La leche y los productos lácteos son alimentos con un alto valor nutritivo pero también susceptibles de contaminación y principales vehículos de introducción de aflatoxina M1 (AFM1) en la dieta, ya que no es destruida por los tratamientos convencionales térmicos de pasteurización o esterilización usados en la industria láctea para higienizar estos productos, y así puede estar presente en yogurt, queso, leche deshidratada y otros productos lácteos. La International Agency for Research on Cancer (IARC) de la OMS, ha categorizado la AFM1 como carcinogénica y tóxica para humanos en el Grupo 1. En este trabajo se analizó la presencia de AFM1 en leche y productos de base láctea comercializados en el área metropolitana de Monterrey, N.L., México, y se evaluaó el consumo de estos productos susceptibles de contaminación por AFM1 en la población por grupos de edad, así como el índice de riesgo carcinogénico. En el primer muestreo se analizaron 84 muestras por la técnica ELISA, de las cuales 20 fueron leche pasteurizada y 64 con proceso térmico UHT, de las cuales 48 fueron leches con presencia de grasa butírica y 16 producto lácteo con presencia de grasa vegetal. Las leches pasteurizadas presentaron un 100% de presencia de AFM1, con una media de 0,39 μg/L y un 20% de las muestras por encima de lo que establece la NOM-243-SSA1-2010 (0,5 μg/L), mientras que de los productos UHT, todas mostraron presencia de AFM1, siendo la leche que contiene grasa butírica la que en promedio se encontró dentro de la NOM con 0,45 μg/L y un 38% de las muestras sobre el límite marcado por la NOM, mientras que el producto lácteo mostró un promedio de 0,66 μg/L y un 69% de las muestras por encima de lo que establece la NOM. En el segundo muestreo se analizaron 162 muestras de leche, incluyendo leche bronca (n = 51), fórmula infantil (n = 55), leche deshidratada (n = 15) y leche y producto lácteo UHT (n = 41), colectadas en supermercados y analizadas por extracción en columnas de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales y cuantificadas mediante HPLC con detector de fluorescencia. Con el objetivo de determinar la ingesta promedio diaria de AFM1 por grupos de edad y poder establecer el índice de riesgo carcinogénico se utilizó la encuesta ENSANUT-2012 correspondiente a Nuevo León, aplicando la fórmula descrita por Kuiper-Goodman (1994). De las 51 muestras de leche bronca analizadas, 16 de éstas resultaron positivas (31%), obteniéndose 2 muestras (4%) por encima del límite máximo que establece la NOM y una media de 0,07 μg/kg. De las 55 fórmulas infantiles analizadas, 11 de éstas mostraron resultados positivos a la presencia de AFM1, mostrando todas valores por encima de lo que establece el Códex Alimentarius (0,025 μg/kg) y una media de 0,04 μg/kg. De las 15 muestras de productos deshidratados, 12 fueron leche (con grasa butírica) y 3 producto lácteo (con grasa vegetal), con una media de 0,13 μg/L y 10 de éstas tuvieron presencia de AFM1. De las 41 muestras UHT, 27 fueron leche y 14 producto lácteo, con una media de 0,30 μg/L y 26,8% de las muestras con niveles de AFM1 por encima de lo establecido por la NOM. Según los datos obtenidos de la ingesta promedio diaria de AFM1 por grupos de edad, se observó que los niños de edades comprendidas entre recién nacidos y edad escolar (0 - 11 años) fue el grupo poblacional que presentó los niveles más elevados de ingesta de AFM1, ya que en este grupo se encuentran los lactantes cuya principal dieta hasta los 6 meses es a base de leche materna o bien leches maternizadas, presentando niveles de ingesta de AFM1 (4,40 ng/kg PCP/día) por encima del límite de índice de riesgo carcinogénico (2 ng/kg PCP/día). Aunque en la población pre-escolar y escolar se modifica la frecuencia, el tipo y el consumo de leche y productos lácteos, el peso corporal todavía no es suficientemente alto para revertir los valores de ingesta promedio diaria de AFM1 presentando niveles elevados de riesgo carcinogénico (5,01 ng/kg PCP/día). Al disminuir la ingesta de leche y productos lácteos por la población adolescente, adulta y adulta mayor y al relacionar esta ingesta con el peso corporal, la ingesta promedio diaria de AFM1 (0,68 ng/kg PCP/día) se encontró por debajo del índice de riesgo carcinogénico, no representando riesgo a este respecto. / Milk and dairy products are foods with a high nutritional value but also susceptible to contamination and main vehicle entry of aflatoxin M1 (AFM1) in the diet because it is not destroyed by the conventional thermal treatments such as sterilization or pasteurization usually used in the dairy industry to sanitize these products, and thus may be present in yogurt, cheese, dried milk and other dairy products. The International Agency for Research on Cancer (IARC) of WHO has categorized the AFM1 as carcinogenic and toxic to humans in Group 1. This paper analyzed the presence of AFM1 in milk and milk-based products marketed in the metropolitan area of Monterrey, NL, Mexico, and the consumption of these products, which are susceptible to contamination by AFM1 was evaluated in the population by age group and as the index of carcinogenic risk. In the first sampling, 84 samples were analyzed by ELISA, of which 20 were pasteurized milks and 66 were UHT-treated products, including 48 milks containing butyric fat and 16 milk products containing vegetable fat. The pasteurized milks showed 100% presence of AFM1, with an average of 0.39 μg/L and 20% of the samples above the provisions of the NOM-243-SSA1-2010 (0,5 μg/L), while UHT products, all showed the presence of AFM1, with milk containing butyric fat which on average were within the NOM with 0.45 μg/L and 38% of the samples above the limit set by the NOM, while the dairy product showed an average of 0.66 μg/L and 69% of the samples above the provisions of the NOM. In the second sampling, 162 milk samples were analyzed, including raw milk (n = 51), infant formula (n = 55), milk powder (n = 15) and UHT-treated products (n = 41), collected from supermarkets and analyzed by extraction in immunoaffinity columns containing monoclonal antibodies, and quantified by HPLC with fluorescence detection. In order to determine the average daily intake of AFM1 by age group and to establish the carcinogenic risk index, ENSANUT corresponding 2012 survey was used to Nuevo León, applying the formula described by Kuiper-Goodman (1994). Among the 51 raw milk samples analyzed, 16 were positive (31%), obtaining 2 samples (4%) above the maximum limit established by the NOM and an average of 0.07 μg/kg. Among the 55 infant formulas analyzed, 11 were positive for the presence of AFM1, showing all values above that established by the Codex Alimentarius (0.025 μg/kg) and a mean of 0.04 μg/kg. Among the 15 dehydrated samples, 12 were milk (milk fat) and 3 milk products (vegetable fat), with an average of 0.13 μg/L and 10 had presence of AFM1. Among the 41 UHT samples 27 were milk and 14 dairy product, with a mean of 0,30 μg/L and 26,8% of samples above the AFM1 levels established by the NOM. According to the data of the average daily intake of AFM1 by age group, it was observed that children aged between newborn and school age (0 - 11 years) was the population group that had the highest intake levels of AFM1, since in this group of infants whose main diet is up to 6 months is breast milk or milk-based infant formula presented AFM1 intake levels of 4.40 ng/kg PCP/day over the limit carcinogenic risk index (2 ng/kg PCP/day). Although the pre-school and school population the frequency, type and consumption of milk and milk products is changed, the body weight is not yet high enough to reverse the values of average daily intake of AFM1 presenting high levels of carcinogenic risk (5.01 ng/kg PCP/day). By reducing the intake of milk and dairy products by the adolescent, adult and older adult population and to relate this intake to body weight, average daily intake of AFM1 (0.68 ng/kg PCP/day) was below the carcinogenic risk index, and representing no risk in this regard.

