En el verano de 2007 un elevado número de delfines listados (Stenella coeruleoalba) apareció varado en la costa Mediterránea en España. Los estudios histopatológicos, inmunohistoquímicos y de RT-PCR realizados a partir de muestras de estos delfines confirmaron la reaparición de una epidemia de morbillivirus, que se extendió posteriormente por el Mediterráneo Francés. En dichas muestras se detectó un Morbillivirus del delfín (DMV, considerado una cepa de la especie Morbillivirus de cetáceos CeMV) muy próximo al virus detectado en la epidemia anterior, ocurrida en 1990. Esta tesis reune tres artículos publicados en revistas científicas y un capítulo de un libro, en los que se describen los hallazgos patológicos en delfines listados varados durante la epidemia en 2007 en Cataluña, y los hallazgos patológicos y de RT-PCR en los delfines listados varados en Cataluña, Comunidad Valenciana y Andalucía en los años posteriores. Los delfines afectados por la epidemia de 2007 mostraron lesiones similares a las descritas en la epidemia de 1990, siendo neumonía bronquiolo-intersticial, depleción linfoide y meningoencefalitis no supurativa los hallazgos microscópicos principales. También en 2007 algunos delfines presentaban lesiones asociadas a agentes infecciosos oportunistas entre los que se encontraba, además de Toxoplasma gondii y hongos compatibles con Aspergillus spp., alfaherpesvirus. Este virus ha sido detectado en varios delfines afectados durante la epidemia, causando en un caso enfermedad concomitante a la infección por morbillivirus. Los delfines listados muertos durante la epidemia de 2007 mostraron menor longitud que los muertos en la epidemia de 1990, lo que podría sugerir que los delfines de mayor edad que estuvieron en contacto con el virus en 1990 estarían protegidos frente a una reinfección. Los estudios inmunohistoquímicos realizados con tejidos de cetáceos varados en Cataluña en los años transcurridos entre ambas epidemias respaldarían la hipótesis de ausencia de circulación del CeMV en el Mediterráneo en el periodo interepidémico. En los años posteriores a 2007 numerosos delfines listados han sido hallados esporádicamente en la costa Mediterránea española afectados por la forma crónica de la infección de morbillivirus. Esta presentación crónica de la enfermedad, descrita tras la epidemia de 1990, se caracteriza por la deteccción de lesiones y virus únicamente en el encéfalo de los delfines, a diferencia de la presencia de lesiones y virus en múltiples órganos que muestran los delfines afectados durante las epidemias. La forma crónica de morbillivirus en delfines muestra similitudes con otras infecciones crónicas debidas a morbillivirus, como la panencefalitis esclerosante subaguda causada por el virus del sarampión en humanos, y la encefalitis del perro viejo causada por el virus del moquillo canino. Sin embargo, dado que actualmente son más las incógnitas que las respuestas, se requeriría continuar investigando sobre el morbillivirus del delfín para poder aclarar aspectos como la patogenia y los mecanismos de persistencia del virus en los delfines afectados por la forma crónica. / In the summer 2007 high number of striped dolphins (Stenella coeruleoalba) stranded on the Spanish Mediterranean coast. Histopathological, immunohistochemical and RT-PCR analysis performed with dolphin material from these strandings confirmed the re-emergence of a morbillivirus epizootic, which afterwards spread to French Mediterranean waters. The Dolphin morbillivirus (DMV, a Cetacean Morbillivirus (CeMV) viral strain) detected showed close relationship to the DMV strain isolated in the previous epizootic, occurred in 1990. This thesis aimed to compile three articles published in peer-reviewed journals and one book chapter describing the pathological findings observed in the striped dolphins affected by the 2007 epizootic in Catalonia, and the pathological and RT-PCR findings observed in Catalonia, Valencia Region and Andalusia in the following years. The lesions observed in the dolphins affected by the 2007 epizootic were similar to those described in the 1990 epizootic, with bronchiolo-interstitial pneumonia, lymphoid depletion and non-suppurative meningoencephalitis as main microscopic findings. In addition several dolphins affected in 2007 also showed, as occurred in 1990, secondary opportunistic infections. But beside to Toxoplasma gondii and Aspergillus spp. like fungus, alphaherpesvirus systemic concomitant infection and disease were also observed in the 2007 outbreak. Striped dolphins affected in 2007 were shorter in length than those affected in 1990, suggesting that older dolphins may have been protected from the infection due to a previous exposure to the virus in the first epizootic. The immunohistochemical studies performed with cetacean tissues from strandings occurred on the Catalonian coast between the 1990 and the 2007 morbillivirus epizootics would support the hypothesis that CeMV has not circulated in the Mediterranean Sea in the interepidemic period. In the years following the 2007 epizootic numerous striped dolphins have been randomly found along the Spanish Mediterranean coast showing the chronic form of morbillivirus infection already described after the 1990 epizootic. The chronic form is characterized by the detection of lesions and virus only in the brain of the affected dolphins, instead of the classic systemic distribution of lesions and virus observed during the epizootics. This presentation of the disease in dolphins shows similarities with other chronic diseases caused by morbilliviruses, as subacute sclerosing panencephalitis due to Measles virus in humans, and old dog encephalitis due to Canine distemper virus in dogs. However, further investigations would be required in order to clarify the pathogenesis and the viral persistence mechanisms in the dolphin morbillivirus chronic form.

Los receptores Toll-like (TLRs), en particular los que se encuentran en vesículas intracelulares de origen endosomal (TLR3, TLR7 y TLR9), están involucrados en la respuesta innata antivírica. La unión a sus respectivos ligandos conduce a la activación de cascadas intracelulares que resultan en una producción de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α) y antivirales (interferones de tipo I). Existe muy poca información sobre la distribución celular y tisular de estos receptores en la especie porcina así como su regulación en condiciones normales o de infección. En el primer estudio de la presente tesis se valoró la distribución tisular de los TLRs endosomales en pulmón y tejidos linfoides primarios y secundarios de cerdos sanos de distintas edades. El marcaje del TLR9 se realizó con un anticuerpo comercial con reactividad específica para el porcino. En cambio, en el caso de TLR3 y TLR7 los anticuerpos se dirigían a las moléculas humanas pero, supuestamente, poseían reactividad cruzada con las moléculas de origen porcino. Los resultados obtenidos permitieron valorar la distribución del TLR9 en los distintos tejidos examinados, pero no la de los TLR3 y TLR7 ya que el uso de los anticuerpos dirigidos frente a estos dos últimos receptores no produjo resultados satisfactorios. Así, el marcaje obtenido con el anticuerpo anti-TLR3 fue muy variable en función del tejido utilizado; es decir, en algunos órganos como el pulmón, tonsila o linfonodos parecía ser específico, pero en otros como en el hígado, producía un intenso color de fondo inespecífico. Por el contrario, sí hubo un marcaje específico para el TLR9 que reveló una expresión constitutiva de dicho receptor en células de la periferia de los folículos linfoides de los linfonodos, la tonsila y las placas de Peyer, (células de tipo epitelial, dendríticas, macrófagos o linfocitos) un