Canine Leishmaniasis (CanL) is due to Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) and is endemic in Mediterranean countries, Portugal, Latin America and Southern Asia. In the last few decades, imported and even autochthonous cases have been recorded in traditionally non-endemic areas such as Central and Northen Europe and Northen America. This is possibly due to a wider spread of the vector and especially to a larger numbers of travelling dogs. Many studies about CanL have been published in the last years and have contributed in understanding different aspects of this disease, including the alternative ways of transmission and the pathologic mechanisms underlying the clinical findings. However, CanL still remains a very challenging disease to diagnose, treat and prevent. Moreover, it is still very difficult to predict the outcome given the low numbers of controlled studies evaluating markers of prognosis. So, the main aims of the present thesis were to investigate new clinico-pathological aspects of CanL and to possibly identify useful prognostic factors. The first study demonstrated that a significant proportion of dogs with leishmaniasis have increased serum cTnI concentration, suggesting that CanL can cause cardiac disease, mainly myoand endocarditis. In the second study, the iron status and its relationship with C-reactive protein (CRP) was for the first time investigated in CanL. The results indicated that dogs with leishmaniasis have decreased serum iron, total iron-binding capacity (TIBC), unsaturated iron-binding capacity (UBIC) and percentage of transferrin saturation and increased concentrations of ferritin. Increased CRP and decreased TIBC are also risk factors for moratility. Finally, since the disease is progressively changing its geographical distribution, the last investigation was conducted in the United Kingdom (UK), currently considered a non-endemic country. The majority of dogs that were diagnosed of leishmaniasis have been adopted from an endemic area (especially from the Mediterranean countries) respect a minority that have travelled to those regions. No autochthonous cases were recognised. Purebreed dogs and those that were classified in stage D according to the Canine Leishmaniasis Working Group guidelines were at higher risk of death. Differently to what has been reported in endemic countries, serology titre at diagnosis and IRIS staging for chronic kidney disease did not influence the outcome.

Los virus de influenza A (IAVs) son los responsables de brotes pandémicos y de la mayoría de las epidemias anuales en los seres humanos, aves y cerdos. Los virus de influenza A se dividen en subtipos, basado en la naturaleza de sus glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA). La HA es una glicoproteína de superficie homotrimérica que media la entrada del virus de influenza a través de la unión celular y eventos de fusión de membranas. El bolsillo de unión al receptor de HA está rodeado por los sitios de unión de anticuerpos antigénicamente variables. Por lo tanto, los anticuerpos limitados a estos sitios debería, en principio, bloquear la unión a las proteínas del receptor, inhibiendo la entrada del virus, lo que demuestra actividad de inhibición de la hemaglutinina y la actividad de neutralización viral. Sin embargo, la subunidad 1 de HA (HA1) es altamente variable a través de los virus de influenza y tiende a cambiar bajo presión inmune; por lo tanto, fácilmente evade los anticuerpos neutralizantes inducidos por la vacunación o infecciones anteriores. Las consecuencias negativas de las infecciones por virus de influenza incentivan al mundo de la ciencia para promover el desarrollo de vacunas multivalentes contra la gripe, que tengan eficaz protección frente a todas las cepas de influenza. Por consiguiente, el campo de la bioinformática se ha convertido en una parte importante de la identificación y validación temprana de nuevas dianas terapéuticas que podrían ser un primer paso esencial en el desarrollo de una vacuna eficaz para el virus de influenza, que representa la alta variabilidad de sus determinantes antigénicos. En esta tesis se postuló que la HA1 podría representar una diana potencial para una vacuna multivalente frente a la infección por influenza virus. Por ende; el objetivo general de esta tesis fue seleccionar péptidos conservados de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la gripe, para evaluar la eficacia de los candidatos seleccionados, para inducir la inmunidad que pueda proteger a los animales contra la infección. Para desarrollar este objetivo, se llevaron a cabo tres estudios experimentales: en ratones (Capítulo 1), cerdos (capítulo 2) y pollos (Capítulo 3). En el primer estudio, se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos HA1 contra la pandemia del virus H1N1 2009 (pH1N1) y el virus de la influenza de alta patogenicidad H7N1 en un modelo de ratón (Capítulo 1). En este estudio, los ratones fueron vacunados por vía intraperitoneal con la mezcla de péptido sintético (NG34 + DC89) y desafiados ya sea con el pH1N1 ó H7N1 del virus de influenza. Una mortalidad del 85% fue observada en los ratones de control, independientemente del virus utilizado para el desafío, 80% y 66% de los ratones vacunados con péptido sobrevivieron al desafío con pH1N1 y H7N1, respectivamente, sin la detección de virus de la influenza (IV). Los ratones vacunados supervivientes se correlacionaron con la presencia de anticuerpos neutralizantes de reactividad cruzada en sueros antes de la exposición. La inmunización con NG34+DC89 también indujo respuesta inmune en mucosas; demostrándose con la presencia de IgA en lavado broncoalveolar en el 50% de los animales. Nuestros resultados también muestran que la vacunación de NG34+DC89 es capaz de inducir anticuerpos y la protección cruzada neutralizante frente a dos cepas heterólogas, pH1N1 y H7N1. Por lo tanto, péptidos NG34+DC89 representan un inmunógeno atractivo, lo que podría ser aún más optimizado para futuras formulaciones de vacunas multivalentes frente el virus de influenza. En el segundo estudio, hemos probado la inmunogenicidad de un cóctel HA1-péptido en un modelo porcino para evaluar si esta nueva formulación puede conferir inmunidad a una amplia gama de virus de influenza in vitro (Capítulo 2). En este estudio, hemos utilizado cuatro péptidos de la HA1 del subtipo H1 del virus de influenza (NG34, DC55, RA22 y SS35), evaluamos su inmunogenicidad en cerdos convencionales de granja frente a virus de influenza homólogos y heterólogos. Las vacunas de péptidos sintéticos indujeron anticuerpos con capacidad neutralizante y de inhibición frente a virus homólogos. Aquellos también cros-reaccionaron frente a los virus heterólogos de origen aviar como el virus H7N1 y virus de influenza de baja patogenicidad H5N2 y además el virus circulante H3N2 de origen porcino. Por otra parte, se detectaron anticuerpos específicos de IgA-secretora en hisopos nasales. Los resultados muestran que los péptidos evaluados fueron inmunogénicos en cerdos. La respuesta humoral con la actividad neutralizante y de inhibición de hemaglutinina generada después de la inmunización podría ser utilizada en otros estudios de inmunidad protectora heterosubtípica. En el tercer estudio se evaluó el efecto protector de la mejora de péptidos de HA1 contra el virus altamente patógeno virus de la influenza H7N1 en pollos, un modelo huésped natural (capítulo 3). En este estudio, se utilizaron dos péptidos sintéticos NG34 y SS35 para vacunar pollos de granja. La vacunación tanto con péptidos NG34 ó SS35 indujeron anticuerpos específicos que reconocen virus heterólogos, como H7N1 y H5N2 in vitro. La vacunación con péptido NG34 provocó una respuesta de anticuerpos protectores que confirió una protección parcial frente un desafío letal con H7N1. Además, el péptido NG34 indujo una respuesta inmune de la mucosa, que correlacionaba con la diseminación viral reducida en hisopos orofaríngeos/ cloacales y la pulpa de la pluma. Por el contrario, animales vacunados con el péptido SS35 no pudieron producir una eficiente respuesta inmune protectora frente el desafío letal H7N1. Es necesario recalcar, que todos los péptidos HA1 del subtipo H1 del virus de influenza, fueron seleccionados mediante el Método de espectros informativo (ISM). Cuatro principales conclusiones generales pueden extraerse de estos estudios: (i) Péptidos HA1 son inmunogénicos en todos los modelos animales estudiados (ratones, cerdos y pollos) e inducen una respuesta immune humoral y de mucosa. (ii) Péptidos inmunogénicos de la subunidad 1 de la proteína hemaglutinina del virus de la influenza confieren una protección parcial contra diferentes subtipos virales en ratones; (iii) Los cerdos vacunados con péptidos HA1 provocan una respuesta de anticuerpos neutralizantes con actividad de inhibición de la hemaglutinina frente a diferentes subtipos de Influenza A virus y (iv) Péptidos HA1 confieren una protección parcial contra un virus altamente patógeno/ H7N1 en modelo de pollo. En general, nuestros resultados proporcionan ideas sobre nuevos enfoques para la vacunación de la gripe y la comprensión de la respuesta inmune frente al virus de influenza en ratones, cerdos y pollos. / Influenza A viruses (IAVs) are responsible for pandemic outbreaks of influenza, and for most of the well-known annual flu epidemics, in humans, poultry and pigs. IAVs are divided into subtypes, based on the nature of their surface glycoproteins, hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). The HA is a homotrimeric surface glycoprotein that mediates influenza viral entry via cellular attachment and membrane fusion events. The receptor-binding pocket of HA is surrounded by antigenically variable antibody binding sites. Therefore, antibodies bounded to these sites should, in principle, block the binding to receptor proteins, inhibiting viral entry, demonstrating hemagglutinin inhibition activity and viral