Los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel de los mamíferos. Los mismos se han adaptado a vivir dentro de los folículos pilosos y las glándulas sebáceas de la piel de sus huéspedes mamíferos. La demodicosis puede ser definida como una enfermedad inflamatoria cutánea caracterizada por la presencia de una sobrepoblación de ácaros Demodex. Se considera que la respuesta inmunitaria celular es la responsable del control de la población de ácaros, mientras que los roles de las respuestas inmunitarias humoral e innata, son desconocidos. En los animales domésticos, la forma más grave de la demodicosis, la padecen los perros. En consecuencia, la demodicosis canina es la enfermedad más estudiada. Se han identificado dos especies de ácaros Demodex en perros: Demodex canis y Demodex injai; mientras se ha propuesto una tercera especie denominada Demodex cornei. Muchos estudios han tratado de documentar la prevalencia de ácaros Demodex en los perros sanos mediante diferentes métodos. En la presente tesis doctoral, se describe una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real para detectar ADN de Demodex (secuencia del gen de la quitina sintetasa) en pelos de perros. Ésta técnica demostró la presencia de ácaros Demodex en porcentajes más altos que en los estudios anteriores, sugiriendo que los ácaros Demodex están presentes en todos los perros sanos independientemente de la edad, sexo, raza o pelaje. Además, la técnica demuestra que las poblaciones de Demodex están distribuidas a lo largo del cuerpo de los perro en pequeño número. Con el fin de establecer las relaciones filogenéticas entre las dos especies caninas y la propuesta tercera especie, amplificamos y secuenciamos un fragmento del ADN mitocondrial de la subunidad ribosomal 16S. El análisis filogenético demuestra que D. injai es una especie diferente de D. canis y que D. cornei es probablemente una variante morfológica de D. canis. Además, se desarrolló y estandarizó una técnica de PCR convencional para la detección específica de ADN de D. injai. Ésta técnica demostró que D. injai también es un habitante normal de la piel de algunos perros y que en la mayoría de los casos clínicos de demodicosis canina, la sobrepoblación de D. injai es infrecuente. Finalmente, con el fin de ampliar los conocimientos de la respuesta humoral en la demodicosis canina, obtuvimos un extracto antigénico crudo de D. canis y demostramos, mediante una técnica de Western-blot, la presencia de inmunoglobulinas G contra diversos antígenos de D. canis en el suero de perros sanos, de perros con demodicosis juvenil generalizada con o sin infección cutánea secundaria. En conclusión, ésta tesis doctoral demuestra que los ácaros Demodex son habitantes normales de la piel canina y que se distribuyen en pequeño número a lo largo del pelaje canino. Además, los ácaros D. canis deben ser considerados una especie diferente a ácaros D. injai y, los ácaros D. cornei, una variante morfológica del mismo. Por otro lado, los perros sanos y los perros con demodicosis juvenil generalizada presentan una respuesta humoral adquirida y anticuerpos dirigidos contra diversos antígenos proteicos de D. canis. / It is considered that Demodex mites are normal inhabitants of the mammalian skin. They have been adapted to live inside skin hair follicles and sebaceous glands of mammalian hosts. Demodicosis can be defined as an inflammatory skin disease characterized by the presence of Demodex mite overpopulation. It is considered that the cellular immune response is responsible for the control of mite population, while the role of the humoral and innate immune responses remains unknown. In domestic animals, the most severe form of demodicosis occurs in dogs. Consequently, canine demodicosis is the most studied disease produced by Demodex mites. Two canine Demodex species have been identified: Demodex canis, and Demodex injai, while a third species unofficially named Demodex cornei, has been proposed. Many studies have tried to report Demodex prevalence in healthy dogs by different methods. In the present doctoral thesis, we described a real-time PCR technique to detect Demodex DNA (sequence of chitin synthase gene) in canine hair samples. This technique demonstrated the presence of Demodex mites in higher percentages than previous reports, suggesting that Demodex mites are present in all healthy dogs independent of age, sex, breed, or coat. Furthermore, Demodex populations were distributed in small numbers along the dog’s body. In order to analyze the phylogenetic relationships between the two canine Demodex species and the proposed third species, we amplified and sequenced a fragment of the mitochondrial 16S rDNA gene. Phylogenetic analysis revealed that D. injai is a different species from D. canis. In addition, it demonstrated that D. cornei is probably a morphological variant of D. canis. A conventional PCR for the specific detection of D. injai DNA was also developed and standardized. This technique demonstrated that D. injai is also a normal inhabitant of some dogs. Moreover, it suggested that in the majority of clinical canine demodicosis cases, an overgrowth of D. injai is unlikely. Finally, to enlighten the field of the humoral response in canine demodicosis, a D. canis crude extract antigen was obtained and we demonstrated the presence of immunoglobulins G against several D. canis antigens in the sera of healthy dogs and in the sera of dogs with juvenile generalized demodicosis with and without secondary complicating pyoderma by western blot technique. In conclusion, this doctoral thesis demonstrated that Demodex mites are normal inhabitant of the canine skin, they are present in the majority of dogs, and are distributed in very low numbers along all the haired skin. Furthermore, Demodex injai must be considered a different species from D. canis, and D. cornei is a probable morphological variant of D. canis. Healthy dogs and dogs with canine juvenile generalized demodicosis have an acquired humoral immune response against Demodex mites and present serum antibodies directed against several Demodex canis protein antigens.

