Tesi realitzada al Departament d'Isquèmia i Inflamació (IIBB-CSIC-IDIBAPS) / After ischemic damage in kidney, alternatively activated or M2 macrophages are key players in resolving inflammation and participating in kidney repair. Obtaining this particular phenotype is a process controlled by deregulation of a series of genes. Modulation of those genes could result in controlling macrophages phenotype and functions, aiming new approaches in resolving ARF. The first aim of this study was to identify genes that are related to M2 macrophages that are involved in tissue repair. By functional genomics we have identified the expression of 14 genes crucial for the induction of the endogenous reparative capacity of the kidney that are modulated by the presence of macrophages. We also demonstrated that modulation of Ivns1abp gene can modulate renal repair. More concrete we show that over-expression of the Ivns1abp gene can enhance macrophages regenerative capacity and switch their phenotype towards M2, provoking modulation of their inflammatory state and increasing its resistance against inflammation inputs. We also demonstrated that silencing of the Ivns1abp genet to macrophages leads them to acquire a M1 phenotype and decrease their reparative and phagocytosis capacity. As a last step, we define pathways that regulate the transcription of the Ivns1abp gene. We show that Ivns1abp gene expression in macrophages is regulated by the c-myc transcription factor and modulated by the presence of cytokines determining cell fate. / Después de la lesión isquémica en el riñón, los macrófagos activados alternativamente o M2 no solo participan en la reparación del daño sino son factores clave en la resolución de la inflamación. La obtención de este fenotipo particular es un proceso controlado por la desregulación de una serie de genes. Modulando estos genes, se podría controlar el fenotipo y las funciones de los macrófagos, con el objetivo de nuevos enfoques en el tratamiento de FRA. El primer objetivo de este estudio fue identificar los genes que están implicados en la reparación de tejidos y que están relacionados con los macrófagos M2. Por genómica funcional hemos identificado la expresión de 14 genes cruciales para la inducción de la capacidad regeneradora endógena del riñón y modulados por la presencia de macrófagos. A continuación hemos demostrado que la modulación del gen Ivns1abp puede modular la reparación renal. En concreto hemos demostrado que la sobre-expresión del gen Ivns1abp en macrófagos puede mejorar su capacidad regenerativa y cambiar su fenotipo hacia M2, provocando la modulación de su estado inflamatorio y aumento de su resistencia frente la inflamación. Se demostró además que el silenciamiento del gen Ivns1abp en macrófagos disminuye su capacidad reparadora y fagocítica transformando su fenotipo a M1. Como ultimo, hemos definido las vías que regulan la transcripción del gen Ivns1abp. Hemos demostrado que la expresión del gen Ivns1abp en los macrófagos está regulada por el factor del trascripción c-myc y modulada por la presencia de citoquinas, determinando el destino de la célula.

Treball realitzat en el Departament d’Evolució funcional d’insectes de l’Institut de Biologia Evolutiva (CSIC-UPF) / La panerola Blattella germanica és un insecte de metamorfosi incompleta (hemimetàbol) i anautògen. Aquesta és una estratègia reproductiva per la qual les femelles no es poden reproduir fins que no han menjat. D'alguna manera els senyals nutricionals han d'arribar als diferents teixits i cèl•lules per informar-los que s'ha assolit un estat nutricional adequat per iniciar els processos reproductius. Tant la via de TOR com la via del receptor d'insulina (InR) semblen formar part conjunta d'aquesta senyalització nutricional. A B. germanica la vitel•logènesi s'activa mitjançant l'hormona juvenil (HJ), que es fabrica i secreta per unes glàndules retrocerebrals anomenades corpora allata (CA). Quan falta l'aliment, els CA no sintetitzen HJ i aquesta no pot activar la síntesi de vitel•logenina (Vg) en el cos gras (CG), que no pot ser incorporada als ovaris, impedint que aquests es desenvolupin correctament. Prèviament havia estat clonada la seqüència de TOR de B. germanica (BgTOR). En aquest treball s'han clonat les de BgInR, BgS6K i de BgPepck. Gràcies al dsRNAi s'ha estudiat la funció del InR com a regulador del creixement, veient que no només afecta a la maduresa sexual de les femelles sinó també la seva mida quan s'injecta en estadis nimfals. La interferència del InR també produeix problemes en el correcte desenvolupament i desplegament de les ales i les tegmines. Així mateix, s'ha comprovat que la interferència del InR fa baixar els nivells dels trànscrits de HMG-S1, HMG-S2, HMG-R i epoxidasa en els CA, implicats en la síntesi d'HJ, així com de la Vg en CG , independentment de l'efecte de la HJ sobre aquesta. També s'ha vist que la interferència del InR produeix una major longevitat en les femelles, a causa que aquestes no es reprodueixen, evitant el desgast que això produeix. Alhora, l'aplicació de dsInR confereix certa protecció davant situacions de dejuni. Altres resultats suggereixen que l'activació d'S6K, tal com succeeix en altres organismes, es realitza per modificacions post-transcripcionals, probablement per fosforilació de la proteïna. S'ha començat a posar a punt un sistema de western-blot per usar-lo per a la detecció de l'estat de fosforilació de S6K i per tant del seu estat d'activació. Mitjançant la tècnica del RNAi s'ha comprovat que la interferència per S6K fa baixar els transcrits de HMG-S1, HMGS2, HMG-R i epoxidasa en els CA, implicats en la síntesi d'HJ, així com la Vg en CG, indicant que està implicat en la transmissió del senyal nutricional als teixits implicats en la vitel•logènesi. Finalment s'ha establert Pepck com a marcador de l'estat nutricional, ja que s'incrementa la seva expressió en situacions de dejuni. No s'ha observat, però, que augmenti quan es redueixen els nivells de S6K o InR mitjançant RNAi, la qual cosa ens indica que la influència de la situació de dejuni sobre la transcripció de PEPCK es pot realitzar per vies alternatives a S6K i InR, si bé sembla que necessita de la presència de InR funcional. / The cockroach Blatella germanica is a hemimetabolous insect with anautogenous reproduction. TOR and Insulin Receptor (InR) pathways are responsible of the nutritional signaling and to control reproductive processes. In B. germanica the yolk protein synthesis is activated by juvenile hormone (JH), which is secreted by retrocerebrals glands known as corpora allata (CA). In starvation, CA are not able to synthesize JH and it can’t activate the synthesis of vitelogenin (Vg) in the fat body (FB), and it can’t be