Actualmente la principal limitación del trasplante hepático es la falta de donantes. Para suplir la carencia de órganos en muchas ocasiones se recurre al trasplante de órganos que no son óptimos para este fin, los denominados hígados subóptimos. Entre estos injertos destacan, por su prevalencia, los hígados esteatósicos. Los hígados esteatósicos son más susceptibles a la lesión de isquemia/reperfusión (I/R) asociada al trasplante hepático que los hígados no grasos, y por ello presentan un mayor riesgo de disfunción tras ser trasplantados. Estudios llevados a cabo en modelos de isquemia normotérmica señalan hacia una mayor alteración en la microcirculación hepática, un aumento en la acumulación de neutrófilos, una mayor liberación de mediadores inflamatorios o una mayor lesión por estrés oxidativo como posibles causas de esta mayor vulnerabilidad a la lesión de I/R.El Precondicionamiento (PC) isquémico, una estrategia quirúrgica basada en la aplicación de breves periodos de isquemia-reperfusión antes de someter al órgano a una I/R prolongada, ha resultado eficaz en la protección de los hígados grasos frente a la lesión de I/R en modelos de isquemia normotérmica, donde se sugiere que la preservación de los niveles de ATP ejercida por el PC isquémico tendría un papel determinante en la protección del PC isquémico en este tipo de hígados. Diversos autores sugieren que el NO y la AMPK están implicados en la protección del PC isquémico frente a la lesión de I/R en modelos experimentales de isquemia normotérmica.Sobre estas bases, en esta tesis se plantearon los siguientes objetivos: (1) estudiar si el PC isquémico, modulando los mecanismos implicados en la mayor vulnerabilidad de los hígados grasos a la lesión de I/R, protege frente a la lesión hepática y pulmonar asociada al trasplante de hígados grasos. Así como la evaluación de la implicación del NO en los efectos protectores del PC isquémico; (2) evaluar el papel de la AMPK y el NO en los efectos del PC isquémico en el metabolismo energético de los hígados grasos sometidos a trasplante.En las condiciones evaluadas en la presente tesis las alteraciones en la microcirculación, la acumulación de neutrófilos o la producción de TNF-α no parecen ser los mecanismos responsables de la mayor susceptibilidad de los hígados grasos a la lesión de I/R; por contra, el estrés oxidativo tiene un papel fundamental en la mayor susceptibilidad que presentan este tipo de hígados a la lesión de I/R asociada al trasplante de hígado. El PC isquémico protegió a los hígados esteatósicos frente a la lesión de I/R asociada al trasplante hepático. El PC isquémico, modulando el sistema xantina/XOD, redujo la lesión hepática y pulmonar asociadas al trasplante de injertos esteatósicos. El NO está implicado en la protección del PC isquémico sobre la lesión hepática y pulmonar asociada al trasplante de hígados esteatósicos. Este mediador vasoactivo al modular el sistema xantina/XOD y los efectos nocivos de los RLO, protegió frente a los desórdenes locales y sistémicos asociados al trasplante hepático. La síntesis de NO durante el PC isquémico es inducida por la activación de la AMPK. Estrategias farmacológicas basadas en la administración de activadores de la AMPK o donadores de NO simulan los efectos beneficiosos del PC isquémico sobre la lesión de I/R asociada al trasplante de injertos no esteatósicos. Si bien los activadores de la AMPK son también beneficiosos en el caso de los injertos esteatósicos, los donadores de NO resultaron ineficaces en este tipo de injertos. En estas condiciones, el NO se combinó con el exceso de RLO presentes en este tipo de injertos generando peroxinitritro, agravando aún más la vulnerabilidad de este tipo de hígados a la lesión de I/R. / Despite the significant improvement during the last decade, the dramatic shortage of organs for transplantation obliges us to consider use of steatotic grafts, which are more vulnerable to hepatic ischemia-reperfusion (I/R) injury than non-steatotic livers. The use of steatotic livers is associated with an increased risk of primary non-function or dysfunction after transplantation. Several hypotheses have been put forward to explain why steatotic livers are more liable to I/R injury than normal livers. These include increases in: oxidative stress, neutrophil infiltration, microcirculatory alterations and release of tumor necrosis factor  (TNF) from Kupffer cell activation. Recently, it has been reported that ischemic preconditioning, based on brief episodes of ischemia and reperfusion, protects steatotic livers undergoing normothermic ischemia. Results obtained suggest that ATP preservation induced by ischemic preconditioning may be central to the protection of steatotic liver against the hepatic I/R injury. NO and AMPK are candidates for mediating ischemic preconditioning. In the present work we examined: (1) whether preconditioning protects against hepatic and lung damage associated with steatotic liver transplantation and the effect of preconditioning on the mechanisms involved in the increased vulnerability of fatty livers to hepatic I/R. Evaluate the role of NO in ischemic preconditioning; (2) Whether AMPK and NO are involved in the benefits of ischemic preconditiong on energy metabolism in steatotic liver transplantation. Steatotic and non-steatotic liver grafts were similar in their blood flow, neutrophil accumulation, and TNF release after transplantation. Neither the increased vulnerability of fatty livers of Zucker rats to hepatic I/R injury associated with liver transplantation nor the protection conferred by preconditioning could be explained by changes in hepatic blood flow, neutrophil accumulation, and TNF release after transplantation under the conditions evaluated. However, in the presence of steatosis, lipid peroxidation injury increased. Preconditioning reduced the xanthine accumulation and percentage of xanthine oxidase seen in steatotic liver grafts during cold ischemia, and conferred protection against liver and lung damage following transplantation. The benefits of preconditioning could be mediated by nitric oxide. NO reduce the deleterious effects of ROS and modulate XDH/XOD activity, thus protecting steatotic livers against hepatic I/R injury. Preconditioning, through AMPK activation, induce NO synthesis. Pharmacological strategies based in pretreatment with AMPK activators or NO donors could protect against I/R injury associated with non-steatotic liver transplantation. However, the effective dose of exogenous NO may differ in both steatotic and non-steatotic livers.The injurious effects of exogenous donors on hepatic injury and oxidative stress in steatotic grafts were associated with increase nitrotyrosine levels. The results of nitrotyrosines suggest that peroxynitrite is a predominant form of ROS in steatotic grafts. This could explain, at least partially, the increased vulnerability of steatotic grafts to I/R injury and the injurious effects of exogenous NO on steatotic liver transplantation.