La esterificación química de ácidos grasos (AG) libres y glicerol, co-productos de la refinación y de la industria del biodiesel respectivamente, genera nuevas grasas con diferentes características físico-químicas y nutricionales. La introducción de estos co-productos en dietas comerciales para perros contribuye a reducir la cantidad de residuos y a conseguir un sistema de producción de alimentos para animales de compañía más sostenible. Por todo ello, el objetivo de esta Tesis es evaluar el uso de diferentes aceites ácidos esterificados (AAE) para dietas caninas. En primer lugar, la presente tesis doctoral explora el efecto de la inclusión en dietas para perros adultos de AAE de palma con diferente contenido en mono- (MG) y diglicéridos (DG), en comparación con un aceite convencional de palma, sobre las preferencias alimentarias, la digestibilidad y los niveles de lípidos plasmáticos, tanto postprandiales como en ayuno. La hipótesis de este capítulo se centra en que la esterificación de aceites ácidos de palma incrementará la digestibilidad de ciertos AG, como la de los AG saturados (AGS), debido a un incremento de los AGS localizados en la posición sn-2 de la molécula de glicerol y a un incremento en el contenido de MG y DG, que poseen propiedades emulsificantes de la grasa. Nuestros resultados indicaron que los perros tienen una preferencia por las dietas con AAE de palma en su composición en comparación con las que incorporaban aceite convencional de palma. Además, la inclusión de AAE de palma no produjo ninguna diferencia ni en la digestibilidad de la grasa ni en la lipemia, tanto postprandial como en ayuno, en comparación con el aceite de palma convencional. No observamos ninguno de los beneficios hipotetizados con la inclusión de aceites de palma esterificados, que se podrían haber visto neutralizados por los efectos negativos de los AAE sobre su digestión y absorción relacionados con su punto de fusión. Por otro lado, la presenta memoria investiga el uso de AAE, obtenidos a partir de aceite de coco, con alto contenido en ácidos grasos de cadena media (AGCM) en comparación con AG de cadena más larga, obtenidos a partir de aceite de colza y soja. Para ello, se determinó el efecto sobre las preferencias alimentarias, la digestibilidad de la dieta y el control de peso en perros adultos con sobrepeso. Diferentes estudios han confirmado el potencial de los AGCM para reducir la grasa corporal (GC) en humanos y roedores. Sin embargo, no se han publicado estudios que estudien este efecto en perros. Nuestros resultados indicaron que la incorporación de AG de aceite de coco no tiene ningún efecto negativo ni en la palatabilidad ni en la digestibilidad de la materia orgánica y la energía en comparación con AG insaturados de cadena más larga. Además, nuestros resultados también muestran una mayor digestibilidad total de la grasa en los animales alimentados con AGCM, debido a una mejor digestibilidad de los AGCM respecto a AGS de cadena más larga. Por otro lado, la incorporación de AGCM del aceite de coco disminuye el porcentaje de peso perdido y aumenta la GC después de un tratamiento de pérdida de peso en comparación con AG insaturados de cadena más larga, aportados por aceites de colza y soja. Sin embargo, las dietas experimentales no sólo difieren en longitud de cadena sino que también lo hacen en grado de saturación, por lo cual es necesario más investigaciones enfocadas a diferenciar estos efectos. / Chemical esterification of free fatty acids (FA) and glycerol, by-products of the refinery and the bio-diesel industries respectively, generates new technological fats with different physico-chemical and nutritional characteristics. Moreover, re-introducing these by-products in commercial canine diets minimizes the amount of residues and contributes to sustainable food manufacturing systems. Thus, this thesis aims to evaluate the use of different esterified acid oils (EAO) for canine diets. On the one hand, this thesis aims to explore the effect of palm EAO with different mono- (MAG) and diacylglycerides (DAG) content on food preferences, digestibility, and post-prandial and fasting plasma lipids compared to palm native oil in adult dogs. It is hypothesized that esterification of palm acid oil improves the digestibility of certain FA, such as saturated FA (SFA), due to a predicted increase of SFA at the sn-2 position within the glycerol molecule and also due to their increased MAG and DAG content, which have fat emulsifying properties. Our results indicate that dogs preferred diets with palm EAO in their composition compared to those with palm native oil. Additionally, the inclusion of palm EAO in a canine basal diet did not result in any differences on lipid digestibility, and fasting and post-prandial lipaemia compared to palm native oil. We did not observe any of the hypothesized expected benefits of the inclusion of palm EAO, which might have been counteracted by negative effects of EAO associated to their melting point on digestion and absorption. On the other hand, this dissertation also aims to investigate the use of EAO with different medium chain fatty acid (MCFA) content from coconut oil on food preferences, digestibility, and weight management compared to longer chain FA from canola and soybean oils in overweight adult dogs. Several studies have confirmed the potential of MCFA to reduce fat mass (FM) in humans and rodents. However, to our knowledge, there are no published studies in dogs assessing this effect. Our results indicate that the incorporation of FA from coconut oil does not have a negative effect neither on palatability nor on organic matter and energy digestibility compared to unsaturated long chain FA. Moreover, our results also show an improvement in overall fat digestibility in dogs fed diets with MCFA, explained by the better digestibility of saturated MCFA versus longer chain SFA. On the other hand, incorporation of MCFA from coconut oil decreases the percentage of body weight lost and increases body FM after weight loss in comparison to longer unsaturated FA from canola and soybean oils. However, since the experimental diets differed not only in chain length but also in chain saturation, further research is needed to clearly differentiate these effects.

El cáncer es una de las principales causas de muerte en la población humana del mundo desarrollado. Los avances en las terapias convencionales, cirugía, quimioterapia, radioterapia, detección y diagnóstico del cáncer han permitido una mejora en los niveles de supervivencia y calidad de vida de los pacientes. Sin embargo, restan multitud de tipos de enfermedades oncológicas donde poco o nada se puede hacer por combatirlas. La viroterapia con adenovirus emerge como una aproximación esperanzadora para el tratamiento del cáncer. Esta terapia permite minimizar la dosis inicial administrada gracias a la replicación viral en el tumor, amplificando exponencialmente los niveles de virus. Además, los avances en el conocimiento biológico del adenovirus y de las técnicas moleculares, permiten conferir selectividad y potencia oncolítica a los adenovirus. Por otra parte, el gran número de vías implicadas en la replicación viral impide la aparición de las clásicas resistencias a los agentes quimioterapéuticos. De todas formas, al alcanzar los ensayos preclínicos in vivo y sobretodo las fases clínicas en pacientes humanos, se hacen patentes nuevas limitaciones relacionadas con esta terapia. Una de estas limitaciones es la falta de potencia oncolítica. Esta falta se debe, en parte, al ciclo viral del adenovirus salvaje, el cual está optimizado para maximizar su producción, limitando la liberación viral al medio inicialmente y disminuyendo la respuesta inmune antiviral. En los tumores existe, sin embargo, un estado de inmunidad deprimida. Además, el aumento y aceleración de la liberación adenoviral se correlaciona con mayor actividad antitumoral. En el primer capítulo de este trabajo hemos combinado los adenovirus con virus adeno-asociados ya que previamente se ha descrito un aumento de la apoptosis y necrosis celular al darse coinfecciones de ambos virus. Esta combinación ha resultado en un aumento de la liberación adenoviral al medio, aumentando la propagación y la citotoxicidad in vitro de los adenovirus y la actividad antitumoral