hecho que sugería que este receptor probablemente puede jugar un papel importante en la activación el sistema inmunitario de los cerdos a partir de las 3 semanas de vida. El segundo estudio de esta tesis consistió en determinar la variación de la expresión de TLR3, TLR7 y TLR9 a lo largo del tiempo en una población de células presentadoras de antígeno. La población de estudio elegida fue la de macrófagos alveolares porcinos (PAMs). Los resultados de la cinética de expresión mediante citometría de flujo nos mostró que estas células presentaban una expresión basal elevada de TLR3 y TLR9 pero no de TLR7. Una de las explicaciones posibles para este marcaje basal señalaría a la necesaria manipulación de estas células antes de ser congeladas como responsable de esta expresión. Por otra parte, es difícil conocer con exactitud el ambiente en el cual se encontraban los PAMs en el pulmón antes de ser recogidos (concentración de interleuquinas, quimioquinas, otras moléculas, etc). Dado que los animales donantes estaban sanos, no presentaban ningún tipo de lesión pulmonar y eran libres de los patógenos víricos comunes del cerdo (circovirus porcino de tipo 2, influenza A y virus del PRRS entre otros) la causa de esta elevada expresión no está clara. En cuanto a la expresión de TLR7, apenas se pudo detectar una expresión basal en los PAMs utilizados. Para el tercer estudio de esta tesis se buscó un modelo de infección con un virus RNA que pudiera influir en la regulación de estos TLRs y además pudiera añadir nuevos conocimientos respecto a la inmunopatogenia de dicha infección. En el campo de las enfermedades infecciosas del porcino, una de las mayores incógnitas inmunológicas del momento la encontramos en la infección con el virus del PRRS. Los resultados de este estudio demostraron que dos cepas del mismo genotipo del virus del PRRS causaban una regulación diferente del TLR3 y del patrón de citoquinas pro-inflamatorias. En concreto, en los estudios de citometría de flujo, la cepa 3262 al inducir la expresión de TLR3 en PAMs, sobre todo a dosis elevadas (m.o.i=1), activaría la producción de TNF-α+; en cambio, la cepa 3267 o la cepa vacunal DV activaron TLR3 con menor intensidad y no inducirían TNF-α; sugiriendo en definitiva, que la regulación del patrón de citoquinas antivirales o pro-inflamatorias en los macrófagos dependería del tipo de cepa utilizada. Resulta interesante señalar que a pesar de las diferencias observadas en la citometría de flujo respecto el porcentaje de células que expresaban TLR3 y en la intensidad de su expresión según el tipo de virus utilizado, la expresión relativa del mRNA no parecía modificarse. Estas diferencias resultan interesantes y apuntan a que distintas cepas de campo de genotipo europeo podrían ejercer un efecto regulador de diferente intensidad sobre moléculas inhibitorias de la cascada de señalización de los TLRs. Además esta regulación parece depender de diferentes factores tales como: la cepa vírica, el tiempo de infección y la dosis infectiva inicial. Nuestros resultados pueden ser útiles para abrir y conducir una nueva línea de investigaciones orientadas hacia el área de la inmunidad innata frente al virus del PRRS. / Toll-like receptors (TLRs), particularly those found within intracellular vesicles of endosomal origin (TLR3, TLR7 and TLR9), are involved in the innate antiviral responses. Binding of those receptors to their respective ligands leads to the activation of intracellular cascades resulting in the release of pro-inflammatory cytokines (TNF-α) and antiviral (type I) interferons. The knowledge on the distribution of those receptors in porcine organs, tissues and cells and its regulation in physiological states or in infection is scarce. In the first study of the present thesis the distribution of endosomal TLRs in lung and primary and secondary lymphoid tissues of healthy pigs of different ages was assessed. Labeling of TLR9 was performed using a commercial antibody with specific reactivity for the porcine TLR9. For TLR3 and TLR7 the antibodies used in the study were directed to human molecules but they were supposed to cross-react with the porcine counterpart molecules. The results allowed the assessment of the distribution of TLR9 in the different tissues examined, but not that of TLR3 and TLR7 since the use of antibodies directed against the latter two receptors did not yield satisfactory results. Thus, labeling obtained with the anti-TLR3 antibody was highly variable depending on the tissue examined, that is, in some organs such as lungs, tonsils or lymph nodes labeling was apparently specific but in others, as in the liver, the se of that antibody resulted in an intense non-specific background. By contrast, TLR9 labeling was specific and revealed a constitutive expression of this receptor in cells of the periphery of lymphoid follicles of lymph nodes, tonsils and Peyer's patches (epithelial cells, dendritic cells, macrophages or lymphocytes) a fact suggesting that this receptor can probably play an important role in activating the immune system of pigs of 3 week-old piglets. The second study of this thesis was aimed to determine the variation of the expression of TLR3, TLR7 and TLR9 over time in a population of antigen-presenting cells. Porcine alveolar macrophages (PAMs) were used for this purpose. The results of the kinetics of expression as assessed by flow cytometry showed that PAMs had a high basal expression of TLR3 and TLR9 but not of TLR7. A possible explanation for this basal labeling could point to the unavoidable manipulation of PAMs needed for their collection. Moreover, it is difficult to know precisely the environmental conditions in which PAMs were in the lungs before being collected (concentration of interleukins, chemokines, presence of other molecules, etc.). Since PAM donors were healthy, showed no lung lesions and were demonstrated to be free of common viral pathogens of pigs (porcine circovirus type 2, influenza A and PRRS virus among others) the cause of this elevated expression remains unclear. As for TLR7, basal expression in the PAMs used was low or nil. The third study of the present thesis aimed to a model of infection with an RNA virus that might influence the regulation of these TLRs and also could add new knowledge regarding the pathogenesis of the infection. In the field of infectious diseases of swine, one of most interesting models of RNA virus infections is PRRS virus for which immunopathogenesis is largely understood. The results of this study showed that two strains of the same genotype of PRRS virus resulted in a different regulation of TLR3 and in a different pattern of pro-inflammatory cytokines. Specifically, in flow cytometry experiments, strain 3262, induced the expression of TLR3 in PAMs, particularly at high multiplicities of infection (m.o.i = 1) and triggered the production of TNF-α+ whereas strain 3267 or the vaccine strain DV resulted in lower TLR3 expression and did not induce TNF-α, suggesting ultimately that the regulation of the antiviral or pro-inflammatory cytokine patterns in macrophages depends on the strain used. Interestingly, despite the differences observed in flow cytometry for TLR3, the relative mRNA expression did not apparently change under different circumstances. This was an interesting observation that suggests that different field strains of genotype I PRRSV might exert a regulatory effect of different intensity on inhibitory molecules of the signaling cascade of TLRs. Furthermore, this regulation seems to depend on various factors such as the viral strain, the time of infection and the multiplicity of infection. Our results may be useful as a basis for further studies in the area of innate immunity against PRRS virus.