incorporated by the ovaries, preventing their proper development. In this work we have cloned the sequences of BgInR, BgS6K and BgPepck. Using RNAi, InR has been studied as a regulator of growth, affecting not only sexual maturity of females, but also their size when RNAi is injected at nymphs. InR interference also produces problems for the proper development and deployment of wings and elytra. It has also been observed that InR interference lowers the levels of HMG-S1, HMG-S2, HMG-R and epoxidase transcription in CA, involved on the synthesis of JH by CA, and consequently, reducing Vg levels. Independently of JH, InR has a direct effect on Vg expression. Besides, InR interference confers greater longevity in females and protection in front of fasting. We have also begun to implement western-blot technique to detect phosphorylation of S6K. The S6K interference reduce transcription levels of HMG-S1, HMG-S2, HMG-R and epoxidase in CA, and Vg in the CG , indicating that it is involved in nutritional signal transmission to the tissues involved in vitelogenesis. Finally, we established Pepck as a marker of the nutritional status, as its expression is increased in starvation. However, it has not been observed any increase when reducing the levels of S6K or InR using RNAi, indicating that the influence of starvation on Pepck transcription can be performed in alternative ways to S6K and InR, but needs the presence of functional InR.

Se plantea la siguiente hipótesis de trabajo que: 1) El entrenamiento de fuerza realizado en condiciones de hipoxia mejora el rendimiento anaeróbico específico. 2) Las condiciones de hipoxia simulada no provocan un descenso de la intensidad de ejecución durante este tipo de ejercicio. 3) El mayor estrés fisiológico y perceptivo soportado en condiciones de hipoxia es el causante de provocar respuestas adaptativas en diferentes sistemas orgánicos: metabólico, cardíaco, nervioso y muscular. Este estudio se lleva a cabo a través de varios trabajos valorando deportistas entrenados, los objetivos de los cuales son: 1) Estudio de la respuesta física sobre el rendimiento anaeróbico láctico mediante: A) La realización de dos programas de entrenamiento que incluyeron ejercicios de fuerza resistencia localizados y generales durante 4 semanas y 12 sesiones. B) Valoración del rendimiento físico y fisiológico midiendo antes y después de la realización de los programas y comparando en dos grupos (hipoxia y normoxia). C) Los test de rendimiento físico incluyeron: test de máximo rendimiento durante 60 segundos (saltos continuos) y máxima capacidad de rendimiento hasta el agotamiento (máximo número de series posibles a realizar). 2) Valoración de la potencia generada durante un ejercicio interválico intermitente (6 series de 15 segundos a máxima intensidad con recuperación de 3 minutos) en condiciones de normoxia, hipoxia moderada (equivalente a 2500m) y severa (equivalente a 4000m). 3) Análisis de la respuesta metabólica del lactato alcanzado al finalizar el test hasta el agotamiento comparando grupos (hipoxia y normoxia) y antes y después del programa de entrenamiento. 4) Valorar el efecto del entrenamiento en condiciones de hipoxia sobre la regulación de sistema nervioso autónomo a través del registro de la recuperación y la variabilidad de la frecuencia cardíaca. 5) Comprobar el efecto provocado por el ejercicio máximo en condiciones de hipoxia y normoxia en la saturación arterial de oxígeno y el rendimiento físico. Los resultados obtenidos en los estudios que conforman la tesis doctoral, nos permiten extraer las siguientes CONCLUSIONES: 1) El grupo de deportistas entrenados que realizó los programas de entrenamiento de fuerza en condiciones de hipoxia hipobárica intermitente mejoró su rendimiento máximo durante un test de 60 segundos y alcanzó un mayor número de series hasta el agotamiento en régimen interválico intermitente. Esta mejora fue estadísticamente significativa comparando el rendimiento anterior y posterior al programa y con el grupo que entrenó en normoxia. 2) La mejora obtenida en el test hasta el agotamiento (mayor número de series alcanzadas) correlacionó con un mayor nivel de lactato alcanzado en el grupo hipoxia (en comparación con el grupo normoxia). 3) Las condiciones de hipoxia simulada no provocan una reducción en la capacidad de generar potencia de fuerza tanto si es moderada (2500m) como severa (4000m) en comparación con normoxia. 4) La Saturación arterial de oxígeno descendió significativamente a medida que la altitud simulada era mayor. Este descenso no afectó la capacidad de rendimiento físico. 5) El entrenamiento de fuerza en hipoxia simulada intermitente provocó modificaciones significativas en comparación con el mismo entrenamiento en normoxia en la respuesta del sistema nervioso autónomo. Estas modificaciones fueron medidas a través del índice de recuperación de la frecuencia cardíaca después de 3 minutos de finalizar el test de rendimiento máximo. De manera global, se puede concluir que el entrenamiento de fuerza en condiciones de hipoxia simulada de carácter intermitente puede mejorar el rendimiento en pruebas de carácter anaeróbico en deportistas entrenados. Además, puede ser una herramienta útil dentro de la preparación física en personas lesionadas que realicen programas de rehabilitación física en condiciones de hipoxia para mantener un nivel físico más alto por el mayor estrés soportado a nivel sistémico. / An intermittent hypobaric hypoxia program (IHH) consisting of a strength endurance training during 4 weeks (3 days per week) in trained athletes has been proven as an effective stimulus to improve the anaerobic performance. The strength training is an important key in the sports involving anaerobic profile but until now has been not used commonly. Two groups (hypoxia and normoxia) were tested during 4 experimental studies in order to assess: 1) the anaerobic capacity after 4 weeks of endurance strength training (EST) over lower limb throughout a test consisting of 60 seconds of continuous jumping's (height mean and fatigue index). 2) The maximal capacity until exhaustion performing intervallic sets (300 meters at 90% of the individual best performance) after a circuit strength training (CST) of 4 weeks of duration. 3) The arterial saturation of oxygen (SaO2) and the correspondingly power strength performance (PSP) during a session of 6 sets of continuous jumping during 15 seconds with incomplete recovery (3 minutes between sets) in normoxia and two hypoxia conditions (moderate and severe). 4) The autonomic function measured throughout the heart rate variability (HRV) and the heart rate recovery index. After EST and CST significant differences were found comparing hypoxic and normoxic groups. Both studies showed that hypoxic treatments were more effective and participants reported a better anaerobic capacity. Lactate values reached after CST were significantly higher in the hypoxic group in comparison with normoxia. Despite that SaO2 reached during PSP was statistically lower in hypoxia than normoxia, athletes were able to maintain the power capacity of strength. Both groups improved the heart rate recovery index after EST and CST programs, however, the hypoxic group reported a significant better data. After conducting our protocols IHH and strength training, we conclude that physiological and physical changes obtained may suggest that procedures to lead the anaerobic adaptive responses could be succesfully used. All these physiological changes would have multiple applications in the sport training and sport rehabilitation.

