The extracellular matrix (ECM) hinders diffusion in both tissues and hydrogels used in 3D cultures. However, how geometric and non-geometric ECM properties contribute to diffusion hindrance remains poorly understood. To address this question, the effective diffusivity D of FITC-dextrans with molecular weight (Mr, 4-70 kDa) spanning the physiological range of signaling factors was measured in a panel of acellular ECM gels with an optical macroscopic assay. Gels included reconstituted basement membrane/Matrigel, fibrin and type I collagen, and exhibited an average pore size much larger than any dextran size. Unexpectedly, a decay of D with Mr following a power-law with an exponent that matched that predicted by the Stokes-Einstein law in all gels (D ~ Mr-1/3, r2=0.99) was observed, revealing that hindered diffusion is dominated by nongeometric viscous factors. This law predicted that Matrigel and fibrin exhibited similar viscosities, which was confirmed with microrheology measurements by atomic force microscopy. Moreover, gels with the lowest D exhibited diffusion hindrance comparable to the extreme physiologic hindrance of brain tissue, which has a typical pore size much smaller than ECM gels. In contrast, diffusion hindrance in sparse (</=1 mg/ml) gels was very weak and below any reported tissue diffusivity data. These observations reveal a major role for the enhanced viscosity of the extracellular space in regulating the passive transport in both 3D culture and tissues, and indicate that dense ECM gels (>/=3 mg/ml) are suitable tissue surrogates in terms of macromolecular diffusion. Additionally, it is unknown to what extent current 3D culture protocols provide physiologic oxygen tension conditions. To address this limitation, oxygen tension was measured within the acellular or cellularized ECM gels with A549 cells, and analyzed in terms of oxygen diffusion and consumption. Oxygen diffusivity in acellular gels was up to 40% smaller than that of water, and the lower values were observed in the denser gels. In 3D cultures, physiologic oxygen tension was achieved after 2 days in dense (>/=3 mg/ml) but not sparse gels, revealing that the latter gels are not suitable tissue surrogates in terms of oxygen distribution. In dense gels, a dominant effect of ECM composition over density in oxygen consumption as observed. All diffusion and consumption data were used in a simple model to estimate ranges for gel thickness, seeding density and time-window that may support physiologic oxygen tension. Thus, critical variables for oxygen tension in ECM gels were identified, and a model to assess initial values of these variables was introduced, which may short-cut the optimization step of 3D culture studies. / Tradicionalmente, las células han sido cultivadas en placas Petri en un entorno bidimensional por más de un siglo. Sin embargo, las células de un organismo vivo tienen un entorno tridimensional. Todas las células del tejido se unen a una matriz extracelular (ECM). Además, la difusión y la vinculación de muchas proteínas tales como factores de crecimiento, está regulada por la matriz 3D. El reconocimiento del importante papel regulador de la ECM in vivo ha extendido los usos de los cultivos en 3D basados en el crecimiento de las células dentro de geles con componentes nativos de ECM . El objetivo general de esta tesis fue estudiar las características de los cultivos celulares tridimensionales de matriz extracelular más comunes en términos de difusión. Los resultados ilustran que la relación de Stokes-Einstein derivada para fluidos newtonianos puede extenderse a la compleja estructura enmarañada de geles de ECM para partículas esféricas mucho más pequeñas que el tamaño de poro medio de la ECM. Además, el impedimento a la difusión (tortuosidad) en geles de ECM está dominada por factores no-geométricos hidrodinámicos (es decir, viscosidad ECS) en lugar de las propiedades geométricas (estérica) del gel tal y como se asume en la literatura. Los cultivos en 3D basados en geles densos (3 mg/ml) son sustitutos adecuados de los tejidos en términos de difusión y son incluso capaces de reproducir la tortuosidad fisiológica extrema del tejido cerebral. Estos resultados apoyan que la ECM es un importante aporte a la tortuosidad del tejido, particularmente en grandes densidades de ECM y se destaca la importancia de utilizar los portadores con baja RH en la entrega de fármacos. Se han proporcionado las primeras mediciones del consumo de oxígeno en células A549 en cultivos 3D, las cuales han revelado un efecto dominante de la composición de ECM sobre la densidad en el consumo de oxígeno. Las predicciones de modelos pueden ser útiles como puntos de partida para el grosor y la densidad celular inicial en los estudios de cultivos 3D, reduciendo así la optimización inicial. Muchos de los efectos no deseados de difusión pueden ser superados mediante simples modificaciones experimentales como el espesor del gel o la densidad de siembra inicial.

Los tensioactivos son compuestos altamente versátiles con amplia utilización en la industria farmacéutica y cosmética. Aquellos derivados de aminoácidos presentan una baja toxicidad y elevada biodegradabilidad y, por lo tanto, tienen un abanico más amplio de aplicaciones y constituyen una alternativa a los tensioactivos sintéticos convencionales. En los últimos años, existe un interés creciente en la utilización de excipientes bioactivos con actividad lítica pHsensible en sistemas nanoestructurados, con el fin de aumentar la especificidad y eficacia de dichos vehículos para la liberación de fármacos en órganos o células dianas. En este trabajo se ha planteado estudiar dos grupos de tensioactivos derivados de lisina: tensioactivos aniónicos de doble cadena derivados de la N(α,)N(ε)-dioctanoil lisina y tensioactivos catiónicos de cadena simple derivados de la N(ε)-acil lisina o N(α)-acil lisina. En primer lugar, se ha procedido con el estudio de las propiedades de interacción de estos tensioactivos con membranas celulares en función del pH del medio, utilizando el eritrocito como modelo de membrana endosomal. Se ha demostrado que los tensioactivos aniónicos tienen actividad lítica pHdependiente independiente del contraión, mientras que las propiedades de los tensioactivos catiónicos dependen especialmente de la posición de la carga catiónica y, en menor medida, de la longitud de cadena alquílica. La actividad pH-sensible se atribuye a la presencia de la carga positiva en el grupo α-amino de la lisina, mientras que el aumento de la fluidez de la membrana y la pérdida de sus proteínas estructurales se han evidenciado como los mecanismos involucrados en el aumento de la lisis celular a pH ácidos. Una vez corroborado el potencial lítico pH-dependiente de los tensioactivos, se ha avanzado en el desarrollo, caracterización