neutralization activity. However, the subunit 1 of HA (HA1) is highly variable across viruses and tends to change under immune pressure and, hence, easily evades the neutralizing antibodies induced by previous vaccinations or infections. The negative implications of influenza virus infections push the world to promote the development of multivalent flu vaccines that protect against all human influenza strains. Therefore, the field of bioinformatics has become a major part of the identification and early validation of new therapeutic targets and could be an essential first step in the development of an effective vaccine for influenza virus that represents the high variability of its antigenic determinants. Therefore, in this thesis it was postulated that the HA1 could represent a potential target for a multivalent vaccine of influenza infection. Consequently, the general objective of this thesis was to select conserved peptides from the HA1 of influenza viruses and to evaluate the efficacy of the selected candidates to induce immunity that can protect animal against infection. To achieve this objective, three studies were undertaken in mice (Chapter 1), pigs (chapter 2) and chickens (Chapter 3). In the first study, we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against the pandemic H1N1 2009 virus and a H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in a mouse model (Chapter 1). In this study, mice were intraperitoneally vaccinated with the peptide mix (NG34+DC89), and next challenged with either the pH1N1 or the H7N1 strain of Influenza virus. Conversely to the 85% mortality observed in control mice, independently of the virus used for challenge, 80% and 66% of the peptide-vaccinated mice survived the challenge with pH1N1 and H7N1, respectively, without detection of influenza viruses (IV). Vaccinated mice surviving correlated with the presence of cross-reactive neutralizing antibodies in sera prior to challenge. The immunization with NG34+DC89 also induced mucosal immune responses demonstrated with the presence of IgA in bronchoalveolar lavage in 50% of the animals. Our results also show that NG34+DC89 is capable to induce cross-neutralizing antibodies and protection against two heterologous IV, pH1N1 and H7N1. Thus, NG34+DC89 represent an attractive immunogen, which could be further optimized for future multivalent vaccine formulations against influenza virus. In the second study, we tested the immunogenicity of a HA1-peptide cocktail in a pig model to assess whether this new formulation can confer immunity to a wide range of IAVs in vitro (Chapter 2). Four peptides (NG34, DC55, RA22 and SS35) within the HA1 from H1 viruses were selected, and evaluated their immunogenicity in conventional farm pigs against homologous and heterologous viruses of influenza. Peptides immunizations induced HA neutralizing and inhibiting antibodies against homologous viruses. Those also cross-reacted against heterologous viruses like H7N1 and H5N2 and, most importantly, the circulating H3N2. Moreover, secretory IgA-specific HA antibodies in nasal swabs were detected. Altogether, the results show that the peptides tested were immunogenic in pigs. The humoral response with hemagglutinin-inhibiting and cross-neutralizing activity generated after immunization could be used in further studies of protective heterosubtypic immunity. In the third study we evaluated the protective effect of improved HA1-peptides against H7N1 highly pathogenic influenza virus (HPAIV) in chickens, a natural host model (Chapter 3). In this study, based on ISM, we selected two highly conserved peptides (NG34 and SS35) of a H1 influenza virus strain and used them to vaccinate free-range chickens. The vaccination with both NG34 and SS35 peptides induced specific antibodies that recognized heterologous viruses, as H7N1 HPAIV and H5N2 Low pathogenic avian virus (LPAIV) in vitro. Vaccination with NG34 peptide elicited a protective antibody response that conferred partial protection against a lethal challenge with H7N1 HPAIV. Furthermore, NG34 peptide induced a mucosal immune response, which correlated with reduced viral shedding in oropharyngeal/cloacal swabs and feather pulp. On the contrary, SS35 peptide vaccinated animals failed to produce an efficient protective immune response as no survival against lethal H7N1 challenge was achieved. Finally, it remains to point out that all HA1-peptides from H1 subtype of influenza virus were selected by the method of informative spectra (ISM). Four main general conclusions can be drawn from these studies: (i) HA1-peptides are immunogenic in all the animals models tested (mice, pigs and chickens) and induce humoral and mucosal immune response. (ii) Novel conserved immunogenic peptides from the hemagglutinin subunit 1 protein of influenza viruses confer partial protection against different viral subtypes in mice; (iii) Pigs vaccinated with HA1 peptides elicit neutralizing and hemagglutination-inhibiting antibody responses against different subtypes of Influenza A virus and (iv) Synthetic peptides from the hemagglutinin of influenza viruses confer partial protection against highly pathogenic A/H7N1 virus in a free-range chicken model. Overall, these data provide insights on new approaches for vaccination in influenza and understanding of the immune response against influenza viruses in mice, pigs and chickens.

La investigación con animales sigue siendo esencial para el avance del conocimiento de los procesos biológicos, especialmente los relacionados con la salud y la enfermedad humana y animal. Los animales más usados en investigación biomédica son los pequeños mamíferos, y más particularmente, los pequeños roedores. Sin embargo, entre estos y el humano hay diferencias esenciales derivadas del tamaño corporal y la longevidad, por lo que el uso de modelos animales de gran tamaño, como la oveja, proporciona en muchos casos una alternativa idónea, principalmente en modelos de ortopedia. Para ello, los animales son normalmente sometidos a anestesia general y por lo tanto, resulta necesario desarrollar nuevas técnicas de refinamiento que disminuyan el dolor en procedimientos experimentales, especialmente en el ovino, cuya evaluación del dolor supone un desafío debido a su especial comportamiento. El presente estudio tuvo como objetivo buscar un refinamiento de la técnica anestésica en ovejas sometidas a un procedimiento ortopédico de defecto óseo segmentario (DOSD), mejorando el bienestar animal y permitiendo disminuir la aplicación de fármacos de rescate, minimizando así el uso de aquellos fármacos que podrían interferir con los objetivos de la investigación. Para la realización de esta tesis se realizó, en primer lugar, una descripción del estudio anatómico correlacionado con la imagen ecográfica de forma detallada del nervio ciático y femoral en la oveja. En segundo lugar, se desarrolló la técnica de bloqueo nervioso ciático y femoral guiado por ultrasonografía y con neuroestimulación. Finalmente, el bloqueo nervioso periférico del nervio ciático pudo aplicarse en la oveja intraoperatoriamente, y prolongarse de forma continua durante el primer periodo postoperatorio con un sistema de infusión. Como conclusión podemos decir que se consiguió reducir el dolor postoperatorio tras la cirugía para la creación del DOSD, haciendo que los animales recuperaran con rapidez la capacidad de carga de la extremidad pélvica. Esto supone un refinamiento de la técnica anestésica, que repercute en una mejora del bienestar animal durante el procedimiento experimental. Creemos, además, que la aplicación de esta técnica podría ser útil en otros procedimientos ortopédicos experimentales en oveja. / Animal research remains essential to advance the understanding of biological processes, especially those related to health and human and animal diseases. The most common animals used in biomedical research are small mammals. However, there are some studies that require larger animals, as rodents often do not faithfully replicate the human disease. Furthermore, between mice and humans there are essential differences in body size and longevity, for which the use of large animal models, among which includes sheep, provides a suitable alternative. Animal models in orthopedic research are usually induced under general anesthesia. Therefore, it is necessary to develop new refining techniques that reduce pain in experimental procedures, especially in sheep, which pain assessment involves a challenge because of the special behavior of these animals. The main objective of this study was to refine the anesthetic technique in sheep that have been included in a segmental diaphyseal bone defect orthopedic study. This suppose a refinement of the anesthetic technique, which results in an improved animal welfare during the experimental procedures, it can allow providing lower doses of rescue medication and also minimizing the use of those drugs that could interfere with the objectives of scientific research. In this Thesis Project, a detailed anatomical description was done, correlated with the echography images of the sciatic and femoral nerves in sheep. Secondly, that peripheral nerve blocking of the sciatic nerve guided with ultrasonography and neurostimulation was applied intraoperatively in sheep. Finally, peripheal nerve blocking of sciatic nerve could be applied intraoperatively and could be extended continuously during the first postoperatory period with an infusion system. As a conclusion, we can expose that pain lowering was achieved after surgery of the segmental diaphyseal bone defect. So, the animals could present a rapid recovery of the load bearing ability of the pelvic limb. This suppose a refinement of the anesthetic technique, which results in an improved animal welfare during the experimental procedures. This new refinement of experimental anesthesia with continuing blockading in sheep could be useful in orthopedic procedures.