L'Organització Mundial de la Salut va declarar la tuberculosi (TB) com "una emergència global" ara fa vint anys. En l’actualitat la TB continua sent la principal causa de mortalitat i morbiditat per malaltia infecciosa a nivell mundial. La TB és causada pels bacteris del complex Mycobacterium tuberculosis, dels quals M. bovis i M. caprae en són els patògens zoonòtics més importants, presentant una àmplia varietat d'hostes animals, tant domèstics com silvestres. Per tant, la TB té repercussions en la salut pública i la sanitat animal, així com en l'economia dels sectors públic i ramader. Les cabres poden ser particularment susceptibles a la infecció per TB i el recent augment de casos reportats indiquen que la TB caprina podria ser una malaltia emergent. Així doncs, es necessiten noves eines específiques per al control de la TB en el cabrum. Les estratègies de control de la TB depenen en gran mesura de la disponibilitat d'una vacuna segura i eficaç. El Bacil Calmette Guerin (BCG), l'única vacuna disponible en l'actualitat, té una eficàcia variable tant en els éssers humans com en animals, i els esforços actuals de la recerca es centren en desenvolupar noves vacunes que reemplacin la BCG, o que n’incrementin l’eficàcia. També són necessaris nous reactius de diagnòstic associats a les vacunes que siguin capaços de distingir els individus vacunats dels infectats. Aquesta tesi pretén abordar aquests reptes mitjançant un nou model animal experimental. La tesi es divideix en cinc seccions: introducció general, objectius, estudis, discussió general i conclusions: La introducció descriu una visió global sobre l'epidemiologia, les característiques de l’agent etiològic, la patogènia, la immunitat i el desenvolupament de noves vacunes i estratègies de vacunació, per contextualitzar els objectius que s’enumeren a continuació. Els quatre estudis contenen cada un dels experiment duts a terme durant el decurs del programa de doctorat. El primer estudi descriu el model experimental de TB en la cabra domèstica, incloent la caracterització dels paràmetres immunològics i post-mortem que seran utilitzats en els estudis posteriors. La tomografia computeritzada va ser validada en aquest estudi per al seu ús com a mètode quantitatiu de valoració de lesions tuberculoses. El segon i tercer estudi estan enfocats en l’avaluació de l'eficàcia de la vacuna BCG i de dues noves vacunes adenovirals recombinants de reforç de la pròpia BCG, basades en antígens que són reconeguts pel sistema immune durant la infecció tuberculosa. La BCG va protegir les cabres front a la disseminació extra-pulmonar de la infecció, mentre que quan es reforçava amb les vacunes adenovirals es millorava la protecció en termes de reducció de les lesions tuberculoses i de la càrrega bacteriana. Finalment, el quart estudi va mostrar que les campanyes de vacunació contra la paratuberculosi (PTB) en cabres poden causar interferències en el diagnòstic de la TB quan s'utilitzen les eines de diagnòstic actualment disponibles. La protecció creuada de la vacuna de PTB Silirum® també es va avaluar en aquest estudi. En els quatre experiments es van avaluar nous reactius de diagnòstic dissenyats seguint el principi DIVA (diferenciació d’animals infectats i vacunats) i marcadors immunològics específics associats amb la protecció o la progressió de la infecció. Els resultats globals i la seva aplicació en els programes de control i eradicació de la TB en animals domèstics, així com en assaigs clínics de vacunes antituberculoses, es discuteixen en la secció de discussió general. Finalment s’enumeren les principals conclusions de la tesi. / The World Health Organization (WHO) declared tuberculosis (TB) “a global public emergency” twenty years ago. Nowadays, TB is still the leading cause of infectious disease mortality and morbidity worldwide. TB is caused by Mycobacterium tuberculosis complex (MTBC) bacteria. M. bovis and M. caprae are the most important zoonotic pathogens among the MTBC, and have a wide range of animal hosts, including both livestock and wildlife. Therefore, TB has repercussions on public and animal health and on the economy of both public and livestock sectors. Goats seem to be particularly susceptible to TB. The recent increase of caprine TB reported cases points to its consideration as an emerging disease. Thus, specific measures to control TB in goat herds need to be implemented. The TB control strategies depend strongly on the availability of a safe and effective vaccine. The Bacillus Calmette Guerin (BCG), the unique currently available vaccine, has variable efficacy both in humans and animals. Current research efforts are focused on the development of new vaccine candidates to replace BCG, or improve its protective effect. In addition, novel vaccine-associated diagnostic reagents are also needed to distinguish vaccinated from infected individuals. The present thesis addresses these concerns using a new experimental animal model. The thesis is divided in five sections: General introduction, objectives, studies, general discussion and conclusions: The introduction describes a global overview of the epidemiology, etiological agent characteristics, pathogenesis, immunity and development of new vaccines and vaccination strategies against TB, to contextualize the thesis objectives. Each of the four studies contains one of the experiments conducted during the PhD program. The first study addresses a comprehensive description of the experimental model of TB in goats, including the characterization of immunological and post-mortem parameters used in subsequent studies. Computed Tomography was validated for use as quantitative method to evaluate gross TB lesions. The second and third studies are focused on assessing the efficacy of BCG and two BCG-booster recombinant adenoviral vaccines. The latter are based on antigens recognized by the immune system during the TB infection. BCG protected goats against extra-pulmonary dissemination. However, boosting BCG with the adenoviral vaccines showed improved protection by reducing TB gross lesions and bacterial load. Finally, the fourth study showed that vaccination campaigns against paratuberculosis (PTB) in goats may cause interferences on the diagnosis of TB when using the currently available diagnostic tools. Cross-protective effect of the PTB vaccine Silirum® was also evaluated in this study. In addition, throughout the four experiments, new vaccine-associated diagnostic reagents, designed following the DIVA (differentiation of infected and vaccinated animals) principle were assessed, as well as specific immunological markers associated with protection or the progression of the infection. The global results and their application in the TB control and eradication programs in domestic animals, as well as in TB vaccines clinical trials are discussed in the general discussion section and the main conclusions are subsequently listed.

El objetivo principal de la presente tesis doctoral fue optimizar la crioconservación de semen caprino de la raza Blanca de Rasquera. Para ello, se diseñaron 4 estudios. En el primer estudio se evaluó la sustitución de la yema de huevo fresco por yema de huevo en polvo (YHP), para reducir el riesgo de contaminación microbiológica del diluyente, así como el efecto de la yema de huevo fresco clarificado obtenida por centrifugación ultrarrápida. Simultáneamente, se evaluó la presencia de plasma seminal en la congelabilidad espermática de donantes de uno y dos años de edad. En el segundo, se estudió la sustitución de los crioprotectores penetrante (glicerol vs trehalosa) y no penetrante (YHP vs lecitina de soja (LS)), así como la inclusión del antioxidante BHT y el tampón zwitteriónico Test, en lugar del Tris, en los diluyentes. En el tercer trabajo, se analizó la lecitina de soja como alternativa viable en la conservación de espermatozoides caprinos en presencia de plasma seminal, así como la concentración óptima del antioxidante BHT en los diluyentes a base de YHP o LS. Por último, en el cuarto estudio se valoró la calidad espermática a lo largo de todo el año, la adición de antioxidantes (BHT o melatonina) en los diluyentes y la aplicación de implantes de melatonina en los sementales en primavera, además de valorar el efecto de la edad y del individuo en la congelabilidad de los espermatozoides caprinos. Tras un complejo análisis de la calidad de los espermatozoides durante su conservación, podemos concluir que la yema de huevo en polvo puede sustituir a la yema de huevo fresco en la congelación de semen caprino, ya que, independientemente de la edad del donante, no se observó superioridad alguna en ningún tipo de yema de huevo analizadas, aunque permaneciendo la necesidad de eliminar el plasma seminal cuando está presente al 15%. Tampoco la yema de huevo clarificada supuso ninguna mejora, pero sí desventajas a la hora de elaborar los diluyentes. Respecto al uso de la lecitina de soja como crioprotector, ésta podría ser una alternativa viable a incorporar en los medios de refrigeración sin la necesidad de eliminar el plasma seminal. No obstante, tras la crioconservación de espermatozoides lavados y no lavados, en diluyentes a base de LS, la viabilidad espermática fue inferior, observándose una población espermática con membranas intactas pero sin función mitocondrial mayor respecto a los espermatozoides conservados con YHP. En cuanto a la sustitución del crioprotector penetrante y del sistema tampón, el glicerol y el tampón Tris continúan siendo las mejores alternativas en la conservación espermática caprina. La inclusión de BHT como antioxidante en los diluyentes apenas mostró efecto alguno, así como tampoco se observaron diferencias significativas al utilizar diferentes concentraciones de BHT (0.6, 2.0 y 5.0 mM) tras la conservación, tanto en los medios a base de YHP como de LS, aunque en éstos últimos, de nuevo, se observó un notable incremento de espermatozoides con membrana plasmática y acrosomal intactas pero sin función