y estudio toxicológico de sistemas nanoestructurados conteniendo estos compuestos. En primer lugar, se han desarrollado nanovesículas lipídicas con los tensioactivos catiónicos y se ha procedido con el estudio de sus efectos tóxicos en células representativas de la piel, como propuesta de su potencial aplicación en formulaciones de administración tópica. Se han observado efectos citotóxicos moderados, respuesta inflamatoria leve y ausencia de fototoxicidad. A continuación, se han llevado a cabo estudios de los mecanismos involucrados en la toxicidad de las nanovesículas, además de la evaluación de su capacidad de internalización celular. Se ha propuesto que el estrés oxidativo, la disfunción mitocondrial y la apoptosis son los principales mecanismos involucrados en la toxicidad. Por otra parte, los estudios de internalización celular y estabilidad endosomal han mostrado la capacidad de las nanovesículas que contienen los tensioactivos con carga positiva en el grupo α-amino de la lisina para romper la membrana de los endosomas, lo que corrobora su actividad pH-dependiente. Por último, se han desarrollado nanopartículas poliméricas incluyendo el tensioactivo aniónico 77KL como excipiente pH-sensible. Se ha encapsulado el fármaco antitumoral metotrexato y se ha demostrado su mayor actividad en inhibir la proliferación de las células tumorales en comparación con el fármaco libre no encapsulado. Este hecho se atribuye, especialmente, a la actividad pH-dependiente de las nanopartículas. Tras la internalización y liberación específica del fármaco a nivel intracelular, la inhibición del ciclo celular, la apoptosis y, en menor medida, el daño mitocondrial y lisosomal, se han demostrado como los mecanismos involucrados en la actividad antitumoral del metotrexato encapsulado en las nanopartículas. En conclusión, es importante destacar que el desarrollo de vehículos con actividad pHdependiente es una propuesta interesante para mejorar la liberación intracelular de fármacos y para aumentar sus efectos terapéuticos. Por lo tanto, se considera que los tensioactivos derivados de lisina estudiados en esta Tesis son potenciales excipientes bioactivos en formulaciones nanoestructuradas. Del mismo modo, los métodos in vitro utilizados se mostraron eficaces en demostrar los mecanismos involucrados en los efectos tóxicos de los nanomateriales. / Surfactants are among the most versatile and widely applied excipients in cosmetics and pharmaceuticals. Amino acid-based surfactants, which have this versatility together with biocompatibility, low toxicity and pH-responsive membrane-disruptive activity, could be potential bioactive excipients in intracellular drug delivery systems. In this line, five anionic and three cationic lysine-based surfactants were studied concerning their pH-dependent properties using the erythrocyte as a model of endosomal membrane. All the anionic surfactants showed pH-sensitive activity independently on the counterion, whereas among the cationic amphiphiles, only those with the positive charge on the α-amino group of lysine displayed membrane-lytic activity dependent on the pH. Thereafter, these amphiphiles were applied in the development of pH-sensitive nanocarriers. The cationic surfactants were included in lipid-based nanovesicles, while the anionic compound 77KL was used for the preparation of methotrexate-loaded chitosan nanoparticles. It was assessed whether the cationic compounds increase the likelihood of intracellular delivery and modulate the toxicity of the nanovesicles, as a proposal for their potencial intravenous application. Due to increasing concern over animal use, in vitro alternative methods were used for all studies. The induction of mitochondrial dysfunction, oxidative stress and apoptosis were the general mechanisms underlying cytotoxicity. Fluorescence microscopy analysis demonstrated that nanovesicles were internalized by cells, and evidenced that their ability to release endocytosed materials into cell cytoplasm depends on the structural parameters of amphiphiles. Moreover, the cytotoxicity of nanovesicles was evaluated using representative skin cell lines, and the wide range of in vitro assays proved the applicability of these nanocarriers for topical administration. On the other hand, the pH-sensitive behavior of nanoparticles containing 77KL allowed accelerated release of methotrexate in an acidic medium, as well as membrane-lytic pH-dependent activity, which facilitated the cytosolic delivery of endocytosed materials. Besides, our results clearly proved that the drug encapsulated into the nanoparticles were more active against the tumor cells than the free drug. Altogether, these studies showed that the design of nanocarriers containing pHsensitive surfactants as bioactive excipients for endosome disruption is a promise approach for intracellular drug delivery and increased therapeutic effects. Furthermore, the insights into some toxicity mechanisms of these new nanomaterials contribute to reducing the uncertainty surrounding their potential health hazards.

Estudios previos demostraron que la disminución de la liberación del ácido araquidónico (AA) bloqueaba la proliferación de los fibroblastos 3T6 inducida por suero fetal. Además, la inhibición de las ciclooxigenasas (COXs) producía una reducción parcial de la proliferación celular, mientras que los antagonistas receptoriales de la prostaglandina (PG) E2 bloqueaban casi completamente el crecimiento de los fibroblastos 3T6. Estos resultados sugirieron la implicación de los metabolitos del AA producidos a través de otras vías como la de las lipoxigenasas (LOXs), que produce leucotrienos (LTs) y ácidos hidroxiecosatetraenoicos (HETEs), o la de los citocromos P-450 (CYPs), que forma HETEs y ácidos epoxieicosatrienoicos (EETs). El objetivo de nuestro trabajo fue estudiar la implicación de estas vías sobre el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6. Nuestros resultados han sugerido que el suero induce la síntesis de PGE2 y 12(S)-HETE en los fibroblastos 3T6, mientras que los niveles de LTB4 son muy bajos y se encuentran en el límite de detección. Por otro lado, los inhibidores específicos de la 5-LOX (zileuton) y de la 12/15-LOXs (baicaleína), y los antagonistas de los receptores de los LTs (U-75302, REV-5901, LY-171883) no inhibieron de forma significativa el crecimiento de los fibroblastos 3T6 ni la incorporación de timidina. Sin embargo, en los macrófagos RAW 264.7, estos mismos tratamientos fueron capaces de inhibir la proliferación celular y la incorporación de timidina, y el zileuton produjo un retraso en el ciclo celular, sin inducir citotoxicidad o apoptosis. Estos resultados sugieren la implicación de la 5-LOX y los receptores de los LTs en el control de la proliferación de los macrófagos RAW 264.7. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que la adición exógena de LTB4 o LTD4, en ausencia de suero, induce un incremento del crecimiento y de la incorporación de timidina en los macrófagos RAW 264.7, y este efecto está mediado por la activación de las vías MAPK y PI3K/Akt. El EPA compite con el AA para ser metabolizado por la COX-2, formando PGE3, y por la 5-LOX, dando lugar al LTB5. Nuestros resultados demuestran que la PGE3 y el LTB5 estimulaban la proliferación de los macrófagos con una potencia similar a la de la PGE2 y LTB4. Dado que la vía de las LOXs no parecía implicada en el control de la proliferación de los fibroblastos 3T6, se centró nuestro interés en estudiar los metabolitos del AA producidos por los CYPs. Nuestros resultados demostraron que inhibidores de los CYPs como el SKF-525A, 17-ODYA, ABT o PPOH inhibieron la síntesis de 12(S)-HETE, el crecimiento celular y la síntesis de DNA. Además, el 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE y 20-HETE revertieron la inhibición del crecimiento celular inducida por el SKF-525A, mientras que el 11,12-EET no lo hizo. Además, nuestros resultados mostraron que en ausencia de factores de crecimiento, el 5-HETE, 12(S)-HETE y 15(S)-HETE inducen el crecimiento de los fibroblastos 3T6 y la síntesis de DNA, y en este efecto estaba implicada la activación de la vía PI3K/Akt. Por otro lado, la adición exógena de 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE o 11,12-DHETE inhibió la proliferación de los fibroblastos 3T6 y la incorporación de timidina inducida por PDGF. Además, sugerimos que estos metabolitos son pro-apoptóticos ya que aumentan la externalización de la fosfatidilserina, la actividad caspasa total y la fragmentación de la cromatina nuclear. Finalmente, observamos que los EETs como el 11,12-EET y 14,15-EET aumentaron la actividad caspasa-3 y caspasa-12 en los fibroblastos 3T6. En resumen, la proliferación de los fibroblastos 3T6 estaría regulada por los metabolitos del AA producidos por la vía de las COXs y por la vía de los CYPs. En este último caso, están implicados los HETEs con efecto proliferativo, y los EETs, con efectos anti-proliferativo y pro-apoptótico. / Free arachidonic acid (AA) can be metabolized by three pathways: the cyclooxygenases (COXs), which produces prostaglandins (PGs) and thromboxanes; the lipoxygenases (LOXs), which forms leukotrienes (LTs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and lipoxins; and the cytochrome P450 monooxygenases (CYPs), which pruduces hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs) and epoxyeicosatrienoic acids (EETs). Finally, the cytosolic epoxide hydrolases catalyze a rapid enzymatic hydration of the EETs to dihydroxyeicosatetraenoic acids (DHETEs). Previous studies demonstrated the role of AA metabolites derived through cyclooxygenase pathway on 3T6 fibroblast growth. These results suggested the implication of other pathways such as LOX or CYP in this function. Therefore, the aim of this thesis was to study the role of AA metabolites derived through LOX or CYP activity on 3T6 fibroblast growth. Our results showed that LOX pathway is not important in the control of 3T6 fibroblast proliferation, while LOX inhibitors and LT receptor antagonists blocked RAW 264.7 macrophage growth. Moreover, in the absence of serum, LTB4 and LTD4 increased RAW 264.7 macrophage proliferation through MAPK and PI3K/Akt pathways activation. On the other hand, CYP inhibitors reduced cell growth, thymidine incorporation and 12(S)-HETE synthesis on 3T6 fibroblasts. Furthermore, 5-HETE, 12(S)-HETE, 15(S)-HETE and 20-HETE reverted the cell growth inhibition induced by the CYP inhibitor SKF-525A. In the absence of growth factors, 5-HETE, 12(S)-HETE and 15(S)-HETE increased cell growth and thymidine incorporation through PI3K/Akt pathway activation. However, exogenous addition of 5,6-EET, 8,9-EET, 11,12-EET, 14,15-EET, 5,6-DHETE or 11,12-DHETE inhibited 3T6 fibroblast growth and thymidine incorporation induced by PDGF. Moreover, these metabolites were pro-apoptotic increasing phosphatidylinositol externalization, total caspase activity and DNA fragmentation. Finally, we observed that EETs such as 11,12-EET and 14,15-EET increased caspase-3 and caspase-12 activity. In summary, 3T6 fibroblast growth is regulated by metabolites derived from AA-COX and AA-CYP, the last mentioned includes HETEs which have proliferative effect and EETs wich have anti-proliferative and pro-apoptotic effects.

El daño tisular secundario que se produce tras una lesión de la médula espinal contribuye de manera significativa a las pérdidas funcionales que se observan pacientes que padecen este tipo de afectación. Aunque la regeneración axonal y la sustitución de las neuronas dañadas tras el traumatismo medular son objetivos importantes para reparar estas lesiones, el desarrollo de estrategias experimentales que tengan como meta evitar el daño secundario sobre axones, neuronas, mielina y las células gliales, sea probablemente más factible de conseguir. La respuesta inflamatoria que se produce después de la lesión contribuye de manera significativa al daño secundario. Actualmente se conocen varios mecanismos encargados de promover el reclutamiento de leucocitos de la circulación periférica al tejido medular lesionado, y la activación de las células gliales endógenas. Sin embargo, las moléculas que desencadenan y modulan estas respuestas no se conocen con detalle. El ácido lisofosfatídico (LPA) es un potente mediador lipídico que activa y regula una gran variedad de respuestas celulares, tales como la homeostasis de calcio, la remodelación del citoesqueleto, la proliferación y supervivencia , la adhesión y migración, y la respuesta inflamatoria . El LPA ejerce todas estas funciones biológicas mediante la activación de 6 receptores acoplados a proteínas G, conocidos como LPARs (LPAR1-6). Estudios recientes ponen de manifiesto la implicación del LPA en el desarrollo de varias patologías, coma la arteriosclerosis, el cáncer y la fibrosis pulmonar, entre otros. Sin embargo, escasos estudios han evaluado hasta el momento si LPA está implicado en el transcurso de patologías que afectan sistema nervioso. Varias observaciones que proceden de cultivos celulares revelan que el LPA es capaz de activar las células microgliales y astrogliales, de inducir la muerte de neuronas, y promover la retracción axonal. Estudios realizados con animales de experimentación también muestran que el LPA está implicado en la etiología de la hidrocefalia fetal, y en el desarrollo de dolor neuropático tras la lesión del nervio ciático y tras isquemia cerebral. Sin embargo, se desconoce actualmente si el LPA participa de manera activa en la fisiopatología de la lesión medular. Durante los últimos 3 años hemos obtenido datos experimentales que demuestran que los niveles de