El virus de la gripe porcina (VGP) es un patógeno importante en el sector veterinario con un gran potencial zoonótico, y por lo tanto se considera también una amenaza potencial para la salud pública. La vigilancia y el control de este patógeno en cerdos es por lo tanto crucial. Los métodos actuales de control se basan en la profilaxis, en particular, en vacunas que suscitan una respuesta de tipo humoral. La capacidad de escape y la alta variabilidad de VGP hacen que la eficacia de estas vacunas pueda verse comprometida; por tanto, deben ser actualizadas periódicamente. El mismo problema se plantea en la salud humana donde se están desarrollando vacunas diseñadas racionalmente con tal de solventarlo. Estas vacunas están siendo diseñadas para potenciar la respuesta de células T contra el virus de la gripe A (VGA). La respuesta de células T esta relacionada con la protección contra la infección por el VGA, centrándose en las proteínas internas y altamente conservadas del virus. Esto permitiría resolver los problemas anteriormente citados. Los epítopos de células T de VGP conocidos en cerdos son sólo unos pocos y están relacionados con el Complejo Mayor de Histocompatibilidad porcino de clase I (CMHpo-I). La vacunología inversa se utiliza en sanidad humana para identificar los epítopos de células T; sin embargo, en cerdos este concepto se ha sido introducido recientemente y por lo tanto se dispone de pocas herramientas. El objetivo principal de este trabajo era identificar epítopos de células T para diseñar racionalmente vacunas contra VGP. Para este propósito, se abordaron las siguientes estrategias. La vigilancia de VGP es fundamental para un control adecuado. La situación epidemiológica de VGP en España debía ser actualizada y se necesitaban más datos genéticos para permitir el uso de la vacunología inversa. El estudio realizado mostró que la situación epidemiológica de España era similar a la de otros países europeos; las cepas circulantes estaban estrechamente relacionadas y evolucionaron de la misma manera. Sin embargo, también se encontraron exepciones; una cepa evolucionó de forma divergente en España. Se sugiere que el cambio genético pueda ser un evento reciente en la evolución de esas cepas. Los ensayos in vitro para determinar la afinidad de unión de epítopos a CMHpo-I disponibles actualmente son pocos y están basados en moléculas recombinantes. Por lo tanto, en primera instancia se intentó generar una herramienta in vitro basada en la forma nativa del CMHpo-I. Para ello se diseñó y desarrolló casi por completo un ensayo de reconstitución de MHC aplicado a CMHpo-I, para el cual se generaron células C1R que expresaran el alelo SLA-1*es11 de los cerdos singénicos Babraham. Por último se puso a punto el ensayo de desnaturalización. A continuación, se aplicó la vacunología inversa para identificar epítopos de células T. Se predijeron epítopos del VGP in silico mediante NetMHCpan para los alelos CMHpo-I de los cerdos singénicos Babraham (SLA-1*es11 y SLA-2*es22); estos epítopos se probaron mediante ensayos funcionales ex vivo (IFNγ y respuesta de proliferación) usando células de cerdos Babraham inmunizados. Desafortunadamente, este enfoque no dio ningun epítopo positivo. Los epitopos de células T fueron también identificados empíricamente. Las proteínas M1 y NP de un VGA humano fueron seleccionadas como diana, se estudiaron mediante el uso de péptidos solapantes y métodos funcionales (IFNγ y respuestas de proliferación) hasta encontrar epítopos de células T. Los epítopos fueron analizados con células procedentes de cerdos Babraham inmunizados con VGA. Se encontraron dos epítopos CMHpo de clase II solapados, NP405-416 y NP407-420. En otro intento, se utilizó una estrategia más compleja de vacunología inversa. Esta había sido utilizada anteriormente por otros autores y comprende una combinación de métodos: predicción de epitopos in silico mediante NetMHCpan y validación de los resultados utilizando las preferencias de unión del alelo CMHpo determinadas in vitro, analisis in vitro mediante un ensayo de unión y analisis in vivo mediante tetrámeros. Los péptidos fueron identificados en animales infectados y expuestos a dos VGP heterólogos. Esta estrategia demostró ser muy precisa y así se identificó un epítopo inmunodominante (NA171-180). En general, estos datos allanan el camino para el diseño racional de una vacuna contra la SwIV a parte de proporcionar una nueva visión de la respuesta de los cerdos a la infección o inmunización con VGA. / Swine Influenza Virus (SwIV) is an important pathogen in veterinary field with a great zoonotic potential and thus it is considered also a potential threat for public health. Surveillance and control of this pathogen in pigs is therefore crucial. Current methods of control are based on prophylaxis; in particular they are based on vaccines eliciting humoral response. Escaping capacity and high variability of SwIV make that the efficacy of those can be compromised; thus vaccines need to be periodically updated. This problem is shared in human health and thus rationally designed vaccines are being developed. Those are being designed to enhance T cell response against Influenza A Virus (IAV). T cell responses showed to be related with protection against IAV infection, targeting the highly conserved internal protein of the virus. This would solve the problems above cited. T cell epitopes of SwIV in pigs are just few and related to class I Swine Leucocytes Antigens (SLA). Reverse vaccinology is used in human health to identify T cells epitope; however, in pigs this has just recently been introduced and thus just few tools were available. The main aim of this work was to identify T cells epitopes in SwIV to be used in rationally designed vaccines. For this purpose, the following studies were performed. Surveillance of SwIV is fundamental to design a proper control. The epidemiological situation of SwIV in Spain needed to be updated and more genetic data were required to allow the use of reverse vaccinology. The study showed that the epidemiological situation of Spain was similar to other European countries in which circulating strains were closed related and evolving in the same way. However, some exceptions were found; one strain evolved divergently in Spain. Genetic shift has been suggested as a recent event in the evolution of those strains. In vitro assays to determinate binding affinities of epitopes to class I SLA (SLA-I) available were few and based on recombinant molecules. Therefore, in a first instance an in vitro tool based on native forms of SLA-I was attempted. MHC reconstitution assay for SLA-I was designed and almost entirely developed. C1R cells expressing the Babraham pigs allele SLA-1*es11 were generated. Finally, the denaturalization step of the assay was set-up. Reverse vaccinology was then applied to identify T cells epitopes. Epitopes of the virus selected as target were predicted in silico by NetMHCpan on Babraham SLA-I alleles (SLA-1*es11 and SLA-2*es22) and tested by ex vivo functional assays (IFNγ and proliferation responses) using cells from immunised Babraham inbred pigs. Unfortunately, this approach did not give any positive epitope. Additionally, T cells epitopes were empirically identified. Proteins M1 and NP of a human IAV were selected as target and thus dissected by using overlapping peptides and functional methods (IFNγ and proliferation responses) until finding T cells epitopes. The tests were performed using cells from IAV immunised Babraham inbred pigs. Two overlapping SLA-II epitope were found, NP405-416 and NP407-420. In another attempt, a more complex strategy of reverse vaccinology was used. This was previously used by other authors and it is based on a combination of methods: in silico prediction of epitopes by NetMHCpan and validation of results by using in vitro binding preferences of the selected SLA-I allele , an in vitro test binding assay and in vivo test by tetramers. Peptides were identified in animals infected and challenged with two heterologous SwIV. This strategy showed to be highly accurate and thus one immunodominant epitope (NA171-180) was identified. Overall, these data pave the way for rational design of vaccine against SwIV as well as providing new insight into pig responses to infection or immunization with IAV.

