La patología articular en el caballo provoca, a corto o largo plazo, cojera en el caballo y es motivo de importantes pérdidas económicas en el mundo deportivo ecuestre. La fisiopatología articular en el caballo comporta una serie de procesos biopatológicos que, si no se detectan y tratan a tiempo, generan un ciclo catabólico autodestructivo que induce la degradación de los propios tejidos articulares. Estudios de medicina humana hace tiempo que han demostrado mediante la determinación de marcadores hemostáticos, y más recientemente, de la concentración de dímero-D sinovial, que existe una activación generalizada tanto de la fibrinolisis como de la cascada de la coagulación en la articulación artrítica que están relacionadas con la inflamación articular. Sin embargo, no hay nada descrito en caballos ni en el resto de especies animales sobre la determinación de la concentración de dímero-D en el líquido sinovial, y lo poco que hay descrito sobre los procesos fisiopatológicos relacionados con la coagulación intra-articular son extrapolaciones de medicina humana. El dímero-D es un producto específico de la fibrinolisis que resulta sólo de la degradación de la fibrina estable y su presencia es indicativa de la formación previa de un coágulo. Nuestros estudios, realizados con caballos con patologías articulares frecuentes como la OCD, la OA y la artritis séptica (AS), han permitido determinar y evidenciar por primera vez y mediante la determinación de la concentración de dímero-D sinovial, la activación de la fibrinolisis sinovial en respuesta a la activación de la cascada de la coagulación en las articulaciones afectadas del caballo, y que varía independientemente de la presencia de enfermedad sistémica en el caballo. Hemos podido comprobar que la concentración de dímero-D sinovial (activación fibrinolítica sinovial) aumenta considerablemente en los caballos con OCD y OA, sobretodo con OCD, y que en los casos con AS este aumento es muchísimo más destacado que en el resto de artritis. Esto demuestra que la actividad fibrinolítica sinovial aumenta de forma más o menos marcada en función de la inflamación articular. La determinación de la concentración de dímero-D sinovial ha demostrado ser un marcador más sensible que el análisis del recuento total de células blancas (RTCB) del líquido sinovial para detectar la presencia de patología articular no infecciosa. Estos hallazgos apuntan que la determinación de la concentración sinovial de dímero-D puede ser útil como marcador de patología articular. En un futuro, ampliando la población de estudio, es posible que se pueda determinar un valor de corte que permita diferenciar entre patología articular inflamatoria e infecciosa. En conclusión, la activación de la cascada de coagulación y de la fibrinolisis en el líquido sinovial desempeñan un papel en la fisiopatología articular de caballos con OCD, OA y AS. La determinación cuantitativa o semi-cuantitativa de dímero-D es un test rápido, económico y práctico, y su uso es factible a nivel clínico para determinar patología articular en el caballo. Finalmente, la investigación de métodos para reducir el depósito de fibrina y estimular la actividad fibrinolítica en las patologías articulares, especialmente las altamente inflamatorias e infecciosas, podría ofrecer una nueva alternativa terapéutica articular. / Equine joint pathology usually results in lameness which is one of the most important reasons for significant economic losses in the equestrian sport world. The biopathological events involved in joint disease generate a catabolic cycle which causes joint tissue degeneration if left uncontrolled. Human studies have demonstrated the relationship between joint inflammation and the hemostatic and the fibrinolytic pathway activation, and secondly that this can be measured by D-dimer concentration determination in synovial fluid. Neither the confirmation of the activation of these two pathways as part of the pathophysiology of joint disease, nor the measurement of D-dimer concentration in synovial fluid have been reported in other species, including equine, although extrapolations from human medicine have been made. D-dimers are specific fibrinolysis byproducts resulting from stable fibrin degradation only and their presence confirms previous clot formation. These studies, which include horses with different types of joint disease like OCD, OA and septic arthritis have confirmed that a fibrinolytic process occurs within the joint in response to the coagulation pathway activation in diseased joints, independently of the presence of systemic disease. We have documented a significant rise in synovial D-dimer concentration (synovial fibrinolytic activation) both in OCD and OA affected horses, and more so in horses with OCD, and furthermore, this rise has been observed as being markedly more prominent in septic arthritis patients. This shows that synovial fibrinolysis activity rises in function of the degree of inflammation. Synovial D-dimer concentration determination has proven to be a more sensitive marker than total nucleated cell count (TNCC) for the detection of non-infectious joint disease. However, further investigation and inclusion of a larger group of horses for study are necessary to be able to give a valid cutoff point useful to differentiate between septic and inflammatory joint disease. In conclusion, both the coagulation and the fibrinolytic pathways play a role in equine joint pathophysiology, in namely OCD, OA and septic arthritis patients. The quantitative or semi-quantitative D-dimer determination is a quick, practical and inexpensive test for the diagnosis of joint pathology in the horse. Finally, investigating ways in which to reduce fibrin deposition and stimulate fibrinolysis activity within diseased joints may offer a new therapeutic alternative especially in highly inflammatory and in septic joint conditions.