LPA aumentan rápidamente en la médula espinal lesionada. También tenemos evidencias convincentes que sugieren que el aumento de los niveles de LPA que se produce en el parénquima medular tras una lesión por contusión desempeña un papel clave en la activación de una respuesta inflamatoria y en el desarrollo del daño secundario, y consecuentemente, en la aparición de déficits funcionales. En la presente tesis hemos elucidado qué receptores del LPA pertenecientes a la familia génica de diferenciación endotelial (LPA1-3) ejercen efectos nocivos en la lesión medular. Demostramos que los receptores LPA1 y LPA2 contribuyen a la generación del daño tisular tras la lesión medular y a la generación de déficits functionales, mientras que el receptor LPA3 ejerce efectos neutrales. Asimismo, describimos los mecanismos por los cuales los receptores LPA1 y LPA2 promueven daño neuronal y desmielinización. Dado que las principales compañías farmacéuticas están interesadas en el desarrollo de agonistas y antagonistas de los distintos receptores del LPA para el tratamiento de varias patologías de gran repercusión clínica, dicha estrategia tiene una gran posibilidad de traslación clínica. / Secondary tissue damage that occurs after spinal cord injury (SCI) contributes significantly to permanent functional disabilities. Although regeneration of damaged axons and replacement of lost neurons are important goals to repair the injured spinal cord, the secondary damage to axons, neurons, myelin and glial cells that follows the initial trauma is likely to be more easily amenable to treatment. Therefore, preventing or minimizing such secondary damage after SCI is expected to substantially reduce functional deficits. The inflammatory response that occurs after SCI strongly contributes to secondary injury. A number of mechanisms underlie the recruitment of leukocytes from the peripheral circulation, and the activation of these cells and endogenous microglia and astrocytes within the injured spinal cord. However, the molecules that trigger these responses are not completely known. Lysophosphatidic acid (LPA) is a potent, biologically active lipid mediator that regulates many physiological functions such as of cellular Ca2+ homeostasis, cytoskeleton remodeling, proliferation and survival, adhesion and migration and inflammation. LPA exerts all these functions by signaling via 6 G-protein coupled receptors known as LPARs (LPA1-6). Recent studies highlight the involvement of LPA in the development of many human diseases, such as atherosclerosis, cancer and pulmonary fibrosis. However, few studies have assessed so far whether LPA contributes to nervous system pathologies. Several in vitro observations reveal that LPA activates astrocytes and microglial cells, causes neuronal cell death, and promotes axonal retraction. In vivo studies also show that LPA is involved in the etiology of fetal hydrocephalus, as well as the development of neuropathic pain after sciatic nerve injury and cerebral ischemia. However, whether LPA is involved in the pathophysiology of SCI is still unknown. We currently have novel unpublished data demonstrating that LPA levels rapidly increased in the contused spinal cord. We have also clear evidences indicating that administration of LPA into the uninjured spinal cords triggers glial cell activation and demyelination, and leads to motor impairments. Altogether, our preliminary results strongly suggest that the increased levels of LPA that occurs after SCI may play an important role in triggering secondary damage and functional impairments. The present thesis aimed at assessing which of endothelial differentiation gene family LPA receptors (LPA1-3) exert such harmful effects in SCI. We found that LPA1 and LPA2 contribute to tissue damage and functional impairments after SCI, whereas LPA3 has a neutral effect.. Moreover, we reveal the mechanisms underlying neuronal cell death and demyelination triggered by LPA1 and LPA2. Since major pharmaceutical companies are interested in the development of LPA receptor agonists and antagonists for the treatment of several human diseases, such treatments have a high likelihood of progressing rapidly to the clinic.

Este trabajo identifica a HERC2 como una proteína que se une a p53 y modula su actividad transcripcional mediante la regulación de su oligomerización. En una primera etapa, implementamos un sistema de geles en gradiente Tris-acetato que permitió el análisis de proteínas gigantes como HERC2 y otras de menor tamaño (hasta de 10 kDa) en un solo gel de electroforesis. Después, estudiamos el papel de HERC2 en la regulación de p53, mapeando los dominios involucrados en la interacción, evaluando los niveles de expresión, actividad transcripcional, localización subcelular y oligomerización de p53 en ausencia de HERC2, para demostrar finalmente que la expresión ectópica del dominio CPH de HERC2 es suficiente para promover la oligomerización de p53 y aumentar su actividad. También se demostró que una mutación patológica de HERC2, que origina un cambio de aminoácido en la posición 594 causa la inestabilidad de la proteína, reduciendo casi por completo su expresión. Esta mutación causa una enfermedad con un fenotipo muy similar al síndrome de Angelman. Con los fibroblastos de individuos afectados por la mutación en HERC2, realizamos ensayos para estudiar la actividad transcripcional de p53 encontrándola reducida. Finalmente, demostramos que los ratones knockout para Herc2 son letales en homocigosis, demostrando que Herc2 es un gen esencial en el desarrollo embrionario de los ratones. / This work identifies HERC2 as a protein that binds to p53 and modulates its transcriptional activity by regulating its oligomerization. As a first step, we developed an electrophoretic analysis using Tris-acetate polyacrylamide gels to detect giant proteins such as HERC2 and other smaller proteins (down to 10 kDa) in the same electrophoresis gel. Then, we found that HERC2 interacted with p53 and identified the domains involved in the interaction. Also, we evaluated the levels of expression, transcriptional activity, subcellular localization and oligomerization of p53 when HERC2 was depleted, to finally demonstrate that ectopic expression of HERC2 (CPH domain) was sufficient to promote the oligomerization of p53 and increase its activity. Also, we demonstrated that a HERC2 pathological mutation, which causes an amino acid change at position 594, induced the instability of the protein and reduced its expression. This mutation causes a disease similar to Angelman syndrome. Fibroblasts affected by the mutation in HERC2 have the transcriptional activity of p53 reduced. Finally, we showed that Herc2 knockout mice are lethal in homozygous, demonstrating that Herc2 is an essential gene in the embryonic development of mice.