Los pacientes con dislipemia son tratados con estatinas para reducir sus concentraciones de lípidos, y disminuir el riesgo cardiovascular. El grado de respuesta a estos fármacos es heterogéneo, y en él podrían influir ciertos genes. Este trabajo trata de valorar la influencia de seis variantes genéticas sobre la eficacia de las estatinas en pacientes con dislipemia, tanto de manera independiente como junto a una serie de variables de control. Las magnitudes lipídicas evaluadas fueron el colesterol total (CT) y el excluido de HDL (noHDL), y las variables de control fueron: edad, dosis media diaria de estatina, cambio en el índice de masa corporal, cambio en el hábito tabáquico, cambio en las horas de ejercicio practicadas semanalmente y cambio en el consumo de gramos de alcohol diarios. La eficacia del tratamiento se valoró mediante tres indicadores: disminución relativa de CT y no HDL según la concentración al final (%C) y según la concentración media durante el tratamiento (%CM), y grado de consecución de objetivos terapéuticos. Este estudio se llevó a cabo en una población NAIF (n=100), pacientes en los que se inicia el tratamiento en la primera visita, y posteriormente en una población NO NAIF (n=57), pacientes ya tratados en la primera visita a quienes se les modifica el tratamiento. Las variantes genéticas estudiadas fueron: APOE c.526C>T (APOE2), APOE c.388T>C (APOE4), SLCO1B1 c.521T>C, CYP3A4 c.-392G>A, HMGCR c.1564-106A>G y LPA c.3947+467T>C. El estudio estadístico se basó en modelos de regresión múltiple. Para la población NAIF, la variante HMGCR c.1564-106A>G resultó influir sobre el %C y el %CM tanto para CT como para noHDL. Aportó al modelo basal un porcentaje de explicación adicional para %C de CT y noHDL de un 9,5% y 8,2%, respectivamente, y 6,2% y 3,5% al del %CM. También resultó influyente para los NO NAIF, suponiendo una explicación adicional de aproximadamente un 8% para los cuatro casos. Cabe destacar que en ambas poblaciones el efecto de la presencia de la variante resultó contrario: perjudicial para los NAIF y beneficioso para los NO NAIF. El gen HMGCR codifica para la enzima sobre la que ejercen su acción las estatinas. La variante estudiada está implicada en la regulación del splicing alternativo del exón 13, que modifica los centros activos sobre los que puede actuar la estatina. Este splicing alternativo también se ve modulado por la concentración de lípidos circulantes, pero esto ocurre únicamente en los no portadores de la variante. En esta tesis se postula que la disminución del CT y el noHDL se producirían de manera gradual y constante en el caso de los portadores de la variante, o según una función de tipo sigmoideo en los no portadores. Además, para los NO NAIF, la variante SLCO1B1 c.521T>C resultó influyente y perjudicial para el %C y %CM del CT, aportando un 7,1% y 5,9% de explicación al modelo basal respectivamente. Esto podría deberse a la relación entre la variante y los efectos adversos de las estatinas, que suele llevar aparejada una mala adhesión al tratamiento. Respecto al grado de consecución de los objetivos terapéuticos, las variantes influyentes fueron HMGCR c.1564-106A>G para el CT para los NAIF, y SLCO1B1 c.521T>C para CT y noHDL de los NO NAIF. La presencia de las variantes supuso mayor dificultad para alcanzar los objetivos. Se puede concluir que la variante estudiada del gen HMGCR tiene cierta influencia sobre la eficacia de las estatinas, aunque su efecto depende del tipo de población estudiada. La presencia de la variante del gen SLCO1B1 también podría presentar cierto efecto perjudicial, pero en ambos casos sería recomendable ampliar el estudio con un mayor número de pacientes. / Patients with dislipemia are often treated with statins to reduce lipids and cardiovascular risk. It is known that the efficacy of statins is variable between patients, so a genetic influence is suspected. This work tries to assess the influence of six genetic variants on the efficacy of statins employing three indicators: percentage reduction of total cholesterol (CT) and noHDL cholesterol (noHDL) according to final concentration (%C) and to mean concentration (%CM), as well as achievement of therapeutic objectives. The study was first developed in a population of patients who were not treated at the first visit (NAIF) and then it was repeated with patients treated in the first visit whose treatment was changed (NO NAIF). The genetic variants were: APOE c.526C>T (APOE2), APOE c.388T>C (APOE4), SLCO1B1 c.521T>C, CYP3A4 c.-392G>A, HMGCR c.1564-106A>G y LPA c.3947+467T>C. The statistical analysis employs multiple regression models to define the percentage of explanation added by the variant to a basal model constructed with the significant control variables. The most influential variant was HMGCR c.1564-106A>G which added an explanation of 9,5%, 8,5%, 6,2% and 3,5% to the indicators %C CT and noHDL, and %CM CT and noHDL in NAIF population. For NO NAIF it added an explanation of over 8% in the same cases. The presence of the variant showed an opposite effect in both populations: harmful for NAIF and beneficial for NO NAIF. This variant is related to an alternative splicing of the exon 13, which is also regulated by lipids concentrations, but only in patients without the variant. This work postulates that the reduction of CT and noHDL is gradual for variant carriers, but follows a sigmoid function for non-carriers. For NO NAIF the SLCO1B1 c.521T>C variant was harmful for %C and %CM of CT, adding explanations of 7,1% and 5,9%. This could be due to the relationship between this variant and the adverse effects of statins, which usually means worse treatment adherence. About therapeutic objectives, the variant HMGCR c.1564-106A>G was influent for CT of NAIF and SLCO1B1 c.521T>C for CT and noHDL of NO NAIF, hindering the achievement of therapeutic objectives in both cases.