Antecedentes: En los seres humanos, el factor de crecimiento transformante beta peritoneal (TGF-β) se asocia con enfermedades peritoneales y la posterior formación de adherencias. No hay estudios sobre las concentraciones de TGF-β peritoneal en caballos con cólico plasma. Por otra parte, caballos con cólicos graves o con líquido peritoneal alterado al ingreso, así como los no sobrevivientes, tendrán mayores aumentos en el plasma y peritoneal de D- dímero. Objetivos: Los objetivos de esta tesis fueron: 1) Determinar las concentraciones en plasma y líquido peritoneal de TGF-β1 y TGF-β 3 en caballos con diferentes tipos de cólicos (no sometidas previamente a cirugía abdominal), 2) comparar estas concentraciones de acuerdo con el tipo de fluido peritoneal (trasudado, trasudado modificado y exudado), 3) comparar y correlacionar las concentraciones plasmáticas y peritoneales de TGF-β 1 y TGF-β3 y los tipos de líquido peritoneal según el grupo de los cólicos y la evolución clínica y 4) describir y evaluar la correlación entre TGF-β 1 y D- dímero. Métodos: Dos estudios clínicos se llevaron a cabo para el desarrollo de estos objetivos. Estudio 1: se obtuvo líquido peritoneal y plasma de 78 caballos con cólico y 8 caballos sanos. Los pacientes fueron clasificados de acuerdo al diagnóstico (obstrucciones, enteritis, trastornos isquémicos y peritonitis), el análisis del líquido peritoneal (trasudado, trasudado modificado y exudado), y el resultado (sobrevivientes y no sobrevivientes). Las concentraciones plasmáticas y peritoneales de TGF-β1 y TGF-β3 se determinaron por ELISA. Los datos se analizaron por pruebas paramétricas y no paramétricas. Un valor de P ≤ 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Resultados: Las concentraciones de líquido peritoneal de TGF-β1 fueron significativamente (P= 0,01) más altas en caballos con peritonitis en comparación con todos los otros grupos de cólico y controles. Los caballos con lesiones isquémicas tuvieron significativamente (P= 0,01) mayores concentraciones peritoneales de TGF-β1 en comparación con los controles y el grupo de caballos con obstrucciones. La concentración peritoneal de TGF-β1 también fue significativamente (P= 0,01) más alta en exudados en comparación con trasudados. Las concentraciones peritoneales de TGF -β1 y TGF-β3 y la concentración plasmática de TGF-β1 aumentaron significativamente en los caballos no sobrevivientes en comparación con los sobrevivientes (p= 0,001, P= 0,004 y P= 0,05, respectivamente). Estudio dos: se incluyeron 124 caballos con cólico y 12 caballos como grupo control. Los caballos con cólico fueron agrupados según el diagnóstico (obstrucciones, enteritis, problemas isquémicos, peritonitis y otros problemas mixtos), los resultados del análisis del líquido peritoneal (trasudado, trasudado modificado y exudado) y la evolución clínica (sobrevivientes y no sobrevivientes). Las concentraciones plasmáticas y peritoneales de D-dímero y las concentraciones peritoneales de TGF−β1 fueron significativamente mayores en los caballos con la enteritis, peritonitis y trastornos isquémicos en comparación con los caballos con obstrucciones intestinales. Las concentraciones peritoneales de dímero D y TGF-β1 fueron significativamente mayores en los caballos con líquido peritoneal alterado (trasudado modificado y exudado) en comparación con los caballos con el análisis normal de líquido peritoneal. La concentración de estas proteínas también fue significativamente mayor en el grupo con peritonitis y en caballos con líquido peritoneal alterado. Las concentraciones peritoneales y plasmáticas de dímero D en y TGF-β1 fueron mayores en los caballos no sobrevivientes. Se encontraron correlaciones significativas, entre débiles y fuertes, entre las proteínas evaluadas y el diagnóstico, la evolución clínica y el tipo de líquido peritoneal. Conclusiones: La concentración peritoneal de TGF-β1 y de dímero D fue mayor en los caballos con enfermedades gastrointestinales graves (lesiones isquémicas intestinales y peritonitis), en caballos con un fluido peritoneal alterado (exudado) y en los no sobrevivientes. La concentración peritoneal de TGF-β1 aumenta en caballos con enfermedad gastrointestinal grave como una respuesta anti-inflamatoria y podría estar correlacionado con alteraciones en el sistema fibrinolítico, manifestado principalmente por el aumento en las concentraciones plasmáticas y peritoneales de D-dímero. / Background: In humans, peritoneal transforming growth factor beta (TGF-β) is associated with peritoneal diseases and subsequent adhesion formation. No studies on plasma and peritoneal TGF-β concentrations in horses with colic are available. On the other hand horses with severe colic or with altered peritoneal fluid at admission, as well as non-survivors, will have greater increases in plasma and peritoneal D-dimer. Aims: The aims of this thesis were 1) To determine both plasma and peritoneal TGF-β1 and TGF-β3 concentrations in horses with different types of colic (not previously subjected to abdominal surgery), 2) to compare these concentrations according to the type of peritoneal fluid (transudate, modified transudate and exudate), 3) to compare and correlate plasma and peritoneal concentrations of TGF-β1 and TGF-β3 and the types of peritoneal fluid according to the colic group and outcome and 4) to describe and to assess the correlation between TGF-β1 and D-dimer. Methods: Two clinical studies were performed for developing these objectives. Study 1: Peritoneal fluid and plasma samples from 78 horses with colic and 8 healthy horses were obtained. Patients were classified according to diagnosis (obstructions, enteritis, ischemic disorders and peritonitis), peritoneal fluid analysis (transudate, modified transudate and exudate), and outcome (survivors and non-survivors). Plasma and peritoneal TGF-β1 and TGF-β3 concentrations were determined by ELISA. Data were analyzed by parametric a non parametric tests. A P≤0.05 was considered as statistical significant. Results: Concentrations of peritoneal fluid TGF-β1 were significantly (P=0.01) higher in horses with peritonitis in comparison with all other colic groups and controls. Horses with ischemic lesions had significantly (P=0.01) higher concentrations of peritoneal TGF-β1 in comparison with controls and the group of horses with obstructions. Peritoneal TGF-β1 concentration also was significantly (P=0.01) higher in exudates in comparison with transudates. Peritoneal TGF-β1 and TGF-β3 concentrations and plasma TGF-β1 concentration were significantly increased in non-survivors compared to survivors (P=0.001, P=0.004 and P=0.05, respectively). Study two: 124 horses with colic and 12 control horses were included. The horses with colic were grouped according to diagnosis (obstructions, enteritis, ischemic problems, peritonitis and other mixed problems), results of the peritoneal fluid analysis (transudate, modified transudate and exudate) and outcome (survivors and non-survivors). Plasma and peritoneal D-dimer concentrations and peritoneal TGF-β1 concentrations were significantly higher in horses with enteritis, peritonitis and ischemic disorders, when compared to horses with large intestinal obstructions. Peritoneal D-dimer and TGF-β1 concentrations were significantly higher in horses with altered peritoneal fluid (modified transudate and exudate) compared to horses with normal peritoneal fluid analysis. The concentration of these proteins was also significantly higher in the peritonitis group and in horses with altered peritoneal fluid. Peritoneal and plasma D-dimer concentrations and TGF-β1 were also significantly higher in non-survivors. There were significant correlations, from weak to strong, between the evaluated proteins and the diagnosis, the outcome and the type of peritoneal fluid. Conclusions: Peritoneal TGF-β1 and D-dimer concentration was higher in horses with severe gastrointestinal diseases (ischemic intestinal lesions and peritonitis), in horses with an altered peritoneal fluid (exudate), and in non-survivors. Peritoneal TGF-β1 concentration increases in horses with severe gastrointestinal disease as an anti-inflammatory response and could be correlated with alterations in the fibrinolytic system mainly manifested by increasing in the plasma and peritoneal D-dimer concentrations.