Tesi realitzada a l'Institut d'Investigació Biomèdica de Bellvitge (IDIBELL) / La Leucoencefalopatia Megalencefàlica amb quists subcorticals, també anomenada MLC, és un tipus rar de leucodistròfia vacuolitzant. Actualment encara es desconeix el mecanisme fisiopatològic de la malaltia, i per tant ni hi ha cap tractament possible per als pacients. S’han descrit dos gens implicats en la malaltia MLC. El primer gen descobert s’anomena MLC1 i codifica per una proteïna de membrana que porta el mateix nom. El segon gen s’anomena GLIALCAM i codifica per una proteïna transmembrana de tipus I que també porta el mateix nom. S’ha decrit que la proteïna GlialCAM actua com a subunitat ß de MLC1 ja que es capaç de dirigir-la i concentrar-la a les unions cel•lulars. Per altra banda, GlialCAM també s’ha descrit com a subunitat auxiliar del canal de Cl- ClC-2 ja que és capaç de modificar les propietats d’activació i rectificació del canal. En la present tesi s’han generat i estudiat diferents models animals i cel•lulars per a l’estudi de la malaltia. En primer lloc, s’ha generat i s’ha caracteritzat un model de ratolí knock-out per a Mlc1. Gràcies a aquest model s’ha observat que la proteïna MLC1 és únicament astrocitària i que la proteïna GlialCAM no es independent de MLC1, ja que en absència d’aquesta es troba deslocalitzada en el cerebel. També s’ha pogut descriure per primer cop la implicació del canal de Cl- ClC-2 en la fisiopatologia, ja que els seus nivells de proteïna disminuixen en el cerebel i el canal es troba gairebé inactiu en els oligodendròcits de l’animal knock-out. Les característiques fenotípiques que presenta el model de ratolí equivalen a les característiques observades en els pacients en fases inicials de la malaltia, ja que l’animal tot i que mostra presència de vacuoles no presenta deteriorament motor i macrocefàlia aparent. També s’ha generat un model de peix zebra knock-out per a zmlc1. Aquest model presenta avantatges respecte el ratolí, com per exemple el baix cost o l’aplicació de tècniques genètiques a gran escala. Aquest model ha permés observar de nou que realment GlialCAM necessita a MLC1 per a la seva correcta localització. També s’ha observat que l’ortòleg zGlialCAMa conserva la seva funció de entre espécies ja que també es capaç de modificar les corrents de ClC-2. Aquests resultats obtinguts amb els models s’han pogut comparar amb el cervell d’una pacient. Aquest cervell demostra que MLC1 és necessària per a la correcta localització de GlialCAM en la regió del cerebel. Per altra banda, s’han desenvolupat diferents models cel•lulars. Primerament s’han estudiat els astròcits del ratolí knock-out. Aquestes cel•lules mancades de MLC1 també presenten vacuoles per tot el citoplasma, però no mostren canvis en la localització ni en els nivells de proteïna de GlialCAM i ClC-2. Aquest fet juntament amb altres estudis del grup van fer pensar si la condició necessària per a que es veguessin afectades aquestes proteïnes estaria relacionada amb el procés del sifoneig de K+. Estudis realitzats en astròcits de rata demostren que en condicions d’un alt contingut de K+, com per exemple durant una alta activitat neuronal, GlialCAM i ClC-2 és localitzen juntament a les membranes cel•lular i ClC-2 canvia les seves propietat de canal. Paral•lelament, estudis realitzats en oligodendròcits de rata també demostren que aquest fet també succeix en aquest tipus cel•lular. / Megalencefalic leukoencephalopathy with subcortical cysts, also known as MLC, is a rare type of leukodystrophy. Currently still unknown pathophysiological mechanism of the disease, and therefore there is no effective treatment possible for patients. There are two genes involved in the MLC disease. Gene was first discovered was MLC1 and this encodes for a membrane protein with the same name. The second gene is called GLIALCAM and encodes for a transmembrane protein type I that also carries the same name. In our group is has been described that GlialCAM acts as a protein ß subunit of MLC1 because it is able to direct and concentrate in the cellular junctions. Moreover, GlialCAM also act as auxiliary subunit of CLC-2 Cl channel as it is capable of modifying the activation and rectification properties of the channel. In this work we have developed two different models to study the physiopathology. The results show that GlialCAM affected by the absence of MLC1. It has been also demonstrated that ClC-2 is implicated in the disease.These results were compared with a patient brian and has been shown that MLC1 is important for the correct location of GlialCAM in the cerbellum. Have also been developed a different cellular models. The results with this models show that GlialCAM and ClC-2 could have a functional role in the process of potassium siphoning.

La exposición a estímulos estresantes de tipo emocional induce activación neuronal en muchas regiones del SNC que cursa en paralelo con una estimulación del eje hipotálamo-hipofisario-adrenal (HPA). La activación neuronal suele valorarse mediante la inducción de genes de expre-sión temprana como c-fos, mientas que la activación del eje HPA se basa en la expresión del factor liberador de corticotropina (CRF) en el núcleo paraventricular del hipotálamo (PVN) y en la liberación de hormonas como la ACTH y los glucocorticoides. Numerosos estudios sugieren que la expresión de c-fos y CRF alcanza un máximo alrededor de los 15-30 min de iniciada la exposición al estrés, para disminuir posteriormente a pesar de la persistencia del estímulo estre-sante. Esta disminución de la respuesta podría obedecer a cambios en las señales estimuladoras y/o inhibidoras que llegan a la neurona como consecuencia de la exposición prolongada al mis-mo estímulo estresante, o bien a mecanismos de represión intracelular. Razonamos que si la hipótesis de los cambios en las señales es correcta, la expresión de dichos genes se restablecería en gran medida en respuesta a un nuevo estímulo estresante, en tanto que si la segunda hipótesis es la válida, la expresión debería estar bloqueada. Utilizando la rata como modelo, hemos estudiado en un primer experimento mediante hibrida-ción in situ (ISH), los cambios en la expresión de c-fos y CRF, y los cambios en los niveles plas-máticos de ACTH y corticosterona tras la exposición prolongada (unas 4 h) a una inmoviliza-ción en plancha (IMO) y cómo esta exposición a la IMO afecta a la respuesta a un nuevo estímu-lo estresante (nado forzado). Los resultados de expresión de c-fos indicaron que en la corteza prefrontal medial (mPFC), el septum lateral ventral (LSv) y la amígdala medial (MeA) la res-puesta al nado tras la IMO prolongada es capaz de restablecerse en gran medida, dando validez a la hipótesis de una reducción de las señales que llegan a las neuronas. Sin embargo, en el PVN la expresión de c-fos en respuesta al nado tras la IMO prolongada se encuentra en su mayor parte bloqueada, sugiriendo un bloqueo intracelular. En consonancia con los resultados de expresión de c-fos en el PVN, tanto la expresión de CRF como la secreción de ACTH en respuesta al nado se encuentran totalmente bloqueadas tras la IMO prolongada. Una interpretación correcta de estos primeros resultados, precisa conocer si las poblaciones neuronales activadas durante la IMO prolongada coinciden o no con las que responden al nado tras esta IMO. Al objetivo de identificar estas neuronas hemos realizado un nuevo experimento similar al anterior pero incluyendo un grupo de animales que fue liberado de la IMO prolonga-da y re-expuesto a una nueva IMO. La finalidad de este grupo era diferenciar la activación debi-da exclusivamente al nado de la que pudiera producirse por otros procesos como la simple ma-nipulación del animal o la propia liberación de la IMO. Para identificar las poblaciones neuro-nales que responden a la IMO prolongada y al nado, hemos realizado un doble marcaje de la proteína c-Fos y el mRNA que codifica para esta proteína mediante inmunofluorescencia e ISH fluorescente (IF-FISH). Basándonos en la dinámica de ambos marcadores, las neuronas que responden a la IMO prolongada mostrarían fundamentalmente proteína y poco o nulo mRNA, mientras que las que responden al nado aplicado tras esta IMO mostrarían fundamentalmente mRNA y nula proteína. Tras este análisis hemos observado que en regiones como el mPFC, el LSV y la MeA, la exposición al nado tras la IMO