La diabetes tipo 1 (DT1) es una enfermedad de origen multifactorial, caracterizada por la destrucción selectiva de células ß productoras de insulina localizadas en los islotes pancreáticos. Estudios realizados en el modelo de ratón NOD, han revelado que la respuesta autoinmune en esta enfermedad está dirigida principalmente por poblaciones autoreactivas de linfocitos T CD4 y CD8 infiltrantes de islote. Durante muchos años, el papel de los linfocitos B en la DT1 ha sido relegado a un segundo plano, sin embargo, a día de hoy se sabe que estas células son importantes en el desarrollo del proceso, y que posiblemente su papel en la presentación de autoantígenos sea clave en las primeras etapas de la respuesta autoinmune. Recientemente, se ha descrito la presencia de linfocitos B autoreactivos infiltrantes de islote frente a una proteína con patrón de expresión neuroendocrino, identificada como periferina. Estos datos, junto con trabajos recientes donde se describe la presencia de un ataque inicial en páncreas frente a elementos del sistema nervioso, ponen de manifiesto la importancia del análisis de esta respuesta. El estudio presentado en esta memoria describe y caracteriza por primera vez, la región antigénica presente en la periferina reconocida por linfocitos B autoreactivos en ratones NOD. La respuesta de estos linfocitos B, esta dirigida frente a la región L465-S495, un epítopo lineal de 17 aminoácidos de longitud localizado en la región C terminal de las isoformas 61 y 58. Por otra parte, mediante el desarrollo de una molécula de detección de linfocitos B específica, hemos podido llevar a cabo un estudio del desarrollo y fenotipo de esta población de linfocitos en ratones NOD. Los resultados obtenidos, muestran la presencia de una respuesta temprana de linfocitos B anti-periferina detectable a partir de las 4 semanas, con un perfil heterogéneo de linfocitos B1 y B2. De forma importante, hemos comprobado como el peritoneo es una región clave en la dinámica de esta población autoreactiva. En este compartimento, la frecuencia de linfocitos B anti-periferina es superior a la detectada en otros órganos, y una parte de la población presenta signos de cambio de isotipo. Por otra parte, experimentos llevados a cabo en ratones diabéticos NOD, han revelado un aumento en el número y frecuencia de estas células en esta región, apuntando a que el compartimento peritoneal podría ser clave en el desarrollo y mantenimiento de la respuesta autoreactiva anti-periferina durante el transcurso de la DT1. / Autoreactive B cells are essential for the pathogenesis of type 1 diabetes. The genesis and dynamics of autoreactive B cells remain unknown. In this thesis, we analyzed the immune response in the NOD mouse model to the neuronal protein peripherin (PRPH), a target antigen of islet-infiltrating B cells. PRPH autoreactive B cells only recognized a single linear epitope of this protein, in contrast to the multiple epitope recognition commonly observed during autoreactive B cell responses. To specifically detect the accumulation of these B cells, we developed a novel approach, octameric peptide display, to follow the dynamics and localization of anti-PRPH B cell during disease progression. Before extended insulitis established, anti-PRPH B cells preferentially accumulated in the peritoneum. As disease unfolded, anti-PRPH B cells invaded the islets and increased in number at the peritoneum of diabetic but not pre-diabetic mice. Isotype switched B cells were only detected in the peritoneum. Anti-PRPH B cells represent a heterogeneous population composed of both B1 and B2 subsets. In the spleen, anti-PRPH B cell were predominantly in the follicular subset. Therefore, anti-PRPH B cells represent a heterogeneous population that is generated early in life but proliferates as diabetes establishes. These findings on the temporal and spatial progression of autoreactive B cells should be relevant for our understanding of B cell function in diabetes pathogenesis.