La producción animal en un país tropical como Colombia se ve limitada, entre otras cosas, por factores ambientales adversos, como temperatura, humedad relativa y radiación solar altas a lo largo del año. En los sistemas de producción bovina colombiana existen razas criollas, como la San Martinero, que ha demostrado los mejores índices reproductivos (fertilidad, natalidad, intervalo entre partos, etc.). Para esclarecer el porqué de la mayor fertilidad, la presente investigación se realiza con el propósito de estudiar proteínas del plasma seminal y su asociación con indicadores de calidad espermática pre- (volumen seminal, concentración, motilidad, viabilidad, morfología, índice de calidad espermática (ICE) y espermatozoides congelables) y post-descongelación (motilidad, viabilidad, morfología e ICE), fertilidad y producción in vitro de blastocistos de esta raza criolla en la época lluviosa comparada con la época seca y con la raza Cebú Brahman. Para la investigación se seleccionaron al azar 7 toros reproductores de la raza San Martinero (SM) y 7 de la raza Cebú Brahman. Los ejemplares se mantuvieron bajo pastoreo en Brachiaria decumbens en el Centro de Investigaciones la Libertad de Corpoica. La evaluación por época se realizó en SM tanto en período lluvioso como de sequía y la evaluación entre razas (SM y Cebú) únicamente se realizó en lluvias. Los muestreos y análisis seminales por toro en fresco se realizaron tres veces y post descongelación 5 veces para evaluación de calidad espermática, fecundación y producción in vitro de blastocistos. El análisis de la información se basó en Modelos mixtos con medidas repetidas en el tiempo y en ecuaciones de predicción y análisis de componentes principales. Los resultados del estudio permitieron la generación de los primeros mapas referenciales uni y bidimensionales de la raza San Martinero y de la Cebú Brahman caracterizados bajo las condiciones climáticas del trópico bajo colombiano. Los resultados obtenidos de los toros SM para la época de lluvias en términos de indicadores de calidad espermática, fecundación in vitro y efecto en el desarrollo embrionario vistos en forma integrada permiten predecir la fertilidad in vivo. Los valores de estos indicadores no generaron grandes cambios entre la época seca o lluviosa, pero sí superaron a los indicadores de eficiencia reproductiva de toros reproductores de la raza Cebú Brahman. Los cambios de las variables estudiadas que determinan la calidad espermática de los toros por efecto de las proteínas plasmáticas son respuesta de la participación en forma de clúster que integra, bajo un modelo de predicción, proteínas con y sin cambios significativos y no en forma independiente. En este estudio reconocimos algunos modelos cuya asociación explican en gran forma el comportamiento de las variables de calidad seminal (volumen seminal, concentración, motilidad, viabilidad y morfología espermáticas), del ICE y de la producción de espermatozoides congelables, en función de la raza, la época climática, o de acuerdo a si se trata de semen fresco o descongelado. La investigación realizada permitió identificar que el punto de proteína A2301, de de peso molecular 16.74 kDa y pI 4.78, se asocia con los toros seleccionados como de mayor fertilidad, mientras que los puntos A4113 y A4119, de pesos moleculares 15.37 y 15.49 kDa y pI de 5.38 y 5.15, respectivamente, se relacionaron con los toros de baja fertilidad. Los resultados encontrados de la evaluación de calidad espermática del toro criollo SM y de participación de las proteínas del plasma seminal estudiados entre época y comparado con la raza Cebú Brahman muestran la superioridad del bovino Criollo y señalan a la proteómica como una gran herramienta para la selección de toros. / Animal production in a tropical country like Colombia is constrained, among other things, by adverse environmental factors such as temperature, relative humidity and high solar radiation throughout the year. In cattle production systems Colombian landraces exists, such as San Martinero, which has shown the best reproductive rates (fertility, birth, calving interval, etc..). To clarify the reason for its increased fertility, this research was done with the purpose of studying seminal plasma proteins and their association with indicators of sperm quality pre- (volume, concentration, motility, viability, morphology, sperm quality index (ICE) and freezable sperm) and post-thaw (motility, viability, morphology and ICE), fertility and in vitro production of blastocysts in this race Creole during the rainy season compared to the dry season and to Zebu Brahman semen. Seven San Martinero (SM) bulls and 7 Zebu Brahman were randomly selected for the research. The specimens were kept under grazing with Brachiaria decumbens in the Research Center Corpoica “La Libertad”. The evaluation was conducted in SM both in the rainy and drought seasons and evaluation between races (SM and Zebu) only took place in the rainy season. Sampling and quality assessment for bull fresh semen were performed three times; for post-thaw sperm, fertilization and in vitro blastocyst production, the evaluations were 5 times repeated. The data analysis was based on mixed models with repeated measures over time and predictive equations and principal component analysis. The results of the study allowed the first generation and two-dimensional reference maps of seminal plasma proteins of San Martinero and Zebu Brahman races characterized under tropical climatic conditions in Colombia. The results of the SM bulls for the rainy season in terms of indicators of sperm quality, fertilization and in vitro embryo development, showed in an integrated way, let predict the in vivo fertility. The values of these indicators did not produce major changes between the dry and rainy season, but outscored the reproductive efficiency indicators of breeding bulls of Brahman Zebu. The changes of the studied variables that determine the sperm quality of the bulls by the effect of the plasma proteins are the response for their participation in a cluster manner and not in an independently manner, that integrates, under a prediction model, proteins with and without significant changes. In this study, some models were recognized whose association explains the behavior of variables that account for semen quality (seminal volume, concentration, motility, viability and sperm morphology), SQI and sperm production, depending on the race, the climatic season, or according to whether it was fresh or frozen-thawed sperm. The investigation identified the protein point A2301, with molecular weight of 16.74 kDa and pI 4.78, associated with bulls selected as those with higher fertility, while points A4113 and A4119, with molecular weight 15.49 15.37 kDa and pI 5.38 and 5.15, respectively, were associated with low fertility bulls. The results of the evaluation of native SM bull sperm quality and participation of seminal plasma proteins studied between seasons, and compared with Zebu Brahman cattle, show the superiority of San Martinero and point to proteomics as a great tool for selecting of bulls.