Las tortugas terrestres mediterráneas, tortuga mediterránea (Testudo hermanni) y tortuga mora (Testudo graeca), presentan problemáticas similares de conservación en España, si bien, la primera está más amenazada. Los programas de conservación, tanto in-situ como ex-situ, deben incluir una adecuada gestión sanitaria. Uno de los aspectos básicos es el establecimiento de los parámetros sanguíneos de referencia para la adecuada interpretación y evaluación del estado sanitario de cada especie. En el primer estudio, realizado en tortuga mediterránea occidental (T. h. hermanni), se valoró el efecto de dos anticoagulantes, heparina de litio y EDTA tripotásico, sobre los parámetros hematológicos. La heparina de litio fue el anticoagulante de elección para las muestras sanguíneas en estos quelonios. Los procesos infecciosos pueden comprometer la viabilidad de las poblaciones de tortugas y son un importante factor a tener en cuenta para la gestión de los centros de cría en cautividad y para la liberación de animales. En el segundo estudio se describe un brote de rinitis crónica asociada a un herpesvirus en una población cautiva de tortuga mora. Los signos clínicos más relevantes fueron rinitis seromucosa bilateral, estomatitis y glositis. Se realizó un estudio hematológico y bioquímico sanguíneo y se comparó con los datos obtenidos en animales sanos de tres poblaciones diferentes. Los animales enfermos mostraron heteropenia, linfocitosis, incremento en la actividad de la AST y aumento de la concentración de α-globulina. Algunos de ellos tenían anemia normocítica y normocrómica. Las lesiones se circunscribían al aparato respiratorio y a la cavidad oral, con marcada hiperplasia epitelial y presencia de infiltrado mixto inflamatorio en el epitelio de la mucosa oral, nasal y traqueal. La microscopía electrónica evidenció la presencia de partículas virales intracitoplasmáticas e intranucleares que, por su tamaño, forma y patrón de distribución, se correspondían con un herpesvirus. La cría en cautividad de especies en peligro de extinción supone unos riesgos sanitarios que las poblaciones salvajes no tienen. En el tercer estudio se describe un episodio de micobacteriosis sistémica atípica en tortuga mediterránea occidental en una población cautiva. Los síntomas aparecieron al final del período de hibernación, en forma de anorexia, embotamiento y letargia, junto a lesiones inflamatorias y edematosas en las extremidades y cola. Los animales afectados fueron eutanasiados. La mayoría de tortugas presentaron una marcada leucocitosis y anemia. Se observó un incremento de AST, ALT, LDH y FA, disminución de los ácidos biliares e hiperproteinemia, con aumento de la fracción globulina y disminución de la fracción albúmina y del cociente A/G en dos animales. En los aspirados articulares se observaron numerosas células mononucleares con abundantes estructuras bacilares fagocitadas. Mediante una tinción de Ziehl-Neelsen se evidenció la presencia de estructuras bacterianas ácido-alcohol resistente. Las lesiones se localizaron en ovario, páncreas, pulmón, bazo, corazón, musculatura caudal, riñón e hígado. El cultivo e identificación para micobacterias fue positivo, así como la secuenciación molecular, mediante la que se identificó Mycobacterium nonchromogenicum. Los aspectos sanitarios en los reptiles están insuficientemente estudiados y valorados para la cría en cautividad y la conservación de las especies amenazadas. En este estudio se comprueba como la heparina de litio es el anticoagulante de elección para la toma de muestras sanguíneas en tortugas terrestres mediterráneas y como las infecciones por herpesvirus y micobacterias pueden comprometer la conservación ex-situ de estas especies. / Mediterranean tortoises, Hermann’s tortoise (Testudo hermanni) and spur-thighed tortoise (Testudo graeca) have similar conservation issues in Spain, although the first has disappeared from most of its original habitat and is more threatened. Both in-situ and ex-situ conservation programs should include adequate health management. One of the main aspects is the establishment of reference values for blood parameters for the proper interpretation and evaluation of the health status of each species. In the first study, conducted in the western Mediterranean tortoise (T. h. hermanni), the effect of two types of anticoagulants, heparin lithium and EDTA tripotassium, on hematological parameters was evaluated. Heparin lithium is considered as the anticoagulant of choice for blood samples of these chelonians. Infectious diseases can compromise the viability of tortoise populations and are important factors to consider in the management of captive populations and for the release of animals, to reinforce wild populations. In the second study, an outbreak of chronic rhinitis associated with a herpesvirus in a captive population of spur-thighed tortoise is described. The most relevant clinical findings were bilateral effusion rhinitis, accompanied by stomatitis and glossitis. An hematological and serum biochemical study was performed and compared with data from healthy animals from three different populations. Diseased animals showed heteropenia, lymphocytosis, increased AST activity and higher α-globulin concentration. Some tortoises showed normocytic and normochromic anemia. The lesions were confined to the respiratory tract and the oral cavity, with marked epithelial hyperplasia and presence of mixed inflammatory infiltrate in the epithelium of the oral, nasal and tracheal mucosa. Electron microscopy revealed the presence of intracytoplasmic and intranuclear viral particles whose size, shape and distribution pattern corresponded to a herpesvirus. Captive breeding of endangered species are more subjected to health risks that wild populations. In the third study, an episode of systemic atypical mycobacteriosis in a captive population of Western Hermann’s tortoise is described. The symptoms appeared at the end of the period of hibernation, in the form of anorexia, dullness and lethargy, with inflammatory and edematous lesions on the limbs and tail. Blood samples, joint taps and skin biopsies were performed. Lately, euthanasia of affected animals was performed. Most tortoises showed marked leukocytosis, with heteropenia, monocytosis and a large number of mononuclear cells, and five animals had anemia. An increase in the values of AST, ALT, LDH and FA, a decrease in bile acids and hyperproteinemia with increased globulin and decreased albumin and A/G ratio were observed. In joint taps, mononuclear cells with phagocytosed bacillary structures were obseved. Ziehl-Neelsen stain revealed the presence of acid-fast bacteria. Lesions were observed in ovaries, pancreas, lungs, spleen, heart, muscle, kidney and liver. Culture and identification were positive for mycobacteria and molecular sequencing lead to the identification of Mycobacterium nonchromogenicum. Health aspects in reptiles are insufficiently studied and assessed for captive breeding and conservation of threatened species. In this study, it was found that lithium heparin is the anticoagulant of choice for blood sampling in Mediterranean tortoises and infections such as those cause by herpesvirus and mycobacteria may compromise the ex-situ conservation of these species.

El visón europeo Mustela lutreola es uno de los mamíferos más amenazados del Mundo. El visón americano Neovison vison se considera actualmente su principal amenaza. Sin embargo, la introducción del visón americano y la concurrencia ecológica posterior de las dos especies no puede explicar, por si sola, la disminución o desaparición del visón europeo en diferentes épocas y lugares. El parvovirus de la enfermedad aleutiana del visón (AMDV) es el principal problema sanitario mundial en las granjas de visón americano, causante de diferentes síndromes clínicos dependiendo de la cepa vírica y de las características del animal. Se realizaron serologías frente el AMDV en muestras de 492 visones europeos y en 1.735 visones americanos durante un periodo de 16 años. Se realizó una determinación de las edades en tres especies de mustélidos. Caninos procedentes de 1.766 cadáveres de 1.661 visones americanos, 54 visones europeos y 51 turones europeos Mustela putorius se seccionaron y se utilizó el recuento de los anillos en el cemento dental para estimar la edad de los ejemplares. Las muestras de visones americanos procedían principalmente de las campañas de control de esta especie exótica invasora, mientras que los atropellos fueron la causa principal de muerte en las dos especie autóctonas. De forma paralela se realizó un análisis de las estructuras demográficas de tres poblaciones de visón americano sometidas a diferente intensidad de control con el objetivo de detectar posibles variaciones en estas estructuras causadas por la captura. La seroprevalencia del AMDV en el visón europeo fue del 32%. No se detectaron diferencias significativas en la seroprevalencia entre sexos o entre años o pesos. La incidencia de seroconversión (negativo a positivo) en visones europeos recapturados fue de 0,46 casos por animal-año de riesgo. Para los animales positivos, la incidencia de seroconversión de un resultado positivo a uno de negativo fue de 0,18 casos por animal- año de riesgo. En 1.735 visones americanos, la prevalencia global fue del 32,4% y ésta varía entre las seis poblaciones silvestres estudiadas y se incrementa con la edad de los animales. Los resultados indican que la infección es endémica, distribuida por todas las poblaciones y no se observaron efectos sobre la dinámica poblacional de ambas especies. ADN del AMDV se detectó mediante PCR y se secuenció y los resultados sugieren que al menos dos tipos de secuencias de AMDV circulan en España y que los AMDV presentes difieren de otros aislados en Norte América y Europa. En relación a las estructuras demográficas, los individuos con edad anterior a su primera temporada de cría representaron aproximadamente la mitad de todos los animales, sin diferencias significativas entre especies o causa de muerte. Se observaron diferencias en los porcentajes de sub-adultos entre los períodos pre- y