Tesi realitzada a la Unitat de Genòmica Funcional i Evolució de l’Institut de Biologia Evolutiva (IBE, CSIC‐UPF) / La maduració sexual dels animals està controlada per hormones. En els insectes alats aquesta maduració es coneix amb el nom de metamorfosi, i pot anar acompanyada d’una completa reorganització de la majoria d’òrgans i estructures juvenils (insectes holometàbols), o bé limitar-se a uns pocs teixits, principalment les ales i la genitàlia (insectes hemimetàbols). La metamorfosi dels insectes holometàbols (metamorfosi completa), que va aparèixer fa uns 300 milions d’anys a partir d’insectes hemimetàbols (metamorfosi incompleta), ha fet que aquest grup animal assolís un gran èxit evolutiu, ja que la diferent morfologia entre les formes juvenils i adultes els permet explotar hàbitats diferents i no competir entre elles. En tots els insectes els canvis metamòrfics estan controlats per dues hormones, la 20-hidroxiecdisona (20E) i l’hormona juvenil (HJ). La 20E s’encarrega d’induir les transicions entre les diverses mudes i estadis del desenvolupament, mentre que l’HJ modula la naturalesa d’aquestes transicions. La present tesi doctoral pretén aprofundir en el coneixement de la regulació molecular de la metamorfosi mitjançant l’estudi del procés de sumoilació, per una banda, i de la funció del gen E93 de l’altra. Per fer-ho s’han utilitzat tres models d’insectes: la panerola Blattella germanica (hemimetàbol), l’escarabat Tribolium castaneum (holometàbol basal) i la mosca Drosophila melanogaster (holometàbol modificat). La sumoilació és una modificació posttraduccional que consisteix en la unió de manera reversible d’una proteïna petita, anomenada Sumo (de l’anglès Small Ubiquitin-like MOdifier), a una proteïna diana. Aquesta unió comporta la modificació de les propietats de la proteïna diana canviant-ne la conformació, la localització subcel•lular, la capacitat d’interacció amb altres proteïnes o la capacitat d’unió al DNA (en el cas dels factors de transcripció), entre d’altres. En els insectes, l’estudi del procés de sumoilació s’havia centrat fins ara en l’holometàbol D. melanogaster, on s’ha vist que és imprescindible per a l’inici de la metamorfosi. En aquesta tesi doctoral s’ha descrit la funció d’aquest procés en el desenvolupament postembrionari d’un insecte molt més basal, B. germanica. Aquesta panerola té dos paràlegs Sumo, BgSumo1 i BgSumo3, mentre que D. melanogaster en té tan sols un, Smt3. Aquest fet permetia, doncs, estudiar l’evolució funcional de la sumoilació en els insectes, i com aquesta funció està distribuïda en animals amb dos proteïnes Sumo. Així, mitjançant la tècnica de l’RNA d’interferència in vivo, s’ha comprovat que la sumoilació és essencial per a la supervivència durant el desenvolupament postembrionari de B. germanica. A més, s’ha vist que el paràleg BgSumo1 és necessari per a que es doni correctament la muda imaginal, per a la transducció del senyal de la 20E durant aquesta muda i per a la proliferació de l’epiteli fol•licular de l’oòcit basal. D’altra banda, s’ha comprovat que diversos receptors nuclears que conformen la via de senyalització de la 20E, imprescindible per a l’inici de la metamorfosi, són capaços de sumoilar-se en condicions in vitro. La segona part del treball se centra en l’estudi funcional del factor de transcripció E93. Aquest, descrit prèviament en D. melanogaster com el responsable de la transmissió del senyal de la 20E en el procés de mort cel•lular programada durant la metamorfosi, s’ha comprovat en aquesta tesi que actua de regulador molt més general dels processos metamòrfics. Així, s’expressa fortament durant el període metamòrfic en els tres models estudiats (B. germanica, T. castaneum i D. melanogaster), i la seva absència bloqueja aquest procés. En l’hemimetàbol B. germanica, la manca de BgE93 durant el darrer estadi nimfal provoca la formació de nimfes supernumeràries, que mai assoleixen l’estadi adult. En l’holometàbol basal T. castaneum, per altra banda, l’absència de TcE93 impedeix la diferenciació adulta que es dóna durant la fase pupal i provoca la muda a un segon estadi pupal supernumerari. Finalment, en l’holometàbol modificat D. melanogaster també provoca un bloqueig general de la metamorfosi. A més, en aquests tres insectes E93 s’encarrega de reprimir l’expressió dels factors de transcripció Broad i Krüppel homolog-1, la presència dels quals impedeix la diferenciació adulta durant el darrer estadi juvenil dels insectes. Per tot això, aquest treball ha pogut descriure el factor de transcripció E93 com l’especificador adult dels insectes alats, pas essencial per avançar en el coneixement de la regulació de la metamorfosi i en l’estudi de l’aparició de la metamorfosi completa a partir d’insectes hemimetàbols. / All immature animals undergo remarkable morphological and physiological changes to become mature adults. In winged insects, metamorphic changes are either limited to a few tissues (hemimetaboly) or involve a complete reorganization of most tissues and organs (holometaboly). In both cases, adult differentiation requires a temporally regulated balance between cell death, tissue growth and morphogenesis. Two hormones control this balance, the steroid 20-hydroxyecdysone (20E) and juvenile hormone (JH). The main goal of this thesis is to characterize the molecular mechanisms underlying the metamorphic process in insects through (i) the study of sumoylation and (ii) the functional characterization of the E93 transcription factor. To this aim, the hemimetabolous cockroach Blattella germanica, as well as the basal holometabolous beetle Tribolium castaneum and the highly modified holometabolous fly Drosophila melanogaster were used. Sumoylation is a post-translational modification that consists on the covalent binding of a small protein, called Sumo (Small Ubiquitin-like MOdifier), to a target protein. This modification is involved in the regulation of various cellular processes such as nuclear-cytosolic transport, transcriptional regulation and progression of cell cycle, among others. Notably, whereas D. melanogaster has only one Sumo protein (Smt3), B. germanica has two, BgSumo1 and BgSumo3. In this thesis, by using RNAi in vivo experiments we have shown that, whereas BgSumo3 is dispensable for the correct development of B. germanica, reduction of BgSumo1 levels resulted in severe defects during the metamorphic transition, including a marked developmental delay due to impaired activation of the ecdysone-triggered signaling cascade. Furthermore, we have shown that all the proteins belonging to the ecdysone-dependent transcriptional cascade of nuclear hormone receptors (BgEcR, BgRXR, BgE75, BgHR3 and BgFTZ-F1) are SUMOylated in vitro. The second part of the thesis is focused on the functional characterization of the E93 gene. First described as a dedicated regulator of cell death, we have demonstrated that this factor controls all the metamorphic transformations in insects. Thus, in the hemimetabolous B. germanica the absence of E93 during the last nymphal instar causes the formation of supernumerary nymphal instars. Moreover, in the holometabolous T. castaneum and D. melanogaster the depletion of E93 impairs adult differentiation during the pupal period and, in the beetle, also causes the formation of a supernumerary pupal stage. Furthermore, E93 controls the essential downregulation of the anti-metamorphic factors Broad and Krüppel homolog-1, two proteins whose presence blocks adult metamorphosis during the pupal stage. In conclusion, our data demonstrate that, despite the evolutionary distance and the differences in the developmental strategies to reach adulthood, E93 is the universal adult specifier in winged insects.