mitocondrial. Finalmente, tras recopilar los resultados obtenidos a lo largo de dos años de experimental, observamos que la viabilidad de los espermatozoides frescos fue superior a los 18 y 30 meses de edad en fotoperiodo positivo (final de la primavera) respecto a los 14 y 25 meses de edad en fotoperiodo negativo (final del otoño). El uso de implantes de melatonina en primavera afectó negativamente la viabilidad y resistencia al shock hipoosmótico del semen fresco y refrigerado, así como la motilidad total en los refrigerados. Por último, existen diferencias entre individuos tanto en el semen fresco como refrigerado y descongelado, identificando tres tipos de individuos: buenos, moderados y malos congeladores. / The main objective of present doctoral thesis was to optimize the semen cryopreservation of goat from Blanca de Rasquera breed. For this, four studies were designed. In the first study we assessed the replacement of fresh egg yolk by powdered egg yolk (PEY), to reduce the risk of microbiological contamination of extender, and the effect of the clarified fresh egg yolk obtained by centrifugation. Simultaneously, we also assessed the effect of the presence of seminal plasma on sperm freezability from males of one and two years old. In the second study, the aim was to substitute the penetrating cryoprotectants (glycerol vs trehalosa) and non-penetrating (PEY vs soybean lecithin (SL)), and the inclusion of the antioxidant BHT and Test zwitterionic-buffer, instead of Tris, in the extenders. The aims of third study were to determine whether SL-based media is a viable alternative in the preservation of goat sperm in the presence of seminal plasma and to determine the optimal concentration of the antioxidant BHT in PEY or SL-based media. Finally, the fourth study was conducted to assess sperm quality throughout the year, the addition of antioxidants (BHT or melatonin) in the extenders, and the application of melatonin implants in males in spring. In addition, we assessed the effect of donor age and the individual in the freezability of goat sperm. After a complex analysis of sperm quality during preservation, we can conclude that the PEY can be used in place of fresh egg yolk in the extenders for cryopreservation goat semen, since, regardless of donor age, there was not superiority in any of the egg yolk types, remaining the need to remove seminal plasma when the medium containing 15% egg yolk. The use of clarified egg yolk did not confer any benefit to the fresh egg yolk, complicated the process of drawing up preservation media. Regarding the use of SL as a cryoprotectant, this could be a viable alternative to incorporate in preservation at 5°C media, without the need to remove seminal plasma. However, after cryopreservation of washed and unwashed sperm, in LS-based media, sperm viability was low and the population of sperm with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function was high compared with sperm preserved PEY. Related to the replacement of penetrating cryoprotectant and the buffer, Tris-buffer system and glycerol were still the best alternative in preserving goat sperm. The inclusion of BHT as an antioxidant in extenders showed hardly any effect, nor when using different concentrations of BHT (0.6, 2.0 and 5.0 mM) after preservation, in PEY or SL-based media, although in the latter, again were observed a significant increase of spermatozoa with intact plasma and acrosomal membranes, but without mitochondrial function. Finally, after compiling the results throughout two years of experimental period, we observed that the viability and resistance to hypoosmotic shock of fresh spermatozoa was higher at 18 and 30 months old males during positive photoperiod (late spring) compared to the 14 and 25 months old males during negative photoperiod (late autumn). The use of melatonin implants in spring negatively affected the viability and hypoosmotic shock resistance of fresh and cooled semen, and the total motility in cooled semen. Finally, individual effect exists on buck sperm cryopreservation, identifying 3 types of males: good, average and bad freezers.

En el primer estudi d’aquesta tesi, es vàren estudiar diferents brots que presentàven patología respiratòria per tal de detectar-ne la presència de virus de la influença porcina. En catorze casos es vàren detectar virus de la grip circulants. Aquests van ser aïllats, seqüenciats a nivell de genoma complet i comparats amb altres virus de la influença coneguts. Els virus aïllats pertanyien als subtipus H1N1 (n=6, incloent un virus pandèmic H1N1 humà), H3N2 (n=4), i H1N2 (n=4). En 11/14 casos es van detectar possibles reorganitzacións genètiques mitjançant l’anàlisi filogenètica. En una segona part es va analitzar l’evolució genètica d’aïllats H1N1 obtinguts en un estudi longitudinal d’un lot de porcs durant 6 mesos. La seqüenciació de 22 aïllats obtinguts en aquesta explotació van indicar la co-circulació de dues variants del mateix virus, així com l’emergència de noves soques recombinants en diferents moments. Aquests resultats indiquen que les reorganitzacions genètiques són comuns i corroboren la importància de conèixer la epidemiologia dels virus de la influenza porcina, particularment en explotacions endèmiques. En el segon estudi d’aquesta tesi, els aïllats seqüenciats prèviament es varen analitzar mitjançant la inhibició de l’hemaglutinació. Aquesta anàlisi es va fer amb l’ús de sèrums mono-específics obtinguts de porcs immunitzats i amb 100 sèrums obtinguts d’explotacions porcines comercials seropositives a grip i no vacunades. Els resultats obtinguts van permetre detectar una gran diversitat antigènica dels virus H1N1. En canvi, els virus H1N2 i H3N2 circulants semblen ser més homòlegs per subtipus al analitzar la seva reactivitat creuada. Quan es van comparar les seqüències d’amino àcids del gen de la hemaglutinina es va observar que els virus H1N1 també presentaven una major quantitat de canvis de residus que els altres dos subtipus. Les causes d’aquestes característiques antigèniques diferents de cada subtipus no es coneixen i probablement són reflex una epidemiologia diferent. / En el primer estudio de esta tesis, se estudiaron diferentes brotes de enfermedad respiratoria en cerdos para detectar la presencia del virus de la influenza porcina. En catorce casos se obtuvo el aislamiento de virus influenza A. Los aislados víricos se secuenciaron en todos sus genes y las secuencias se compararon con otros virus de la influenza porcina. Los virus aislados pertenecían a los subtipos H1N1 (n=6, incluyendo un virus pandémico H1N1 humano), H3N2 (n=4), y H1N2 (n=4). En 11/14 casos se detectaron posibles reorganizaciones genéticas en los genes examinados. En una segunda parte se analizó la evolución genética de aislados H1N1 obtenidos en un estudio longitudinal de un lote de cerdos durante 6 meses. La secuenciación de 22 aislados obtenidos en esa explotación indicaron la co-circulación de dos variantes del mismo virus, así como la emergencia de virus recombinantes en diferentes momentos. Estos resultados indican que las reorganizaciones genéticas son comunes y corroboran la importancia las situaciones endémicas. En el segundo estudio de esta tesis, los aislados secuenciados previamente se analizaron mediante la inhibición de la hemaglutinación (IHA). Este análisis se hizo con el uso de sueros mono-específicos obtenidos de cerdos inmunizados con los aislados obtenidos anteriormente y con 100 sueros obtenidos de explotaciones porcinas comerciales no vacunadas. Los resultados obtenidos permitieron detectar una gran diversidad antigènica entre los virus H1N1. En cambio, los virus H1N2 y H3N2 circulantes parecen ser más homólogos al analizar su reactividad cruzada. Cuando se compararon las secuencias de aminoácidos del gen de la hemaglutinina se observó que los virus H1N1 también presentaban una mayor cantidad de cambios en los residuos aminoacídicos que los otros dos subtipos. Las causas de estas diferentes características antigénicas de cada subtipo no se conocen y probablemente son reflejo de particularidades epidemiológicas. / In the first study of the present thesis, outbreaks of respiratory disease were investigated for the presence of swine influenza virus (SIV). In 14 cases the circulating influenzaviruses were isolated, fully sequenced and compared with other known SIV. H1N1 (including human pandemic H1N1) was the most common subtype involved in the outbreaks (n=6), followed by H3N2 (n=4) and H1N2 subtypes (n=4). In 11/14 cases the phylogenetic analyses indicated the occurrence of possible reassortment events. In the second part of the study, the genetic evolution of a H1N1 isolate was assessed over a six-month period in a longitudinal study in closed group of pigs. Sequencing of 22 isolates retrieved during that follow-up indicated the co-circulation of two different variants of the same virus. Also, the emergence of SIV reassortants at certain timepoints was evidenced. These results indicate that reassortment events in SIV are common, and point towards the need for a better understanding of the epidemiology of SIV, particularly in endemic farms. In the second study of the present thesis, SIV isolates sequenced in the first study where analyzed by means of the haemagglutination inhibition assay (HI) using monospecific sera obtained from pigs immunized with the different isolates. Also, 100 serum samples obtained from seropositive and unvaccinated commercial farms were analyzed. Based on those analysis, a high antigenic diversity was found when comparing the H1N1 viruses. In contrast, HN2 and H3N2 viruses circulating in Spanish swine seemed to have less antigenic diversity regarding their cross-reactivity in the HI. Comparing the amino acid sequences of the haemagglutinin of the analyzed isolates, H1N1 viruses had more changes than the other subtypes. The causes behind this different behavior depending on the subtype are unknown and probably reflect a different epidemiology.