in vivo tras la administración intratumoral de ambos virus. Otra limitación de la viroterapia adenoviral es la falta de modelos adecuados que reflejen fielmente la realidad que los adenovirus oncolíticos se encuentran en pacientes humanos. Los modelos murinos son ampliamente utilizados para los ensayos de toxicidad y eficacia. Sin embargo, son poco o nada permisivos a la replicación viral, disponen de sistemas inmunes comprometidos para permitir la implantación artificial de tumores humanos, que evolucionaran de forma muy diferente a los tumores espontáneos de los pacientes. Esto provoca bajas correlaciones de los índices terapéuticos y, a veces, de los efectos adversos, entre modelos y pacientes. En el segundo capítulo de este trabajo hemos generado y caracterizado preclínicamente un adenovirus canino oncolítico, ICOCAV17, para su uso como agente terapéutico en la clínica veterinaria y como modelo para la viroterapia en clínica humana. Su replicación esta ligada a la vía del Retinoblastoma, incorpora el gen de la hialuronidasa para aumentar su diseminación intratumoral y hemos insertado el motivo RGD en su cápside para aumentar la infectividad de células tumorales. Además, cinco pacientes caninos con diferentes tipos de tumores han sido tratados intratumoralmente. Los resultados obtenidos indican que ICOCAV17 parece seguro administrado por vía intratumoral y su actividad antitumoral ha sido comprobada en tres pacientes observando necrosis y reducciones tumorales. / Cancer remains as a main cause of death in the developed world. The improvements made in conventional therapies as chemotherapy, surgery, radiotherapy, detection, and diagnosis of cancer have led to increased survival indexes and higher patient quality of live. However, some tumor types have not effective treatments yet. Virotherapy with adenoviruses is as a promising therapy for cancer treatment as it allows minimizing the initial administered dose due to the amplification of the virus within the tumor. This amplification increases the amount of virus present in the tumor. Moreover, the knowledge about adenoviruses and new molecular technics allows us to confer the virus tumor selectivity and oncolytic potency. Further, due to the multiple pathways that are involved in the virus cycle, the development of tolerance is quite difficult, as it happens for the well-known chemotherapeutic agents. Nevertheless, when viruses reach preclinical in vivo assays or clinical phases in human patients, new limitations related with this therapy appear. Low oncolytic potency is an example of these limitations. Life cycle of wild type adenovirus is one of the reasons of this low potency as it is optimized to maximize the total production what needs of low levels of released virus at early times decreasing the immune response against virus. However, immune response in tumor environment is inhibited. Moreover, enhanced adenovirus release correlates with increased antitumor activity. In the first part of this work we have combined adenovirus with adeno-asociated virus as enhanced apoptosis and cell death is described when combination of both viruses is performed. This combination resulted in enhanced adenovirus release, increasing adenovirus propagation and cytotoxicity in vitro, and antitumor activity in vivo when both virus were injected intratumoraly. Another problem of virotherapy with adenovirus is the lack of good predictive models. Murine models are widely used for toxicity and efficacy assays. However, these models are poor permissive to adenovirus replication, they have compromised immune system to allow artificial implanted human tumors to grow subcutaneously, and these tumors show different clinical evolution compared to spontaneous tumors within patients. All these factors led to poor correlated therapeutic indexes when adenoviruses reach clinical phases and less frequently to unexpected adverse events. In the second part of this work we have generated and characterized in preclinical assays a canine oncolytic adenovirus named ICOCAV17. This virus was conceived as a therapeutic veterinary agent and a model to human virotherapy. ICOCAV17 is a retinoblastoma pathway controlled virus, expressing a hialuronidase to enhance virus spread through the tumor, and has an RGD motif in the fiber to increase tumor cell infectivity. Moreover, five canine patients with different tumor types have been treated intratumoraly. Results suggest a good safety profile injecting the virus intratumoraly and efficacy has been observed in three patients.

La transmisión de patógenos zoonósicos desde la fauna salvaje al ganado doméstico, y vice-versa, es una problemática global ya que los ungulados salvajes aumentan en número y distribución en toda Europa, incluso en áreas urbanas. Al mismo tiempo, en la Unión Europea la frecuencia de ciertas zoonosis de transmisión alimentaria aumenta cada año. Además, la resistencia antimicrobiana es una amenaza mundial que urge ser monitorizada para evitar su diseminación. El propósito de esta Tesis es investigar si ciertos patógenos zoonósicos se comparten entre el ganado doméstico en extensivo y los ungulados salvajes (el jabalí – Sus scrofa - y la cabra montés – Capra pyrenaica) de un entorno natural del noreste español. Adicionalmente, hemos analizado la presencia de resistencia antimicrobiana tanto en patógenos como en bacterias comensales de estos hospedadores. Por último, se exploró lo mismo en jabalíes urbanos de Barcelona (España). La prevalencia de Salmonella fue mayor en jabalíes que co-habitaban con ganado vacuno (35.67%, CI 95% 28.19 - 43.70) que en aquellos que no (17.54 %, CI 95% 8.74 - 29.91), de manera similar, la riqueza de serotipos fue mayor en el primer grupo. Además, la probabilidad de que un jabalí sea portador de Salmonella aumenta cuanto mayor es el rebaño de vacas con el que comparte el hábitat. El hallazgo una cepa de S. Enteritidis resistente a ciprofloxacina y ácido nalidíxico en jabalí es una causa de preocupación para la salud pública. La diferente prevalencia de Salmonella en ganado vacuno (21.92%, 95% CI 13.10-33.14) y cabra montés (0.96%, 95% CI 0.2-2.8) y la ausencia de serotipos compartidos sugieren la ausencia de nexo (más información en el Estudio I y II). La prevalencia de E. coli O157:H7 fue baja: 3.41% en jabalí (IC 95% 0.94 - 8.52) y 1.88% en cabra montés (IC 95% 0.39 - 5.38), mientras que este patógeno no fue aislado del ganado doméstico (Estudio III). Respecto a Campylobacter, las muestras de cabra montés fueron negativas. C. jejuni se aisló de un jabalí (0.67%, IC 95% 0.02 – 3.66), sin embargo, C. jejuni fue la especie predominante en el ganado vacuno: 9.09% (IC 95% 3.02 – 19.95). C. lanienae fue la especie más frecuente en jabalí (12%, IC 95% 7.27 – 18.3) y se encontró simultáneamente en una vaca. Este estudio (IV) indica que, de nuevo, la cabra montés parece no desempeñar un papel importante en la epidemiología de Campylobacter. Además, aunque el jabalí y el ganado vacuno tienen su propia especie predominante de Campylobacter, existe una potencial transmisión de C. lanienae y C. jejuni entre ambos hospedadores. Tanto los animales salvajes como domésticos parecen poco importantes como reservorio de resistencia antimicrobiana (Estudio III). La frecuencia de resistencia en E. coli indicador fue reducida (0 a 7.9%). Sin embargo, se detectó resistencia a una cefalosporina de tercera generación en jabalí, y a fluoroquinolonas tanto en éste como en ganado vacuno. Esto sugiere el potencial del jabalí como centinela de resistencia antimicrobiana en una gran variedad de ambientes. En jabalíes urbanos, Salmonella se encontró en un 5% (IC 5% 0.61-16.91) y Campylobacter coli en un 4.88% (IC 95% 0.6-16.53). Otros Campylobacter termófilos fueron moderadamente prevalentes (19.51%, 95% CI 8.82-34.87), mientras que C. jejuni y E. coli O157:H7 no fueron aislados. La frecuencia de resistencia antimicrobiana fue mayor en Enterococcus faecium (95% de los aislados era resistente a uno o más agentes), seguido por Enterococcus faecalis (50%) y E. coli (10%). Además, describimos por primera vez resistencia a linezolid en un aislado procedente de fauna salvaje. Ya que estos resultados tienen implicaciones en la salud pública, es necesario llevar a cabo un seguimiento sanitario de la fauna en entornos urbanos.