La Alta Presión Hidrostática (APH) es una tecnología no térmica capaz de extender la vida útil de los alimentos al mismo tiempo que mantiene sus características nutricionales y organolépticas. El queso fresco es una variedad no madurada, de coagulación enzimática o ácida, y que generalmente es consumido poco después de su elaboración. El queso fresco tradicional es obtenido por coagulación enzimática y es un medio ideal para el crecimiento bacteriano, ya que en su fabricación no se utilizan fermentos lácticos, posee una elevada actividad de agua y un alto contenido en proteína y grasa. El principal objetivo de esta tesis fue evaluar el efecto de la APH para extender la vida útil de un queso fresco tradicional obteniendo un producto de alta calidad. Para este propósito, se realizó un estudio preliminar con quesos comerciales de pequeño formato (80 g) a nivel de planta piloto con el fin de determinar la capacidad de la APH para inhibir el crecimiento de microorganismos causantes de deterioro. Los quesos fueron tratados a 300 y 400 MPa (5 min a 6°C) y se evaluaron diferentes parámetros microbiológicos, de de composición y físico-químicos durante su almacenamiento en frío. Los resultados mostraron que la APH no modificó la composición del queso fresco y produjo sólo pequeños cambios en el color (más amarillo) y la textura (más firme), cuando se comparó con un queso no tratado. Además, la aplicación de 300 y 400 MPa aumentó la vida útil de los quesos a 14 y 21 días, respectivamente. La siguiente fase fue determinar la vida útil de un queso comercial (250 g) tratado a 500 MPa (5 min a 18°C) bajo condiciones industriales siguiendo también su evolución microbiológica, de composición, físico-química y sensorial durante 21 días de almacenamiento en frío. En este caso, los quesos presurizados alcanzaron una vida útil de entre 19 y 21 días al compararlos con los quesos no tratados que fue de entre 7 y 8 días. Sin embargo, el tratamiento de 500 MPa afectó significativamente a las características de color, textura, microestructura y sensoriales del queso, pero no así su preferencia por parte de un panel de catadores. Es importante destacar que la APH fue capaz de mantener las características de aroma del queso a lo largo de su vida útil, retrasando la formación de compuestos volátiles responsables de sabores extraños. Adicionalmente, se realizó un ensayo de inoculación con Listeria spp. con el fin de evaluar la efectividad de la APH (300-600 MPa durante 5 min a 6°C) para asegurar la inocuidad alimentaria. Se seleccionaron tres cepas bacterianas (L. monocytogenes Scott A y CECT 4031, y su marcador, L. innocua CECT 910) para estudiar la inactivación y la generación de daño sub-letal después del tratamiento y su evolución durante 15 días de almacenamiento a 4°C. Con el tratamiento de 300 MPa no se consiguió inactivar ninguna de las cepas inoculadas. Sin embargo, tanto los tratamientos de 500 MPa y 600 MPa se lograron importantes reducciones de Listeria spp. Por otra parte, la presurización del queso fresco entre 300-600 MPa no produjo significativamente daño sub-letal, apreciándose diferencias en el comportamiento entre las cepas estudiadas. Así, se observó que L. monocytogenes CECT 4031 fue la más sensible a la APH y Scott A la más resistente. En los quesos tratados el crecimiento de esta bacteria durante el almacenamiento en frío no fue inhibido. Los recuentos en los quesos tratados a 300 MPa no fueron distintos a los del queso control para todas las cepas y nivel de inoculo utilizados. / High pressure processing (HPP) is a non-thermal technology able to extend the shelf-life of a number of food products while maintaining their sensory and nutritional quality. Fresh cheese is unripened rennet or acid-coagulated type and is usually consumed after manufacturing. Traditional fresh cheese is obtained by rennet coagulation and it may serve as an ideal medium for bacterial proliferation, since no starter culture is added, and considering its high water activity and its high protein and fat contents. The main objective of this thesis was to evaluate the effect of HPP technology for extending the shelf-life of a starter-free fresh cheese, and in order to obtain a high quality product. For this purpose, a preliminary study at pilot plant scale using small commercial cheeses (80 g) was carried out with the aim to determine the HPP capacity to inhibiting the outgrowing of spoilage microorganisms. In this sense, cheeses were treated at 300 and 400 MPa (5 min at 6ºC) and their microbiological, compositional and physico-chemical evolution during cold storage was evaluated. Results indicated that HPP did not affect cheese composition and provoked only little changes in colour (more yellow) and textural (firmer) properties of fresh cheese when compared with untreated cheese. Besides, 300 and 400 MPa were able to extend fresh cheese shelf-life to 14 and 21 days, respectively. The next step was to determine the shelf-life of commercial fresh cheeses (250 g) treated at 500 MPa (5 min at 18ºC) at industrial scale, by following their microbiological, compositional, physico-chemical and sensorial evolution during cold storage of 21 days. This time, pressurised cheeses achieved a shelf-life of about 19-21 days compared to 7-8 days of the untreated cheese. However, 500 MPa significantly affected colour, microstructural, textural and sensory characteristics, but the preference for the treated cheese was not affected. It is also worth noting that HPP was able to maintain the aroma characteristics of cheese throughout its shelf-life, leading to a delay in the formation of volatile compounds responsible for off-flavours. Additionally, an inoculation study with Listeria spp. was carried out in order to evaluate the effectiveness of the HPP (300-600 MPa for 5 min at 6°C) to assure food safety. Three bacterial strains (L. monocytogenes Scott A and CECT 4031, and its surrogate L. innocua CECT 910) were selected to study the initial inactivation achieved, the sublethal damage generated and microbial growth during 15 days of storage at 4°C. Treatment at 300 MPa did not inactivate any of the strains inoculated. Conversely, 500 and 600 MPa were effective to achieve significant reductions of pathogen counts in fresh cheese. On the other hand, treatment of fresh cheese within the range of 300-600 MPa did not produce significant sublethal injury. Regarding behaviour differences among Listeria strains, it was observed that L. monocytogenes CECT 4031 was the most sensitive and L. monocytogenes Scott A the most resistant to HPP. Finally, growth during cold storage was not prevented since viable cells remain after the treatment. Counts of cheeses treated at 300 MPa were not different from untreated cheese counts, for all strains and inocula level used. On the other hand, differences in rate of growth among strains were observed. Scott A strain showed the lowest rate for all conditions studied. These results confirm that the fresh cheese, due to their characteristics of pH and aw, is able to support growth of Listeria spp.