L'objectiu d'aquest estudi és aprofundir en els mecanismes bàsics d'aclimatació a nivell perifèric induits per l'Exposició a Hipòxia Hipobàrica Intermitent (EHHI). Degut a les lògiques limitacions per a la realització d'aquest tipus d'estudis en éssers humans, es va procedir a reproduir en rates de laboratori protocols d'EHHI capaces d'induir les respostes hematològiques descrites en humans. Per dur a terme aquesta tasca decidírem realitzar diferents estudis invasius a nivell del miocardi (MIO), del diafragma (DFG) i del tibialis anterior (TA). S'analitzaren paràmetres com la densitat capil·lar (CD), la densitat fibril·lar (FD), l'àrea de la secció transversal de les fibres musculars (FCSA), la màxima distància de difusió, el nombre de capil·lars en contacte amb cada fibra (NCF) i el percentatge de cada tipus de fibra muscular (FOG, FG, SO), entre d'altres. Per altra banda, també s'estudiaren activitats enzimàtiques relacionades amb el metabolisme oxidatiu (lactat dehidrogenasa, LDH, i citrat sintasa, CS), així com la concentració de proteïnes totals i de la mioglobina (Mb). El programa de quatre setmanes d'EHHI de quatre hores per sessió, ha demostrat ser un estímul eficaç per induir un grau variable d'angiogènesi en tots els músculs estudiats, així com canvis en la morfometria de les fibres i alteracions de les activitats enzimàtiques, depenent en tots els casos de l'activitat desenvolupada pels músculs i de la seva composició. / El objetivo de este estudio es profundizar en los mecanismos básicos de aclimatación a nivel periférico inducidos por la exposición a hipoxia hipobárica intermitente (EHHI). Debido a las lógicas limitaciones para la realización de este tipo de estudio en seres humanos, procedimos a reproducir en ratas de laboratorio protocolos de EHHI capaces de inducir las respuestas hematológicas descritas anteriormente en humanos. Para ello decidimos realizar estudios invasivos a nivel del miocardio (MIO), del diafragma (DFG) y del tibialis anterior (TA). Se analizaron parámetros como la densidad capilar (CD), la densidad fibrilar (FD), el área de la sección transversal de las fibras musculares (FCSA), la máxima distancia de difusión desde la membrana celular al centro de la fibra (MDD), el número de capilares en contacto con cada fibra muscular (NCF) y la tipología de cada tipo de fibra muscular (FOG, FG, SO), entre otros. Por otra parte, se estudiaron actividades enzimáticas relacionadas con el metabolismo oxidativo (lactato deshidrogenasa, LDH, y citrato sintasa, CS), así como la concentración de las proteínas totales y de la mioglobina (Mb). El programa de cuatro semanas de EHHI de cuatro horas por sesión, ha mostrado ser un estímulo eficaz para inducir un grado variable de angiogénesis en todos los músculos estudiados, así como cambios en la morfometria de las fibras y alteración de las actividades enzimáticas, depenendiendo en todos los casos de la actividad desarrollada por los músculos y de su composición. / SUMMARY: The aim of this study was to go deeper into the knowledge of the basic mechanisms of adaptive peripheral responses during short intermittent hypobaric hypoxia exposure (IHHE). For this purpose different studies in myocardial, diaphragm and tibialis anterior muscles were carried out.We analysed some morphofunctional parameters such as capillary (CD) and fibre density (FD), fibre cross-sectional area (FCSA), maximal diffusion distance from surrounding capillaries to the fibre core (MDD), number of capillaries contacting a fibre (NCF), muscle fibre type composition (FOG, FG, SO) and other characters. We also studied enzymatic activities related to oxidative metabolism (lactate dehydrogenase, LDH, and citrate sintase, CS), the total protein and the myoglobin concentration.The IHHE programme of 4-hour daily sessions during 4 weeks demonstrated to be an efficient stimulus to produce a different level of angiogenesis in all studied muscles. Moreover, it seems to indicate that morphofunctional changes in muscle induced by short-intermittent exposure to hypobaric hypoxia not only are related to the activity and to the fibre contractile properties, but also to itsoxidative character.

The aim of this work is to gain insight in the understanding of the biogenesis of membrane proteins, specially their folding, assembly and ER-exit. Our model is the human cystinuria transporter rBAT- b0,+AT. Disulfides and N-glycans are crucial for the correct folding, assembly and traffic of proteins. So we identified the disulfides and the N-glycans of the transporter and analysed their role in biogenesis of the transporter. In order to analyse the disulfide connectivity of rBAT, cysteine residues were mutated to serine, and we used mass-tagging of sulfhydryl (-SH) groups with mPEG5000-maleimide (mPEG) under denaturing conditions. A molecule of mPEG attaches to a –SH group, shifting the apparent molecular weight of the protein of interest by aprox. 5 kDa, which is easily detectable in SDS-PAGE. These experiments show that, in the presence of b0,+AT, the rBAT ectodomain is completely oxidised and contains 3 disulfide bonds. The pegylation pattern of C242S and C273A suggest that they form a disulfide bond. Pulse-chase analysis show that mutants C242S to C666S are retained in the ER and degraded, while C673S and C685S displayed slower stability and maturation rate. Interestingly, the double mutant C673S-C685S had a wild-type behaviour. These results strongly suggested that the other 2 disulfides present in rBAT ectodomain are C571-C666 and C673-C685. Further analysis showed that the only disulfide bond that is stably formed in the absence of the others is C242-C273, suggesting that it is the first to form in rBAT. It was also observed that when rBAT is expressed in the absence of b0,+AT, its oxidative folding is impaired, indicating that b0,+AT is necessary for the folding of rBAT. Its main role may be the stabilization of the oxidation of C571 to form the C571-C666 disulfide. This step seems to occur post-translationally and possibly defining the end of the oxidative folding process. In order to analyse the role of the N-glycans of rBAT the N-glycan consensus sites were mutated to serine or alanine. Pulse assays showed that rBAT contains 5 N-glycans. Pulse-chase and Endo H assays showed that all mutants display a wild-type like stability and maturation, except for the S577A mutant. Further studies showed that the N332 probably sustains degradation of unassembled rBAT and that the N-glycan N575 is necessary and sufficient for a wild-type-like maturation rate. The C-terminal loop of rBAT plays a key role in biogenesis as its deletion causes retention in the ER and