Els virus de la influença tipus A (VIA) són patògens zoonòtics que poden infectar un ampli nombre d’hostes incloent-hi les aus, els porcs i els homes, entre altres. Anualment es documenten milions d’infeccions en humans causades per virus de la influença estacionals. Les pandemies causades pel virus influença també tenen una elevada repercussió pel que fa a la sanitat i l’economia. Tot i que determinats subtipus de VIA s’adapten millor en espècies d’aus que en humans, hi ha hagut casos d’infeccions en humans per virus de la influença de tipus aviars. La susceptibilitat dels porcs per infectar-se amb virus de la influença tant d’origen aviar com humà és també important pel que fa a la salut pública. El genoma del virus influença és segmentat in consta de vuit molècules de ARN de cadena senzilla i sentit negatiu que codifiquen per 11 o 12 proteïnes. Per tant, si una cèl·lula s’infecta simultàniament per dos VIA diferents, pot succeir un reagrupament amb la conseqüent generació d’una nova soca de virus. A més, mutacions a les glicoproteïnes de superfícies (sobretot a l’hemaglutinina, HA) són les responsables de l’elevada variabilitat de VIA. Tot i que les vacunes front a les epidèmies estacionals són eficaces, no produeixen resposta immunològica front una amplia varietat de VIA. És a dir, les vacunes estacionals només protegeixen front a les soques virals circulants durant una determinada estació. Aquest fet, junt amb el risc de possibles pandèmies, han fet encara més important i urgent el desenvolupament d’una vacuna universal capaç de produir immunitat front a múltiples subtipus virals. En la present tesis s’ha estudiat la resposta immunitària front a la infecció i vacunació del VIA en el context de VIA d’alta patogenicitat (vIAAP) A/H5N1 i A/H7N1 i el virus pandèmic A/H1N1 (pH1N1). El treball s’ha dividit en tres parts i cada part s’ha subdividit en capítols. Part I (capítols 1 i 2), conté la introducció general i els objectius de la tesi doctoral. L’objectiu d’aquesta primera part és donar una visió global i introduir informació per entendre (i) la infecció pel virus de la influença, (ii) la resposta immunològica provocada després de la infecció per VIA i (iii) un breu resum de les vacunes actuals front a influença. A continuació, s’exposen els objectius a aconseguir. Part II, és el cos de la tesis i conté els quatre treballs (del capítol 3 al 6) duts a terme durant els quatre anys que ha durat el programa de doctorat. Tots els capítols presentats han estat publicats o sotmesos a publicació en revistes indexades internacionals. Per tant, cada estudi manté l’estructura estàndard de: resum, introducció específica, materials i mètodes, resultats i breu discussió. Estudiar el paper dels determinants virals i caracteritzar la infecció pel VIA en diversos hostes pot ser de gran interès a l’hora de dissenyar vacunes òptimes. S’ha descrit la proteïna NS1 com a un dels principals determinants de virulència en mamífers, però no s’ha estudiat gaire el paper d’aquesta en aus. En el capítol 3 es va avaluar la implicació de la proteïna NS1 en la patogenicitat viral en pollets. Es van infectar pollets amb vIAAP H7N1 que contenien el segment NS de vIAAP H5N1. Les manifestacions patològiques i la resposta immunològica conseqüència de la infecció amb cada un dels virus van ser avaluades. També és molt important el paper de la immunitat prèvia durant un brot perquè pot ser determinant de la mort o supervivència de l’animal. En el capítol 4 es van exposar pollets a un virus H7N2 de baixa patogenicitat (vIABP) i a continuació es van infectar amb un vIAAP H7N1. Posteriorment es van infectar amb un vIAAP H5N1. Els animals que havien estat infectats prèviament amb vIABP quedaven protegits a la posterior infecció letal amb el vIAAP H7N1. No obstant, la resposta immunitària produïda no era suficient per a protegir els pollets front a la infecció amb un virus heterosubtípic (vIAAP H5N1). La presència o absència d’anticossos inhibitoris front a H7- i H5- correlacionaven amb la presència o absència de protecció, respectivament. Conèixer els programes de vacunació actuals i la seva eficàcia és útil per a planificar i dissenyar futures estratègies de vacunació. Les aus aquàtiques són el reservori dels VIA; per tant, són extremadament importants pel que fa a l’ecologia del virus. Aprofitant els programes de vacunació es va testar el sèrum de diverses espècies d’aus de zoològics i centres de recuperació d’Espanya (capítol 5). Els sèrums es van utilitzar per a l’avaluació de la resposta humoral deguda a la vacuna. El principal objectiu del treball era determinar l’eficàcia de vacunes disponibles (inactivades en suspensió oliosa) en diverses espècies d’aus i comparar la variabilitat inter- i intra-espècie. Finalment, i tenint en compte el potencial risc del VIA, els esforços es van focalitzar en desenvolupar una vacuna capaç de protegir a un ampli nombre de subtipus de VIA. La pandèmia de 2009 amb el virus H1N1 (pH1N1) és un clar exemple que els porcs poden actuar com a “coctelera” i generar nous virus. En el capítol 6 es van immunitzar porcs amb pèptids derivats de l’HA i a continuació es van infectar amb el virus pH1N1. Tot i que els pèptids-HA produïen una molt bona resposta humoral i cel·lular, no es va detectar activitat neutralitzant i només es va obtenir un efecte parcial en l’eliminació del virus. Part III (Capítols 7 i 8), és la secció on es discuteixen les implicacions dels resultats obtinguts en els diferents estudis i on s’enumeren les conclusions principals. En una secció a part, s’han inclòs totes les referències bibliogràfiques utilitzades per a l’elaboració de la tesi. S’ha inclòs també un apèndix per afegir informació addicional. / Influenza A viruses (IAV) are zoonotic pathogens that can replicate in a wide range of hosts, including birds, pigs and humans, among others. Millions of human infections caused by seasonal influenza virus are reported annually. Influenza pandemics have also a significant health and economic repercussions. Although certain subtypes of IAV are better selected in avian species than in humans, there are reports that evidence cases of human infections with avian influenza viruses (AIV). The susceptibility of pigs to infection with influenza viruses of both avian and human origins is also important for public health. The genome of influenza virus is segmented and consists of eight single-stranded negative-sense ribonucleic acid (RNA) molecules encoding 11 or 12 proteins. Thus, if a single cell is simultaneously infected by two distinct influenza viruses, a reassortment can occur resulting in the generation of a novel virus strain. Moreover, mutations in the surface glycoproteins (mainly in the hemagglutinin, HA) are the responsible of the high variability of IAV. Influenza vaccines against seasonal epidemics, although have good efficacy do not elicit immune response against a wide variety of IAV. Thus, seasonal vaccines only confer protection against the circulating viral strains. This, together with the risk of potential pandemics, has highlighted the importance of developing a universal vaccine able to elicit heterosubtypic immunity against multiple viral subtypes. In this thesis the immune response to IAV infection and vaccination was evaluated in the light of the risk of highly pathogenic AIV (HPAIV) A/H5N1 and A/H7N1, and the pandemic IAV A/H1N1. The work is divided into three parts and each one is further divided into chapters. Part I (chapters 1 and 2) contains the general introduction and the objectives of the thesis. The aim of this first part is to give a global overview and to introduce information to understand (i) the influenza infection, (ii) the immune responses elicited after IAV infection and (iii) a brief summary of current vaccines against influenza. Afterwards, the initial objectives to be achieved are exposed. Part II is the body of the thesis and it contains four studies (from chapter 3 to 6) developed during the four-year period comprising the PhD program. All the chapters are published or submitted to publish in international peer-reviewed journals. Thus, each study contains an abstract, a specific introduction, the materials and methods section, the obtained results and a discussion. To study the role of IAV determinants and to characterize the influenza infection in different hosts could be of great importance to direct the efforts to the formulation of more efficient vaccines. The non structural 1 (NS1) protein is known to be a major determinant of virulence in mammals but little is known about its role in avian species. In chapter 3, the involvement of NS1 in viral pathogenicity was evaluated in chickens. Birds were challenged with two reassortant AIV carrying the NS-segment of H5N1 HPAIV in the genetic background of an H7N1 HPAIV. The pathological manifestations, together with the immunological outcome were evaluated. The role of pre-existing immunity during an outbreak is also important and can determine whether the animals succumbed to infection or not. In chapter 4, chickens pre-exposed to H7N2 low pathogenic AIV (LPAIV) were challenged with H7N1 HPAIV and subsequently infected with H5N1 HPAIV. Pre-exposed animals were protected against the lethal H7N1-challenge whereas naïve animals succumbed. However, pre-existing immunity did not provide protection against HA-heterosubtypic virus (H5N1 HPAIV). The presence or absence of H7- and H5-inhibitory antibodies correlate with the protection (or lack of it) afforded. The control of current vaccination programs and their efficacy is useful to plan and design better vaccines. It is well known that wildfowl are the reservoirs of IAV; thus they are extremely important concerning the ecology of the virus. Sera from several avian species from Spanish zoos and wildlife centers were collected during two successive vaccination programs and were tested to evaluate the vaccine-elicited humoral response (chapter 5). The main objective of this work was to determine the efficacy of current vaccines (inactivated water-in-oil) in several avian species and to compare the differences inter- and intra-specie. Finally, and taking into account the potential risk that IAV represent to our society, the efforts were focused on developing a broadly protective influenza vaccine. The 2009 human H1N1 pandemic (pH1N1) is a clear example that pigs can act as a vehicle for mixing and generating new assortments of viruses. In chapter 6 pigs were immunized with HA-derived peptides and subsequently infected with pH1N1 virus. Although the HA-peptides induced broad humoral and cellular responses no neutralization activity was detected and only a partial effect on virus clearance was observed. Part III (chapters 7 and 8) is where the implications of all the findings from the studies are discussed and the major conclusions are listed. A list of all the references used to develop the thesis is listed after the three parts, in an independent section. An appendix section is also included to give further information.