La regeneración de hueso derivada de la pérdida de masa ósea se ha convertido en uno de los grandes desafíos de la medicina actual, siendo el autoinjerto de hueso esponjoso fresco el tratamiento modelo, debido principalmente a sus excelentes propiedades biológicas, que aseguran un aporte de células con potencial osteogénico, factores de crecimiento y componentes de la matriz extracelular que fomentarían la neoformación ósea. Sin embargo las desventajas de este tipo de injertos han determinado que la búsqueda de un material sintético que aporte o complemente estas propiedades y que, por lo tanto, sustente la regeneración ósea, sea actualmente una importante línea de investigación en la medicina regenerativa. Dentro de estos materiales, destaca el cemento de hidroxiapatita debido a su excelente biocompatibilidad, dada por una composición física y química similar a la fase mineral del hueso, lo que determina que al ser utilizada como injerto óseo genere una vía biomimética de neoformación ósea. Teniendo en cuenta, que en la naturaleza, la formación de los primeros indicios de mineralización ósea son construidos sobre un nanoesqueleto de colágeno, es que hemos definido como objetivo de nuestro estudio demostrar la mayor capacidad osteoconductora resultante de la adición de colágeno a un cemento de hidroxiapatita en un modelo biológico, mediante la utilización de dos tipos distintos de soporte de hidroxiapatita, que fueron el cemento óseo de hidroxiapatita propiamente tal y las microesferas de hidroxiapatita. Para ello se intervinieron 30 conejos neozelandeses blancos adultos, a los cuales se les practicó un defecto de 5 mm a nivel lateral de ambos cóndilos femorales, los que fueron, los cuales fueron divididos aleatoriamente en 5 grupos de acuerdo al tipo de relleno utilizado: cemento de hidroxiapatita, cemento de hidroxiapatita más colágeno, microesferas de hidroxiapatita, microesferas de hidroxiapatita más colágeno y por último se dejo un grupo control con el defecto vacío. La evolución de los implantes fue evaluada de manera clínica, radiográfica y mediante M.E.R., con un sistema semicuantitativo y por histomorfometría, en dos bloques de tiempo de 1 y 3 meses respectivamente. Paralelamente, se realizó una evaluación histológica con una evolución de 12 días de los grupos anteriormente definidos. Nuestros resultados demostraron que no existen diferencias estadísticamente significativas en la respuesta ósea entre la adición o no de colágeno al cemento de hidroxiapatita, sin embargo encontramos diferencias significativas con respecto a la presentación física de los materiales, obteniendo una mayor neoformación ósea en los grupos en que el cemento fue entregado en forma de microesferas con respecto al cemento entregado como masa. / Bone regeneration derived from bone loss has become one of the greatest challenges of modern medicine. Fresh autogenous cancellous bone grafts is the standard treatment due to its excellent biological properties that ensure a supply of cells with osteogenic potential, growth factors and extracellular matrix components that promote bone neoformation. However, the disadvantages of these grafts have currently made the search for a synthetic material that provides or supplements these properties and, therefore, supports the bone regeneration an important branch of research in regenerative medicine. Hydroxyapatite cement as a bone graft substitute outshines all other materials. Its high biocompatibility given by its physical and chemical composition, which resembles the mineral phase of the bone, generates a biomimetic path of new bone formation. Given that in nature, the formation of the first signs of bone mineralization are built on a collagen nanoskeleton, the objective of this study was to demonstrate the greater osteoconductive capacity resulting from the addition of collagen to hydroxyapatite cement in a biological model. This was achieved by the use two different types of hydroxyapatite: hydroxyapatite compact paste and hydroxyapatite microspheres. On 30 adult white New Zealand rabbits a 5mm defect was made on the lateral aspect of both femoral condyles. These defects were randomly divided into five groups according to the type of bone substitute material used: hydroxyapatite cement, hydroxyapatite cement with collagen, hydroxyapatite microspheres, hydroxyapatite microspheres with collagen and lastly no substitute filling as a control group. The evolution of the implants was assessed through clinical evaluation, X-rays, as well as Backscattered Scanning Electron Microscopy (BS-SEM) with a semi-quantitative system and histomorphometry in two time blocks: one and three months after surgery. In parallel, a histological evaluation was carried out, in all the previously mentioned groups, on day 12 of the investigation. The results revealed that there were no statistically significant differences between the bone response when using hydroxyapatite cement/microspheres with or without the addition of collagen. However; significant differences appeared regarding the physical presentation of the material used. Greater bone formation was present in the groups where the hydroxyapatite was applied as microspheres than in those with the paste form. Despite the results obtained, we consider necessary more experimental studies in vivo in order to confirm or reject the achievement of potential osteoconduction enhancement with the use of collagen in bone cements.