El creixement i el desenvolupament dels vedells durant l’alletament és crucial per la seva futura productivitat. En aquesta tesi es van realitzar quatre estudis per avaluar diferents estratègies de millora dels paràmetres productius i de salut dels vedells alletats Holstein. Al primer estudi es va avaluar la integritat intestinal dels vedells recent nascuts i es va associar aquesta amb la incidència de diarrees durant els primers dies de vida. Es va veure que els vedells que desenvolupaven diarrees durant els primers 7-14 dies de vida havien nascut amb una permeabilitat intestinal elevada, la qual cosa suggereix que els vedells que més endavant desenvolupen diarrees possiblement hagin nascut més predisposats a patir-les. Al segon estudi es van avaluar els efectes de l’addició del probiòtic L. rhamnosus en dues dosis diferents (107 or 109 CFU/50kg de pes viu) durant 14 dies en el període de deslletament sobre la microbiota fecal, la immunitat i el creixement. Va resultar que els vedells complementats amb el probiòtic no van tenir millor immunitat ni creixement possiblement perquè la microbiota fecal no es va veure afectada per la ingestió de L. rhamnosus. Al tercer estudi es van avaluar els efectes de l’addició de butirat en forma de butirat sòdic o tributirina al lactoreemplaçant, amb dosis de 3 g/kg de matèria seca, durant 42 dies en el creixement, el metabolisme de la glucosa i la incidència de diarrees. Els vedells complementats amb butirat van tendir a tenir una major incidència de diarrees i els vedells complementats amb tributirina van tenir un creixement menor que els vedells control. A més, l’addició de butirat al lactoreemplaçant no va influenciar el metabolisme de la glucosa. Al quart estudi es van avaluar els efectes en el creixement d’incrementar el nivell d’alimentació dels vedells durant el període d’alletament i fins a dues setmanes després. Els vedells prenien 4 o 6 L/d de lactoreemplaçant en combinació amb un pinso baix (4.1%) o alt (11.2%) en greix. Es va veure que els vedells que prenien més lactoreemplaçant creixien més durant el període d’alletament i quan aquests menjaven un pinso alt en greix seguien creixent més també després del deslletament, a diferència dels que menjaven un pinso baix en greix que van disminuir el seu creixement un cop es va deixar d’oferir lactoreemplaçant. En conclusió, els vedells que pateixen diarrees durant el seu desenvolupament van néixer amb una permeabilitat intestinal elevada. A més, suplementar els vedells alletats amb L. rhamnosus i amb butirat al lactoreemplaçant després del deslletament (amb dosis de 107 o 109 CFU/50kg de pes viu durant 14 dies) i abans del deslletament (amb dosis de 3 g/kg de matèria seca durant 42 dies), respectivament, no va resultar en avantatges sobre la salut i el creixement. En canvi, incrementar el nivell de greix del pinso (fins al 11.2%) quan els vedells prenien 6 L/d de lactoreemplaçant va resultar en un major pes viu abans i després del deslletament. / Growth and development of young calves is crucial for the later productive parameters. In this thesis, four studies were conducted to evaluate different strategies to improve performance and health of suckling Holstein calves. In the first study, intestinal integrity of newborn calves was evaluated and associated with the development of diarrhea during the first days of life. It was found that calves that incurred diarrhea during the first 7-14 days of life had been born with an increased intestinal permeability suggesting that diarrheic calves may have been more predisposed to suffer scours. In the second study, the effects of supplementing calves with the probiotic L. rhamnosus around weaning in two different doses (107 or 109 CFU/50kg of body weight) for 14 days on the modulation of the fecal microbiota, performance and immunity around weaning were evaluated. Calves that had been supplemented with the probiotic showed no improved performance or immunity possibly due to the lack of modulation of the fecal microbiota by the ingestion of L. rhamnosus. On the third study, the effects of supplementing lactating calves with butyrate in the form of sodium butyrate or tributyrin in the milk replacer, at doses of 3 g/kg of dry matter, for 42 days on performance, glucose metabolism and incidence of diarrhea were evaluated. Calves that had been supplemented with butyrate tended to have increased incidence of diarrhea and calves supplemented with tributyrin showed retarded growth compared to control calves. Also, butyrate addition in the milk replacer resulted in no improved glucose metabolism. The fourth study evaluated the effects on performance parameters of an enhanced feeding program before and after weaning. Calves were fed either 4 or 6 L/d of milk replacer in combination with a low fat (4.1%) or a high fat (11.2%) starter feed. Results showed that calves fed increased daily amount of milk replacer had improved growth before weaning and calves that were also fed a high-fat starter feed had the greatest body weight after weaning in contrast with calves fed 6 L/d of MR and a low-fat starter feed that showed decreased growth once milk replacer was no longer provided. In conclusion, calves that experienced diarrhea early in life were born with increased intestinal permeability. Moreover, supplementing calves with L. rhamnosus or with butyrate in the milk replacer at weaning (at doses of 107 or 109 CFU/50kg of body weight for 14 days) and during the preweaning period (at doses of 3 g/kg of dry matter for 42 days), respectively, had no beneficial effects on performance and health. However, increasing the amount of fat in the starter feed to 11.2% when calves were fed 6 L/d of milk replacer increased overall body weight before and after weaning.