El presente estudio se desarrolló bajo el marco del proyecto europeo PigQTech cuyoobjetivo es investigar si QTLs de importancia económica en la industria productoraporcina, previamente descritos en cruces de razas divergentes, se encuentransegregando en poblaciones comerciales. En el presente estudio se analizaron dospoblaciones porcinas de tipo comercial Pietrain y Large White, donde fue analizada lapresencia de QTLs, búsqueda y análisis de genes candidatos. La búsqueda de QTLs seefectuó mediante el análisis de la segregación alelica de microsatélites y su relación conlos caracteres productivos medidos. Se analizaron 10 regiones de los cromosomas 1, 2,3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 13, tres de las cuales fueron utilizadas como regiones control (1, 6, 9)por no haber QTLs descritos previamente en ellas. Los resultados muestran segregaciónde QTLs para los cromosomas 2, 3, 4, 7 y para las regiones control 1 y 9 en la poblaciónLarge White, mientras en la población Pietrain se detectaron QTL en los cromosomas 7y 8. En resumen, se observó que los QTLs descritos en cruces de razas divergentes estánpresentes en poblaciones comerciales, sin embargo no segregan por igual entre lasdistintas poblaciones.Adicionalmente se realizó un estudio de asociación de los genes candidatos H-FABP,receptor de leptina (LEPR) y la piruvato carboxilasa (PC). El gen H-FABP reveló laexistencia de asociación entre los distintos genotipos para los caracteres de grasa dorsal,longitud de canal y pH, sin embargo estas asociaciones no se presentan por igual en lasdistintas poblaciones. El análisis de asociación del gen receptor de leptina reveló laexistencia de asociación entre sus distintos genotipos con un menor pH a las 24 horaspostmortem, sin embargo esta asociación se presentó solo en la población Large White.La secuenciación del cDNA del gen de la piruvato carboxilasa reveló una alta similitudnucleotídica con la de otras especies de mamíferos, y que además es polimórfica. Asímismo el mapeo mediante el panel de células somáticas híbridas irradiadas reveló que elgen de la PC está localizado en el cromosoma 2 en el brazo p entre los microsatélites SW2623 (9.8 cM) y el SW256 (19 cM). / The present study was developped under the framework of the European PigQTechproject, whose objective was to investigate the segregation of economically importantQTLs previously described in divergent pig crosses in commercial populations. In thepresent study, we analysed the segregation of QTL and candidate genes in Pietrain andLarge White. The search of QTLs was made by the analysis of the microsatellite allelicsegregation and its influence on the recorded commercial traits. Ten regions onchromosomes 1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10 and 13 were analysed. As not QTL had beenpreviously described in the regions located in chromosomes 1, 6 and 9, we used thesesegments as control regions. In Large White, results showed segregation of QTLs inchromosomes 2, 3, 4 and 7 as well as in the Ssc1 and Ssc9 control regions. The analysisin Pietrain indicated the presence of QTL in chromosomes 7 and 8. In summary, weobserved that QTLs described in experimental pig crosses are also present incommercial breeds. However these QTLs do not show the same segregation patternamong different populations.Additionally, we carried out an association analysis of the heart fatty acid bindingprotein (H-FABP), leptin receptor (LEPR) and pyruvate carboxylase (PC) candidategenes. The association analysis between H-FABP and the recorded traits, revealed theinfluence of this gene on back fat thickness, carcass length and pH in some of ourpopulations. Influence of LEPR on the pH at 24 hours postmortem was detected inLarge White. The analysis of the nucleotidic sequence of the PC cDNA, revealed both ahigh similarity between other mammal species, and the existence of sequencepolymorphism in our populations. Furthermore, we allocated PC in the short arm ofchromosome 2 (2p), between the markers SW2623 (9.8 cM) and SW256 (19 cM) in anRH panel.