prolongada provocó la activación de nuevas neuronas sugiriendo cierta especificidad en la respuesta a ambos estímulos estresantes. Sin em-bargo, en el PVN con la exposición al nado tras la IMO prolongada no provocó activación de nuevas neuronas, confirmando la existencia de una sola población neuronal que responde indis- tintamente frente a estímulos estresantes de distinta naturaleza que es bloqueada tras una esti-mulación prolongada. Una gran parte de la activación neuronal observada en términos de expresión de c-fos en res-puesta a los distintos estímulos estresantes podría deberse a procesos de activación generalizada o de arousal que enmascararía aquellas neuronas que son realmente importantes en la respuesta al estrés. En un último experimento hemos pretendido disminuir la aportación del arousal, ad-ministrando a nivel sistémico DSP-4, una neurotoxina altamente selectiva para las terminales noradrenérgicas provenientes del LC. Una semana después de la administración de DSP-4, ex-pusimos a los animales a estímulos estresantes de diferente intensidad (ambiente nuevo, olor al depredador e IMO) para posteriormente analizar la expresión de c-fos mediante FISH en el mPFC, el LSv, la MeA y el PVN. El alcance de la lesión sobre las terminales noradrenérgicas del LC se valoró mediante inmunoflorescencia de la dopamina beta-hidroxilasa (DβH). En concor-dancia con datos de la literatura, sólo en el mPFC y la MeA se pudo apreciar una disminución en las terminales noradrenérgicas. La lesión con el DSP-4 no tuvo un impacto sobre la expresión de c-fos en respuesta a los distintos estímulos estresantes, salvo en la respuesta del LSv a la IMO donde se observó una disminución. En conjunto, los resultados sugieren que en la reducción de la expresión de c-fos observada tras la exposición prolongada a un estímulo emocional pueden intervenir tanto la familiarización con el estímulo y la consiguiente reducción de las señales estimuladoras como la represión in-tracelular de la expresión del gen. La contribución de cada uno de los mecanismos es marcada-mente dependiente del área estudiada. Por otro lado, parecen existir poblaciones de neuronas que responden específicamente a la IMO y al nado, aunque muchas de ellas pueden ser comunes a ambos. En la respuesta del eje HPA podrían añadirse bloqueos adicionales que probablemente contribuyen a reducir el posible impacto negativo de una liberación excesiva de glucocorticoi-des. El escaso impacto de la administración de DSP-4 podría explicarse por la existencia de me-canismos compensatorios y por lo tanto sería necesario valorar otras alternativas para disminuir la aportación del arousal a la respuesta de estrés. / Exposition to emotional stressful stimuli leads to neuronal activation of several regions of the Central Nervous System (CNS) that converge into the stimulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal axis (HPA). This neuronal activation can be measured by the induction of early expression genes (IEG) such as c-fos, while the activation of the HPA axis can be measured by the expression of the corticotrophin-releasing-factor (CRF) in the paraventricular nucleus of the hypothalamus (PVN) and also by the release of hormones such as ACTH and glucocorti-coids. There are several studies that suggest the expression of c-fos and CRF to reach its maxi-mum around 15-30 min after initiation of the exposition to stress. A decline in these parameters is observed even with the persistence of the stressful stimuli. This decline could be due to chang-es in the stimulatory/inhibitory signals arriving to the neurons as a consequence of a prolonged exposition to the same stressful stimuli, or it could also be due to intracellular repression mech-anisms. If the former hypothesis is correct, the expression of such genes would be mostly reestablished in response to new stressful stimuli, however, if the second hypothesis is valid, the expression should be blocked. In a first experiment we studied changes in the expression of c-fos and CRF in the rat CNS and changes in plasma levels of ACTH and corticosterone after a prolonged exposure (4 h approx.) to immobilization (IMO). We then assessed how this exposure could affect the response to a new stressor (forced swim). The results of expression of c-fos indicated that in the medial pre-frontal cortex (mPFC), the ventral lateral septum (LSv) and the medial amygdala (MeA) the response after prolonged IMO can be greatly restored, validating the hypothesis of a reduction of signals arriving to the neurons. However, in the PVN, the c-fos expression in response to forced swimming after prolonged IMO is largely blocked, suggesting an intracellular repression. Corroborating the results of c-fos expression in the PVN, the expression of CRF and ACTH secretion in response to forced swim are completely blocked after prolonged IMO. A correct interpretation of these first results requires knowing whether the neuronal popula-tions activated during prolonged IMO are the same as those responding to the forced swim ap-plied after the prolonged IMO. In order to identify these neurons we performed a new experi-ment which was similar to the previous one but including a new group of animals that was re-exposed to a second IMO instead of the forced swim. The purpose of this group was to differen-tiate activation due exclusively to forced swim from the one that could be produced by other processes such as the simple manipulation of the animal or the release of IMO. To identify the neuronal populations that respond to prolonged IMO and forced swim, we have performed a double labeling of c-Fos protein and its mRNA. Given the dynamics of both markers, the neu-rons which respond to the prolonged IMO would show essentially protein and little or no mRNA, while those responding to forced swim applied after this IMO would show essentially mRNA and no protein. After this analysis we found that in regions such as the mPFC, LSV and MeA, exposure to forced swim after prolonged IMO triggered activation of new neurons sug-gesting some specificity in the response to both stressors. However, in the PVN exposure to forced swim after the prolonged IMO did not cause activation of new neurons, confirming the existence of a single neuronal population that responds similarly to different stressful stimuli, by which activation is inhibited after prolonged stimulation. A great part of the neuronal activation observed in terms of expression of c-fos in response to various stressful stimuli could be due to generalized activation or arousal processes. This activa- tion could mask those neurons that are really important in the stress response. In a final experi-ment we tried to decrease the contribution of arousal administrating DSP-4, a neurotoxin that is highly selective for LC noradrenergic terminals. One week after the administration of DSP-4, we exposed the animals to stressful stimuli differing in intensity (new enviroment, predator odor and IMO) and then we analyzed the expression of c-fos in the mPFC, LSV, MeA and PVN . The extent of the lesion on the noradrenergic terminals of LC was assessed by immunofluorescence of dopamine beta-hydroxylase (DβH). We observed only a decrease in noradrenergic terminals in the mPFC and MeA supporting data found in the bibliography. The DSP-4 lesion had no effect on the expression of c-fos in response to various stressors, except in the LSV in animals exposed to IMO where a decrease was observed. The results of this work suggest that the reduction of c-fos expression observed after prolonged exposure to an emotional stimulus may involve both familiarization with the stimulus, with the consequent reduction of stimulatory signals, as well as an intracellular repression of this gene. The contribution of each mechanism seems to be markedly dependent of each region con-cerned. On the other hand, it seems to exist neuronal populations that respond specifically to IMO and forced swim, although many of them may be common to both. The HPA axis response could probably include additional blockages that may help to reduce the negative impact of an excessive glucocorticoid release. The limited impact of the DSP-4 administration could be ex-plained by the existence of compensatory mechanisms, therefore other alternatives to reduce the contribution of arousal to stress response should be considered.