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La gripe es un problema de salud pública en todo el mundo, siendo una de las enfermedades infecciosas más comunes y una patología de las vías aéreas altamente contagiosa. Desde abril de 2009, un nuevo virus de influenza A H1N1, con origen porcino dio lugar a la aparición de brotes en todo el mundo siendo declarada posteriormente como una situación de pandemia. Hoy en día el virus pdmH1N1 de 2009 continúa en circulación, generalmente provocando infecciones leves y autolimitadas. Sin embargo, un pequeño porcentaje de pacientes requieren hospitalización y atención especializada en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI). Es digno de mención comentar que se ha identificado un aumento en la producción de citoquinas proinflamatorias en pacientes de UCI. Esta observación sugiere la hipótesis de que la heterogeneidad en el resultado de la infección por virus de la gripe pdmH1N1 de 2009 podría ser debido no sólo a la diferencia entre fitness /virulencia de las diversas cepas de virus pandemico circulantes, sino también por el medio ambiente inmune del huésped que pueden contribuir a la patogénesis respiratoria grave, probablemente por una respuesta inmune exacerbada asociada a hipercitoquinemia. Para probar esta hipótesis el presente trabajo se divide en cuatro estudios que describen los experimentos realizados en ratones y hurones con los virus pdmH1N1 de 2009 aislados durante el brote de 2009 de pacientes que mostraron grados de enfermedad desde leve a severa con el fin de analizar las características patológicas de la infección. Los experimentos en los capítulos 5 y 6 se llevaron a cabo con el fin de evaluar si los altos niveles de citoquinas proinflamatorias y, en particular IL-6, podrían afectar a la respuesta inmune del huésped y al curso clínico de la infección. Los ratones fueron tratados con LPS o ratones que expresaron altos niveles de IL-6 fueron infectados con el virus pdmH1N1 de 2009 (CAT09) simultáneamente. En el caso de la exposición a LPS, los resultados mostraron que los signos clínicos y la pérdida de peso fueron directamente influenciadas por LPS en los animales infectados con CAT09. Sin embargo, no se detectaron diferencias en la carga viral de los pulmones de los ratones infectados con exposición de LPS, lo que indica que el tratamiento con LPS no estaba afectando a la replicación viral in vivo. La secreción de IL-6 después de la exposición a LPS correlacionó con pérdida de peso corporal a mayor grado de patología. El papel de la IL-6 en la infección por influenza se abordó mediante la inducción de IL-6 en ratones antes de ser infectados con CAT09. Una vez más, los niveles de IL-6 se correlacionaron con la pérdida de peso. Sorprendentemente, la replicación viral no fue afectada por altos niveles de IL-6 debido a que la carga viral no mostró diferencias significativas cuando se compararon los dos grupos infectados, aunque los animals infectados con alto nivel de IL-6 aclararon el virus antes que los animales infectados con CAT09. Se detectó una fuerte respuesta de anticuerpos en los animales infectados, siendo los ratones infectados sólo con CAT09 sin tratamiento con IL-6, los que obtuvieron los mayores títulos de inhibición de hemaglutinación. IL-10 correlacionó con los niveles de IL-6 en el suero y en los pulmones en los primeros días después de la infección. Finalmente, las lesiones histopatológicas fueron más graves en los ratones con altos niveles de IL-6 e infectados con CAT09. Desde el inicio de la pandemia de 2009, mutaciones de resistencia a oseltamivir (OsR) se han descrito en virus circulante pdmH1N1 de 2009. En el capítulo 7 estudios in vitro e in vivo en el que se compararon dos cepas (R6 y R7) de virus pandémico OsR. Hubo diferencias in vitro en la cinética de ambos virus que finalmente se reflejó en la patogénesis de la infección in vivo. Los resultados obtenidos en el análisis in vitro mostraron diferencias en el fitness en la replicación viral de los virus estudiados respecto a un virus sensible a oseltamivir (F), siendo F > R6 > R7. En el siguiente experimento in vivo, ambas cepas OsR produjeron un resultado fatal aunque en diferente magnitud y cinética; el grupo infectado con R6 experimentó un 40 % de letalidad y el grupo R7 un 20 % a los 4 dpi. Sin embargo, a 7 dpi el porcentaje de supervivencia fue de un 50 % para ambos grupos infectados con virus OsR. La replicación viral detectada en los pulmones de los grupos infectados con virus OsR obtuvo los valores no estadísticamente diferentes para R7 que para R6. Hubo una fuerte respuesta de anticuerpos a los 14 dpi en ambos grupos infectados para cada virus, pero no anticuerpos de reacción cruzada. Curiosamente, se detectaron altos niveles de IL-6 en el suero de los ratones R7 con diferencias significativas. Sorprendentemente, los niveles de IL-6 en los pulmones de R6, R7 y animales control fueron similares a todos los tiempos sin diferencias estadísticas. Niveles de IL-10 de suero y pulmón mostraron valores ligeramente más altos también en ratones R7 en comparación con los controles a los 3 y 5 dpi, respectivamente. Hallazgos histopatológicos mostraron lesiones más severas en ratones R7 a 5 dpi. Para analizar las posibles diferencias de virulencia, se infectaron hurones con dos virus pdmH1N1 de 2009 de dos pacientes sin condiciones comórbidas conocidas, uno con consecuencia fatal (F), mientras que el otro sólo mostró enfermedad respiratoria leve (M). Este estudio está comprendido en el capítulo 8. Los hurones desarrollaron diferente grado de severidad de signos clínicos que no se correlacionaron con el origen del virus utilizado en la infección, exhibiendo patología severa (S) o no severa (NS). Se detectó una disminución significativa en el peso corporal en los animales S en comparación con los animales NS a 4 a 7 dpi. La evolución clínica de la infección se relaciono directamente con los hallazgos histopatológicos. El análisis de las proteínas de fase aguda mostró que las concentraciones de haptoglobina (HP) y amiloide A sérico (SAA) incrementaron en ambos grupos después de 2 pi. Los títulos de virus en todos los tejidos fueron más altos en los hurones pertenecientes al grupo S en comparación con los hurones pertenecientes al grupo de NS a 4 dpi. Los animales infectados con ambos virus mostraron una fuerte inhibición de la hemaglutinina de la respuesta de anticuerpos en el suero de ambos virus a 10 y 14 dpi. Los hurones con un progreso severo de la infección clínica mostraron respuestas de anticuerpos ligeramente más altos y los títulos virales más altos después de la infección. / Influenza is a worldwide public health concern, being one of the most common infectious diseases and a highly contagious airborne pathology. From April 2009, a new influenza A H1N1 virus with swine origin gave rise to the emergence of worldwide outbreaks which was subsequently declared as a pandemic situation. Nowadays pdmH1N1 2009 virus continues on circulation and generally triggers mild and self-limiting infections. Nevertheless, a small percentage of the patients require hospitalization and specialized attention in Intensive Care Units (ICUs). Noteworthy, in ICU patients an increased proinflammatory cytokine production has been identified. This observation would suggest the hypothesis that the heterogeneity in the outcome of pdmH1N1 2009 influenza virus infection could be due not only to differential fitness/virulence of the diverse circulating pandemic virus strains but also to the host immune environment that may contribute to severe respiratory pathogenesis, probably by an exacerbated immune response associated to hypercytokinemia. To test such hypothesis the work was divided in four studies describing the experiments performed in mice and ferrets with pdmH1N1 2009 viruses isolated during the 2009 outbreak from patients that showed mild to severe disease in order to analyse pathological features of the infection. Experiments in chapters 5 and 6 were conducted in order to evaluate whether high levels of proinflammatory cytokines and in particular IL-6, might affect host immune responses and the clinical course of infection. Mice were treated with LPS or mice expressing with high levels of IL-6 were infected with pdmH1N1 2009 (CAT09) simultaneously. In the case of LPS exposure, results showed that clinical signs and weight loss were directly influenced by LPS in CAT09 infected. However, no differences in viral load of lungs from infected mice were detected upon LPS exposure, indicating that LPS treatment was not affecting viral replication in vivo. IL-6 secretion upon LPS exposure correlated with body weight loss and higher pathology. The role of IL-6 in influenza infection was addressed by inducing IL-6 in mice prior CAT09 infection. Again, IL-6 levels correlated with weight loss. Surprisingly, viral replication was not affected by high levels of IL-6 since viral load did not exhibit significant differences when both infected groups were compared, although high level of IL-6 in infected animals correlated with sooner viral clearance