El objetivo de esta tesis es estudiar la relación entre los problemas de comportamiento del perro y el gato doméstico y su estado de salud. Consta de dos grandes partes. La primera estudia el papel de los problemas médicos sobre el comportamiento del animal. En la segunda se analiza la relación inversa. El comportamiento de cualquier animal depende directamente del funcionamiento de sus órganos y sistemas. Muchos problemas médicos pueden modificar su funcionamiento. Por lo tanto, los problemas médicos pueden alterar el comportamiento del animal. El dolor puede potenciar la aparición, por diferentes mecanismos, de miedo, agresividad, conductas compulsivas y afectar al sueño. Además, se observó que existen dos formas clínicas diferentes de expresar la agresividad por dolor en el perro. Los perros que no son agresivos e inician un proceso doloroso, suelen ser agresivos cuando van a ser manipulados. Además estos son impulsivos, es decir, no muestran señales previas antes de morder. En el caso de aquellos perros que ya son agresivos cuando se inicia el proceso doloroso, suelen empeorar la agresividad pre-­‐existente. Muchos de los problemas médicos se expresan únicamente con cambios de comportamiento, incluso, sin alterar las pruebas de laboratorio o de imagen. Este hecho es especialmente importante en algunos problemas neurológicos que cambian el comportamiento. Existen zonas del sistema nervioso central (SNC) que tienen un control sobre el comportamiento pero que, sin embargo, no se reflejan en el examen neurológico. Además, algunas lesiones del SNC pueden ser únicamente funcionales, por lo que no se detectan ni en el examen neurológico, ni en las pruebas de imagen usadas convencionalmente. Finalmente, también existen problemas neurológicos que dan alteraciones en el examen neurológico y problemas de comportamiento pero que, sin embargo, no modifican las pruebas complementarias. La tesis recoge uno de estos casos, un gato con una polioencefalomielopatía espongiforme congénita, que es una enfermedad muy rara en el gato y en el ser humano. Es el primer caso descrito en el que el motivo de consulta principal fueron los cambios de comportamiento (falta de aprendizaje de los hábitos de eliminación y de la conducta de juego). Por otro lado, se ha visto que los problemas de comportamiento más frecuentes del perro (miedo, ansiedad por separación y agresividad) pueden alterar el perfil bioquímico y hematológico. La mayoría de los cambios no parecen inducir enfermedad de forma directa. Sin embargo, se ha observado que los perros agresivos tienen un ratio neutrófilos/linfocitos más elevado. El ratio neutrófilos/linfocitos se ha relacionado con un mayor riesgo de afectación cardiovascular en humanos, así como con un peor pronóstico de varios problemas médicos. Finalmente, se ha visto que la fluoxetina, uno de los fármacos más utilizados en medicina del comportamiento, también puede alterar el perfil bioquímico y hematológico del perro. Sin embargo, estos cambios no parecen ser patológicos. Toda esta evidencia sugiere que los problemas de comportamiento y el estado de salud están íntimamente relacionados. Además, evidencia la necesidad de colaboración entre las diferentes especialidades veterinarias para mejorar en el conocimiento científico de todas ellas. / The aim of this thesis is to study the relationship between medical and behavioral problems in domestic dogs and cats. It has been divided into two main parts. The role of medical conditions on behavioral problems has been studied in the first part. The inverse relationship has been analyzed in the second part. Animal behavior depends directly on the functioning of organs and systems. Medical conditions can modify the proper functioning of organs and systems. Thus, these medical problems can change behavior. Through different mechanisms, pain can lead to fear, aggressive behaviors, compulsive disorders and sleep alterations. Additionally, it has been observed that there are two different patterns of expression of pain-­‐related aggression. Dogs that were aggressive before the onset of pain may be more aggressive (more frequent and more intense) in the same context of their previous aggression and tend to be less impulsive. Otherwise, dogs that were not aggressive before the onset of pain may be more impulsive and the aggression may happen in a context of manipulation. Behavioral changes could be the only clinical signs of many medical conditions, even without changing laboratory or imaging tests. This fact is especially important in some neurological problems that lead to behavioral changes. There are zones in the central nervous system (CNS) that have a role in the control of behavior; however, they cannot be checked by a neurological examination. Additionally, some neurological lesions of those areas may only be functional. These lesions cannot be detected in the neurological examination nor in the laboratory or imaging tests. Finally, neurological problems that lead to changes in the neurological examination and behavioral problems, but without having changes in the work-­‐up can exist. This thesis shows one of these cases, a congenital spongiform polioencephalomyolopathy in a cat. This is a very strange disease in cats and human beings, and it is the first case where the main complaint of the owners were the behavioral changes (learning impairment regarding elimination habits and play behavior). On the other hand, it has been observed that most common behavioral problems (fear, separation anxiety and aggressive behaviors) can lead to changes in the biochemical and hematological panel. Most of these changes do not directly lead to medical problems. Nevertheless, it has been demonstrated that aggressive dogs show a higher neutrophils/lymphocytes ratio. The neutrophils/lymphocytes ratio has been related to a higher risk of developing cardiovascular problems, and to a poor prognosis of several medical conditions. Finally, it has also been observed that fluoxetine, one of the most common drugs used in behavioral medicine, can modify the biochemical and hematological panel of dogs. However, these changes do not seem to be pathological. All of this evidence suggests that behavioral and health problems are intimately related. Additionally, they highlight the importance to collaborate among the different veterinary specialities in order to improve the scientific knowledge of all disciplines.

La leishmaniosis canina (LC) es una zoonosis endémica en el Mediterráneo, está causada por Leishmania infantum y se transmite por Phlebotomus. En áreas endémicas, la prevalencia de la infección es muy superior a la prevalencia de la enfermedad. La LC es una enfermedad sistémica y los perros se pueden presentar con gran variedad de signos clínicos. Los signos clínicos oculares aparecen en el 16% al 80% de los perros con leishmaniosis y queratoconjuntivitis seca (KCS) se diagnostica en 2 - 17% de ellos. Pocos estudios han investigado los mecanismos patogénicos que causan los signos clínicos oculares. El principal objetivo de este proyecto fue adquirir un mayor conocimiento de las alteraciones que ocurren en los ojos y anejos oculares de los perros con leishmaniosis. En el primer estudio se caracterizó el tipo de infiltrado inflamatorio presente en los ojos de perros con leishmaniosis, en qué estructuras oculares estaba localizado y se evaluó la presencia de amastigotes de Leishmania mediante inmunohistoquímica. El 30% de los globos oculares presentaban inflamación granulomatosa a piogranulomatoso con linfocitos y células plasmáticas. El parásito se detectó en el 26,6% de los ojos. El infiltrado granulomatoso y el parásito estaban asociados significativamente. Las estructuras afectadas fueron, por orden: conjuntiva y limbo, cuerpo ciliar, iris, córnea, esclera y ángulo iridocorneal, coroides y nervio óptico. El infiltrado inflamatorio y la detección del parásito estaban asociados significativamente con los signos clínicos oculares. Se evaluaron los músculos lisos y estriados intraoculares, extraoculares y de los anejos donde se observó infiltrado granulomatoso con parásitos de Leishmania. El infiltrado se detectó alrededor de las fibras musculares, en el endomisio. No se detectaron necrosis, degeneración o regeneración de las fibras musculares, aunque esporádicamente había atrofia de las fibras. Ocasionalmente, los parásitos estaban dentro de las fibras. La inflamación se detectó en al menos uno de los músculos examinados en 24,03% de los ojos y anejos evaluados. La implicación de estos músculos en la LC no se había descrito previamente, y puede contribuir a los signos clínicos descritos. Se procedió a la investigación de las glándulas encargadas de la síntesis del componente acuoso (glándula lacrimal principal (MLG) y glándula de la membrana nictitante (NMG)) y lipídico (glándulas de Meibomio (MG)) de la película lacrimal. Se encontró un infiltrado granulomatoso similar al descrito en los ojos, que rodeaba los conductos de dichas glándulas, y ocasionalmente rodeando los acinos. La MG y la NMG estaban más frecuentemente afectadas que la