Leishmania infantum és un protozou paràsit intracel·lular obligat de mamífers, transmés per la picada de dípters hematòfags del gènere Phlebotomus. Les persones infectades poden desenvolupar diversos de quadres clínics de severitat variable anomenats de manera genèrica leishmaniosi. La leishmaniosi per L. infantum és una zoonosi de la que el gos domèstic és el reservori, alhora que pot patir la malaltia. De fet, la leishmaniosi és una de les principals malalties infeccioses en gossos a en les zones endèmiques per L. infantum. L'aplicació de tècniques moleculars, alhora que estudis de la resposta immunitària en animals i persones han demostrat taxes d'exposició al parasit i infecció molt superiors a la incidència de malaltia. La interacció entre paràsit i hoste resulta, doncs, de gran interés per a entendre els factors que duen a la progressió de la malaltia o a la infecció no patògena. Aquesta tesi presenta els estudis sobre aquesta interacció en gossos i cavalls domèstics amb infecció natural (no experimental) per L. infantum a Catalunya i Mallorca. Els principals resultats d'aquests estudis són: • En l'avaluació de la resposta immunitària cel·lular front L. infantum en gossos infectats, la intradermorreacció retardada és més sensible que la proliferació de limfòcits, i el bioassaig d'interferó gamma. Tot això, els resultats indiquen que tots tres mètodes es complementen i cal integrar-ne els resultats per a disposar d'una valoració escaient de la resposta immunitària cel·lular. • La pell macroscòpicament sana del musell de gossos amb leishmaniosi presenta lesions microscòpiques de moderades a severes, i un nombre elevat de paràsits detectables microscòpicament. Contràriament, tot i poder ser positiva a PCR d'L. infantum, la pell de gossos sans infectats no presenta lesions macroscòpiques ni paràsits a l'anàlisi microscòpica. • Els paràmetres d'infecció i immunitat front L. infantum en gossos domèstics són essencialment iguals abans i després de la temporada d'activitat del vector transmissor de la malaltia. • Els cavalls domèstics de zones endèmiques per L. infantum poden patir leishmaniosi, en la forma de lesions cutànies similar la la leishmaniosi cutània humana. Aquest procés va acompanyat de respostes immunitàries similars a les descrites en gossos i humans. • Tot i l'escassa incidència de leishmaniosi cutània per L. infantum en cavalls domèstics de zones endèmiques, aquests presenten prevalences de resposta immunitària humoral i cel·lular elevades, amb una predominància clara del component cel·lular. Els cavalls i gossos domèstics estudiats presenten així altes taxes d'infecció natural per L. infantum i resposta immunitària, eminentment cel·lular, en absència de malaltia. En conjunt, i en consonància amb el publicat en altres hostes, notablement en humans, aquests resultats mostren L. infantum com un paràsit ubicu, que infecta de manera prevalent els seus hostes. Els hostes sans de diferentes espècies presenten algunes característiques comunes, com són escassa càrrega parasitària, i resposta immunitària específica cel·lular forta, i humoral més feble. La malaltia (leishmaniosi) resulta així un resultat infreqüent de la infecció dels mamífers hostes de L. infantum, essent la resposta immunitària cel·lular clau per a la ressistència a la malaltia. / Leishmania infantum is an obligate intracellular protozoan parasite of mammals transmitted by hematophagous sandflies (Phlebotomus sp). Infected persons can develop clinical presentations of varying severity generically called leishmaniosis. Leishmaniosis by L. infantum is a zoonosis maintained by domestic dogs, which are also highly susceptible to disease. In fact, leishmaniosis is among the most important infectious diseases in dogs living in areas endemic for L. infantum. Use of molecular biology techniques, as well as studies on the specific immune response in animals and humans have shown infection to be more prevalent than disease. The host-parasite interaction therefore warrants research to elucidate the factors involved in progression of infection into full-blown disease or non-pathogenic infection. This thesis presents studies on the host-parasite interaction in domestic dogs and horses from Catalunya and Mallorca with natural infection by L. infantum. The main results of these studies are: • In evaluating the specific cellular immune response to L. infatnum in infected dogs, the leishmanin skin test is more sensitive than both the lymphocyte proliferation assay and an interferon-gamma bioassay. Regardless, our results show that all three assays are complementary, and have to be interpreted integrally to evaluate the host cellular immune response adequately. • Macroscopically normal muzzle skin of leishmaniotic dogs has moderate to severe microscopic lesions and high numbers of parasites as detected microscopically. By contrast, normal muzzle skin of healthy dogs which is PCR-positive for L. infantum shows negligible microscopic lesions and no parasites visible microscopically. • Parameters of infection and immunity to L. infantum in domestic dogs do not change significantly after the vector sandfly season. • Domestic horses living in areas endemic for L. infantum can develop leishmaniosis in the form of cutaneous lesions similar to those in humans. This is accompanied by an immune response which is similar to that described in dogs and humans. • Despite leishmaniosis by L. infantum is rare in horses, domestic horses living in endemic areas show widespread specific humoral and cellular immune responses to L. infantum, with the cellular component being more prevalent. The domestic dogs and horses studied show elevated prevalence of natural infection by L. infantum and specific immune response to the parasite, which is predominantly cellular. As a whole, and in consonance with data from other L. infantum hosts, notably humans, these results show L. infantum as a highly prevalent parasite. Healthy hosts of L. infantum show similarities across host species, such as low parasite load, strong cellular specific immunity, and a weaker specific humoral immune response. Disease (leishmaniosis) is therefore and infrequent outcome of infection of mammalian host species of L. infantum, with cellular immunity playing a key role in resistance to disease.

Este trabajo de investigación forma parte de los proyectos Mapeo e identificación de genes implicados en el metabolismo lipídico en porcino, la calidad de la carne y la calidad del jamón curado (AGL2007-66707-C02-02) y Estudio de caracteres relacionados con el metabolismo lipidico y la calidad en porcino mediante el analisis integral de datos masivos de genotipos y expresion genica (AGL2010-22208-C02-02), cuya finalidad consiste en determinar la arquitectura genética de diversos caracteres relacionados con el metabolismo lipídico, en particular aquellos vinculados al metabolismo del colesterol, lipoproteínas plasmáticas LDL y HDL y triglicéridos. La presente tesis aborda la caracterización molecular de los genes Low density lipoprotein receptor-related protein 12 (LRP12), Tribbles 1 (TRIB1), Adiponectin (ADIPOQ) y diversos miembros de la familia Solute carrier family 27A (SLC27A1, SLC27A2 y SLC27A4) porcinos, así como la identificación de polimorfismos y la realización de estudios de asociación con caracteres relacionados con el metabolismo lipídico en una población comercial Duroc. En total, se ha detectado cuatro polimorfismos sinónimos en el gen LRP12 (c.507C>T, c.762C>T, c.771A>G y c.1101A>G), un indel en la región 3’UTR del gen TRIB1 (c.*156_157del), una sustitución en la región 3’UTR del gen ADIPOQ (c.*1512G>T), dos polimorfismos sinónimos (c. 441C>T, c.747A>G) y una sustitución (c.*400C>T) en la región 3’UTR del gen SLC27A1 y dos polimorfismos sinónimos en el gen SLC27A4 (c.243T>G y c.837C>T). Asimismo, se ha observado que la variabilidad de los genes LRP12 y TRIB1, localizados en el intervalo de confianza de un QTL para triglicéridos a 190 días, no está asociada con dicho carácter, y sin embargo presenta una fuerte asociación con el contenido de ácidos grasos saturados del músculo gluteus medius (P < 0.001). Para los genes SLC27A1 y SLC27A4 se obtuvo resultados similares, aunque la asociación con el contenido de ácidos grasos saturados resultó ser no significativa después de aplicar la corrección de Bonferroni. Finalmente, el genotipo ADIPOQ presentó una asociación muy significativa con el contenido de LDL a 190 días (P=0.0027). Por otra parte, se ha procedido a identificar polimorfismos del tipo copy number variation (CNV) en la población experimental Duroc. Para ello, se ha empleado la herramienta Illumina Porcine SNP60 Beadchip Y los paquetes informáticos cnvPartition v3.1.6, CNstream y PennCNV. Los resultados obtenidos han evidenciado la existencia de una notable grado de variación cromosómica estructural CNV en dicha población / This study forms part of the projects Mapping and identification of genes involved in pig lipid metabolism and meat and cured ham quality (AGL2007-66707-C02-02) and Study of traits related with lipid metabolism and meat quality in pigs by means of the integral analysis of massive genotyping and expression data (AGL2010-22208-C02-02), whose goal consists in determining the genetic architecture of diverse traits related with lipid metabolism and, in particular, of those dealing with serum cholesterol, triglyceride and low (LDL) and high density lipoprotein concentrations. More specifically, the current thesis has undertaken the molecular characterization of the Low density lipoprotein receptor-related protein 12 (LRP12), Tribbles 1 (Drosophila) (TRIB1), Adiponectin (ADIPOQ) and several members of the Solute carrier family 27A (SLC27A1, SLC27A2 and SLC27A4), as well as the identification of polymorphisms and the performance of association studies with lipid traits in a commercial Duroc population. By using this approach, we have identified four synonymous SNP at LRP12 (c.507C>T, c.762C>T, c.771A>G y c.1101A>G), an indel at the 3’UTR of TRIB1 (c.*156_157del), a substitution at the 3’UTR of ADIPOQ (c.*1512G>T), two synonymous polymorphisms (c. 441C>T, c.747A>G) and one 3’UTR substitution (c.*400C>T) at SLC27A1 and two synonymous polymorphisms at SLC27A4 (c.243T>G AND c.837C>T). We have also found that variability of LRP12 and TRIB1, that map to the confidence interval of one QTL for serum triglycerides, is not associated with the aforementioned trait but with gluteus medius saturated fatty acid content (P < 0.001). Similar associations have been observed for the SLC27A1 and SLC27A4 loci, althought they became non-significant after applying the Bonferroni correction for multiple testing. Finally, we have detected a very strong association between ADIPOQ genotype and serum LDL levels a 190 days (P=0.0027). On the other hand, genotyping of the Duroc population with the Illumina Porcine SNP60 Beadchip has revealed the segregation of a remarkable number of copy number variants.