than the CAT09 infected animals. A strong antibody response was detected in infected animals, being only CAT09 infected mice without IL-6 treatment, the ones with the highest hemagglutinin inhibiting titers. IL-10 levels correlated with IL-6 levels in serum and lungs in the first days after infection. Finally, histopathological lesions were more severe in mice with high levels of IL-6 and CAT09 infected. From the onset of the 2009 pandemic, oseltamivir resistance (OsR) mutations have been described on circulating pdmH1N1 2009 viruses. In chapter 7, in vitro and in vivo experiments in which two strains (R6 and R7) of OsR pandemic virus were compared. There were kinetics differences in both virus in vitro that finally were reflected in the pathogenesis of infection in vivo. The results obtained in the in vitro analysis showed different fitness in viral replication in the virus studied in comparison with a oseltamivir sensitive virus (F), being F>R6>R7. On the following in vivo experiment, both OsR strains produced a fatal outcome although with different magnitude and kinetics, R6-infected group experimented a 40% of lethality and R7-group a 20% at 4 dpi. However, at 7 dpi the percentatge of survival was a 50% in both OsR-infected groups. Viral replication detected in lungs from OsR-infected groups had higher but not statistically different values for R7 than for R6. There was a strong antibody response at 14 dpi on both infected groups for each virus but no cross- reactive antibodies. Interestingly, high levels of IL-6 were detected in serum from R7-mice with significant differences. Surprisingly, levels of IL-6 in lungs of R6, R7 and control animals were similar at all time-point with no statistical differences. Serum and lung IL-10 had also slightly higher values in R7-mice when compared with controls at 3 and 5 dpi respectively. Histopahological findings showed more severe lesions on R7-mice at 5 dpi. To analyze possible virulence differences in viral fitmess, ferrets were infected with two contemporary pdmH1N1 2009 viruses from two patients without known co-morbid conditions, one that became fatal (F) while the other only showed mild (M) respiratory disease. These were studied in chapter 8. Ferrets developed different degree of clinical signs severity that did not correlate with the origin of the virus used in the infection, exhibiting severe (S) or non severe (NS) pathology. A significant decrease in body weight was detected in S animals compared to NS animals at 4 to 7 dpi. Clinical progress of the infection correlated directly with histopathological findings. The analysis of the acute phase proteins showed that the concentrations of haptoglobin (HP) and serum amyloid A (SAA) increased in both groups after 2 dpi. Virus titres in all tissues were higher in ferrets belonging to S group when compared to ferrets belonging to NS group at 4 dpi. Animals infected with both virus showed a strong hemagglutinin inhibiting antibody response in sera to both viruses at 10 and 14 dpi. Ferrets with a severe progress of the clinical infection showed slightly higher antibody responses and higher viral titers after infection.

Un total de 141 granjas porcinas de Cataluña se analizaron con el fin de averiguar la prevalencia de portadores de Salmonella spp, caracterizar las cepas aisladas y determinar que factores pueden influir en la aparición y mantenimiento de este microorganismo en las granjas. Para ello se realizó una encuesta epidemiológica y se recogieron muestras individuales de heces de reproductoras y de los corrales de los animales de engorde. Las muestras se sembraron en caldo Rapapport-Vassiliadis y se realizaron subcultivos a las 24 y 48 horas en agar XLT4. De las colonias identificadas como Salmonella spp. se realizó el serotipado, fagotipado y el estudio de sensibilidad frente a 18 antimicrobianos. Por otra parte, se evaluaron serológicamente 141 unidades de engorde en la comarca de Osona y se realizó una comparación de dos ELISAs disponible comercialmente para el diagnóstico de la salmonelosis porcina. Las muestras de sangre recogidas se evaluaron mediante ELISA (Svanova Biotech, Uppsala, Suecia). Para la prueba de comparación se seleccionaron 361 (reproductoras y engordes) sueros porcinos de estatus bacteriológico conocido y se analizaron mediante el ELISA Svanova y otro ELISA comercial (Salmotype, Labor Diagnostik, Leipzig, Alemania). Los resultados de ambas pruebas se compararon mediante el valor kappa. Los resultados bacteriológicos permitieron clasificar 39 granjas (28,06%) con una o más muestras positivas a Salmonella, identificándose 17 serotipos diferentes en el total de explotaciones. De ellos, el más frecuente fue Salmonella Anatum en las reproductoras y Salmonella Typhimurium en los engordes. El 68,8% de las cepas aisladas fue resistente a las tetraciclinas, un 67,7% a la sulfamida y un 53,1% a la combinación sulfamida + trimetoprim. El 62,50% de las cepas presentó resistencia a tres o más antimicrobianos simultáneamente. Todas las cepas analizadas fueron sensibles a la ceftriaxona y a la colistina. En el análisis serológico se determinó una seroprevalencia del 77,3% de granjas positivas. Los factores epidemiológicos que se relacionaron con la presencia de portadores de Salmonella en las granjas de reproductoras (p<0,05) fueron tener censo de hembras adultas superior a 250 cabezas, la presencia de drenajes de purines abiertos y la ausencia de métodos de control de roedores. En las granjas de engorde la presencia de otras especies de animales de abasto y el número de plazas de engorde (>1600) fueron factores de riesgo significativos. Con respecto a la serología, dos factores se asociaron significativamente con la infección: la falta de medidas para evitar la entrada de pájaros y el uso de aguas de bebida provenientes de pozos artesanos. En la comparación de pruebas serológicas se vió una pobre concordancia (kappa= 0,191) entre ambos ELISAs. De estos resultados se concluye que un porcentaje considerable de granjas porcinas de Cataluña presentan animales con excreción activa de Salmonella, presentándose una gran variedades de serotipos con unos perfiles de multirresistencia a los antimicrobianos muy amplios. El estudio epidemiológico realizado muestra que, en los cerdos, la infección por Salmonella está estrechamente relacionada con factores de bioseguridad elementales. / A total of 141 pig farms of Catalonia were analysed to determine the prevalence of carriers of Salmonella spp. and the factors can influence the entrance and maintenance of this microorganism in the farms. To achieve these goals, an epidemiological survey was carried out. Sampling was done by collection of faecal samples of sows and pooled faecal samples in finishing pens. Faeces were inoculated in Rapapport-Vassiliadis broth and subcultures were performed onto XLT4 agar at 24 and 48 hours of incubation. Bacterial colonies suspected to be Salmonella were further confirmed by serotyping and phagetyping and were also tested for its susceptibility against a panel of 18 antimicrobial agents. On the other hand, 141 fattening units of Osona county were examined serologically by means of an ELISA. Three hundred and sixty-one of these serum samples were further used to compare two ELISAs commercially available for the diagnosis of swine salmonellosis by using the kappa value. The bacteriological analysis yielded 39 farms (28%) with one or more positives samples to Salmonella. The isolated strains belonged to 17 different serotypes. The most frequent was Salmonella Anatum in the sows and Salmonella Typhimurium in the fattening pigs. Antimicrobial susceptibility tests showed that the highest level of resistance was against tetracicline (68.8%), sulphonamides (67.7%) and their combination with trimethoprim (53.1%). Sixty-two percent of the strains showed resistance to three or more antimicrobial agents. None of the strains was resistant to colistin or ceftriaxone. With regards to the serological analysis, we found a seroprevalence of 77.3% of positives farms. The epidemiological factors that were related to the presence of carriers of Salmonella in sows (p<0,05) were to have census of adult females >250 heads, the presence of open drainages of sewage and the absence of rodent control programmes. In fattening pigs, risk factors were: the number of present pigs (> 1600) and presence of other species of livestock in the farm were significant factors of risk. In the serological study, two factors were significantly associated with the infection status: the lack of measures to avoid the entrance of birds and the use of water obtained from wells. Comparison of serological tests, showed a poor agreement (kappa = 0.191) between both ELISA. Of these results we can conclude that a considerable percentage of farms pig of Catalonia have animals with active excretion of Salmonella and that there is a great diversity of serotypes all of which can have multidrug resistance profiles. The epidemiological study showed that, in the pigs, infection by Salmonella is closely related to elementary factors of biosafety.