MLG. No hubo diferencias significativas en la detección de parásitos entre las distintas glándulas. Las muestras de ojos con signos clínicos compatibles con KCS mostraban el infiltrado granulomatoso y la presencia del parásito más frecuentemente que las muestras de ojos sin signos clínicos. Un posible mecanismo por el que los perros con leishmaniosis desarrollan KCS es la infiltración granulomatosa alrededor de los conductos de las glándulas lacrimales, lo que causaría retención de la secreción. Finalmente, se investigó la cantidad de parásitos en las MG, MLG y NMG mediante PCR cuantitativa. Parásitos de Leishmania se detectaron en todas las muestras analizadas en cantidades variables. En las tres glándulas, las muestras obtenidas de perros con signos clínicos tenían más parásitos que las muestras de perros sin signos clínicos. Se establecieron puntos de corte óptimos para las tres glándulas, de manera que las muestras con resultados por debajo del punto de corte tenían más probabilidad de pertenecer a perros con signos clínicos asociados a KCS que las muestras con resultados por encima del punto de corte. Establecer puntos de corte puede ayudar al clínico a determinar si los signos oculares se deben a leishmaniosis o a otras causas de KCS. / Canine leishmaniosis (CL) is an endemic zoonosis highly prevalent in the Mediterranean shore, where it is caused by Leishmania infantum and transmitted by Phlebotomus sand flies. In these areas, the prevalence of infection is much higher than the prevalence of disease. CL is a systemic disease and hence dogs can present with a wide variety of clinical signs. Ocular disease occurs in 16% to 80% of dogs with leishmaniosis and keratoconjunctivitis sicca (KCS) in 2% to 27% of dogs with leishmaniosis. Studies investigating the pathogenic mechanisms underlying ocular disease are sparse. The main objective of this project was to gain further knowledge about the events occurring in the eyes and adnexal structures from dogs affected by leishmaniosis. First, we characterized the inflammatory infiltrate present in the eyes, where this inflammation was located within the globe and evaluated the presence of Leishmania amastigotes by immunohistochemistry. Thirty percent of globes had some degree of granulomatous to pyogranulomatous infiltrate with variable lymphocytes and plasma cells. The parasite was detected in 26.6% of globes. There was a significant association between the granulomatous infiltrate and the parasite. Affected structures were, in order of involvement: conjunctiva and limbus, ciliary body, iris, cornea, sclera and iridocorneal angle, choroid and optic nerve sheath. Both the granulomatous infiltrate and the parasite were significantly associated with clinically diagnosed ocular disease. Intraocular, extraocular and adnexal smooth and striated muscles were evaluated, and granulomatous infiltrate with associated Leishmania parasites were noted. Inflammatory infiltrate was noted around muscle fibers, in the endomysium. Myofiber necrosis, degeneration or regeneration was not noted, although myofiber atrophy was rarely seen. Occasionally, parasites were noted within myofibers. Inflammation was noted in at least one of the muscles in 24.03% of the evaluated eyes and adnexa. Involvement of these muscles had not been previously reported in CL and may contribute to some of the reported clinical signs. Adnexal glands that synthesize the aqueous (main lacrimal gland (MLG) and nictitating membrane gland (NMG)) and lipid (Meibomian glands (MG)) components of the tear film were investigated next. A similar granulomatous infiltrate was noted surrounding the ducts and occasionally surrounding acini. MG and NMG were more commonly affected by theinfiltrate than MLG. No significant differences in detection of Leishmania parasites were noted between glands. Samples from eyes with clinical signs compatible with KCS were more commonly affected by the granulomatous infiltrate than those from eyes without clinical signs. A possible pathogenic mechanism of KCS in CL is that granulomatous infiltration around ducts of lacrimal glands, induced by the parasite, causes subsequent retention of secretion. Finally, the project focused on investigating the amount of parasites in MG, MLG and NMG by real-time PCR, in order to elucidate if the number of parasites was related to development of KCS associated to CL. Leishmania parasites were found in various amounts in all samples analyzed. For all three glands, samples from dogs with clinical signs contained significantly more parasites (lower ΔCt (Cycle threshold)) than samples from dogs without clinical signs. Optimal cut-off values of ΔCt were established for all three glands, so that samples with ΔCt below these cut-offs were more likely to be from dogs that displayed clinical signs related to KCS than samples with ΔCt above the cut-off. These findings indicate that cut-off values could aid the clinician in determining, in a dog infected with Leishmania spp., if compatible ocular clinical signs are due to leishmaniosis or to other causes of KCS.

Acid-base disturbances have been reported in the veterinary literature concerning the field of the small animal intensive care. Such disorders have diagnostic, therapeutic, and prognostic implications in terms of morbidity and mortality in such population. Besides albumin is a weak acid that can affect pH and plays a key role in the metabolic component of the acid-base balance often is not taken into account during the acid-base assessment. The main goal of the first study was to compare the traditional and the quantitative approaches for the assessment of acid-base imbalances in hypoalbuminemic dogs. This study was designed as a prospective observational clinical study and included the evaluation of 105 critically ill patients and 135 healthy patients as controls. Jugular venous-blood samples were collected from each patient on admission to determine: TP, Alb , BUN, Glu , hematocrit, , Na+ , Cl- , K +, Pi , pH , pCO2 , HCO3 - , AG, AGalb and /or AGalb-phos, SBE, SID, Atot , and SIG. Patients were divided into two groups according to the severity of hypoalbuminemia: mild hypoalbuminemia (Alb = 2.1 to 2.5 g /dL) and severe hypoalbuminemia (Alb ≤ 2.0 g/dL). According to the HH approach most frequent imbalances were simple disorders (51.4 %) mainly metabolic acidosis (84.7%), in most cases associated to a high AG acidosis. However, when using the quantitative method 58.1% were complex disorders, and SIG acidosis (74.3 %) and Atot alkalosis (33.3 %) were the most frequent acid -base imbalances. The second study allowed us to conclude that the agreement between the traditional and quantitative methods of interpretation of acid-base balance was poor, and many imbalances were detected using the quantitative approach but would remain undetected using the traditional approach to acid-base status. Moreover, these alterations were different according to the severity of hypoalbuminemia and characteristics of the disease in each hypoalbuminemic patient, especially in SIRS/septic patients. In humans, SIRS is relatively frequent condition and is associated with high mortality rates. However, data on the incidence of SIRS and the usefulness of biomarkers in veterinary medicine is scarce. The main goal of the second study was to determine the diagnostic and prognostic value of plasma iron vs the inflammatory markers albumin, CRP and fibrinogen on admission and over the ICU stay of dogs with SIRS. This study was designed as prospective observational study and included 116 client-owned dogs: 54 dogs with SIRS/sepsis, 42 with local inflammation and 20 clinically healthy dogs as a control group. Blood samples were taken on admission in all study groups, and then on alternate days until discharge or death in both inflammation groups. On admission, dogs with SIRS had significantly lower plasma iron (65 ± 5.8 µg/dL, p=0.001) concentrations than dogs with local inflammation (89.5 ± 6.2 µg/dL, p=0.001). Plasma iron, albumin, and CRP were able to separate dogs in the SIRS/sepsis group from those presenting local inflammation with AUCs for the ROCs curves of 0.679, 0.834, and 0.704 respectively. The admission values for these variables did not separate survivors and non survivors within the SIRS/sepsis group. However, the increase in iron and the decrease in CRP, from admission to discharge, was higher in survivors than in non-survivors within the SIRS/septic group (22.8 vs. 2.51 μg/dL respectively, p = 0.021 for iron; -67.1 vs. -4.1 mg/L respectively, p = 0.002 for CRP), resulting in discharge iron and CRP concentrations for survivors similar to those in the local inflammation group. The second study allowed us to conclude that hypoferremia is a sensitive marker of systemic inflammation in dogs. In this study, the increase in iron concentrations during the hospitalization period of SIRS/septic dogs was associated to a better prognosis, suggesting that plasma iron in combination with other biomarkers of inflammation such as CRP and albumin might be used to monitor the inflammatory process.