post-reproductor, con una alta mortalidad durante el período de dispersión-invierno en las tres especies. Las frecuencias de mortalidad de los animales sub-adultos fueron de 0,46, 0,50 y 0,55 para el visón americano, el visón europeo y el turón europeo. Las tasas de supervivencia del visón americano fueron más altas que para las especies nativas. No se observaron diferencias en la edad media de los animales encontrados muertos en atropellos entre las tres especies ni entre visones americanos atropellados y capturados. No se detectaron evidencias de cambios en la estructura de edades en ninguna de las poblaciones. La proporción de individuos de cada sexo y clase de edad se mantuvieron constantes, lo que sugiere que a pesar de los trabajos de control del visón americano, la estructura de edades se mantuvo estable durante el período de estudio. / The European mink (Mustela lutreola) is one of the most endangered mammals in the world. The invasive American mink (Neovison vison) is considered the main factor for this decline. However, the American mink’s introduction and the subsequent ecological concurrence of the two species cannot solely explain the decline or disappearance of the European mink in different times and places. Aleutian mink disease parvovirus (AMDV) is the main health problem in fur farming worldwide, causing varied clinical syndromes that depend on the viral strain and host factors. Infection with AMDV has been speculated to contribute to the decline of the European mink, but a detailed study has not been performed. To assess the potential effects of AMDV infection on the conservation of the European mink, we surveyed AMDV antibody in samples from 492 native European mink and 1,735 feral American mink collected over 16 yr. In order to investigate a possible AMDV impact on demographic structures, age estimation of three mustelid species was performed. Canine samples of 1,766 carcasses from 1,661 American mink, 54 European mink and 51 European polecats (Mustela putorius) were sectioned, and cementum annuli counts in tooth sections were used for age estimation. American mink samples consisted primarily of trap-captured animals, whereas road casualties were the principal origin of European mink and European polecat carcasses. Simultaneously, the demographic structures of three mink populations subjected to different culling intensities were studied with the aims to detect possible variations in these structures caused by trapping, and identify simple and efficient indicators of successful trapping efforts. The antibody prevalence in European mink was 32%. There were no statistically significant differences in antibody prevalence between sexes, or among years or weight classes. For recaptured European mink, incidence of seroconversion (negative to positive) was 0.46 cases per animal-year at risk. For positive animals, the incidence of conversion from positive to negative was 0.18 cases per animal-year at risk. In 1,735 feral American minks, the overall prevalence was 32.4% and varied among the six wild populations studied. The prevalence increased with age. Infection with AMDV appears to be endemic, distributed across the entire ranges of both species, and no effects on the population dynamics of either species were observed. AMDV DNA was detected PCR and sequenced and the results suggested that two sequence types of AMDV were circulating in Spain, and that the Spanish AMDVs differed from other described isolates from North America and Europe. In demographic structures, individuals prior to their first breeding season (class 0+) represented approximately half of all animals, with no significant differences between species or causes of death. Differences in sub-adult percentages were observed between the pre- and post-reproductive period, with a high mortality during the dispersal-winter period in all three species. Frequencies of mortality of the sub-adult age class were 0.46, 0.50 and 0.55 for American mink, European mink and European polecat, respectively. Survival rates of the American mink were higher than those of the native species. No differences were observed in mean age of animals found dead as road casualties in all three species or between captured American mink and road casualties. In relation with the culling effect over the studied populations, no evidence of age structure changes was detected in any population. The proportion of individuals in each sex and age class remained constant over time, suggesting that despite the control efforts, the age structure remained stable over the study period.

El productes de plasma dessecat per esprai (SDP) tenen un alt contingut proteic i són components útils per a moltes aplicacions, principalment com a productes valuosos per la nutrició animal. El plasma s'obté a partir de sang de porcs sans aptes pel consum humà. Durant l’obtenció, s’afegeixen anticoagulants i la sang s’emmagatzema en tancs refrigerats. Un cop a la planta de processament, la sang es centrifuga, per separar el plasma de la fracció cel∙lular. El plasma es deshidrata en un procés d'assecat per polvorització per produir un producte final en pols. El dispositiu assecador crea microgotes per aspersió del plasma a alta pressió, l’aigua s'evapora per l'entrada d'aire a 170‐250°C i una temperatura de sortida a 80°C. L'assecat per esprai o polvorització produeix diferents efectes simultanis de deshidratació, canvis de temperatura i altres efectes com canvis osmòtics, dany oxidatiu i desnaturalització proteica que podrien contribuir a explicar un procés encara poc entès d'inactivació microbiana. L'objectiu d'aquesta tesi va ser avaluar si el plasma porcí assecat per aerosol (SDPP), en forma de producte comercial i obtingut a partir de lots de milers de porcs y sotmès a tractament, podria transmetre o no alguns dels virus més resistents a altes temperatures y que per altra banda, de forma molt freqüent, afecten a la producció porcina. Atès que la majoria d'elles poden produir infeccions inaparents, fins i tot a l’edat de final d’engreix, el risc que es puguin trobar a a la sang de recollida d’escorxador no és menyspreable. En el primer estudi es va fer el seguiment de la transmissió del Parvovirus porcí (PPV) durant el subministra d’SDPP comercial, com a model de detecció de virus d'alta resistència tèrmica, en porcs susceptibles. Trenta‐sis porcs Landrace x Duroc deslletats (28 d d'edat) van ser alimentats amb dietes que contenien 0 o 8% SDPP. El lot d’SDPP utilitzat contenia anticossos (ABs) per PPV (títol 1: 400). Es varen prendre mostres de sang dels porcs els dies 0 i 63 per a determinar si l'alimentació SDPP havia causat el desenvolupament d'ABs contra PPV, Virus de la síndrome reproductiva i respiratòria (PRRSV) o el Virus de la malaltia d'Aujeszky (ADV). La inclusió de SDPP a la dieta va millorar el creixement dels porcs sense seroconversió contra els virus estudiats. L'objectiu del segon estudi fou avaluar si l’SDPP comercial que conté genoma del Circovirus porcí tipus 2 (PCV2) podia ser un vehicle de transmissió d'aquest virus. Es varen utilitzar garrins Landrace recent deslletats de truges no virèmiques i seleccionats per baixos títols d'ABs. En aquest estudi, l'absència d'ABs enfront PCV2 en porcs experimentals no era necessari ja que els anticossos materns són comuns a les granges comercials. L’SDPP es va incloure en les dietes d'assaig a 0 o 8%. El lot SDPP utilitzat a l'estudi contenia 2,47 x 105 còpies d'ADN de PCV2 / ml mesurats per PCR quantitativa en temps real (qrt‐PCR). Els porcs van ser mostrejats a dies 0, 10, 35 i 45 . No es va observar virèmia o seroconversió enfront PCV2 en porcs alimentats amb SDPP i tampoc no es va observar seroconversió a cap altre dels virus analitzats (PPV, el virus de la malaltia vesicular porcina i ADV). En el tercer estudi, l’SDPP que contenia ADN de PCV2 es va utilitzar per provar la potencial transmissió del PCV2 de porcs inoculats amb el PRRSV. El PRRSV és un virus amb efectes immunomoduladors que normalment facilita les infeccions concurrents. Vint‐i‐tres porcs Landrace de 3,5 setmanes d'edat distribuïts en un arranjament factorial 2 x 2 i assignats a corralines de nivell de bioseguretat 3 (BSL3) per evitar la contaminació creuada per PRRSV (ja que és un virus molt estès en la producció comercial). Les dietes contenien 0 o 8% SDPP. El lot comercial específic de SDPP utilitzat en aquest estudi contenia 7,56 x 105 còpies del genoma de PCV2 per gram. Els porcs varen ser mostrejats a 0, 14 i 28 dies després de l'exposició PRRSV. Tant els grups desafiats amb PRRSV com amb SDPP no varen donar lloc a la transmissió de PCV2. El quart estudi es va dirigir a avaluar si l’SDPP comercial podia estar involucrat en la transmissió del Virus de l'hepatitis E (VHE), una infecció viral freqüent entre la població de porcs i que ha estat reconegut com a zoonotic potencial. Es van trobar ABs enfront HEV en el 100% de les 84 mostres analitzades de diferents lots comercials d’SDPP d'origen espanyol, mentre que només el 22,4% de les mateixes mostres varen ser positives a l'ARN del VHE. En conseqüència, era un motiu de preocupació saber si SDPP pot contribuir a la transmissió del VHE per SDPP. Es varen analitzar mostres de sèrum d'estudis previs en els quals s'havien alimentat els porcs amb dietes comercials SDPP al 0 o 8% per detectar HEV. L’edat dels porcs va variar de 3 a 15 setmanes d’edat i la durada d'alimentació va ser entre 4 a 9 setmanes, depenent de l'experiment. En una de les mostres d’SDPP es va confirmar que contenia VHE ARN. No es va detectar seroconversió en cap dels animals pertanyents als diferents estudis, el que va portar a la conclusió que l’SDPP no representa un risc per a la transmissió del VHE. Es pot concloure que els resultats dels estudis abans esmentats van contribuir a aclarir que SDPP no sembla ser un vector de patògens i, per tant, és un ingredient d’alt contingut de proteïna natural segur i d'alta qualitat per al seu ús en l'alimentació animal. / El plasma desecado por aerosol (SDP) tiene un alto contenido proteico, que lo convierte en un componente útil para muchas aplicaciones, y de alto valor para la nutrición animal. El