subsequent degradation of rBAT. Analysis of this C-terminal loop showed that, when mutated, residues S675A, L678A and N679A have a similar maturation defect than the N-glycan mutant S577A and that mutants Y674A, L681A and Y682A showed little maturation and stability, explaining, at least in part, the results obtained when the whole loop is deleted. When expressed in the C673S-C685S background, some single loop mutants show an important decrease in rBAT stability and maturation. This synergistic effect suggests that the disulfide bond masks part of the maturation and stability effects of these loop residues, and that the absence of the disuflide bond potentiate the misfolding and maturation defects caused by these mutations. Finally, the biogenesis effects of some loop residues in the S577A background suggest that residues S675, L678 and N679 interact functionally and/or structurally with the N-glycan N575 and that they may form part of an ER-exit conformational signal in the luminal domain of the transporter. / El objetivo de este trabajo es el de estudiar la biogénesis de las proteínas de membrana. El modelo utilizado para ello es el transportador humano rBAT- b0,+AT, cuya ausencia causa cistinuria. Para estudiar el ensamblaje, el plegamiento y el tráfico del heterodímero se han analizado los puentes disulfuro, los N-glicanos y la cola C-terminal de rBAT. Los resultados muestran que el ectodominio de rBAT se encuentra completamente oxidado formando 3 puentes disulfuro: C242-C273, C571-C666 y C673-C685. Probablemente el primero en formarse es C242-C273 pues es el único capaz de formarse establemente en ausencia de los demás. Cuando una de estas cisteínas se encuentra desapareada, ésta interacciona con los demás residuos de cisteína evitando la correcta formación de los demás puentes disulfuro. La subunidad ligera b0,+AT es necesaria para el plegamiento oxidativo de rBAT. Parece que su presencia estabiliza la oxidación de C571 para formar el puente disulfuro C571-C666. Este puente disulfuro y el C242-C273 son esenciales para la biogénesis del transportador, no así el puente disulfuro C673-C685. rBAT contiene 5 N-glicanos. Ninguno de ellos es esencial para el transportador, aunque son necesarios para una degradación eficiente, para la salida del RE y para que el transportador sea plenamente funcional. De hecho, el N-glicano N575 es necesario y suficiente para conferir una eficiencia máxima de maduración al transportador. El mutante que elimina la cola C-terminal de rBAT, Δ673-685, es retenido en el RE y posteriormente degradado, lo que muestra la importancia de este element en la biogénesis del transportador. El estudio de los mutantes simples y dobles de esta región muestra que estos residuos son importantes para la estabilización y maduración del heterodímero, lo que explica, al menos en parte, el fenotipo observado en Δ673-685. El estudio de los mutantes dobles de la cola C-terminal de rBAT y del N-glicano N575 o del puente disulfuro C673-C685 sugiere que estos elementos podrían interaccionar física y/o funcionalmente con residuos de la cola C-terminal de rBAT para promover la maduración eficiente del transportador, y que podrían constituir parte de una señal conformacional de salida del RE en el dominio luminal de rBAT.

Se han realizado dos experiencias con un total de 104 hembras caprinas de raza Murciano-Granadina pertenecientes al EMEGA de Guadalupe (Murcia), con el fin de determinar los valores de actividad catalítica de diversas enzimas (ASAT, ALAT, γ-GT, LDH y F.Al.), según el "status" sexual de los animales. En un primer grupo se ha trabajado con 54 cabras con edades comprendidas entre 12 y 14 meses y que todavía no habían tenido ningún parto. En una segunda experiencia se han tomado dos lotes de 25 cabras multíparas con edades entre 3'5 y 4 años. Para la primera experiencia se realizaron las tomas de sangre tres meses antes del inicio de las cubriciones (fase 1) con intervalos de 15 días (6 muestras), 7 muestras durante la fase de gestación (fase 2) y una tercera fase de lactación con una duración de 150 días (6 muestras). Para las hembras multíparas se tomaron 4 muestras con periodicidad mensual para el lote de gestantes y 7 muestras para el lote de hembras en la fase de lactación. La determinación de la actividad enzimática se ha llevado a cabo por técnicas espectrofotométricas mediante métodos automatizados. En la elaboración de los resultados se han empleado métodos estadísticos paramétricos para ASAT, ALAT, γ-GT y LDH y métodos no paramétricos para F.Al. En la primera experiencia los niveles medios de actividad enzimática hallados para ASAT han sido de 44'71 ± 8'20, 49'75 ± 12'90 y 115'76 ± 26'32 UI/l para las fases anterior a la cubrición, gestación y lactación, respectivamente. El estudio comparativo por "t" de Student, revela la existencia de diferencias significativas entre las tres fases. En hembras multíparas los valores medios fueron de 47'37 ± 9'72 UI/l para la fase de gestación y de 56'25 ± 8'06 UI/l para hembras en lactación encontrándose diferencias significativas entre sí, aunque se mantiene el hecho de que tanto en hembras primíparas como multíparas los resultados más elevados corresponden a la fase de lactación. La comparación entre ambas experiencias revela, asimismo, diferencias entre fases coincidentes para ambos grupos de animales. Para ALAT, las medias conseguidas en la primera experiencia fueron (15'69 ± 3'94, 23'55 ± 5'70, 11'43 ± 3'91 UI/I para las tres fases, respectivamente, y de 10'69 ± 4'41 y 13'13 ± 3'0 UI/l en las fases de gestación y lactación en hembras multíparas, Se han encontrado diferencias significativas entre fases entre experiencias.Los niveles medios de actividad catalítica de γ-GT para la primera segunda experiencia y dentro de las fases estudiadas fueron de 25'92 ± 5'65, 19'32 ± 5'61 y 24'11 ± 6'71 y 35'22 ± 7'82 y 40'85 ±6'60 UI/I, respectivamente, obteniéndose que tanto en hembras primíparas como multíparas los valores más bajos se detectaron durante la gestación, aunque los resultados tanto entre fases como entre experiencias para fases coincidentes se mostraron significativamente diferentes.En el caso de LDH los valores medios de actividad en cabras primíparas fueron en las fases anterior a la cubrición, durante la gestación y lactación de 161'56 ± 34'0, 79'80 ± 21'63 y 164'18 ± 40'53 UI/l, respectivamente, no hallándose diferencias significativas entre las fases l y 3, En hembras multíparas lo resultados medios hallados fueron de 115'20 ± 25'24 y 150'27 ± 20'31 UI/l para la tercera gestación y tercera lactación, respectivamente. Los niveles durante la gestación fueron significativamente inferiores a los encontrados