El objetivo general de este trabajo de Tesis Doctoral es evaluar los efectos de dietas ricas en diferentes tipos de ácidos grasos (saturados, poli-insaturados omega 6 y omega 3) sobre el transcriptoma de grasa abdominal, hígado y músculo esquelético en pollos de engorde mediante el uso de GeneChip microarrays. En concreto se investiga que genes y vías metabólicas, de las conocidas hasta el momento, se ven afectadas en el pollo de carne al ingerir raciones con distinto grado de insaturación y se comprueba si los cambios en la expresión de determinados genes y vías metabólicas, descritos en experimentos previos, también se observan mediante el uso de GeneChip microarrays. En una segunda fase, se estudia la evolución con la edad del pollo del nivel de expresión de diferentes genes seleccionados a partir de los resultados obtenidos del experimento anterior y de la bibliografía existente en esta área para pollos de carne. Se diseñó un ensayo con pollos de carne alimentados con 4 piensos experimentales, una dieta baja en grasa (0,5% de grasa añadida) y 3 raciones suplementadas con 10% de diferentes grasas: sebo, como fuente de AGS de cadena larga, aceite n-3 (70% aceite de linaza + 30% aceite de pescado) rico en AGPI n-3 y aceite de girasol, rico en AGPI n-6. Dentro de este ensayo se desarrollaron dos estudios en paralelo. Uno para estudiar las variaciones producidas por las dietas experimentales en el transcriptoma de la grasa abdominal, el hígado y el músculo esquelético de pollos de carne de 50 días. Otro para estudiar la evolución en el tiempo de la expresión de genes seleccionados. Para ello se tomaron muestras de estos mismos tejidos (grasa abdominal, hígado y músculo) a lo largo del crecimiento de los pollos, tras 0, 10, 21, 35 y 45 días de administración de los piensos experimentales. Los piensos experimentales se suministraron a los animales desde el día 14 de vida. Cambios fenotípicos. Los rendimientos productivos de los animales se registraron como una comprobación previa de que se producían los cambios fenotípicos esperados. Así, efectivamente, los animales alimentados con la dieta rica en ácidos grasos omega-3 presentaron un menor depósito de grasa abdominal comparados con aquellos alimentados con dietas ricas en ácidos grasos saturados. Los cambios en la composición de los diferentes tejidos también fueron los esperados con composiciones que reflejaban los perfiles de ácidos grasos de las dietas. Los animales alimentados con dietas bajas en grasa, y con menor contenido en energía, tal y como se había comprobado en experimentos previos, presentaron rendimientos completamente diferentes al resto de grupos. Estudio del transcriptoma. La dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 fue la que indujo mayores cambios en los transcriptomas estudiados, sobretodo en el caso de grasa abdominal y músculo esquelético. En el caso de la grasa abdominal la dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 produjo cambios respecto a todas las otras dietas y, sobre todo, con variaciones en vías metabólicas poco específicas o relacionadas con la metabolización de diferentes moléculas. En el caso del músculo las diferencias de expresión se encontraron fundamentalmente entre la dieta rica en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 en comparación con la dieta rica en ácidos grasos saturados, y la mayoría de las vías afectadas estaban relacionadas con el sistema inmune. Estudio de genes seleccionados. En este estudio se seleccionaron genes de interés según los resultados obtenidos en el estudio del transcriptoma y la bibliografía disponible. No todos los genes seleccionados mostraron cambios en respuesta a las diferentes dietas o al tiempo de consumo de estas. Los genes ITGB2, FABP7, LIPA, GSTA3, LITAF mostraron diferencias en su expresión en grasa abdominal entre los pollos alimentados con la dieta rica en ácidos grasos insaturados omega-3 y los alimentados con omega-6 o saturados. El gen CYP2C18 mostró mayores niveles de expresión en hígado en animales alimentados dietas ricas en ácidos grasos poli-insaturados n-3 y n-6 en comparación con aquellos alimentados con saturados. Los genes CLU y ITGB2 en grasa abdominal, CYP2C18, PCK1, PPARa, PPARg y FASN en hígado y ITGB2 y FABP4 en músculo mostraron cambios en su expresión con la edad del animal. De estos estudios podemos concluir que el transcriptoma de la grasa abdominal es mucho más sensible a cambios en la composición de la grasa de la dieta que el transcriptoma del hígado o del músculo esquelético. Además, dietas ricas en ácidos grasos poli-insaturados omega-3 producen transcriptomas muy diferentes a aquellos producidos por dietas ricas en ácidos grasos omega-6, saturados o incluso por dietas bajas en grasa en la grasa abdominal y el músculo esquelético. Los genes que presentaron cambios debido a las dietas o a la edad identificados en el presente trabajo, están principalmente relacionados con la metabolización de lípidos y otras moléculas y con la respuesta inmune, y son de interés para futuros estudios en pollos de engorde relacionados con el metabolismo lipídico o el desarrollo de los animales. / The general aim of this PhD thesis is to assess the effects that diets rich in different fatty acid families (saturated, poly-unsaturated omega-6, or omega-3) have on the transcriptome of adipose tissue, liver, and skeletical muscle in broiler chickens, using GeneChip microarrays. In particular, this work wants to describe differences in gene/pathway expression in broiler chickens fed diets differing in their unsaturation degree, and want to verify those differences in genes/pathways expression previously described in literature. In a second part of this PhD Thesis, we describe the time-evolution of the expression of genes selected from those found important in the microarray data and in literature on broiler chickens. In this work, broiler chickens were fed 4 different experimental diets, a low-fat diet (0.5% added fat) and 3 diets supplemented with 10% of three different fats: tallow, rich in saturated fatty acids, a mixture of n3 oils (70% linseed oil + 30% fih oil) rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids, and sunflower oil rich in poly-unsaturated omega-6 fatty acids. This work includes two experiments that were developed parallel in time. First experiment studies the effects of the experimental diets on transcriptomes of abdominal fat, liver, and skeletical muscle in 50 days old broiler chicken; second experiment describes time-evolution of the expression of selected genes depending on the diets. Abdominal fat, liver, and skeletical muscle were sampled in broiler chickens on days 0, 10, 21, 35, and 45 after experimental feeds were introduced to the animals on day 14 of age. Phenotype changes. Productive performance was registered as a pre-requisite before we could proceed to run microarray analysis. Chickens fed the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids showed lower deposition of abdominal compared to those fed the diet rich in saturated fatty acids. The different studied tissues also showed the expected changes in composition mimicking fatty acid profile of the respective diets. Broiler chickens fed low fat diet, and so with lower energy levels, showed productive performance records completely different to all other treatments, as expected. Study of transcriptome. Diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids induced most of the important observed changes in expression, especially in abdominal fat and skeletical muscle. For abdominal fat, diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids induced changes compared to all other diets, affecting several unspecific pathways related to metabolism of different molecules. For skeletical muscle, differential expression was mainly found between the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids and diet rich in saturated fatty acids. Most of the pathways affected in this case were related to immune response. Study of selected genes. A group of genes were selected based on results obtained from the microarray experiment and previous results available on literature. Not all selected genes were differentially expressed among diets or time points. Genes ITGB2, FABP7, LIPA, GSTA3, LITAF showed differences on expression in abdominal fat of broiler chickens fed the diet rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids compared to those fed diets rich in poly-unsaturated omega-6 or saturated fatty acids. Gene CYP2C18 showed increased expression levels in liver of broiler chickens fed diets rich in poly-unsaturated omega-3 or omega-6 fatty acids compared to those fed saturated fatty acids. Genes CLU and ITGB2, in abdominal fat, genes CYP2C18, PCK1, PPARa, PPARg and FASN in liver and genes ITGB2 and FABP4 in skeletical muscle were affected by the age of the broiler chicken. As conclusions, we can say the transcriptome of the adipose tissue is more sensible to changes in the composition of the fat included in the diet than liver or muscle transcriptomes. Moreover, diets rich in poly-unsaturated omega-3 fatty acids resulted in very different transcriptomes when compared to diets rich in saturated or poly-unsaturated omega-6 fatty acids, or even when compared to low fat diet. Genes differencialy expressed among diets or sampling days were mainly related to metabolism of different molecules and to immune response. These are genes of interest for future studies related to lipid metabolism or development in broiler chickens.