Trex1 is an exonuclease that was first identified in mammal cells and due to its role in DNA metabolism was conjectured to have a role in DNA damage repair and cancer. It was unexpected to find that Trex1-/- mice generated a few years later did not present increased cancer incidence but an inflammatory myocarditis that lead to premature death. Furthermore, TREX1 mutations were later associated to a number of different diseases that presented deregulation of the immune system, such as, SLE but also neurological defects in AGS. Nbs1 is a 95kDa protein and was first identified to it its interaction with Mre11 and Rad50 (MRE11 complex). This complex is important for DSB detection and repair and has been conserved overall the species. The genomic region encoding Nbs1 was previous noted to be mutated in NBS patients. These patients are characterised with immunodeficiency, neural defects and increased cancer incidence. This Thesis comprises three main parts. The first part characterises Trex1 as promoter and describes its induction upon IFN-γ stimulation. The second part describes how and to what extent the lack of Trex1 in macrophages affects its function upon TLR stimulation and further explains molecular mechanisms behind autoimmunity in the absence of Trex1 function. Finally, the last part, focuses primarily on Nbs1, assesses the importance of a fully functional Nbs1 in macrophage function and on immune response in vivo. Taking the previous stated into account it can be concluded that Trex1 and Nbs1 are cornerstone proteins of macrophage pro-inflammatory function and although the roles of these proteins in macrophages are different, in essence, they both are indispensably crucial for DNA metabolism. This further suggests that the tight regulation of the amounts of free DNA in macrophages is important in the pro-inflammatory but not in anti-inflammatory response and that both Nbs1 and Trex1 are indispensable for macrophage inflammatory regulation. / TREX1 es una exonucleasa que se identificó inicialmente en células de mamífero y debido a su papel en el metabolismo del ADN, se supuso que estaría involucrada en la reparación del daño en el ADN y en el cáncer. Sorprendentemente, cuando años más tarde se generaron los ratones TREX1-/-, éstos no presentaban una mayor incidencia de cáncer, y sin embargo presentan una miocarditis inflamatoria que conlleva la muerte prematura. Posteriormente, las mutaciones de TREX1 en humanos han sido asociadas a diversas enfermedades que presentan en común una desregulación del sistema inmunitario, como puede ser el Lupus Eritematoso Sistémico, pero también a otras que implican afectaciones neurológicas como el AGS. Nbs1 es una proteína de 95 kDa y fue identificado por primera vez a causa de su interacción con Mre11 y Rad50 (complejo MRE11). Este complejo es esencial para la detección y reparación de las roturas de tipo DSB y se halla presente en toda la escala evolutiva. Nbs1 se encuentra mutado en pacientes que sufren el síndrome de NBS. Estos pacientes padecen inmunodeficiencia, defectos en el sistema nervioso y además tienen incremento de la incidencia de cáncer. Esta tesis se compone de tres partes donde se caracteriza la función de estas dos proteínas en macrofagos activados de manera pro-inflammatoria. En la primera parte caracterizamos la región promotora de TREX1 y se describe su inducción tras la estimulación con IFN-γ. La segunda parte describe cómo y en qué medida la falta de TREX1 en macrófagos afecta a su función tras la estimulación de receptores TLR, y además explica los mecanismos moleculares que pueden subyacer en los procesos de autoinmunidad en ausencia de TREX1. Finalmente, la última parte, se centra en Nbs1, donde se analiza la importancia de esta proteína en las funciones de los macrófagos y en la respuesta inmunitaria in vivo. Los datos en su conjunto concluyen que TREX1 y Nbs1 son proteínas esenciales en la función pro-inflamatoria de los macrófagos y aunque las funciones de estas proteínas en los macrófagos son diferentes, en esencia, ambas son indispensables y cruciales para el metabolismo del ADN. Esto sugiere que la regulación estricta de las cantidades de ADN libre en los macrófagos es importante en su acción pro-inflamatoria, pero no en la respuesta anti- inflamatoria y que tanto Nbs1 como TREX1 son indispensables para la regulación inflamatoria de los macrófagos.