en lactación tanto en hembras primíparas como en hembras multíparas. La comparación entre ambas experiencias determinó diferencias significativas. El estudio no paramétrico de F.Al. determinó unos valores para la mediana de 162'2, 117'4 y 123'5 UI/I en la primera experiencia y según las fases y de 149'4 y 161'9 UI/I para hembras multíparas. No se encontraron diferencias significativas entre gestación y lactación. / Two experiments have been conducted on a total of 104 Murciano-Granadina female goats belonging to EMEGA in Guadalupe (Murcia). The aim was to determine the values of catalytic in various enzymes (ASAT, ALAT, γ-GT, LDH and F.Al.) according to the sexual status of the animals. In the first experiment 54 goats aged between 12 and 14 months were used. In the second experiment two groups of goats aged between 3'5 and 4 years were used. In the first trial blood samples were taken three months before mating (phase 1) at intervals of 15 days, 7 samples during gestation (phase 2) and 6 samples during lactation (phase 3) over period of 150 days. In goats been taken 4 samples every month for animals during gestation and 7 samples for goats during lactation. Enzyme activity was determined using automated spectrophotometric techniques. The results were calculated using parametric statistical methods for ASAT, ALAT, and -GT and LDH, and non parametric methods for F.Al. There are significative differences on the average levels of ASAT, ALAT and -GT serum activity depending on the «sexual status» of the goat. The -GT activity depends on the age, having the young females enzyme activity levels lower than those who are in third gestation and third lactation period.There is a decrease in LDH catalytic activity levels during gestation in comparison with lactation period in both multiparous and primiparous goats. LDH is the on1y enzyme with has not significative differences between the period prior to breeding and first lactation period.The values found for the alkaline phosphatase enzyme activity had great individual variations in both multiparous and primiparous goats.

OBJETIVOS Esta tesis pretende desarrollar una herramienta de fácil aplicación, fiable, consistente y no invasiva que sea capaz de evaluar el estatus del sistema circadiano. Para conseguir este objetivo, se plantearon los siguientes objetivos específicos: 1. Crear un algoritmo para la evaluación ambulatoria y no invasiva del sistema circadiano mediante la integración de los ritmos de temperatura periférica, actividad motora y posición corporal en la variable compuesta TAP. 2. Validar la variable integrada TAP para la detección de sueño y vigilia en comparación con el gold standard para este propósito, la polisomnografía. Además, se pretende comprobar si TAP mejora la detección de sueño con respecto a las estimaciones obtenidas mediante la actigrafía convencional. 3. Transferir la utilidad de TAP, implementada en un dispositivo de registro ambulatorio en una patente internacional. 4. Evaluar la validez de la variable TAP para la detección de alteraciones circadianas en condiciones patológicas: 4.1. Revisar los conocimientos previos sobre cáncer y ritmos circadianos, prestando especial atención a los tratamientos que tienen en cuenta el sistema circadiano. 4.2. Estudiar las diferencias interindividuales del ritmo de actividad-reposo que podrían potencialmente afectar el resultado del tratamiento en pacientes de cáncer. 4.3. Evaluar cómo los tratamientos cronomodulados afectan la sincronización interna de diferentes ritmos circadianos en pacientes de cáncer. 4.4. Evaluar las perturbaciones circadianas de sujetos con deterioro cognitivo leve con el fin de establecer la utilidad de la variable TAP para evaluar objetivamente la progresión de la enfermedad. METODOLOGÍA En esta tesis, se evaluaron tres ritmos y procesaron con el fin de obtener la variable TAP que después se aplicó en varias condiciones de salud y enfermedad. Ritmo de temperatura Este ritmo se evaluó mediante un sensor de temperatura (Thermochron iButton DS1921H, Dallas, Maxim) cosido a una muñequera de modo que la superficie del sensor quedara en contacto con la arteria radial de la muñeca de la mano no dominante. Ritmo de actividad motora y posición corporal Estos ritmos se evaluaron gracias a un actímetro (Hobo Pendant G Acceleration Data Logger, Massachusetts, USA) colocado en el brazo no dominante mediante un brazalete deportivo. De la información proporcionada por el actímetro, se definieron 2 variables: actividad motora, expresada como grados de cambio de posición y posición corporal, definida como el ángulo entre el eje X y el plano horizontal. Procesamiento de los datos Cada variable se normalizó entre 0 y 1 después de haber eliminado los artefactos mediante inspección visual de los datos. Además, los datos de temperatura se invirtieron de modo que los valores máximos de todas las variables coincidieran en el mismo momento. Después, calculamos la media de las variables normalizadas para cada sujeto obteniendo la variable TAP cuyos valores varían entre 0 (para periodos de reposo) y 1 (para periodos activos). CONCLUSIÓN GENERAL La monitorización circadiana ambulatoria, no invasiva y fiable del estado funcional del sistema circadiano humano es un procedimiento muy útil para la prognosis de ciertas enfermedades como cáncer, deterioro cognitivo leve y perturbaciones del sueño. La monitorización conjunta y la integración de varias salidas del reloj biológico mejora la consistencia de los resultados y facilita la evaluación de la desincronización interna entre diferentes variables rítmicas. De este modo, la variable TAP, basada en la integración de los ritmos de Temperatura periférica, Actividad motora y Posición corporal, ha superado las premisas de alta fiabilidad, aceptación y versatilidad para el estudio ambulatorio y prolongado del estado del sistema circadiano humano en muy distintas situaciones de salud y enfermedad. Además, ha sido posible implementar este algoritmo en un dispositivo bajo patente internacional. / OBJECTIVES This thesis aims to develop a reliable, consistent, non-invasive and easily applied tool based on multivariable recordings, able to depict circadian system status and circadian rhythmic synchrony in humans. In order to pursue this final goal, the following specific objectives were determined: 1. To create a multivariable tool able to reliably and non-invasively ambulatory assess the circadian system status by integrating wrist temperature, motor activity and body position rhythms into the composite TAP variable. 2. To validate this integrated variable for sleep and wake detection against the gold standard for this purpose, the polysomnography and test if TAP improves the detection from that obtained with actigraphy alone. 