plasma se obtiene a partir de sangre de cerdos sanos, aptos para el consumo humano. Durante su obtención, se añaden anticoagulantes y la sangre se almacena en tanques refrigerados. Una vez en la planta de procesado, la sangre se centrifuga, para separar el plasma de la fracción celular. El plasma se deshidrata mediante un proceso de secado por pulverización en aerosol para producir un producto final en polvo. El dispositivo crea un espray de microgotas por aspersión del plasma a alta presión, el agua se evapora por la entrada de aire a 170‐250°C y una temperatura de salida de 80°C. El secado por pulverización produce distintos efectos simultáneos, incluyendo: deshidratación, cambios bruscos de temperatura y otros efectos tales como cambios osmóticos, estrés oxidativo y desnaturalitzación proteica que podrían contribuir a explicar un proceso aún poco entendido de inactivación microbiana. El objetivo de esta tesis fue el de evaluar si el plasma porcino desecado por aerosol (SDPP) en forma de producto comercial y obtenido a partir de lotes de miles de cerdos podría transmitir o no algunos de los virus más resistentes a altas temperaturas y que frecuentemente afectan a la producción porcina. Dado que la mayoría de ellos pueden producir infecciones inaparentes, incluso a la edad de final de engorde, el riesgo que puedan encontrarse en la sangre recogida en matadero no es despreciable. En el primer estudio se realizó un seguimiento de transmisión del Parvovirus porcino (PPV) durante el aporte de SDPP comercial en la dieta, como un modelo de detección de virus de alta resistencia térmica, en cerdos susceptibles. Treinta y seis cerdos Landrace x Duroc recién destetados (28 de edad) se alimentaron con dietas que contenían 0 o 8% SDPP. El lote de SDPP utilizado contenía anticuerpos (ABs) para PPV (título 1: 400). Se tomaron muestras de sangre de cerdos en el día 0 y 63 para determinar si la inclusión de SDPP en el alimento había causado el desarrollo de ABs frente PPV, el Virus del síndrome reproductivo y respiratorio porcino (PRRSV) o el Virus de la enfermedad de Aujeszky (ADV). La inclusión de SDPP en la dieta mejoró el crecimiento de los cerdos sin seroconversión frente a los virus estudiados. El objetivo del segundo estudio consistió en evaluar si el SDPP comercial que contenía genoma de Circovirus porcino tipo 2 (PCV2) podía ser un vehículo de transmisión de este virus. Se utilizaron lechones Landrace recién destetados de cerdas no virémicas y seleccionados por presentar bajos títulos de ABs. En este estudio, la ausencia de ABs frente PCV2 en cerdos experimentales no era una condición excluyente, ya que los anticuerpos maternos son un factor común en los cerdos de granjas comerciales. El SDPP se incluyó en las dietas de ensayo a 0 o 8%. El lote de SDPP utilizado en el estudio contenía 2,47 x 105 copias de ADN de PCV2 / ml medidos por PCR cuantitativa de tiempo real PCR (qrtPCR). Los cerdos fueron muestreados a 0, 10, 35 y 45 días. No se observó viremia o seroconversión frente PCV2 en los cerdos alimentados con SDPP y tampoco se observó seroconversión frente a ninguno de los otros virus analizados (PPV, el virus de la enfermedad vesicular porcina, y ADV). En el tercer estudio, el SDPP que contenía ADN de PCV2 se utilizó para probar la potencial transmisión del PCV2 en cerdos inoculados con el PRRSV. El PRRSV es un virus con efectos inmunomoduladores que normalmente facilita las infecciones concurrentes. Veintitrés cerdos Landrace de 3,5 semanas de edad fueron distribuidos en un diseño factorial 2 x 2 y asignados a corralinas BSL3 para evitar la contaminación cruzada por PRRSV (un virus ampliamente extendido en condiciones de producción comercial). Las dietas contenían 0 o 8% SDPP. El lote comercial específico de SDPP utilizado en este estudio contenía 7,56 x 105 copias del genoma de PCV2 por gramo. Los cerdos se muestrearon a 0, 14 i 28 d después de la exposición al PRRSV. Los grupos desafiados con PRRSV y alimentados con SDPP no dieron lugar a transmisión del PCV2. El cuarto estudio se dirigió a evaluar si el SDPP comercial estaba involucrado en la transmisión del Virus de la Hepatitis E (VHE), una infección viral frecuente entre la población de cerdos que ha sido reconocido como un virus con potencial zoonótico. Se encontraron ABs frente a HEV en el 100% de las 84 muestras analizadas de distintos lotes comerciales de SDPP de origen español, mientras que solo el 22,4% de las mismas muestras fueron positivas por ARN del VHE. En consecuencia, era un motivo de preocupación conocer si el SDPP puede contribuir a la transmisión del el VHE. Se analizaron muestras de estudios previos en los que se habían alimentado los cerdos con dietas comerciales con SDPP al 0 o 8% para detectar HEV. La edad de los cerdos varió entre 3 a 15 semanas de edad y la duración de la alimentación fue entre 4 a 9 semanas, dependiendo del experimento. Una de las muestras de SDPP se confirmó que contenía ARN del VHE. No se detectó la seroconversión en ninguno de los animales pertenecientes a los distintos estudios, lo que condujo a la conclusión que el SDPP no representa un riesgo para la transmisión del VHE. Se concluyó que los resultados de los estudios mencionados contribuyeron a aclarar que el SDPP no parece ser un vector de los agentes patógenos estudiados y, por lo tanto, según los estudios realizados se trata de un ingrediente natural seguro de alta calidad con un alto contenido de proteínas para su uso en nutrición animal. / Spray dried plasma (SDP) products have high protein contents and, therefore, are useful components for many applications, mainly as valuable products for animal nutrition. Plasma is obtained from blood of healthy pigs fit for slaughter for human consumption. Blood is pooled from many animals, collected in tanks with anticoagulant and chilled. In the processing plant, blood is centrifuged to separate the plasma from cellular fraction and dehydrated by a spray‐drying process to produce a powered ingredient. The spray dryer device creates micro‐drops and evaporates water by inlet air at 170‐250°C and outlet temperature at 80°C. Spray‐drying produces concurrent effects of dehydration, changes of temperature and others effects such as osmotic changes, oxidative damage, and protein denaturizing stress that could contribute to explain a poorly understood process of microbial inactivation. The objective of this thesis was to evaluate if commercial spray dried porcine plasma (SDPP) obtained from batches of thousands of pigs could transmit or not some of most common high heat resistant viruses that affect swine production. Since most of them may produce unapparent infections at slaughter age, the risk to be found in collected blood at slaughterhouse is not negligible. In the first study, Porcine parvovirus (PPV) transmission throughout commercial SDPP, as model of high thermally resistant virus, was explored in susceptible naïve pigs. Thirty‐six Landrace × Duroc weanling pigs (28 d of age) were fed with diets containing either 0 or 8% SDPP. The SDPP lot used contained antibodies (ABs) to PPV (titer 1:400). Blood samples were collected from pigs on d0 and 63 to determine whether feeding SDPP caused development of ABs against PPV, Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) or Aujezsky disease virus (ADV). Inclusion of SDPP in the diet improved growth of pigs without seroconversion against studied viruses. The objective of the second study was to assess if commercial SDPP containing Porcine circovirus type 2 (PCV2) genome may be a vehicle of transmission for this virus. Weaned Landrace piglets from non viremic sows and selected for low ABs titres were used. In this study, absence of ABs against PCV2 in experimental pigs was not required because maternal antibodies are widespread in commercial farms. SDPP were included in the test diets at 0 or 8%. The SDPP lot used in the study contained 2.47 x 105 PCV2 DNA copies/ml measured by quantitative real time PCR (qPCR). Pigs were sampled at 0, 10, 35 and 45 d. No viremia or seroconversion against PCV2 was observed in pigs fed with SDPP and also no seroconversion to other virus analyzed (PPV, ADV and Swine vesicular disease virus, SVDV) was observed. In the third study, SDPP containing PCV2 DNA was used to test the potential transmission of PCV2 to pigs challenged with PRRSV. PRRSV is a virus with immunomodulatory effects that usually facilitates concurrent infections. Twenty‐three Landrace pigs of 3.5 weeks (w) of age were distributed in a 2 x 2 factorial arrangement and allocated in BSL3 boxes to avoid PRRSV cross‐contamination (since it is a widely spread virus under commercial production conditions). The diets contained 0 or 8% SDPP. The specific commercial lot of SDPP used in this study contained 7.56 x 105 PCV2 genome copies per gram. Pigs were sampled at 0, 14 and 28 d post PRRSV challenge. PRRSV challenged groups and SDPP groups, did not result in PCV2 transmission. The fourth study was addressed to assess if commercial SDPP was involved in the transmission of Hepatitis E virus (HEV), a prevalent viral infection within the pig population that has been recognized with zoonotic potential. HEV ABs were found in 100% of 84 samples of different commercial SDPP lots from Spanish origin, while only 22.4% of the same samples were positive for HEV RNA. Accordingly, it was of concern to know if SDPP may contribute to HEV transmission by SDPP. Serum samples from previous studies in which naïve pigs were fed with commercial SDPP diets at 0 or 8% were analysed to detect HEV. Age of pigs ranged from 3 to 15w of age and the feeding duration was between 4 to 9w, depending on the experiment. One of the lots of SDPP was confirmed to contain HEV RNA. HEV seroconversion was not detected in any of the animals belonging to the different studies, leading to the conclusion that SDPP does not represent a risk for HEV transmission. It can be concluded that the results of the above mentioned studies contributed to clarify that SDPP seems not to be a vector for pathogens and, therefore, it is a natural, safe, high‐quality ingredient with high protein contents for use in animal nutrition.