La importancia de la hematología y la bioquímica sanguínea en medicina aviar se refleja en el incremento de estudios destinados a la obtención de los intervalos de referencia en muchas especies de aves en general y en las Estrigiformesen particular. Para interpretar correctamente sus valores se requiere conocer la influencia que los factores ambientales, fisiológicos y metodológicos ejercen sobre los mismos. La edad es un factor muy relevante, especialmente en el primer periodo de vidalas aves donde acontece el proceso de crecimiento. Estudios realizados sobre otras especies de aves han demostrado que la edad influye sobre los parámetros hematológicos y bioquímicos produciendo cambios significativos en sus valores. El objetivo de esta tesis doctoral fue determinar los intervalos de referencia hematológicos en cinco especies de Estrigiformes en diferentes clases de edad. Se muestrearon 339 animales; 92 cárabo comunes (Strix aluco), 88 mochuelos europeos (Athene noctua), 96 autillos europeos (Otus scops), 17 búhos chicos (Asio otus) y 48 lechuzas comunes (Tyto alba), procedentes de dos centros de recuperación de fauna salvaje localizados en la región Nord-Este de España. De todos los parámetros analizados, únicamente las concentraciones de colesterol y albúmina junto a la osmolaridad plasmática no mostraron variabilidad inter específica. El resto de parámetros variaron entre especies. Respecto a la comparación entre clases de edad, los resultados de nuestro estudio muestran que dentro delorden de las Estrigiformes se produce un incremento con la edad en el recuento total de eritrocitos, valor hematocrito y en las concentraciones de hemoglobina. Por el contrario, la concentración de fósforo y la actividad de la fosfatasa alcalina disminuyeron con la edad. Adicionalmente, dentro de la familia Strigidae se observó un incremento en las concentraciones de gamma globulina y sodio, y un descenso de la cifra total de leucocitos y de la concentración de calcio con la edad. Esta tesis doctoral demuestra la importancia de considerar la edad como un factor relevante en la obtención de los intervalos de referencia hematológicos y bioquímicos en las Estrigiformes, y evidencia que los pollos de estas especies son como una cohorte independiente. En base a ello se han propuesto dos intervalos de referencia. En la segunda parte de este trabajo de tesis doctoral quisimos valorar la modificación propuesta por Arock et al., 2013 de un método semi-directo (MSDTLC) de recuento total leucocitario basado en el colorante eosinofílico del segundo paso de la tinción de Diff-Quick y determinar su grado de relación con el método directo hemocitométrico de Natt y Herrick, que tradicionalmente se emplea en la sangre aviar en los laboratorios. Se muestrearon 20 animales,10 cárabos comunes (Strix aluco) y 10 buitres leonados (Gyps fulvus). Se observó una buena correlación entre métodos (r=0.89), ausencia de errores de tipo constante o proporcional y Bias= 2.06 (95 % CI -6.44 a 10.57). El método semi-directo obtuvo unaimprecisión intra observador mayor (CV=16.3%) y una menor imprecisión entre observadores (CV= 8.5%) que la observada en el método de Natt y Herrick. En conclusión, el método modificado de recuento leucocitario total, MSDTLC recientemente propuesto, permite un recuento fiable tanto de heterófilos como de eosinófilos en las muestras sanguíneas de cárabo común y de buitre leonado, muestra una alta precisión y por tanto puede ser empleado como alternativa de otros métodos semi-directos, cuando el método hemocitométrico directo no está disponible. / The importance of hematological and blood biochemistry testing in avian veterinary medicine is reflected in the increasing numbers of studies leading to the identification of reference intervals of Strigiformes. To conduct a proper clinical interpretation, a set of characteristic health values is required and the influence of the environmental, physiological and methodological factors should be understood. The age is an influential factor especially in the first time of life when the most rapid growth rate or increase in body mass occurs, and studies in other avian groups have shown the age significantly influences producing detectable changes in hematological and blood biochemistry parameters. The objective of this study was to determine baseline data of hematologic and blood biochemistry parameters of five species of Iberian Strigiformes in different age classes. 341 nocturnal birds of preys were sampled from wildlife health centers, 92 Tawny Owls, 88 Little Owls, 96 Scops Owls, 17 Long-eared Owls and 48 Barn Owls. Only the reference interval of cholesterol, albumin and plasmatic osmolality did not show inter-specific variability. The others hematologic and biochemical parameters varied between the species. Between the age classes considered, a common trend was observed. Into the Strigiforme Order no differences were observed between juveniles and adults in any hematologic and blood biochemistry parameter. The packed cell volume, red blood cell count and hemoglobin of chicks were significantly lower than juveniles and adults, and alkaline phosphatase activity and phosphorus concentrations were significantly higher. In the Strigidae family, sodium and gamma globulins increased with age and total WBC and calcium decreased. Our results evidenced the importance of considering age classes for the establishment of hematologic and biochemical reference intervals in the Strigiformes, and provide evidence that data from chicks of this Order were identified as unique group compared to older cohorts; therefore two hematologic and blood biochemical reference intervals by age have been defined. Based on the staining affinity of heterophils and eosinophils in the step 2 of Diff-Quick stain, it has been proposed to test a novel modified semi-direct method for total leukocyte count. The purpose of this study was compare this semi-direct Romanowskybased quick stain method with the direct method of Natt and Herrick and to study the intra and inter-observer imprecision in samples from two species of birds with a different differential leukocyte counts. 20 samples of tawny owl (Strix aluco) and griffon vulture (Gyps fulvus) were used to calculate the WBC by the two methods. A good correlation was observed, r = 0.89; no constant and/or proportional error was found. The Bias was 2.06 (95 % CI -6.44 to 10.57). The intra-observer imprecision of a semi-direct Romanowsky-based quick stain method was higher (in tawny owl CV = 18.3% and griffon vulture CV = 14.3%) than the Natt and Herrick method, but the inter-observer imprecision was lower (in tawny owl CV = 24% and griffon vulture = 7%) than the Natt and Herrick method. In conclusion, the techniques did not produce equivalent results, but the semi-direct Romanowsky-based quick stain method allowed reliable counting of both heterophils and eosinophils in tawny owl and griffon vultures blood samples and showed high precision and therefore could be used as an alternative of other semi-direct counting methods when direct hemocytomer method is not available.