L'esòfag, estructura tubular interposada entre la regió faríngea i la resta del tub digestiu situat a l'abdomen, no és un òrgan mancat d'importància, com pugui semblar a ull nu. Nosaltres l'hem triat com a tema de la nostra Tesi, perquè creiem que es tracta d'un òrgan l'estudi del qual se'ns presenta sumament atractiu sota qualsevol punt de vista, ja sigui embriològic, anatòmic, fisiològic o patològic incloent-hi el seu tractament. Així mateix considerem que hem de fer especial menció de la porció més distal de l'esòfag o regió esòfago-gàstrica. / El esófago, estructura tubular interpuesta entre la región faríngea y el resto del tubo digestivo situado en el abdomen, no es uno órgano falto de importancia, como pueda parecer un ojo desnudo. Nosotros el hemos escogido como tema de nuestra Tesis, porque creemos que se trata de un órgano el estudio del cual se nos presenta sumamente atractivo bajo cualquiera punto de vista, ya sea embriológico, anatómico, fisiológico o patológico incluyendo su tratamiento. Así mismo consideramos que tenemos que hacer especial mención de la porción más distal del esófago o región esófago-gástrica.

Tesis por compendio de publicaciones / Introducción: La lactancia materna es la forma de alimentación recomendada, siempre que sea posible, al menos durante los primeros seis meses de vida. Si esto no es posible, existen fórmulas artificiales con las que poder cubrir los requerimientos nutricionales de los recién nacidos. La exposición a determinados factores ambientales, incluidos factores nutricionales, durante el periodo intrauterino y los meses posteriores al nacimiento podría determinar la susceptibilidad a determinadas enfermedades en etapas posteriores de la vida. Se ha demostrado una menor susceptibilidad a determinadas enfermedades en niños alimentados con leche materna frente a aquellos que lo han sido con fórmulas infantiles, incluyendo menor riesgo de enfermedades gastrointestinales y respiratorias, y menor riesgo de obesidad y diabetes en la edad adulta. El hecho de que estos cambios se prolonguen hasta la edad adulta sugiere que la exposición temprana a factores nutricionales podría estar asociada a cambios epigenéticos. Las poliaminas son policationes orgánicos presentes en todas las células de mamíferos. Su interés es debido a su función, siendo esenciales para la proliferación y la diferenciación celular. Su presencia ha sido demostrada en la leche humana siendo las poliaminas más abundantes la espermidina y la espermina. Objetivos: El objetivo de la presente Tesis ha sido evaluar si la adición de poliaminas tras el procesado podría mejorar el desarrollo del sistema inmune y producir un patrón de colonización microbiana similar al obtenido mediante lactancia materna utilizando como modelo ratones BALB/cOlaHsd. Métodos: 60 crías de ratón de 14 días de edad fueron distribuidas aleatoriamente en cuatro grupos: 1) ratones sin destetar con lactancia normal; 2) ratones destetados precozmente alimentados con fórmulas infantiles; y 3) tres grupos distintos de ratones destetados precozmente alimentado con una fórmula infantil suplementada con concentraciones crecientes de poliaminas. Se analizó la microbiota intestinal mediante fluorescent in situ hybridization (FISH) y detección por citometría de flujo y PCR cuantitativa. Además, se analizaron poblaciones linfocitarias mediante citometría de flujo y la expresión de genes relacionados con la activación, proliferación y diferenciación de linfocitos T y B. Resultados y Conclusiones: En relación a la microbiota, nuestros resultado muestran, por primera vez que nosotros sepamos, que la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas modula las poblaciones bacterianas de Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. y bacterias similares a Akkermansia, incluida A. muciniphila, hasta niveles parecidos a los del grupo alimentado con lactancia normal en un efecto que parece ser dependiente de la dosis de poliaminas administrada. De forma similar a lo que ocurría con la microbiota intestinal, la suplementación de la fórmula infantil con poliaminas induce cambios en las poblaciones linfocitarias y la expresión génica, incrementándose el porcentaje de linfocitos B en sangre, y linfocitos CD4+, CD8+ y B en bazo, en una proporción dependiente de la dosis de poliaminas; y reduce las diferencias en la expresión de los genes Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 y Tlr4 cuando se compara con lactancia normal. Los resultados obtenidos de este estudio ayudan a comprender la compleja interrelación entre la nutrición, el sistema inmune y la microbiota intestinal durante el periodo de lactancia. Los resultados obtenidos deberían ser estudiados en humanos, ya que de demostrarse efectos similares, la suplementación de las fórmulas infantiles con poliaminas podría contribuir a un mejor desarrollo, con un efecto beneficioso sobre la salud, de niños alimentados con fórmulas. / Introduction: As has been recommended by a large number of health or breastfeeding organisations, whenever feasible, infants should be fully breastfed for at least six months. If full breastfeeding is not possible, safe and suitable infant formula should be used. According to the early programming theory, environmental exposure, including nutritional exposure during the intrauterine stage and during the perinatal months of life, might make children more susceptible to some diseases later in life. Indeed, it has been demonstrated that infants who have been breastfed have a lower susceptibility to some diseases than infants who were fed with artificial manufactured formulas. The fact that these changes are extended into adult life suggests than early exposure to nutritional factors are associated with epigenetic changes. Polyamines are organic polycations that are present in all mammalian cells. They have significant interest due to their reported biological roles in eukaryotic cells, because they are essential to cell proliferation and differentiation. Their presence has been demonstrated in human milk as being the most abundant spermidine and spermine polyamines. Objectives: the main objective of the present thesis was to evaluate whether the addition of polyamines after processing could improve immune system development and the microbial colonization pattern in a similar way that breast feeding do. Methods: A total of 60 mice pups (14-days old) were randomly assigned to four-day intervention groups as follows: 1) breastfed unweaned pups; 2) early weaned pups fed with infant formula; and 3) three different groups of early weaned pups fed with infant formula supplemented with increasing levels of polyamines. After a four-day diet intervention, samples were obtained. Microbiota composition was analysed by fluorescent in situ hybridization (FISH) coupled with flow cytometry detection, and by quantitative PCR targeted at 14 bacteria genus and species. The lymphocyte populations in the blood, spleen and mesenteric lymph nodes were analysed by fluorescence activated cell sorting (FACS); moreover, the expression of genes encoding T-cell and B-cell activation, proliferation and differentiation, as well as Toll-like receptors (TLRs), in the small intestinal tissues was assessed using a 96-well RT-PCR arrays. Results and Conclusions: Regarding the microbiota composition, independently of the analysis methods, our results showed, for the first time to our knowledge, that supplementation of infant formula with polyamines modulates Bacteroides-Prevotella, Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp. and Akkermansia-like bacteria groups, including A. muciniphila, to levels closely related to normal lactation group, in a dose-dependent manner and immune system parameters in infant formula feeding compared to mice with normal lactation. Similar to microbiota, the supplementation of manufactured infant formula in polyamines induces changes in lymphocyte populations and gene expression, increasing the percentage of B-cells in blood and CD4+, CD8+ and B-cells in the spleen in a dose-dependent manner, and it reduces differences in the expression of Cd1d1, Cd40, Hdac5, Hdac7, Clcf1 and Tlr4 genes compared with normal lactation. The results obtained from this study highlight the complex interplay between nutrition, the immune system and microbial colonization patterns during lactation. Such an effect requires further investigation in human infants because supplementation of an infant formula in polyamines might contribute to healthy gastrointestinal tract development in children fed with commercial formula.