El objetivo de la presente tesis ha sido obtener información sobre la epidemiología de la Tuberculosis Bovina (TBb) en rebaños vacunos así como la obtención de datos para la implementación de un posible sistema de vigilancia basado en riesgo. En el primer estudio se analizó la variación espacio-temporal del riesgo de TBb en rebaños vacunos desde el año 2006 hasta el 2011. Los resultados indicaron que la prevalencia y la incidencia fueron más elevadas en algunas comarcas y en algunos años, comparando con la evolución global a nivel de país. El análisis de potenciales factores de riesgo indicaron que tanto los movimientos entre granjas provenientes de zonas de elevada incidencia (>1%) como la presencia de ganado de lidia, incrementaban el riesgo de infección. En el segundo estudio se describió una aproximación a un sistema de vigilancia basado en riesgo que se está evaluando actualmente en Nueva Zelanda. Dado que la presencia de TBb en granjas está conducida por un número de factores que incluyen: historial de infección previo en la explotación, frecuencia de test diagnósticos llevados a cabo en la explotación, localización geográfica y los movimientos de animales; el objetivo del estudio fue calcular una puntuación de riesgo de infección para cada granja utilizando datos recogidos durante la campaña de erradicación de forma rutinaria. De esta forma, los rebaños podrían ser clasificados en función de su riesgo de infección y así la vigilancia se podría focalizar en intentar detectar, de una forma más eficiente y economizando los costes, aquellas granjas con la puntuación de riesgo más elevada. En el tercer estudio, la sensibilidad individual de la vigilancia de TBb en mataderos de Cataluña fue evaluada. La probabilidad de detectar un bovino infectado fue estimada mediante el producto de las siguientes probabilidades: 1) probabilidad de que un bovino infectado llegue a matadero presentando lesiones compatibles y detectables macroscópicamente (LDM), 2) probabilidad de que LDM sean detectadas durante la inspección en matadero, 3) probabilidad de que el veterinario oficial de matadero sospeche de TBb y envíe las muestras al laboratorio para su confirmación. La sensibilidad individual de la vigilancia de TBb en los mataderos de bovino de Cataluña, resultó ser de un 31.4% (CI 95%: 28.6-36.2). En el cuarto estudio, la dinámica de transmisión de TBb dentro de un rebaño fue analizada. Para ello se desarrolló un modelo compartimental estocástico SEI (Susceptibles, Expuestos e Infecciosos). Con este modelo se infirieron los parámetros relacionados con la transmisión, en particular el ratio de transmisión (β) y el ratio en el que los animales infectados pasan a ser infecciosos (α). También, debido a la controversia sobre las sensibilidades reportadas de la prueba de la intradermo-tuberculinización simple (IDTs) en condiciones de campo, la probabilidad de detectar tanto los animales infectados como los infecciosos (ϕ y ρ, respectivamente) fue también evaluada. Las distribuciones posteriores de los parámetros modelizados fueron obtenidas mediante el método de las cadenas de Markov Chain Monte Carlo y por métodos de aproximación por computación bayesiana (MCMC-ABC). El promedio obtenido, de 33 rebaños de diferentes áreas de España, para el ratio de transmisión varió entre 0.0001 y 0.0002 por día, y el promedio del ratio de transición de bovinos infectados a infecciosos varió entre 0.011 y 0.0001. / The present PhD Thesis aimed to provide information about the epidemiology of bovine tuberculosis (bTB) in cattle and relevant data for the implementation of a risk based surveillance system. In the first study the space-time variation of the risk of bTB in cattle between 2006 and 2011 was analyzed. The results indicated that in some counties, between some years, the prevalence and the incidence of the disease was higher as compared to the global rate in the rest of the counties of Spain. The analysis of potential risk factors indicated that both, a large number of movements from counties with high incidence (>1%), and presence of bullfighting cattle herds increased the bTB risk. In the second study it was described a risk-based approach for bTB surveillance that is under development in New Zealand. Given that the presence of bTB in a herd is driven by a number of factors including previous infection history, the amount of testing carried out on individual herds, geographic location or herd movement behavior, the objective was to use routinely recorded data to derive a ‘risk score’ for each of these factors and then to combine them to return a composite bTB risk score for each herd. By this way, herds could be ranked and this would enable to focus surveillance in those herds with the highest risk score, providing effective surveillance coverage at a reasonable overall cost. In the third study the individual sensitivity of bovine tuberculosis surveillance in Catalonian slaughterhouses of cattle was assessed. The probability of detection of a bTB-infected cattle by the slaughterhouses in Catalonia was estimated as the product of three consecutive probabilities: P1) the probability that a bTB-infected animal arrived at the slaughterhouse presenting Macroscopically Detectable Lesions (MDL); P2) the probability that MDL were detected by the routine meat inspection procedure, and P3) the probability that the veterinary officer suspected of bTB and sent the sample for laboratory confirmation. The mean individual bTB surveillance sensitivity of the different cattle slaughterhouses in Catalonia obtained in this study was 31.4% (CI 95%: 28.6-36.2). In the fourth study a stochastic compartmental SEI (Susceptible, Exposed (latent), and Infectious) model was developed to mimic Bovine tuberculosis (bTB) within-herd transmission dynamics. This model was used to infer several parameters related to bTB spread within Spanish cattle farms, in particular the cattle-to-cattle transmission rate (β) and the rate at which infected cattle become infectious (α). Also, given the controversy over the sensitivities of the single intradermal tuberculin test (SIT) application in field conditions, the probability of detection of both infected and infectious cattle (ϕ and ρ, respectively), were also evaluated. A Markov Chain Monte Carlo-Approximate Bayesian Computation (MCMC-ABC) method was used to generate posterior distributions and the mean within herd transmission rate (β) estimated in 33 Spanish herds varied between 0.0001 and 0.0002 per day, and the mean rate at which infected cattle become infectious (α) varied between 0.011 and 0.0001.

La present tesi doctoral tenia com a objectiu complementar el coneixement actual sobre l’eficàcia de la vacuna enfront a PCV2 en condicions d’infecció subclínica i explorar dos conceptes nous (en quan a estratègies de vacunació enfront a aquest patogen) que poguessin augmentar l’eficàcia d’aquest tractament. El primer estudi pretenia avaluar la possible interferència de la presència de diferents nivells d’anticossos d’origen maten (AOM) en el moment de la vacunació, en l’evolució del guany mig diari de pes (GMDP). En aquest estudi, només es va detectar una possible interferència en l’eficàcia de la vacuna sobre el GMDP, quan es va considerar la subpoblació d’animals amb els valors S/P més alts. Per tant, l’impacte d’aquesta possible interferència en condicions de camp es probablement negligible en la majoria d’animals i de les granges. En el segon estudi, es va avaluar la viabilitat d’eradicar la infecció de PCV2 en una granja convencional infectada subclínicament amb PCV2 mitjançant una estratègia de vacunació en massa. L’aplicació durant una any de la vacunació en massa enfront a PCV2 (sense implementar mesures específiques de maneig o de bioseguretat) no va ser capaç d’eliminar l’infecció per PCV2. De fet, un cop la vacunació es va aturar, el virus es va detectar de nou. De totes maneres, la disminució dels nivells d’anticossos i la no detecció del virus durant la segona meitat del període de vacunació en massa deixa entreveure que la eradicació de la infecció de PCV2 mitjançant un programa de vacunació més llarg i més extensiu podria ser possible. / This thesis aimed to complement the current knowledge on PCV2 vaccination efficacy under subclinical infection conditions and give new creative concepts (“thinking out of the box”) for future related studies. The first study had the objective to assess the putative interference of different maternally derived antibody (MDA) levels at the time of vaccination on the average daily weight gain (ADWG) evolution. In this study, an apparent interference of vaccine efficacy on ADWG was noticed only when a small subpopulation of pigs with the highest ELISA S/P ratios was considered, Therefore, the impact of this possible interference under field conditions is probably negligible for most of the animals and farms. In the second study, the feasibility to eradicate PCV2 in a conventional PCV2 infected farm by using a mass vaccination strategy was assessed.. One year period of mass PCV2 vaccination (without implementing further farm management practices or biosafety measures) was not able to clear out PCV2 infection. Indeed the virus became detectable again when vaccination was stopped. However, the decreasing antibody levels and the lack of viral detection during the second half of the vaccination period shed a light on eradicating this virus by applying a longer term vaccination in a wider area would be feasible.