3. To test the validity of TAP variable in specific pathological conditions with known circadian impairments: 3.1. To review, the previous knowledge on cancer and circadian rhythms, as well as circadian-based treatments for this disease. 3.2. To study the inter-individual differences in rest-activity rhythm, that could potentially affect treatment outcome, in colorectal cancer patients. 3.3. To assess how chronomodulated treatment affects internal synchronization on cancer patients by multivariable recordings. 3.4. To evaluate circadian disturbances in mild cognitively impaired subjects, a previous condition to Alzheimer’s Disease, in order to establish its potential usefulness to objectively assess the disease progression. 4. To transfer the usefulness of TAP implemented in an ambulatory monitoring device for its clinical application and its potential commercialization by an international patent. METHODOLOGY In these PhD, three rhythms were recorded and processed as to obtain an integrated variable TAP in several conditions of health and disease. Temperature rhythm The wrist temperature rhythm was assessed using a temperature sensor (Thermochron iButton DS1921H, Dallas, Maxim) attached to a double-sided cotton sport wrist band, and the sensor surface was placed over the inside of the wrist on the radial artery of the non-dominant hand. Body position and rest-activity rhythm The body position and rest-activity rhythm was assessed using an actimeter (Hobo Pendant G Acceleration Data Logger, Massachusetts, USA) placed on the non-dominant arm by means of a sports band, with its X-axis parallel to the humerus bone. From the information provided by the actimeter, we defined 2 variables: motor activity (A) and body position (P). Motor activity was expressed as degrees of change in position. Body position was calculated as the angle between the X-axis of the actimeter and a horizontal plane. Thus, P oscillated between 0º for maximum horizontality and 90º for maximum verticality. Data processing Each variable was normalized between 0 and 1, after removing artifacts identified by visual inspection of the data. In addition, wrist temperature data were inverted in such a way that maximum values for all variables occurred at the same time. We then calculated the mean of the normalized variables for each subject, obtaining TAP values which range between 0 (for rest periods) and 1 (for active periods). GENERAL CONCLUSION The reliable ambulatory monitoring of circadian system in humans has proven very relevant for disease prognosis in such conditions as cancer, mild cognitive impairments and sleep disturbances. The joint recording and following integration of several clock outputs increase results’ consistency as isolated variable artifacts are minimized by the integration of several variables and enables the calculation of internal desynchronization among different rhythmic variables. TAP, integration of wrist Temperature, motor Activity and body Position rhythms, has supported the premises of high reliability, acceptance and versatility for the long-period ambulatory study of human circadian system status under several conditions of health and disease. Thus, these positive results have facilitated the implementation of TAP’s algorithm in a new device for ambulatory monitoring and registered in an international patent, already in exploitation.

El síndrome urémico resulta de la disminución marcada de la función renal. Este estado mantenido conduce a la insuficiencia renal crónica, que se define como la destrucción progresiva e irreversible de las nefronas. En la insuficiencia renal crónica se dan cita diferentes factores de riesgo cardiovascular, la propia uremia supone un factor de riesgo. La causa principal de morbi-mortalidad en estos pacientes deriva de alteraciones en el sistema cardiovascular.El tratamiento mediante hemodiálisis ha supuesto la prolongación de la vida para estos enfermos, pero a la vez, ha acarreado problemas relacionados con alteraciones cardiovasculares.En la presente tesis se estudian las vías de síntesis de factores endoteliales que pueden estar alteradas por la enfermedad y que pueden ser las responsables, al menos en parte, de las alteraciones vasculares que padecen estos enfermos. Nos centramos en la participación de los factores endoteliales relajantes: prostaciclina, NO y EDHF, observando que la uremia produce una disminución de su síntesis o liberación en respuesta a estímulos vasodilatadores y vasoconstrictores. Las alteraciones vasculares que puede ocasionar el tratamiento con hemodiálisis, ha puesto de manifiesto que aunque disminuye la participación de NO en la respuesta vascular, aumenta la de EDHF. Estos resultados son importantes, pues suponen la aparición de un mecanismo compensatorio, capaz de mejorar la función endotelial.El estudio de la expresión de genes implicados de manera directa o indirecta en la reactividad vascular sugiere que la enfermedad podría tener su origen en un fallo metabólico, puesto que nuestros resultados muestran una menor expresión génica de DDAH-1. Esta enzima es la encargada de metabolizar las toxinas que se acumulan en la uremia y que son inhibidores enzimáticos, causando gran parte de la disfunción vascular y alteraciones neurológicas que aparecen en esta enfermedad.Las modificaciones enzimáticas que hemos observado en la insuficiencia renal crónica podrían ser dianas terapéuticas para mejorar la calidad de vida en estos enfermos. / Uremia is an established risk factor for cardiovascular and cerebrovascular accidents. Hemodialysis improves the life's quality of these patients, but this treatment also produces vascular alterations.We examined the relaxant and contractile response in forearm veins from patients with chronic renal failure before hemodialysis, on chronic hemodialysis and in veins obtained from donors (controls).We study the role of vasodilator prostaglandins (PGI2), nitric oxide (NO) and endothelium derived hyperpolarizing factor (EDHF). The contribution of these factores is diminished in chronic renal failure. This effect might contribute to, or even cause, some of the vascular features of this condition. Hemodialysis improves the endothelial function because of an augmented participation of EDHF.The study of gene expression showed a metabolic failure in the enzyme that degrades the uremic toxins. The low expression of this enzyme, dimethylarginine dimethylamino hydrolase (DDAH), could explain some vascular features and could be a therapeuthic strategy for improving life's quality of these patients.

