thesis will shed light in the inner operation of AGS. / La síndrome d'Aicardi-Goutières (AGS), és una malaltia autoimmunitària recessiva que mimetitza una infecció vírica intrauterina, i la qual és caracteritzada per calcificacions intracranials, atròfia cerebral i augment d'IFN-alfa al líquid cefaloraquidi. L'AGS és una malaltia genètica heterogènia associada amb mutacions al gen que codifica per a l'exonucleasa TREX1, a qualsevol dels gens codificants per a les components de la ribonucleasa RNASE H2, a la fosfo­hidrolasa SAMHD1, a la deaminasa ADAR1 o al sensor citoplasmàtic MDA5. El coneixement d'aquestes funcions és fonamental per tal d'entendre la patogènesi de l'AGS. En aquesta tesi s'ha aprofundit en el coneixement del mecanisme regulador de la transcripció de Samhd1. Hem vist que Samhd1 es troba expressat en diferents òrgans sense necessitat de cap estímul previ, com el pàncrees, l’intestí prim i els macròfags derivats de moll d’os, i en diferents quantitats en altres òrgans de ratolí. Donada la important afectació que té l’AGS al cervell, també es va analitzar la seva expressió en neurones i cèl·lules de la micròglia. També hem vist que Samhd1 es troba induït en presència de citocines proinflamatòries, però no es troba afectada la seva expressió en presència de citocines antiinflamatòries així com tampoc en presència de TNF-gamma. Utilitzant macròfags derivats de ratolins deficients en STAT1, hem pogut demostrar que l’expressió de Samhd1 per IFN-alfa és a través d’STAT1, ja que la seva expressió es troba completament reprimida en aquestes cèl·lules. Ens vam centrar en la inducció de Samhd1 i per la seva comprensió vam focalitzar en l’estudi del seu promotor. Es van clonar 1500 parells de bases del promotor de Samhd1 en un plasmidi reporter de luciferasa, i es va veure que aquest fragment era suficient per induir l’expressió de luciferasa. A partir d’aquest constructe, es van realitzar llavors noves construccions delecionant cada vegada una regió del promotor. Es va veure que en delecionar una regió específica de 161pb, l’expressió de luciferasa es trobava completament reprimida, indicant que aquesta regió del promotor és crítica per a la inducció de Samhd1. Experiments de retard en gel (EMSA) van mostrar que Samhd1 es troba reprimit en condicions basals per una proteïna que no hem arribat a caracteritzar, i experiments de precipitació de cromatina (ChIP) van mostrar que IRF1 es troba involucrada en la inducció de Samhd1 per IFN-alfa. La nostra hipòtesi doncs, és que l’expressió de Samhd1 té un mecanisme de regulació doble: en condicions basals es troba reprimit i en presència d’IFN-alfa s’indueix una via de senyalització independent d’STAT1 que fa saltar el complex repressor del promotor, i també s’indueix una via de senyalització dependent d’STAT1, que indueix l’expressió d’IRF1 i que activa la transducció de Samhd1. Fins ara no hem caracteritzat la proteïna o complex de proteïnes que reprimeix l’expressió de Samhd1 en condicions basals, però s’està investigant mitjançant anàlisis proteòmics. En aquesta tesi també s’ha fet la construcció d’un ratolí KO condicional per a TREX1. Una vegada aconseguit aquest animal condicional, el qual conté el gen de Trex1 flanquejat per dues dianes LoxP, aquest s’està encreuant amb diferents soques que expressen CRE sota regulació de diferents Socs2 promotors. Els ratolins homozigots KO i que expressen CRE, tenen un fenotip similar al fenotip que mostren els ratolins KO totals de TREX1. Estem en el procés d’obtenció de ratolins homozigots KO i que expressen CRELysM però, donat a problemes amb la penetrància d’aquest al·lel, hem tingut algunes dificultats. Els resultats d’aquesta tesi en conjunt poden ajudar a entendre una mica més el funcionament de l'AGS.