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Las nuevas vacunas de subunidades están abriéndose paso dentro de la vacunología veterinaria y entre ellas, las pseudopartículas virales o VLPs (por su nombre en inglés “virus-like particles”) son una de las estrategias más atractivas que están abriendo nuevas fronteras en la vacunación de animales. Las VLPs son estructuras proteicas rígidas con un tamaño dentro del rango de los nanómetros, que presentan una geometría muy bien definida y una espectacular uniformidad que mimetiza la estructura de los virus nativos de los que proceden. Las VLPs tienen importantes ventajas en relación a la seguridad por el hecho de carecer de genoma viral, que elimina cualquier riesgo asociado a la replicación viral, reversión, recombinación o reorganizamiento genómico. La proteína de la cápside del virus de la fiebre hemorrágica del conejo (por su nombre en inglés “Rabbit haemorrhagic disease virus” o RHDV) es capaz de formar RHDVVLPs y estas partículas han demostrado poseer una fuerte inmunogenicidad, protegiendo al hospedador natural tras un desafío mortal. Además, estudios anteriores apuntaron la posibilidad de usar RHDV-VLPs como vector para mejorar la inmunoterapia contra el cáncer. Sin embargo, no hay estudios que hayan investigado la posibilidad de usar las RHDV-VLPs como vector vacunal con epitopos de enfermedades virales de animales. El objetivo de esta tesis es estudiar el potencial inmunogénico de las RHDV-VLPs como vectores vacunales de enfermedades virales en diferentes animales. En los dos primeros estudios, se investigó la inmunogenicidad de las RHDV-VLPs en el modelo murino, tanto in vitro como in vivo. Los resultados de estos estudios demostraron que el epítopo insertado era procesado y presentado mediante MHC-I por células dendríticas y que la inmunogenicidad dependía de los diferentes sitios de inserción. Las RHDV-VLPs quiméricas fueron capaces de proteger a los ratones frente a un desafío viral. También, la respuesta se vio alterada según la ruta de administración del antígeno. El tercer estudio confirmó los resultados en ratón, pero esta vez en experimentos in vitro con células de cerdo. Por último, se estudió inmunogenicidad de las RHDV-VLPs quiméricas en cerdo. Los resultados mostraron que la ruta de administración y el adjuvante determinaron la respuesta inmune después de la inmunización con las RHDVVLPs quiméricas y que los animales presentaban muy buena respuesta inmune celular y humoral, no solo frente a RHDV-VLPs sino frente al epítopo antigénico. Estudios posteriores se tendrán que abordar para demostrar la protección de los cerdos. En conclusión, en esta tesis se demuestra el potencial de las RHDV-VLPs como inmunógenos en dos sistemas animales diferentes. / New subunit vaccines are getting a foothold in veterinary vaccinology and virus-like particles (VLPs) are one of the most appealing approaches opening up frontiers in animal vaccines. VLPs are robust protein cages in the nanometer range exhibiting welldefined geometry and remarkable uniformity that mimic the overall structure of the native virions. VLPs have an important advantage in terms of safety; indeed, lacking the genome of the virus avoid any of the risks associated with virus replication, reversion, recombination or re-assortment. Rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) capsid protein is able to form RHDV-VLPs and these particles showed a strong immunogenicity and protected the natural host after a lethal challenge. Additionally, previous studies described the possibility to use RHDV-VLPs as platform for the insertion of foreign epitopes or for DNA packaging. Nowadays, one study has shown the possibility to use RHDV-VLPs as carrier for improving cancer immunotherapies but no studies have investigated the possibility to use RHDV-VLPs as vaccine vectors carrying epitopes corresponding to viral animal diseases. This thesis is aimed to study the potential immunogenicity of RHDV-VLPs as epitope carriers for viral disease in different animal models. In the first two studies, the immunogenicity of chimeric RHDV-VLPs was investigated in a murine system in vitro and in vivo. Results from these studies demonstrated that the inserted epitope was processed and presented in an MHC-I context by dendritic cells (DCs) and that the different sites of insertion of the epitope influenced the immunogenicity of the VLPs. Chimeric RHDV-VLPs were able to protect mice from a viral challenge. Also, the route of antigen delivery influenced the immunogenicity of the particles. The third study confirmed the initial results but this time in in vitro experiments using porcine cells. Lastly, chimeric RHDV-VLPs were studied as immunogens in pigs. The results showed that the delivery route and adjuvant influenced immune responses after chimeric RHDV-VLP immunization and more importantly that pigs exhibited very good cellular and humoral immune responses against not only RHDV-VLPs but also against the antigenic epitope. Further studies have to be performed to prove protection in pigs. In conclusion, in this thesis we demonstrated the potential of RHDV-VLPs as immunogens in two different animal systems.