Tras valorar la demanda al Servicio de Neurofisiología delHospital La Fe de Valencia de pruebas neurofisiológicas para estudiode disfunción eréctil masculina así como sus resultados, hemosobservado la necesidad de contemplar la erección como un sistemaneurológico complejo que excede el ámbito periférico y que por tantodebe ser valorado como tal.Intentamos demostrar con esta tesis que la utilización aisladade test neurofisiológicos no valora completamente dicho sistema ypor tanto puede inducir a errores diagnósticos.Hemos estudiado una muestra retrospectivamente de 129pacientes que acudieron al Servicio de Urología con demanda deasistencia por disfunción eréctil y fueron a su vez remitidos a Serviciode Neurofisiología, en el periodo de un año durante 1997. Una vezvalorados clínicamente y clasificados fueron estudiados con unabatería de pruebas neurofisiológicas y otras de tipo bioquímico,hormonal, vascular y de imagen. Dicha batería incluyó la realizaciónde potenciales somatosensoriales de nervio pudendo y de nervio tibialposterior, reflejo bulbocavernoso y electromiografía/neurografía delplexo lumbo-sacro. Consideramos que estas pruebas nos permitendiagnosticar o confirmar el origen neurológico de una disfuncióneréctil y en otros casos únicamente descartarlo, así como evaluar laefectividad del tratamiento.2Los hallazgos obtenidos constatan que el estudioneurofisiológico completo para el diagnóstico de una disfunción eréctilno puede obviarse, ni siquiera en el caso de que existiera unaetiología no neurológica que de por sí ya justifique la mencionadadisfunción. Demostramos que existe una correlación electro-clínicasignificativa entre cada nivel neuroanatómico lesionado y la pruebaneurofisiológica que explora dicho nivel. Sin embargo, no existe unaasociación significativa de cada una de las técnicas empleadas, nientre sí ni con factores o grupos etiológicos determinados.Tampoco existe una asociación significativa entre lospotenciales de nervio pudendo y el reflejo bulbocavernoso en aquellospacientes con patología neurológica. Un resultado alterado de estereflejo en alguno de los lados no excluye la realización de unpotencial somatosensorial de nervio pudendo, y viceversa, puestoque son pruebas complementarias en el diagnóstico neurofisiológicode una disfunción eréctil. Además pensamos que técnicamente no essostenible la realización del reflejo bulbocavernoso sólo en un lado.No existe una asociación significativa entre los potenciales de nerviopudendo y el reflejo bulbocavernoso en cada uno de los diferentesgrupos etiológicos.El empleo de cada técnica neurofisiológica tiene un sentidoporque:- El reflejo bulbocavernoso junto con la electroneuromiografíapermiten despistar el origen neurológico periférico de una DE porel elevado valor predictivo negativo que posee.- Los potenciales somatosensoriales de nervio tibial posterior y losdel nervio pudendo permiten despistar el origen neurológicocentral de una DE por el elevado valor predictivo negativo queposee, evitando el diagnóstico de falsos negativos.3Dado que no existe asociación significativa entra cada pruebaaisladamente y cada factor de riesgo o grupo etiológico, el estudioneurofisiológico de una DE debe realizarse siempre combinandovarias técnicas para poder intentar localizar la afectación neurológica:No existe una prueba neurofisiológica que aisladamente puedaetiquetar de neurogénica la etiología de una disfunción eréctil.Este estudio debe comenzar por una electroneuromiografíageneral seguida de otra circunscrita al territorio pélvico. En función delos hallazgos que obtengamos se debe diseñar el estudioneurofisiológico. La combinación de técnicas elegida exigeconocimientos exhaustivos de neuroanatomía y de la fisiopatología dela disfunción eréctil que, por ende, forman parte de la NeurofisiologíaClínica. / After valuing the request of neurophysiologic tests for the studyof masculine erectile dysfunction as well as their results to theService of Neurophysiology ("La Fe" Hospital in Valencia, Spain), wehave noticed the need to observe the erection as a complexneurological system that goes beyond the outlying scope andtherefore it should be valued as such. We intend to demonstratethrough this thesis that the isolated use of neurophysiologic test doesnot value this system completely and therefore it can induce todiagnoses' mistakes. We have studied a sample of 129 patients thatwent to the Service of Urology with the demand of attendance forerectile dysfunction retrospectively and then they were sent to theService of Neurophysiology, in the period of one year in 1997. Oncevalued clinically and classified they were treated with a series ofneurophysiologic tests on the one hand and biochemical, hormonal,vascular and image tests, on the other, which included the realizationof somatosensory evoked potentials of pudendal nerve and posteriortibial nerve, bulbocavernosus reflex and electromiography/neurography of the lumbar-sacral plexus. We consider that thesetests allow us to diagnose or to confirm the neurological origin of anerectile dysfunction and in other cases only to discard it, as well as toevaluate the effectiveness of the treatment.

Stable isotopes, as tracers of the food chain, have been used to characterize the relationship between consumers and their food since isotopic fractionation implies discrimination against certain isotopes. But stable isotope analyses (SIA) can also be carried out in fish reared with artificial diets, as gilthead sea bream (Sparus aurata), the species most cultivated in the Mediterranean. Changes in natural abundance of stable isotopes (13C and 15N) in tissues and its reserves may reflect changes in the use and turnover of nutrients as the catabolic enzymes involved in the processes of decarboxylation and deamination show a preference for the lighter isotopes. Therefore these analyses can provide us useful information about the nutritional and metabolic status of fish. The aim of this project was to determine the capacity of stable isotopes to be used as potential markers of growth capacity and rearing conditions in sea bream. In this sense, stable isotope analyses have been combined with other metabolic (cytochrome-c-oxidase, COX, and citrate synthase, CS, activities) and growth parameters (RNA, DNA). The set of results obtained from the different studies conducted in this project shows that SIA, in combination with other metabolic parameters, can serve as an effective tool in discriminating fish with better growth potential as well as sensitive marker of nutritional status and fattening. Moreover, combination of stable isotopes analysis with emerging tools such as proteomic techniques (2D-PAGE), provide new insights on the metabolic changes occurring in fish muscles during exercise induced growth. / Els isòtops estables com a traçadors de la cadena alimentària s'han utilitzat per caracteritzar la relació entre els consumidors i els seus aliments, ja que el fraccionament isotòpic implica una discriminació en contra de certs isòtops. Però les anàlisis d'isòtops estables (SIA), també es poden dur a terme en peixos cultivats amb dietes artificials, com la orada (Sparus aurata), la especie més cultivada a la Mediterrània. Canvis en l'abundància natural d'isòtops estables (13C i 15N) en els teixits i les seves reserves poden reflectir els canvis en l'ús i reciclatge dels nutrients ja que els enzims catabòlics implicats en els processos de descarboxilació i desaminació mostren una preferència pels isòtops més lleugers. Per tant, aquestes anàlisis ens poden proporcionar informació útil sobre l'estat nutricional i metabòlic dels peixos. L'objectiu d'aquest projecte va ser determinar la capacitat dels isòtops estables per ser utilitzats com a marcadors potencials de la capacitat de creixement i condicions de cria de l'orada. En aquest sentit, les anàlisis d'isòtops estables s'han combinat amb altres metabòlics (activitats citocrom-c-oxidasa, COX, i citrat sintasa, CS) i els paràmetres de creixement (ARN/ADN). El conjunt de resultats obtinguts en els diferents estudis realitzats en aquest projecte demostra que el SIA, en combinació amb altres paràmetres metabòlics, pot servir com una eina eficaç per discriminar els peixos amb millor potencial de creixement, així com a marcador sensible de l'estat nutricional i d'engreix. D'altra banda, la combinació de l'anàlisi d'isòtops estables amb les eines emergents, com ara tècniques de proteòmica (2D-PAGE), ens proporciona nous coneixements sobre els canvis metabòlics que ocorren en els músculs dels peixos durant l’increment del creixement muscular induït per l'exercici.