Fundamental biological processes such as morphogenesis, tissue regeneration, and cancer invasion, depend on the collective migration of cell groups. The mechanisms that result in collective migration are not well understood, partially because the physical forces that initiate and maintain collective cell migration remain largely unknown. These forces include the traction forces, exerted by the cells on the extracellular matrix, and the cell-cell forces, transmitted between adjacent cells through cell-cell junctions. While the former have been studied, the latter have never been measured in the context of collective cell migration. The objective of this thesis has been to study these forces and integrate them in order to define the biomechanical mechanisms involved in the expansion of an epithelial monolayer. The thesis is presented as a compilation of two articles. In the first article, a new method for measuring intra-and intercellular forces in a cell monolayer was reported. It was shown that cells tend to align and migrate in the direction of maximal principal stress, demonstrating that intercellular forces act as a guidance mechanism during collective cell migration. In the second article, the expansion of an epithelial monolayer was studied. A new experimental model based on a barrier migration assay using polydimethylsiloxane membranes was implemented, allowing the study of epithelial expansion in a controlled and systematic manner. Structural and morphological changes at the cell level were observed during the expansion of the cellular monolayer. Furthermore, a mechanical wave propagates slowly spanning the entire monolayer, traversing intercellular junctions in a cooperative manner and building up differentials of mechanical stress. A minimal model based on sequential fronts of cytoskeletal reinforcement and fluidization captured essential features of this wave generation and propagation. These findings established a mechanism of long-range cell guidance, symmetry breaking and pattern formation during monolayer expansion.

Actualment, l’estudi de la relació entre nutrició i salut ha comportat que la immunonutrició esdevingui una ciència d’interès creixent. El cacau és un aliment ric en macronutrients (fibra, proteïnes, carbohidrats i lípids), micronutrients (minerals i vitamines) i conté una quantitat relativament elevada de flavonoides. Aquests inclouen majoritàriament els flavan-3-ols, com (-)-epicatequina, (+)-catequina i procianidines, compostos amb capacitat antioxidant i amb efectes antitumorals, en processos neurodegeneratius i sobre el sistema cardiovascular i el sistema immunitari. És per aquest motiu que el cacau s’ha convertit en un aliment amb gran interès com a potencial nutracèutic. L’al·lèrgia alimentària representa un problema de salut important en els països industrialitzats amb elevada prevalença en la població adulta i sobre tot en infants. Els individus afectats presenten una resposta immunitària anòmala quan ingereixen certs aliments o components alimentaris. La seva patogènia inclou la pèrdua de tolerància oral a proteïnes dels aliments i, en la majoria de casos, s’acompanya de la producció d’IgE. Entre les diferents manifestacions clíniques destaquen les alteracions gastrointestinals, les afeccions cutànies i l’anafilaxi, que pot arribar a xoc anafilàctic i comprometre la vida del pacient. En base a aquests antecedents, l’objectiu principal de la tesi ha estat determinar si la capacitat immunomoduladora del cacau podia ser útil per controlar la patogènia de l’al·lèrgia alimentària i establir el paper dels flavonoides en aquest efecte. De forma preliminar, es va desenvolupar un model d’al·lèrgia no alimentària, que va permetre estudiar els efectes d’una dieta enriquida amb cacau convencional sobre la resposta immunitària i establir variables objectives per avaluar la resposta anafilàctica. L’efecte del cacau en el model d’al·lèrgia desenvolupat mitjançant una única immunització intraperitoneal d’ovoalbúmina (al·lergogen), hidròxid d’alumini i toxina de Bordetella pertussis (adjuvants) va revelar, principalment, que el cacau atenuava la síntesi d’anticossos específics relacionats amb la resposta immunitària Th2. D’altra banda, en aquest mateix model, es van quantificar els canvis produïts en l’activitat motora immediatament després de realitzar una provocació oral. D’aquesta manera es va poder establir una variable objectiva per avaluar l’anafilaxi que es correlacionava inversament amb la concentració de proteasa II mastocitària sèrica. Posteriorment es va desenvolupar un model d’al·lèrgia alimentària en rata mitjançant la combinació d’una única immunització intraperitoneal, com la descrita anteriorment, amb l’administració oral de l’al·lergogen catorze dies més tard i durant tres setmanes. Aquest model es caracteritza principalment per l’exacerbació en la síntesi d’anticossos relacionats amb la resposta Th2 (IgE, IgG1, IgG2a) conseqüent a l’inici de l’administració oral i que ja és patent a la primera setmana. A més, la provocació oral dels animals amb al·lèrgia alimentària va provocar un increment de fins a sis vegades de la concentració de proteasa mastocitària II i de la seva expressió gènica a nivell intestinal. Un cop desenvolupat i caracteritzat el model d’al·lèrgia alimentària, es va determinar l’efecte d’una dieta enriquida amb cacau en aquest model. Els animals van rebre una dieta rica en cacau convencional des del moment de la immunització intraperitoneal i fins al final de l’estudi. El cacau va ser capaç de reduir la síntesi d’anticossos específics associats a la resposta tipus Th2, especialment d’isotip IgE. També va inhibir la secreció de citocines de tipus Th2 i, a més, en realitzar una provocació oral, va protegir parcialment de la resposta anafilàctica ja que va disminuir la síntesi i alliberament de la proteasa mastocitària II. Per identificar si els responsables d’aquest efecte eren els flavonoides, es va determinar sobre aquest mateix model d’al·lèrgia alimentària, l’efecte d’una dieta enriquida amb cacau no fermentat, el qual proporcionava principalment flavonoides i menys proporció d’altres components. Els cacau no fermentat va tenir un cert impacte en l’al·lèrgia alimentària però els seus efectes van ser menys potents que els observats amb la dieta enriquida amb cacau convencional. Per tant, a la vista dels resultats obtinguts, es pot concloure que els flavonoides del cacau no són els únics responsables del seu poder modulador en la resposta Th2. En resum, la intervenció nutricional amb una dieta enriquida en cacau en el model d’al·lèrgia alimentària desenvolupat, demostra l’efecte beneficiós d’aquest aliment i li confereix un interès especial en el camp de la immunonutrició com a potencial nutracèutic. / Nowadays, immunonutrition has become a very interesting issue of study. Due to cocoa has a relatively high content of flavonoids (mainly flavanols such as epicatechin, catechin and procyanidins), and it has a beneficial role in cardiovascular, chronic inflammation and cancer, cocoa has a potential role in immunonutrition as a nutraceutical. On the other hand, food allergy is an immune disease which is caused by food allergens, and is mainly mediated by IgE. During the past decades has become a major public health in westernized countries with an increasing prevalence. Based on these antecedents, the aim of the present study was to ascertain the effect of a cocoa-enriched diet on a food allergy rat model and also to establish the role of cocoa flavonoids in these effects. As a preliminary study, an allergy model by means of an intraperitoneal immunization with ovalbumin (allergen), aluminum hydroxide and toxin from Bordetella pertussis (adjuvants), was achieved. Using this rat model, a diet with conventional cocoa was tested and animals were orally provoked with the allergen to establish unbiased variables to study an anaphylactic response. The conventional cocoa diet was able to reduce Th2-associated antibodies, mainly specific IgE, and cytokines. The anaphylactic response produced a decrease in the number of animal movements which was inversely correlated with serum mast cell protease release. Then, a food allergy model was set up by means of the combination of only one intraperitoneal immunization (as above) with an oral administration of the allergen, fourteen days later and for three weeks. The model was achieved after the first week of oral gavage as demonstrated by a rise in the synthesis of specific antibodies related with Th2 immune response. Finally, using the food allergy model, a nutritional intervention with cocoa was assay. The animals received a conventional cocoa-enriched diet which was able to reduce the synthesis of Th2-specific antibodies and also partially inhibit the anaphylactic response because the diet produced a reduction in the serum concentration of mast cell protease and a down-regulation of its intestinal gene expression. To establish the role of cocoa flavonoids in this immunomodulation, food allergic animals received a diet containing non fermented cocoa which provided mainly flavonoids and no other cocoa components. Although a certain tendency of protection was detected, the conventional cocoa effect was stronger demonstrating that not only flavonoids are responsible for the protection in front of food allergy, and suggesting that cocoa has a high interest in the field of health and immunonutrition.