L’entitat clínica coneguda com Síndrome metabòlica (SM) es troba fortament condicionada per factors ambientals com una dieta inadequada o el sedentarisme i actualment afecta entre un 10-25% de la població adulta mundial, en alguns països i grups d’edat aquest percentatge arriba a ser del 50-60%. El fet de patir SM augmenta el doble el risc patir malaltia cardiovascular (MCV) i en cinc vegades el risc de patir Diabetis Mellitus tipus 2. A partir d’estudis observacionals sobre poblacions amb baixa incidència de SM, les quals consumien grans quantitats d’oli de peix, es va veure que els àcids grassos poliinsaturats de cadella llarga omega-3 (AGPI omega-3) eren clau per a la prevenció i millora de la SM. Però al tractar-se de àcids grassos amb varies instauracions en la seva estructura química, són vulnerables a la lipoperoxidació en una situació d’estrès oxidatiu. En el cas de la SM, l’estrès oxidatiu juga un paper clau en dos sentits, per un costat pot intervenir en el desenvolupament de factors de risc com l’aterosclerosi o la resistència a la insulina i per l’altre ser secundari a processos patològics previs com l’obesitat. Diferents estudis han classificat els antioxidants d’origen fenòlic com els antioxidants externs que disposen de mes afinitat per a les membranes, resultant així els antioxidants més eficaços per disminuir l’oxidació de les membranes riques en AGPI. Per tot això, aquest treball pretén demostrar que una dieta enriquida en AGPI omega-3 prevé la SM i l’estrès oxidatiu associat a aquesta i com aquesta millora es pot incrementar amb l’administració dietètica dels polifenols provinents de la llavor de raïm. / La entidad clínica conocida como Síndrome metabólico (SM) está fuertemente condicionada por factores ambientales tales como un dieta inadecuada o el sedentarismo y actualmente afecta entre 10-25% de la población mundial adulta, en algunos países y grupos de edad este porcentaje llega a valores de 50-60%. El hecho de padecer SM aumenta dos veces el riesgo de padecer enfermedad cardiovascular (ECV) y en cinco veces el riesgo de padecer Diabetes Mellitus tipo 2. A partir de estudios observacionales sobre poblaciones con baja incidencia en SM, las cuales consumían grandes cantidades de aceite de pescado, se observó que los ácidos grasos poliinsaturados omega-3 (AGPI omega-3) eren claves para la prevención y mejora del SM. Pero al tratarse de ácidos grasos con varias instauraciones en su estructura química son vulnerables a sufrir peroxidación lipidica en una situación de estrés oxidativo. En el SM el estrés oxidativo juega un papel clave en dos sentidos, por un lado puede intervenir en el desarrollo de factores de riesgo como la ateroesclerosis o la resistencia a la insulina, por otro lado puede ser secundario a procesos patológicos previos como por ejemplo la obesidad. Diferentes estudios han clasificado los antioxidantes de origen fenolico como los antioxidantes externos con más afinidad por las membranas ricas en AGPI. Por todo esto, este trabajo pretende demostrar que una dieta enriquecida en AGPI omega-3 previene el SM y el estrés oxidativo asociado a esta y como esta mejora se puede ver incrementada con la suplementación dietética de los polifenoles procedentes del hueso de las uvas. / Metabolic Syndrome (MS) is a clinical entity which is strongly influenced by environmental factors such as unhealthy diet and poor physical inactivity. Nowadays MS affects approximately 10-25% adults worldwide; in some countries and age groups the percentage can be as high as 50-60%. MS increases the risk of suffering from cardiovascular disease and type 2 diabetes by 2-and 5-fold, respectively. The evidence showed that populations with low incidence of MS consume large amounts of fish oil. Therefore were established omega-3 PUFA as a key to prevention and improvement of SM. The chemical structure of PUFA with double bounds in it leads these fatty acids to lipoperoxidation in a situation of oxidative stress. In SM oxidative stress plays a key role in two ways, on one hand might intervene in the development of risk factors such as atherosclerosis or insulin resistance and on the other hand could be secondary to a previous pathological process such as obesity. Different studies have classified the phenol antioxidant as external antioxidants source which have more affinity for membranes, resulting in the most effective antioxidants to reduce oxidation membranes rich in PUFA. All in all, this study aims to demonstrate that a diet rich in PUFA omega-3 prevents SM and oxidative stress associated. Also this improvement can be increased with the administration of dietary polyphenols from grape seed.