The deep-sea has long been considered the last region one Earth to be untouched from anthropogenic disturbances. However, studies have shown that the deep-sea is not as pristine as once assumed and it has been suggested that it may actually act as a sink for persistent organic pollutants (POPs). POPs are ubiquitous in the environment and of particular concern due to their high persistence, toxicity, bioaccumulation potential and long-range transport. Although POPs have been detected in a range of deep-sea organisms from around the world, little is known on the potential impact anthropogenic contamination may have on deep-sea ecosystems. Thus, the present thesis aimed to investigate the bioaccumulation of POPs and potential adverse effects in deep-sea organisms resulting from exposure to these contaminants. To this end, a range of different contaminants, including legacy (e.g. polychlorinated biphenyls [PCBs], dichlorodiphenyltrichloroethane [DDTs], hexachlorocyclohexanes [HCHs]) and emergent (e.g. polybrominated diphenyl ethers [PBDEs]) POPs, as well as other contaminant classes such as polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), alkylphenols (APs) and mercury (Hg) were determined in different Mediterranean deep-sea organisms. Results showed that Mediterranean deep-sea organisms are potentially exposed to a wide range of contaminants, some of them potentially causing a risk for the deep-sea ecosystem as well as for human health. In this context, the present work presents one of the few studies and the first in the Mediterranean to simultaneously determine the bioaccumulation of legacy POPs and emergent PBDEs in deep-sea organisms. Moreover, the presence of APs in deep-sea fauna has not been previously investigated and this thesis thus provides novel information on the presence of these contaminants in remote marine environment. Also, Hg contamination could be of particular concern for deep-sea environments as levels appeared to increase with increasing habitat depth of the analyzed species. Furthermore, almost all species, including the commercially exploited fish Mora moro and the highly valuable red shrimp Aristeus antennatus, exhibited Hg levels exceeding the recommended consumption value of 0.5 μg/g wet weight and thus potentially pose a risk for human health. In addition to chemical analyses, biomarkers of pollution including enzymatic activities and gene expression profiles were used to determine the potential negative effects contaminant exposure may have on deep-sea biota. The biomarkers applied include enzymes involved in the xenobiotic metabolism such as the cytochrome P450 enzymes (CYPs), carboxylesterase (CbE) and glutathione-S-transferase (GST) as well as antioxidant responses such as catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPX), glutathione reductase (GR) and superoxide dismutase (SOD). The present work has shown that despite the lack of seasonal fluctuations of abiotic factors such as temperature and salinity in the Mediterranean deep-sea, organisms exhibit significant seasonal variability in enzymatic responses related to reproductive processes and food availability. Additional findings of the present work include the differential accumulation of POPs among fish species and compared to the crustacean Aristeus antennatus. Apart from factors such as habitat and feeding strategies, results indicated that differential CYP-mediated xenobiotic metabolism capacities between fish and crustacea may influence the variations in bioaccumulation patterns of POPs such as PCBs. Furthermore, novel biomarkers such as the gene expression of vitellogenin as indicator of endocrine disruption in male fish was applied for the first time to a deep-sea fish species, namely Alepocephalus rostratus. Furthermore, a major objective of this work was to investigate the particular case of submarine canyons, which are thought to act as natural conduits for particles and associated contaminants from surface waters to the deep ocean. In this sense, the present study showed that deep-sea organisms dwelling within the head of Blanes canyon, NW Mediterranean, might be particularly at risk from experiencing detrimental effects from exposure to anthropogenic pollutants. / Durante mucho tiempo, el mar profundo se consideraba como el único medio exento de impacto antropogénico. Sin embargo, en las últimas décadas varios estudios han demostrado que el mar profundo no es tan prístino como se había pensado y que podría de hecho actuar como sumidero para contaminantes persistentes. Esta tesis tiene como objetivo de estudiar la bioacumulación de contaminantes orgánicos persistentes (COPs) en organismos del mar Mediterráneo profundo y los posibles efectos adversos que les pueden ocasionar. Con este fin, se determinaron los niveles de COPs legados como los bifenilos policlorados (PCBs), diclodifeniltricloroetano (DDTs), hexaclorociclohexanos (HCHs), y el penta- y hexaclorobenzeno (PeCB, HCB) y también de COPs emergentes como los polibromodifenil éteres (PBDEs). Además, se analizaron otros tipos de contaminantes como el mercurio (Hg) en musculatura y los metabolitos de hidrocarburos aromáticos policíclicos (PAHs) y alquilfenoles (APs) en bilis. Los posibles efectos negativos asociados con la exposición a estos contaminantes se determinaron mediante biomarcadores enzimáticos y de expresión génica, incluyendo enzimas de citocromo P450 (CYPs), glutatión-S-transferasa (GST), carboxilesterasa (CbE), glutatión peroxidasa (GPX), glutatión reductasa (GR) y catalasa (CAT). Los resultados obtenidos indicaron que los organismos de las zonas profundas del Mediterráneo están potencialmente expuestos a múltiples tipos de contaminantes de los cuales algunos pueden causar efectos adversos. En este contexto, este estudio es el primero en investigar los niveles de COPs legados y los emergentes PBDEs en organismos de gran profundidad del Mediterráneo. Además, se analizó por primera vez la presencia de metabolitos de APs en una especie abisal aportando información relevante respeto a la presencia y destino de estos contaminantes en el medio marino. Un objetivo importante de esta tesis consistía en investigar la contaminación del cañón de Blanes, ya que los cañones submarinos podrían actuar como vía de transporte preferencial de contaminantes asociados a partículas debido a su proximidad de la costa y su estructura geomorfológica. En este sentido, los resultados sugirieron que los organismos que habitan la zona de la cabecera del cañón de Blanes presentan un riesgo mayor de sufrir efectos adversos asociados a la exposición a COPs.