La Interleucina 6 (IL-6) és una citocina altament multifuncional, amb moltes accions pleiotròpiques, considerada una de les principals citocines controlant el sistema immune i coordinant-lo amb els sistemes nerviós i endocrí. La IL-6 es produeix en molts tipus cel·lulars dins del sistema nerviós central (SNC) i al seu torn, múltiples cèl·lules hi poden respondre. Per tant, és necessari caracteritzar quina és la contribució específica de cada tipus cel·lular en el paper global de la IL-6, tant en condicions fisiològiques com patològiques. Com que els astròcits tenen una important resposta enfront la IL-6 i, a més, són un dels principals productors de IL-6, hem produït per primera vegada ratolins amb una deficiència de IL-6 específica als astròcits (ratolins Ast-IL-6 KO) i ratolins amb una supressió del receptor de IL-6 en astròcits (ratolins Ast-IL-6R KO). Els nostres resultats indiquen que IL-6 i IL-6R astrocitaris influeixen en la supervivència inicial, presumptament per mitjà de la mortalitat intrauterina, i que estan involucrats en diferents graus en el control del pes corporal en adults i en el comportament (activitat locomotora, ansietat, exploració, agressivitat, aprenentatge i memòria), entre d’altres. A més, per tal d’estudiar el seu paper durant la neuro-inflamació, hem usat el model animal àmpliament usat de l’Esclerosis múltiple, la encefalitis autoimmune experimental (EAE), i un model de lesió traumàtica en escorça encefàlica (criolesió) en ratolins Ast-IL-6 KO i Ast-IL-6R KO. En referència a la EAE, els resultats indiquen que la deficiència en IL-6 i IL-6R astrocitàries no prevé completament la simptomatologia típica de paràlisis ascendent de la EAE però que si que modifica la seva simptomatologia d’una manera diferent segons el sexe. En referència a la lesió traumàtica a l’escorça, resultats inicials suggereixen un paper de la deficiència de IL-6 astrocitària en la resolució de la lesió traumàtica. En algunes ocasions, eliminar el IL-6R astrocitari imita el fenotip dels ratolins Ast-IL-6 KO, mentre que en altres casos s’observava el contrari, suggerint accions autocrines i paracrines de la IL-6 astrocitaria. Els nostres resultats indiquen importants funcions de la IL-6 i el IL-6R astrocitaris, en alguns casos totalment diferent d’aquelles que s’havien vist amb els animals IL-6 KO totals. Finalment, com que la IL-6 és capaç de senyalitzar sense unir-se al receptor de membrana mIL-6R sinó unint-se al receptor soluble (sIL-6R) (trans-senyalització), és necessari estudiar la importància d’aquesta via en les accions de la IL-6 al SNC, la qual cosa s’ha fet en ratolins bigènics (GFAP-IL6/sgp130) amb expressió restringida als astròcits de IL-6 i d’un inhibidor específic de la trans-senyalitazació, el sgp130. El bloqueig de la trans-senyalització en SNC redueix varis dels efectes perjudicials que té la IL-6 en un model animal de neuroinflamació (ratolins GFAP-IL6) com la gliosis severa, alteracions vasculars, neurogènesis malmesa i neurodegeneració. / Interleukin-6 (IL-6) is a highly plurifunctional cytokine, with many pleiotropic actions, considered one of the main cytokines controlling the immune system and coordinating it with the nervous and endocrine systems. IL-6 is produced in multiple cell types in the central nervous system (CNS), and in turn many cells do respond to it. It is therefore important to ascertain which the contribution of each cell type is in the overall role of IL-6, during both physiological and pathological conditions. As astrocytes are major responders to IL-6 as well as one of the main CNS producers of IL-6, we have produced for the first time mice with astrocyte-derived IL-6 deficiency (Ast-IL-6 KO mice) and mice with deletion of IL-6 receptor in astrocytes (Ast-IL-6R KO mice). Our results indicate that astrocyte IL-6 system influenced the early survival, presumably due to intrauterine death, and was also involved to various degrees in the control of adult body weight and behavior (such as locomotor activity, anxiety, exploration, aggressiveness, learning and memory), among others. Also, in order to test its role during neuroinflammation, we studied an extensively used animal model of Multiple sclerosis, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and a traumatic brain injury model (cryolesion) in Ast-IL-6 KO and Ast-IL-6R KO mice. Regarding EAE, results indicate that lack astrocytic IL-6 and IL-6R deficiency did not fully prevent EAE's prototypical ascending paralysis course but they modified its symptomatology in a gender-dependent manner. Regarding traumatic injury to the cortex, preliminary results obtained suggest a role of astrocytic IL-6 deficiency in traumatic brain injury resolution. In some occasions deleting IL-6R in astrocytes mimicked the phenotype of Ast-IL-6 KO mice, while in others the opposite was observed, suggesting autocrine and paracrine roles of astrocytic IL-6. Our results suggest important roles of the astrocyte IL-6 system, in some cases totally unexpected from previous results with animals with total deletion in IL-6 (IL-6 KO mice). Finally, as IL-6 is able to signal without binding to the membrane bound mIL-6R but by binding to a soluble receptor (sIL-6R) (trans-signaling), it is necessary to assess the importance of this pathway in mediating IL-6 actions in CNS. Bigenic mice (GFAP-IL6/sgp130 mice) with astrocyte-targeted production of IL-6 and coproduction of the specific inhibitor of IL-6 trans-signaling, human sgp130 were studied. Blockade of trans-signaling in the CNS reduced many of the detrimental effects that IL-6 have in the GFAP-IL-6 mice model of neuroinflammation; such as the severity of the gliosis, vascular alterations, impaired neurogenesis and neurodegeneration.