El propofol es un agente anestésico inyectable que puede usarse para la inducción o para el mantenimiento de la anestesia. Actualmente su uso está ampliamente extendido tanto en medicina humana como en veterinaria, especialmente en campos tales como la anestesia en pacientes gestantes. No obstante sus efectos sobre el feto no se conocen con exactitud. En la presente tesis doctoral se ha determinado, en primer lugar, la farmacocinética del propofol en ovejas gestantes a término así como el paso placentario del propofol tras la administración de un bolo único endovenoso de 6 mg/kg y tras la administración de un bolo endovenoso de 6 mg/kg seguido de una infusión continua de 0.4 mg/kg/m durante una hora. En la segunda fase del estudio se han determinado los efectos del propofol sobre el sistema cardiovascular y del equilibrio ácido-base de madres y fetos. Para el estudio farmacocinéticos se emplearon 12 ovejas de raza ripollesa. Todas ellas fueron preparadas quirúrgicamente para el procedimiento experimental. Las concentraciones plasmáticas decrecieron siguiendo un modelo bicompartimental, con una primera fase rápida de caída de concentraciones plasmáticas y una segunda fase de eliminación plasmática lenta. Las concentraciones de propofol fetales encontradas en este estudio demostraron ser mucho más bajas que las maternas corroborando los datos previos en los cuales se había observado este efecto de barrera placentaria en muestras de sangre fetal obtenidas después del parto. Si comparamos los parámetros farmacocinéticos del propofol obtenidos en las madres y los fetos después de la administración de un bolo i.v. podemos observar que las AUC son tres veces superiores en las madres en comparación con los fetos. En cambio el tiempo en que el feto esta expuesto al fármaco es similar al de la madre, tal y como se refleja en la similitud entre los MRT encontrados en el estudio (0.4 h en la madre y 0.5 h en el feto). Sin embargo, aunque el tiempo de exposición sea el mismo en las madres que en los fetos los tiempos de vida media para los fetos fueron más del doble de los obtenidos para las madres. Esta eliminación lenta observada en los fetos ha sido descrita anteriormente en neonatos humanos. Cuando se evalua el paso placentario tras la administración de una infusión continua de propofol se puede observar que las concentraciones fetales durante toda la infusión son entre seis y nueve veces inferiores que las de la madre. Esta relación de concentraciones se mantiene elevada durante todo el tiempo en que se mantiene la infusión, mientras que a partir de la supresión del tratamiento esta relación de concentraciones va diminuyendo hasta llegar a una relación de 1:1 a la hora y media de la supresión. Este dato indica que el fármaco no llegaría al feto en grandes cantidades y que el retorno a la madre desde el feto se realizaría con dificultad, de manera que, en la madre, la lenta fase de eliminación terminal estaría marcada por la eliminación fetal de fármaco. Dicha lentitud en la eliminación fetal se ve reflejada en elevados tiempos de vida media de eliminación en el feto (1.1 h) en comparación con los observados en las madres (0.5h), al igual que en la primera parte del estudio. El MRT también mostraria un tiempo de residencia media del propofol en los fetos. En la segunda fase del estudio se emplearon 6 ovejas Ripollesas a término preparadas de forma quirúrgica. La presión arterial media (MAP) y la presión diastólica (DAP) maternas disminuyeron de forma significativa (p<0.05) durante los 15 primeros minutes de la infusión. Durante este periodo de tiempo también disminuyo el pH materno debido a un aumento significativo de la PaCO2. El pH fetal decreció de forma significativa durante el periodo de la infusión mientras que la MAP, DAP y PaCO2 fetales incrementaron de forma significativa. Tras el cese de la infusión todos los parámetros volvieron a valores normales no detectándose diferencias significativas entre el periodo control y el de recuperación. Podemos concluir que el propofol cruza la placenta con rápidez. Las concentraciones de propofol en ovejas gestantes fueron superiores a las detectadas en sus fetos. Los efectos del propofol sobre fetos ovinos fueron relevantes aunque estos recuperaron sus constantes tras el cese de la infusión de propofol. / Propofol is an injectable anaesthetic that is currently used both in veterinary and human medicine for the induction and maintenance of anaesthesia. Although little is known about the pharmacokinetics and the effects of propofol in fetuses, it is widely used in obstetric procedures, particularly in caesarean section. This study determines firtly the pharmacokinetics of propofol in pregnant ewes in the last third of pregnancy, and placental transfer and pharmacokinetics in fetuses after the administration of a 6 mg/kg IV bolus (phase 1) or a 6 mg/kg IV bolus followed by continued infusion of 0.4 mg/kg/minute. In the second part of the study we have determined the effects of propofol on maternal and fetal cardiopulmonary function during the last trimester.Twelve pregnant Ripollesa ewes, free of any clinical signs of illness, between 105 and 135 gestational days were used for the pharmacokynetical study. All ewes were prepared surgically for the experimental study. We have shown that the plasma concentration decreased with a two-phase kinetic profile, one fast phase with the fall of plasma concentrations, and a second slow plasma elimination phase. The fetal PRF concentrations measured in this study were shown to be much lower than the maternal ones, corroborating the previous data in which a placental barrier effect was demonstrated in fetal blood samples taken after giving birth in humans.In comparing the pharmacokinetic parameters of PRF obtained from ewes and from fetuses after the administration of an i.v. bolus, it was apparent that the AUC was three times higher for mothers, indicating that exposure to the medication in fetuses is three times lower than for mothers. The time in which the fetus is exposed to the medication is similar to that for the mother, as reflected by the similarity between the MRT (0.4 h for the dams and 0.5 h for the fetus). Nevertheless, the half-life times for the fetuses were more than twice those for the mothers. This slow elimination observed in the fetuses has been previously described in human neonates. It is possible that the small amounts of PRF found in neonates may be due to its slow elimination and not to the fact that there are large amounts of these drugs in the mother and her fetus. In other words, the fetuses have small amounts of propofol and this is eliminated very slowly. When the placental transfer of propofol is analysed after the administration of an i.v. bolus and infusion, it can be seen that the fetal concentrations throughout infusion were between six and nine times lower than for the mother. The relationship between concentrations remains high throughout the infusion period but after the treatment stops the relationship between concentrations fell until it reached a 1:1 ratio, 90 min later. This indicates that the medication did not reach the fetus in high amounts, and its return to the mother would also occur slowly, so that, in the mother, the slow terminal elimination phase would be characterised by the fetal elimination of the medication. Such slowness is reflected in the higher elimination half-lives in fetuses (1.1 h), in comparison with those observed in mothers (0.5h) The MRT also suggests significant differences between mothers and fetuses, with a higher propofol residency time in the fetuses, compared to the mothers.In the second part of the study six pregnant Ripollesa sheep were used to study the cardiovascular effects of propofol. They were prepared as above. The maternal mean arterial pressure (MAP) and diastolic arterial pressure (DAP) were significantly decreased (p<0.05) during the first 15 min of the infusion period, while the maternal pH was also significantly decreased. The maternal PaCO2 and PaO2 were significantly increased throughout the total infusion period. It was further observed that the fetal pH decreased significantly, throughout the infusion period, whereas the fetal MAP, DAP and PaCO2 were significantly increased during the first 15 min of the infusion, after which time all parameters returned to control values. No differences in either maternal or fetal parameters were observed between the control and the recovery times.We conclude that propofol crosses the placenta very rapidly in sheep. The propofol concentrations in ewes were far greater than those found in the fetuses. Nevertheless, the fetuses showed a far slower elimination of propofol and the effect of propofol on prenatal lambs may be relevant.