Skeletal deformities and pigmentary disorders, occurring from the early larval stages, affect the external appearance of fish, downgrade the market value of the final product and reduce the intensive production of flatfish juveniles. Among other factors, lipid nutrition is known to be involved in skeletogenesis and pigmentation, and unbalanced levels of lipids or essential fatty acids (EFA) or their inappropriate form of supply in the diet during larval development may lead to skeletal deformities and pigmentary disorders. This thesis aimed to study the role of dietary lipids and EFA in the incidence of skeletal and pigmentary disorders in Senegalese sole (Solea senegalensis), a flatfish of high market value produced in the Iberian Peninsula. In a first part, larvae were fed different commercial enriching products for Artemia metanauplii, presenting distinct FA profiles. Absolute levels of DHA, EPA and ARA of 9.5, 3.1 and 0.7% TFA, respectively, and n−3/n−6 PUFA, DHA/EPA, ARA/ DHA and OA/PUFA ratios of 5.2, 3.0, 0.1, 0.5, respectively, were recommended as more suitable for Senegalese sole growth performance, larval development and ossification, although the incidence of skeletal deformities was not significantly affected by the dietary FA composition. A variation, even slight, of these proportions might have modified the metabolism of lipids and disrupted the profile of lipid accumulation in the target tissues, leading to severe intestinal and hepatic steatosis and reduced larval growth and development. In a second part, larvae were fed increasing amounts of dietary peroxidized lipids (34.5 to 78.8 nmol MDA g-1 w.w.). Although no physiological alterations were detected on their FA profile, oxidative stress status, survival, growth performance, metamorphosis and ossification, fish seemed to activate antioxidant defense mechanisms in response to the dietary oxidative stress, through the consumption of the dietary vitamin E and the activation of antioxidant enzymes. Feeding fish with highly oxidized diets caused an increase of fat accumulation in the enterocytes and a reduction in bone mineralization. Vitamin E was suggested to interact with ossifying cartilage. In a third part, the effects of dietary arachidonic acid (ARA) on the incidence of skeletal malformations and pigmentary disorders were evaluated on Senegalese sole larvae. The amount of 4.5% TFA of ARA fed to larvae during the Artemia feeding period was optimal for proper growth and ossification, whereas 1 and 7.5% TFA of ARA led to imbalanced ARA/EPA and n-6/n-3 ratios that was suspected to disrupt the relative proportions of prostaglandins PGE2 and PGE3, and significantly delayed somatic growth and skeletal ossification. None of the dietary ARA contents affected the incidence of skeletal deformities in vertebral and caudal regions, but feeding larvae with high levels of dietary ARA (10.2% TFA in rotifer and 7.1% in Artemia metanauplii) during the pre-, pro- and/or post-metamorphosis induced an impaired eye migration in larvae, altered their head shape and cranial bone remodeling and induced malpigmentations. The ontogeny of the pigmentation of the ocular side skin at both morphological and molecular levels was studied in Senegalese sole larvae and the appearance of the ARA-induced pseudo-albino phenotype was characterized. A high “sensitivity window” to ARA-induced malpigmentation was identified during pre- and pro-metamorphosis stages, resulting in pseudo-albino specimens characterized by the absence of differentiation of post-metamorphic populations of chromatophores and the inhibition of the melanogenesis, reflected by the disrupted expression of genes involved in these processes (asip, pax3, cKit, mitf, tyr, trp1 and slc24a5). Supplying high ARA amounts to larvae altered their dietary ARA/EPA ratio and relative concentrations of PGE2 and PGE3, causing pigmentary disorders. This work provides helpful knowledge to understand how dietary lipids and EFA affect skeletogenesis and pigmentation processes, to improve actual Senegalese sole larval rearing and juveniles’ quality. / Las malformaciones esqueléticas y problemas pigmentarios son dos de los problemas más importantes que afectan actualmente a la producción masiva de juveniles de peces planos. Estas anomalías, que ocurren desde las etapas iniciales del desarrollo larvario, afectan su apariencia externa, disminuyen su precio final en el mercado y representan un importante cuello de botella para la acuicultura. Entre los factores implicados en la aparición de los citados desórdenes, la nutrición lipídica es uno de los parámetros más importantes afectando a la esqueletogénesis y a la pigmentación. Un desequilibrio en los niveles de lípidos y/o ácidos grasos esenciales (AGE) puede conducir a un desarrollo anormal del esquelético y despigmentación. El objetivo de la presente tesis doctoral investigó el efecto de los lípidos y AGE (particularmente el ácido araquidónico, ARA) administrados en la dieta, sobre la esqueletogénesis y pigmentación en larvas del lenguado senegalés (Solea senegalensis), especie de pez plano producido en la península Ibérica, con alto precio en el mercado. El efecto de diferentes productos comerciales con distintos perfiles de ácidos grasos (AG) usados comúnmente para enriquecer Artemia, fue evaluado sobre el crecimiento, la maduración del sistema digestivo, la deposición de lípidos en diversos tejidos objetivos, la osificación y la incidencia de deformaciones esqueléticas en larvas de lenguado senegalés, trabajos que fueron completados con el estudio de la regulación molecular de dichos procesos durante el proceso de metamorfosis. Los efectos de los lípidos oxidados en la dieta también fueron evaluados sobre el crecimiento larvario, la actividad de enzimas antioxidantes, la deposición intestinal de lípidos, la osificación y la incidencia de deformidades esqueléticas en el lenguado senegalés. Finalmente, los efectos del ARA de la dieta sobre el crecimiento, la osificación, la incidencia de malformaciones esqueléticas y los desórdenes pigmentarios fueron evaluados y relacionados con las proporciones de prostaglandinas PGE2 y PGE3. La ontogenia de la pigmentación de la piel del lado ocular fue estudiada a nivel morfológico y molecular con el fin de detectar posibles alteraciones de un perfil normal de desarrollo de la pigmentación, mientras que la aparición del fenotipo pseudo-albino inducido nutricionalmente por un exceso de ARA fue también caracterizada.